DE69127829T2 - Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Produktion von Proteinen in rekombinanten Wirtszellen. Sie betrifft insbesondere Materialien und Verfahren zur Produktion reifer Proteinformen aus heterologen Vorstufenpolypeptiden unter Verwendung eines Enzyms, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt (PACE), das in ausgewählten Wirtszellen exprimiert wird.
• Viele Eukaryontenproteine werden auf natürliche Weise als größere Vorstufenpolypeptide synthetisiert, die zur vollen Reifung vor der Sekretion auf spezifische Weise einem proteolytischen Processing unterzogen werden müssen. Viele dieser Eukaryontenproteine oder -vorstufen falten sich jedoch bei der Synthese in Bakterien unrichtig oder unwirksam und weisen daher eine niedrige spezifische Aktivität auf. Für die Synthese von biologisch vollaktiven reifen Proteinen und Peptiden ist bei allen untersuchten Eukaryonten, darunter Hefe [R.S. Fuller et al., Ann. Re. Physiol., 50: 345 (1988)], Wirbellose und [R. H. Scheller et al., Cell, 32:7 (1983)] und Säugetierzellen [J. Douglass et al., Ann. Rev. Biochem., 53:665 (1984); und W.S. Sossin et al., Neuron, 2, 1407 (1989)] häufig eine posttranslationelle Proteolyse erforderlich.
• Einer der frühen Vorgänge bei der Reifung von Vorstufenprotein ist die endoproteolytische Spaltung an der Carboxyl-Seite von paarweise auftretenden basischen Aminosäuresequenzen (z.B. -Lys-Arg- und -Arg-Arg-). Auf diese Art von endoproteolytischer Spaltung wurde anfänglich aufgrund der Sequenzen verschiedener endokriner und neuroendokriner Vorstufenproteine geschlossen, und sie wurde zuerst aufgrund von Untersuchungen des Promsulins [D.F. Steiner et al., Science, 157:697 (1968); R.E. Chance et al., Science, 161:165 (1968)] und der ACTH/β-Endorphin-Vorstufe, Proopiomelanocortin (POMC) [M. Chretien und C.H. Li, Can. J. Biochem., 45:1163 (1967)] vorgeschlagen. In Folgestudien wurden verschiedenste Vorstufenproteine aufgezeigt, bei denen eine Endoproteolyse an Paaren basischer Aminosäuren erforderlich ist, um zu reifen Peptiden, darunter Serumfaktoren (A.K. Bentley et al., Cell, 45:343 (1986)], Virusproteine [C.M. Rice et al., Virology, 151:1 (1986); C.M. Rice et al., Science, 229:726 (1985); J.M. McCune et al., Cell, 53:55 (1988)], Wachstumsfaktoren [L.E. Gentry et al., Mol. Cell Biol., 8:4162 (1988); K. Sharples et al., DNA, 6:239 (1987); M. Yanagisawa et al., Nature, 332:411 (1988); und Gray et al., Nature, 303:722 (1983)] sowie Rezeptoren [Y. Yosimasa, Science, 240:784 (1988)], zu gelangen. Siehe auch Dickerson et al, J. Bid. Chem., 265:2462 (1990); Achsietter et al., EMBO J., 4:173 (1985); und Mizuno et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 144:807 (1987).
• Durch Spaltung an der Stelle einer paarweise auftretenden basischen Aminosäuresequenz werden viele Propeptide entfernt, die bei dem Processing des reifen Proteins verschiedene Funktionen ausuben. In gewissen Fällen kann das Propeptid die richtige Faltung und Disulfidbrückenbildung innerhalb der Proteinsequenz vermitteln. In anderen Fällen scheint das Vorhandensein des Propeptids eine Rolle bei der γ-Carboxylierung von Glutaminsäureresten in Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren zu spielen. Zu den γ-carboxylierten Proteinen gehören Faktor IX und Protein C sowie gewisse knochenspezifische Proteine, wie Knochen-GLA- Protein/Osteocalcin. Das Propeptid kann auch die intrazelluläre Zielfindung steuern und die koordinierte Synthese mehrerer reifer Peptide aus einem einzigen Vors tufenpolypeptid regulieren.
• Die Sequenzen der Propeptiddomänen gewisser Vitamin-K-abhängiger Blutgerinnungsproteine sind bereits veröffentlicht worden Esiehe Furie et al, Cell, 53:505 (1988)] und die Größe des Propeptids wurde sowohl für Faktor IX als auch Protein C bestimmt. Bei Faktor IX handelt es sich um ein Zymogen einer Serinprotease, die einen wichtigen Bestandteil des Intrinsic-Wegs der Blutgerinnungskette darstellt. Das Protein wird in der Leber synthetisiert und vor der Sekretion co- und posttranslationell weitgehend modifiziert. Zu diesen Modifizierungen gehört das endoproteolytische Processing zur Entfernung der Prä- und Propeptide, Glycosylierung, Vitamin-K-abhängige γ-Carboxylierung von 12 aminoterminalen Glutaminsäureresten sowie β-Hydroxylierung eines einzelnen Asparaginsäurerests.
• Die γ-Carboxyglutaminsäurereste statten das reife Faktor-IX-Protein mit metallbindenden Eigenschaften aus und funktionieren bei dem Processing der anderen Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsproteine möglicherweise ähnlich. Diese γ-carboxyglutaminsäurereste sind ausschlaggebend für die Gerinnungswirkung. Die gamma- Carboxyglutamat-Domäne (GLA-Domäne) von Faktor IX ist ebenfalls als wichtige Voraussetzung für die Zellbindung erkannt worden [Derian et al., J. Biol. Chem., 264 (12): 6615-6618 (1989)].
• Aufgrund der Fortschritte der Gentechnik werden zur Zeit viele Eukaryontenproteine durch Rekombinationstechnik in ausgewählten Zellen produziert. Zum Beispiel wird in US-Patent Nr. 4 784 950 die Expression des vollständigen Faktors VII in Säugetierzellen beschrieben. Zur Aktivierung des exprimierten Proteins ist eine Reaktion mit einem proteolytischen Enzym erforderlich. Außerdem wurden die DUKX-Ovarienzellinien des Chinesischen Hamsters (CHO), die rekombinanten Faktor IX in hohen Antigenmengen (20 µg/ml/Tag) produzieren, isoliert. Bei Vorhandensein von Vitamin K3 sind jedoch nur 1-2% des rekombinanten Proteins γ-carboxyliert und daher biologisch aktiv [Kaufman et al, J. Biol. Chem., 261 (21) :9622-28 (1986)]. Außerdem wurde durch aminoterminales Sequenzieren des rekombinanten Proteins gefunden, daß bei 50% des von den CHO-Zellen produzierten rekombinanten Faktors IX das Propeptid halten bleibt [Derian et al, J. Biol. Chem., 264(12): 6615-18 (1989)1. Vermutlich war das endoproteolytische Processing-Enzym der CHO-Zellen, das diese Spaltung steuert, entweder gesättigt oder einfach in seiner Funktion unwirksam.
• Als in Frage kommende echte Säugetier-Vorstufenendoproteasen wurden bereits verschiedene wirksame Faktoren, die zur in-vitro-Spaltung an einzeln oder paarweise auftretenden Basenresten fähig sind, vorgeschlagen. Siehe zum Beispiel Y.P. Loh und H. Gainer, in Brain Peptides, D.T. Krieger, M.J. Brownstein, J.B. Martin, Eds. (WileyInterscience, New York, 1983), S. 76- 116; M. Chretien et al. in Cell Biology of the Secretory Process (Karger, Basel, Switzerland, 1983), S. 214-246; A.J. Mason et al., Nature, 303:300 (1983); P.J. Isackson et al., J. Cell. Biochem., 33:65 (1987); I. Lindberg et al., J. Neurochem., 42:1411 (1985); JA. Cromlish et al., J. Biol. Chem., 261:10850 (1986); K. Docherty et al., J. Biol. Chem., 259:6041 (1984); T.C. Changundy.P. Loh, Endocrinolocy, 114, 2092 (1984); B.P. Noe et al., J. Cell. Biol., 99:578 (1984); U.P. Loh, J. Biol. Chem., 261:11949 (1986); H.W. Davidson et al., Biochem. J., 246:279 (1987); P. Gluschankof et al., J. Biol. Chem., 262:9615 (1987); C. Clamigrand et al., Biochem., 26:6018 (1987); S.O. Brennan und R.J. Peach, FEBS Letters, 229:167 (1988); R.S. Fuller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1434 (1989); K. Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 159:305 (1989); I.C. Bathurst et al., Science, 241:348 (1987), sowie G. Thomas et al., Science, 241:226 (1988)].
• Obwohl diese in Frage kommenden wirksamen Faktoren und andere Processing-Enzyme als an den Propeptid-Processing-Reaktionen beteiligt vorgeschlagen wurden, so sind diese in Frage kommenden endoproteolytischen Faktoren entweder noch nicht voll beschrieben oder als echte Endoprotease, die Vorstufen in vivo spaltet, nachgewiesen worden. Die Reinigung von proproteinspaltenden Enzymen wurde immer durch ihre niedrigen Aktivitätsmengen in Säugetiergeweben und dadurch, daß sie artbedingt mit Membranen assoziiert sind, behindert. Die Reinigung dieser spezifischen Proteasen wurde außerdem durch unspezifische Spaltung der Testsubstrate in vitro und durch kontaminierende Proteasen, wie z.B. den aus Lysosomen freigesetzten Proteasen, zusätzlich erschwert.
• Bei dem vom KEX2-Gen codierten Hefeenzym Kex2 handelt es sich um eine membrangebundene Ca&spplus;&spplus;-abhängige Serinprotease, der beim sekretorischen Weg von Saccharomyces cerevisiae eine Spätfunktion zukommt. Das Enzym spaltet die Polypeptidketten von Prå-Pro-Killertoxin und Prä-Pro-α-Faktor dieses Mikroorganismus an den paarweise auftretenden basischen Aminosäuresequenzen Lys-Arg und Arg-Arg [D. Juijus et al, Cell, 37:1075 (1984); D. Julius et al, Cell, 36:309 (1984); K. Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 156:246 (1988); R.S. Fuller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1434 (1989)]. Es wird angenommen, daß es sich bei Kex-2 um den Prototyp einer Proproteinconvertase handelt.
• Vor Kurzem verursachte angeblich die Coexpression des Hefe-KEX2-Gens und POMC in Säugetier-BSC-40-Zellen (einer Zellinie, die zum Processing dieser Peptidvorstufe nicht fähig ist) die Bildung von authentischen Neuroendocrin-Prohormon-Peptiden, darunter γ-LFH und β-Endorphin, durch proteolytische Spaltung an paarweise vorliegenden basischen Aminosäuren [Thomas et al., (1988), Zitat oben]. Von Foster et al, Thrombosis and Haemostasis, 62:321 (1989), wurde berichtet, daß das Produkt des Hefegens KEX2 bei Coexpression der Hefe- Endoprotease des KEX2-Gens und der Wildtyp-Protein-C- Vorstufe die Protein-C-Vorstufe in eine zweikettige Form spaltet. Das Processing des Propeptids und die Auswirkung der Expression von KEX2 wurden jedoch noch nicht untersucht.
• Zwei mit PC2 und fur bezeichnete Human-DNA- Proteasesequenzen weisen zueinander und zu der KEX2-Gensequenz eine gewisse Strukturhomologie auf. PC2, eine subtilisinähnliche Säugetierprotease, wurde durch Amplifizierung einer Human-Insulinom-cDNA-Bibliothek mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von aus Kex2- stammenden Primern identifiziert. PC2, von dem man annimmt, daß es an dem endoproteolytischen Processing von Prohormonen beteiligt ist, weist zu der Hefe-EX2- Protease eine teilweise Homologie auf, besonders an den Domänen mit den mutmaßlichen aktiven Stellen [Smeekens et al, J. Biol. Chem., 265:2997 (1990)]. Bis heute wurde jedoch für den PC2-Klon keine funktionelle Wirksamkeit nachgewiesen.
• Dadurch, daß die vollständige Kex2-Gensequenz zur Verfügung stand, konnte man die wesentliche Homologie zwischen dem KEX2-Protein und "Furin", dem Produkt des teilweise beschriebenen menschlichen fur-Gens, nachweisen. Ursprünglich wurde der fur-Locus durch seine Nähe (unmittelbar stromaufwärts) zu dem Protooncogen c-fes/fps identifiziert CA. J. M. Roebroek et al, EMBO J., 5:2197 (1986)]. Es wurde die vollständige Nukleotidseguenz der mutmaßlichen Codierregion des fur-Gens beschrieben. Bei einem Vergleich stellte sich heraus, daß das Produkt des menschlichen fur-Gens eine Strukturhomologie zu der subtilisinartigen Serinprotease, die vom Kex2-Gen der Hefe S. cerevisiae codiert wird, aufweist [A. M. W. van den Ouweland et al., Nucl. Acids Res., 18(3) :664 (1990)]. Diese veröffentlichte cDNA-Codiersequenz für fur ist in Figur 1 dargestellt. Siehe auch R.S. Fuller et al, Science, 246:482 (1989). Es wurde jedoch kein Beweis für die Expression von fur beschrieben.
• Es wurde ein Expressionssystem entwickelt, das Baculovirus-Vektoren dazu verwendet, um heterologe Gene in kultivierte Insektenzellen einzuführen und das anschließend die Expression der heterologen Polypeptide bewirkt. Für die rekombinante Expression bestimmter Proteine (siehe z.B. G. Ju et al., Curr. Communic. in Mol. Biol. - Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Mitteilungen der Molekularbiologie - Gentransfervektoren für Säugetierzellen], C.S.H.L. Press (1987) S. 39-45; sowie A. E. Atkinson et al., Pestic. Sci., 28:215-224 (1990)] hat sich dies als erfolgreich herausgestellt. Es besteht in der Technik ein Bedarf an einem Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit des proteolytischen Processing von Vorstufenpolypeptiden in rekombinanten Wirtszellen.
Zusammenfassung der Erfindung
• Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, daß sie eine ausgewählte Wirtszelle mit einer rekombinanten DNA-Sequenz, die für PACE, das Enzym, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt, codiert und operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression von PACE gestattet, wobei das PACE aus der Gruppe vollständiges PACE und PACE ohne Transmeznbrandomäne ausgewählt ist; sowie eine Polynukleotidsequenz, die für ein Vorstufenpolypeptid codiert, wobei das Vorstufenpolypeptid als Substrat für das codierte PACE dient, und welche operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression des Proteinprodukts des Vorstufenpolynukleotids durch die Wirtszelle gestattet, zur Verfügung stellt. Diese Wirtszelle ist dadurch gekennzeichnet, daß sie dazu fähig ist, sowohl PACE als auch das heterologe Vorstufenprotein zu exprimieren, welches anschließend durch das coexprimierte PACE in seine reife Form gespalten wird. Diese Wirtszelle ist daher zur Produktion hoher Mengen an PACE und des aktiven reifen heterologen Proteins fähig. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung kann es sich bei der Wirtszelle um einen Mikroorganismus, z.B. eine Bakterien- oder Pilzzelle, eine Säugetierzelle oder eine Insektenzelle, handeln.
• Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, daß sie einen rekombinanten Expressionsvektor, der zur Expression in einer ausgewählten Wirtszelle geeignet ist, mit einer DNA-Sequenz, die für PACE, das Enzym, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt, codiert, wobei die für PACE codierende Sequenz operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression von PACE gestattet, wobei das PACE aus der Gruppe vollständiges PACE und PACE ohne Transmembrandomäne ausgewählt ist; sowie eine Polynukleotidsequenz, die für ein Vorstufenprotein codiert, welches als Substrat für PACE dient, und welche operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression des Proteinprodukts gestattet, zur Verfügung stellt. Die Codiersequenzen des Vektors sind operativ mit einer oder mehreren geeigneten Regulatorsequenzen verbunden, die fähig sind, die Replikation und Expression von PACE und dem ausgewählten Propeptid in einer ausgewählten Wirtszelle zu steuern.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist, daß sie ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute eines biologisch aktiven Proteins, wobei man eine Wirtszelle mit (a) einer DNA-Sequenz, die für PACE, das Enzym, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt, codiert und die operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression von PACE gestattet, sowie (b) einer für ein Vorstufenpolypeptid codierenden Nukleotidsequenz, wobei das Vorstufenpolypeptid als Substrat für PACE dient, die operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verbunden ist, die die Expression dieses Proteins gestattet, kultiviert, zur Verfügung stellt. Dieses Verfahren kann die Wirksamkeit eines funktionellen reifen Proteins erhöhen oder anderweitig die Produktion eines funktionellen reifen Proteins fördern, wobei für die biologische Aktivität dieses Proteins das Processing einer Propeptidform durch das Enzym PACE erforderlich ist. Die Erfindung kann auch zum Processing von γ-carboxylierten Proteinen und anderen Proteinen, bei denen keine gamma-Carboxylierung erforderlich ist, verwendet werden, was zu höheren Mengen biologisch aktiver oder andersweitig nützlicher Proteine führt.
• Das Verfahren kann die Transformation einer ausgewählten Wirtszelle mit den oben beschriebenen rekombinanten Expressionsvektoren beinhalten. Diese Zellinie wird dann unter geeigneten Bedingungen, die eine Expression des rekombinanten Proteins bzw. der rekombinanten Proteine gestatten, kultiviert. Das exprimierte ausgewählte Protein bzw. die exprimierten ausgewählten Proteine wird/werden dann aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium durch geeignete traditionelle Mittel geerntet.
• Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden genauen Beschreibung der Erfindung hervor.
Beschreibung der Zeichnung
• Figur 1 zeigt die veröffentlichte fur-DNA-Sequenz von A.M. W. van den Ouweland et al., Nucl. Acids Res., 18(3):664 (1990).
• Die für PACE codierende zusammengesetzte cDNA-Sequenz, die sich von der obigen Figur 1 dadurch unterscheidet, daß darin die 5'-nichttranslatierte Region von Nukleotid Nr. -320 bis -1 und die 3'-nichttranslatierte Region von Nukleotid Nr. 2383 bis 3974 enthalten ist, sowie die in dieser Sequenz codierten Aminosäuren sind in Figur 2 dargestellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung beinhaltet Zusammensetzungen (z.B. Vektoren, transformierte Wirtszellen, rekombinante Polypeptide) sowie Verfahren zur Herstellung, zur Expression und zur Sekretion einer Säugetier- Endopeptidase, PACE, in ausgewählten Wirtszellen, wobei diese Säugetier-Endopeptidase an der Produktion von reifen Polypeptiden aus Vorstufenpolypeptiden durch Spaltung an paarweise vorliegenden basischen Aminosäuren (-LysArg-, -LysLys- und -ArgArg-) beteiligt ist. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, z.B. die rekombinanten Polynukleotide, können zur vermehrten intrazellulären oder extrazellulären Produktion von PACE in verschiedenen Wirtszellen, darunter Mikroorganismen, z.B. Bakterien und Pilze, Insektenzellen und Säugetierzellen, verwendet werden. Die Produktion von PACE in diesen Expressionssystemen stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, Verfahren zum wirksamen Processing und zur wirksamen Umwandlung von coexprimierten heterologen Vorstufenpolypeptiden mit von der PACE-Endopeptidase erkannten Processingstellen zu gewünschten reifen Formen dieser Polypeptide. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch zur Produktion der Endopeptidase in hohen Ausbeuten zwecks Produktion von gereinigter Endopeptidase für industrielle Zwecke verwendet werden.
• Wenn nicht anders angegeben, werden bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung traditionelle molekularbiologische, mikrobiologische und immunologische Tecbniken sowie DNA-Rekombinationstechniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, angewandt. Solche Techniken werden in der Literatur genau beschrieben. Siehe z.B. Sainbrook et al., "Molecular Cloning; A Laboratory Manual" [Molekulares Klonieren; Ein Laborhandbuch], 2. Ausg. (1989); "DNA doning" [Klonieren von DNA], Bd. I und II (Hrsg. D.N. Glover, 1985); "Oligonudeotide Synthesis" [Oligonukleotidsynthese] (Hrsg. J. Gait, 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [Nukleinsäurehybridisierung] (Hrsg. Translation" [Transkription und Translation] (Hrs. B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); "Animal Cell Culture" [Tierische Zellkultur] (Hrsg. R.I. Freshney, 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" [Immobilisierte Zellen und Enzyme] (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular doning" [Praktische Anleitung für das Molekulare Klonieren] (1984); die Reihe Methods in Enzymolojy (Academic Press, Inc.), insbesondere Bd. 154 und 155 (Hrsg. Wu und Grossmann bzw. Wu); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" [Gentransfervektoren für Säugetierzellen] (Hrsg. J.H. Miller und M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology" [Immunchemische Verfahren in der Zell-Molekularbiologie], Hrsg. Mayer und Walker (Academic Press, London, 1987); Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice" [Proteinaufreinigung: Theorie und Praxis], 2. Ausg. 1987 (Springer-Verlag, N.Y.), und "Handbook of Experimental Immunology" [Handbuch der experimentellen Immunologie], Bd. I-IV (Hrsg. D.M. Weir und C. C. Blackwell, 1986).
• Die folgenden Definitionen lassen sich auf in der Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung verwendete Ausdrücke anwenden. Im vorliegenden Zusammenhang handelt es sich bei dem Ausdruck "PACE" um ein Acroynm für ein Enzym, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt (oder spaltet). PACE, das ursprünglich aus einer menschlichen Leberzellinie isoliert worden war, ist eine subtilisinartige Endopeptidase, d.h. ein propeptidspaltendes Enzym, das eine Spezifität für Spaltung an basischen Resten eines Polypeptids, z.B. -Lys-Arg-, -Arg-Arg- oder -Lys-Lys-, aufweist. PACE wird durch Calciumionen stimuliert und durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PM5F) gehemmt. Eine für PACE (oder Furin) codierende DNA-Sequenz wurde von A.M.W. van den Ouweland et al., Zitat oben, veröffentlicht und ist in Figur 1 dargestellt.
• Figur 2 zeigt eine für zumindest eine Form von PACE codierende cDNA aus einer tierischen Zelle, genauer gesagt einer menschlichen Zelle. Es wird angenommen, daß andere Formen von PACE existieren oder daß solche geschaffen werden können. Wie im vorliegenden Text beschrieben, kann PACE von DNA-Sequenzen codiert werden, die sich bezüglich der Sequenz von der veröffentlichten Sequenz und der Sequenz von Figur 2 aufgrund natürlicher allelischer oder artbedingter Variationen unterscheiden. Der Ausdruck "PACE" bezieht sich daher auf eine beliebige natürlich vorkommende Form von PACE, darunter auch die in Figur 2 dargestellte PACE-Vorstufe und verschiedene Formen, die einem Processing unterzogen worden sind, darunter das reife PACE-Polypeptid.
• Auf ähnliche Weise kann der Ausdruck PACE Fragmente der PACE-DNA und Aminosäuresequenzen oder absichtlich modifizierte Sequenzen hiervon, die die katalytische Spezifität dieses Enzyms beibehalten, beinhalten. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher die Verwendung aller solcher DNA-Sequenzen, vorausgesetzt, daß die biologische Wirksamkeit der Vermittlung von Propeptidspaltung und/oder γ-Carboxylierung ganz oder teilweise trotz solcher Modifizierungen beibehalten werden. Der im vorliegenden Zusammenhang verwendete Ausdruck "PACE" umfaßt daher die im vorliegenden Text spezifisch offengelegten Peptid- und DNA-Sequenzen sowie deren Analoge, die die biologische Wirksamkeit von PACE beibehalten.
• Zu den von dieser Definition umfaßten PACE Analogen können "truncated" Polypeptide (darunter auch Fragmente) und PACE-artige Polypeptide, z.B. Mutanten, die die katalytische Wirkung beibehalten und vorzugsweise eine Homologie von mindestens 80%, besonders bevorzugt 90% und ganz besonders bevorzugt 95% zu Figur 1 oder 2 aufweisen, gehören. Solche Analoge unterscheiden sich typischerweise nur durch 1, 2, 3 oder 4 ausgewechselte Codons. Dazu gehören zum Beispiel Polypeptide, die sich von den natürlichen Aminosäuresequenzen von PACE durch kleinere Aminosäurevariationen unterscheiden, insbesondere durch konservativen Aminosäureaustausch. Bei konservativen Austauschen handelt es sich um solche, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren, die bezüglich ihrer Seitenketten verwandt sind, auftreten. Genetisch codierte Aminosäuren lassen sich im allgemeinen in vier Familien einteilen: (1) sauer = Asparaginsäure, Glutaminsäure; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan, sowie (4) polar und ladungsfrei = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren bezeichnet. Es kann daher durchaus angenommen werden, daß ein einzelner Austausch eines Leucin gegen ein Isoleucin oder Valin, einer Asparaginsäure gegen eine Glutaminsäure, eines Threonins gegen ein Serin oder ein ähnlicher konservativer Austausch einer Aminosäure gegen eine strukturmäßig verwandte Aminosäure keine größere Auswirkung auf die Enzymaktivität haben wird, besonders wenn der Austausch nicht eine Aminosäure an der aktiven Stelle des PACE-artigen Polypeptids betrifft.
• Unter Verwendung der Sequenzangaben von Figur 2 sowie der angegebenen Eigenschaften von PACE lassen sich nach dem Stand der Technik weitere für PACE codierende DNA-Sequenzen erhalten. Zum Beispiel können die Strukturgene durch Variieren einzelner Nukleotide unter Beibehaltung der richtigen Aminosäure(n) oder durch Variieren der Nukleotide zur Veränderung der Aminosäuren ohne Verlust der enzymatischen Aktiviät manipuliert werden.
• Nukleotide können durch bekannte Verfahren, darunter zum Beispiel in-vitro-Mutagenese und Primer-Reparatur, substituiert, insertiert oder deletiert werden.
• Das Strukturgen kann an seinem 3'-Ende und/oder seinem 5'-Ende unter Beibehaltung seiner Endopeptidase Wirkung in ein "truncated" Strukturgen umgewandelt werden. Zum Beispiel enthält das wie in Figur 2 dargestellt codierte PACE eine mutmaßliche Transmembrandomäne, die dazu dienen könnte, es an den Membranen der Golgi- Körper in der Zelle, wo es exprimiert wird, zu verankern. Außerdem kann es wünschenswert sein, die Transmembran(TM-)Region und/oder die cysteinreiche Region (CRR) zu deletieren. Es kann auch wünschenswert sein, die für die Signalsequenz codierende Region zu entfernen und/oder sie durch eine heterologe Sequenz zu ersetzen.
• Es kann auch wünschenswert sein, einen Abschnitt der PACE-Sequenz (besonders denjenigen, der die katalytische Domäne enthält) mit einer heterologen Codiersequenz zu ligieren und so ein Fusionspeptid mit der enzymati schen Spezifität von PACE zu schaffen.
• Zusätzlich zu den oben genannten Möglichkeiten können weitere für PACE codierende offene Leseraster (OLR) oder Strukturgene von cDNA-Bibliotheken anderer tierischer Ausgangszellen erhalten und/oder geschaffen werden.
• Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "Polypeptid" auf ein Aminosäurepolymer und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts; Peptide, Oligopeptide und Proteine fallen daher alle unter die Definition eines Polypeptids. Außerdem bezieht sich dieser Ausdruck nicht auf postexpressionelle Modifizierungen des Polypeptids, zum Beispiel Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen usw. bzw. schließt diese nicht aus. Zum Beispiel fallen Polypeptide mit einem oder mehreren Analogen einer Aminosäure (darunter zum Beispiel auch unnatürliche Aminosäuren usw.), Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie andere aus dem Stand der Technik bekannte natürlich und nicht natürlich vorkommende Modifizierungen ebenfalls unter die Definition.
• Der Ausdruck "Vorstufenpolypeptid" bedeutet ein exprimiertes Polypeptid, das normalerweise einer oder mehreren posttranslationellen proteolytischen Spaltungen unterzogen wird, wodurch ein biologisch aktives reifes Polypeptid entsteht. Unter den Ausdruck "Vorstufenpolypeptid" fallen auch "Pre-Pro-Polypeptide" sowie "Propolypeptide".
• Bei einem "Prepeptid" handelt es sich um den Teil eines Vorstufenpolypeptids, das durch Spaltung mit "Signalpeptidase" während der Transiokation des Polypeptids in das endoplasmatische Retikulum entfernt wird. Die "Prepeptid"-Region liegt normalerweise an dem aminoterminalen Ende oder in dessen Nähe.
• Bei einem "Propeptid" handelt es sich um den Teil eines Vorstufenpolypeptids, der durch eine "Propolypeptidkonvertase" oder "Endopeptidase" (zum Beispiel KEX2 und PACE) während der Reifung des Polypeptids entfernt wird. Viele Proteine wie z.B. Plasmaproteine, Hormone, Neuropeptide und Wachstumsfaktoren werden mit einer zusätzlichen "Propeptid"-Region an der Carboxy-Seite der Prepeptidregion translatiert. Nach Abspaltung des Prepeptids wird der "Propeptid"-Abschnitt von einer Sequenzspezifischen Endopeptidase abgespalten, was zur Reifung des Polypeptids beiträgt. Bei der "reifen" Form eines Polypeptids sind Prepeptid- und/oder Propeptidregion entfernt worden.
• Ist ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz von einer bestimmten Nukleinsäuresequenz "abgeleitet", so bezieht sich dies auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mit der eines in der Sequenz codierten Polypeptids identisch ist, oder einen Teil davon, wobei der Teil aus mindestens 3-5 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 8-10 Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt mindestens 11-15 Aminosäuren besteht, oder wobei dieser Teil immunologisch mit einem in der Sequenz codierten Polypeptid identifizierbar ist. Dieser Begriffskomplex beinhaltet auch ein von einer bestimmten Nukleinsäuresequenz exprimiertes Polypeptid.
• Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid wird nicht unbedingt von einer bestimmten Nukleinsäure sequenz, zum Beispiel der in Figur 2 dargestellten Sequenz, translatiert. Es kann auf beliebige Weise geschaffen werden, darunter zum Beispiel chemische Synthese oder Expression eines rekombinanten Expressionssystems oder Isolierung aus einer Zelle. Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid kann ein oder mehrere Analoge von Aminosäuren oder unnatürlichen Aminosäuren in seiner Sequenz beinhalten. Verfahren zur Insertion von Aminosäureanalogen in eine Sequenz sind aus dem Stand der Technik bekannt. Darunter können sich auch ein oder mehrere Marker befinden, die dem Fachmann bekannt sind.
• Der Ausdruck "rekombinantes Polynukleotid" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang ein Polynukleotid genomischer, semisynthetischer oder synthetischer Abstammung oder aus cDNA, wobei dieses Polynukleotid aufgrund seiner Abstammung oder Behandlung: (1) nicht mit dem ganzen Polynukleotid, mit dem es in der Natur assoziiert ist, oder mit einem Teil davon assoziiert ist, (2) an ein Polynukleotid gebunden ist, bei dem es sich nicht um dasjenige handelt, an das es in der Natur gebunden ist, oder (3) nicht in der Natur vorkommt.
• Der Ausdruck "Polynukleotid" bedeutet im vorhegenden Zusammenhang eine polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, und zwar sowohl Ribonukleotide als auch Desoxyribonukleotide. Dieser Ausdruck bezieht sich lediglich auf die Primärstruktur des Moleküls Der Ausdruck beinhaltet daher Doppel- sowie Einzelstrang-DNA und RNA. Er beinhaltet auch bekannte Arten von Modifizierungen, zum Beispiel aus dem Stand der Technik bekannte Marker, Methylierung, "Hütchen", Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Zu anderen bekannten Modifizierungen gehören Internukleotidmodifizierungen, zum Beispiel mit ladungsfreien Bindungen (Phosphonsäuremethylester, Phosphorsäuretriester, Phosphorsäureamidester, Carbaminsäureester usw.) und mit geladenen Bindungen (Phosphorsäurethioester, Phosphorsäuredithioester usw.), solche mit angehefteten Molekülteilen wie z.B. Proteinen (darunter Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L- Lysin usw.), solche mit interkalierenden Substanzen (Acridin, Psoralen usw.), solche, die Komplexbildner enthalten (Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidierende Metalle usw.), solche, die Alkylierungsmittel enthalten, solche mit modifizierten Bindungen (alpha-anomere Nukleinsäuren usw.) sowie unmodifizierte Formen des Polynukleotids.
• Bei einem "Replikon" handelt es sich um ein beliebiges genetisches Element, das als autonome Einheit der Polynukleotidreplikation innerhalb einer Zelle agiert, d.h. zu Replikation unter seiner eigenen Kontrolle fähig ist. Zu einem Replikon können daher folgende zählen (ohne darauf beschränkt zu sein): ein selektierbarer Marker, ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus oder ein Cosmid.
• Bei einem "Vektor" handelt es sich um ein Replikon, an das ein anderer Polynukleotidabschnitt angeheftet ist, um die Replikation und/oder Expression des angehefteten Teils zu bewirken.
• "Kontrollsequenz" oder "Regulationssequenz" beziehen sich auf Polynukleotidsequenzen, die erforderlich sind, um die Replikation und Expression der codierenden Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, zu bewirken. Diese Kontrollsequenzen sind verschiedener Art, je nach Wirtsorganismus. Bei Prokaryonten zählen zu solchen Kontrollsequenzen im allgemeinen Promoter, ribosomale Bindungsstellen und Transkriptionsterminationssequenzen. Bei Eukaryonten zählen zu solchen Kontrollsequenzen im allgemeinen Promoter und Transkriptionsterminations- Sequenzen. Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" ist dahingehend zu verstehen, daß dazu mindestens alle Bestandteile gehören, deren Vorhandensein für die Expression in einer ausgewählten Wirtszelle erforderlich ist, wobei darunter auch zusätzliche Bestandteile, deren Vorhandensein vorteilhaft ist, zu verstehen sind, zum Beispiel Leader- Sequenzen und Fusionspartnersequenzen.
• "Operativ verknüpft" oder verwandte Begriffe wie "operative Assoziation" beziehen sich auf die Beziehung zwischen den so beschriebenen Teilen, die es ihnen ermöglicht, auf die ihnen zukommende Weise zu funktionieren. Eine mit einer codierenden Sequenz "operativ verknüpfte" Kontrollsequenz ist so ligiert, daß die Codiersequenz unter mit den Kontrolisequenzen kompatiblen Bedingungen exprimiert werden kann.
• Bei einem "offenen Leseraster" (OLR) handelt es sich um eine Polynukleotidsequenzregion, die für ein Polypeptid codiert. Diese Region kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder auch die gesamte codierende Sequenz darstellen.
• Bei einer "codierenden Sequenz" handelt es sich um eine Polynukleotidsequenz, die in ein Polypeptid translatiert wird, üblicherweise über die mRNA, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz sind durch ein Translationsstartcodon am 5'-Ende und ein Translationsstopcodon am 3'-Ende festgelegt. Eine Codiersequenz kann cDNA und rekombinante Polynukleotidsequenzen beinhalten, ist jedoch nicht hierauf beschränkt.
• "PCR" bezieht sich auf die bei Saiki et al., Nature, 324:163 (1986); US-Patent Nr. 4 683 195 und US-Patent Nr. 4 683 202 beschriebene Technik der Polymerase-Kettenreaktion. Unter diesem Akronym sind auch andere bekannte PCR-Modifizierungen zu verstehen.
• Im vorliegenden Zusammenhang ist x "heterolog" zu y, wenn x nicht auf gleiche Weise mit y natürlich assoziiert ist, d.h. x ist mit y in der Natur nicht assoziiert, oder x ist mit y nicht in der gleichen Weise wie in der Natur assoziiert.
• Unter den Ausdrücken "rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zellinien", "Zellkulturen" und anderen derartigen Ausdrücken versteht man ausgewählte Wirtszellen, z.B. Säugetier-, Insekten- oder Mikroorganismenzellen, die als Rezipienten für einen rekombinanten Vektor oder andere Arten von Transfer-DNA verwendet werden können oder so verwendet wurden. Zu diesen Ausdrücken gehört die Nachkommenschaft der Ausgangszelle, die transformiert worden ist. Es ist bekannt, daß die Nachkommenschaft einer einzelnen Eltemzelle morphologisch oder in Bezug auf den Genom- oder Gesamt-DNA- Gehalt nicht unbedingt mit dem Ausgangselter vollständig identisch sein müssen, und zwar aufgrund natürlicher, zufälliger oder absichtlicher Mutation.
• Der Ausdruck "Mikroorganismus" beinhaltet im vorliegenden Zusammenhang prokaryontische und eukaryontische Arten von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze. Zu den Pilzen gehören Hefe und fadenförmige Pilze. Säugetierzellen und Insektenzellen sind von dem Begriff "Mikroorganismus" ausdrücklich ausgeschlossen. Bei "Säugetierzellen" handelt es sich um Zellen eines Angehörigen der Klasse Mammalia; Mikroorganismenzellen und Insektenzellen sind ansdrücklich ausgeschlossen. Insektenzellen und kompatible Vektoren, die als rekombinante Expressionssysteme genutzt werden können, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Dazu gehören zum Beispiel Insektenexpressions- und -transfervektoren, die von dem Baculovirus Autographa californica-Kernpolyeder virus (im folgenden "AcNPV" oder "Baculovirus"), das ein helferunabhängiger Virusexpressionsvektor ist, abgeleitet sind. Bei von diesem System abgeleiteten Virusexpressionsvektoren wird üblicherweise der starke Virus- Polyhedringen-Promoter dazu verwendet, um die Expression heterologer Gene voranzutreiben.
• "Transformation" bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf die Insertion eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für die Insertion verwendeten Verfahren. Beispiele sind die direkte Aufnahme, Transfektion, f-Paarung, Transduktion, Infektion oder Elektroporation. Das exogene Polynukleotid kann in Form eines nichtintegrierten Vektors, zum Beispiel einem Plasmid, erhalten bleiben oder auch in das Wirtsgenom integriert werden.
• Es wurde nun von den Erfindern entdeckt, daß das Enzym PACE in verschiedenen Wirtszellen, darunter Säugetierzellen, Mikroorganismen und Insektenzellen, rekombinant exprimiert werden kann. Bei einem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine einzelne, transformierte Wirtszelle, die PACE exprimiert, verwendet. Eine für PACE codierende Polynukleotidsequenz oder eines ihrer biologisch aktiven Fragmente können in einen Expressionsvektor insertiert und mit für die Expression des Enzyms in der gewählten Wirtszelle geeigneten Expressionskontrollsequenzen operativ verknüpft werden. Die Transformation bzw. Transfektion des Vektors in die gewählte Wirtszelle kann unter Verwendung von Materialien und Verfahren, die üblicherweise für die Einführung von Polynukleotiden in eine Wirtszelle verwendet werden, durchgeführt werden. Zu solchen Verfahren gehören Verpackung des Polynukleotids in ein Virus und Transduktion eine Wirtszelle mit dem Virus oder aus dem Stand der Technik bekannte Transfektionsvorgänge, wie in den US-Patenten Nr. 4 399 216, 4 912 040, 4 740 461 und 4 959 455 beispielhaft angegeben. Der verwendete Transformationsvorgang hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Ist der Vektor in die gewählte Wirtszelle transformiert worden, so wird die Zelle kultiviert, um PACE zu exprimieren.
• Zum Erhalt von PACE-Expression werden rekombinante Wirtszellen, die sich von den Transformanten ableiten, unter Bedingungen, die die Expression der rekombinanten PACE-codierenden Sequenz gestatten, inkubiert. Diese Bedingungen hängen jeweils von der gewählten Wirtszelle ab. Diese Bedingungen sind jedoch leicht für den Durchschnittsfachmann feststellbar.
• Das in der transformierten Wirtszelle exprimierte PACE kann auf verschiedene Weise nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann man es durch enzymatische Aktivität (oder erhöhte enzymatische Aktivität oder verlängerte enzymatische Aktivität) unter Verwendung von fluorogenen Substraten mit einer zwei Basen umfassenden Spaltstelle, für die PACE spezifisch ist, nachweisen. PACE kann auch über seine immunologische Reaktionsfähigkeit mit anti-PACE- Antikörpern nachgewiesen werden.
• PACE kann auf übliche Weise, wenn es intrazellulär gebildet wird, aus der Zelle durch Lyse oder, wenn es sezerniert wird, aus dem Kulturmedium isoliert werden. Bleibt während der Expression die Transmembrandomäne erhalten, so daß sich das PACE in den Wirtszellmembranen befindet, so kann man die Wirtszellen lysieren und die Membranfragmente durch übliche Verfahren isolieren. Diese Fragmente, die PACE angereichert enthalten, können als solche oder an einen bei dem Processing von Vorstufenpolypeptiden verwendeten festen Träger gebunden verwendet werden. Die Zellmembranen können in einem Medium beim optimalen pH dispergiert sein, oder teilchengebundene Membran kann in eine Säule gefüllt werden. Weitere nützliche Zusammenstellungen lassen sich ebenfalls verwenden
• Rekornbinant exprimiertes PACE kann die Spaltungseffizienz eines Vorstufenpolypeptids zwischen den zwei Basen umfassenden Resten Lys-Arg, Lys-Lys oder Arg-Arg, wodurch man die reife Forrn erhält, verbessern. Die Wirkung von rekombinant exprimiertem PACE auf ausgewählte, entweder rekombinante oder natürlich vorkommende, Vorstufenpolypeptide stellt daher ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung dar. Bei dem exprimierten Vorläufer wird es sich um solch einen Vorläufer handeln, der über eine von PACE erkannte Processing-Stelle verfügt.
• Beispielsweise kann das rekombinant exprimierte PACE für die in-vitro-Umwandlung von heterologen Vorstufenpolypeptiden in reife Polypeptide verwendet werden. Lösliches rekombinantes PACE, d.h. ein "truncated" PACE-Polypeptid ohne Transmernbrandomäne, kann extrazellulären (oder konditionierten) Medien, in denen ein Vorstufenprodukt aus der Zelle, in der es exprimiert wird, sezerniert wird, als Reagens zugesetzt werden.
• Ein besonders bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, das zu hohem Expressionsniveau des reifen Proteins führen kann, ist die Coexpression von PACE und einem Proprotein, das solch ein Processing erfordert, wodurch man das reife Protein erhält. Außerdem wurde überraschenderweise von den Erfindern entdeckt, daß die Coexpression von PACE mit Proteinen, die für die biologische Wirkung eine γ-Carboxylierung erfordern, die Expression erhöhter Ausbeuten an funktionellen, biologisch aktiven reifen Proteinen in Eukaryontenzellen, vorzugsweise Säugetierzellen, gestattet.
• Als Beispiele für Vorstufenpolypeptide zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind zu nennen, jedoch nicht als Einschränkung zu verstehen: der transformierende Wachstumsfaktor (TGF) beta und dessen überfamilie, darunter Inhibin und Aktivin; morphogene Proteine aus Knochen (MPK); Insulin und Relaxin; Koagulationsfaktoren, wie z.B. von-Willebrand-Faktor (vWF); Faktor IX, Protein C, Protein S, Prothrombinfaktor 10, Faktor VII sowie gamma-Carboxyglutamatprotein aus Knochen, Wachstumsfaktoren, wie Wachstumsfaktor aus Blutplättchen (WFBP) sowie Wachstumsfaktoren aus Nerven (WFN); sowie Viruspolypeptide, darunter solche des Cytomegalievirus (CMV), Hepatitis-delta-Virus (HDV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Human-Ixnmundefizienz-Virus (HIV) sowie Herpes-Simplex-Virus (HSV). Jedes beliebige Vorstufenpolypeptid mit mindestens einer zwei Basen umfassenden Spaltstelle kommt für die vorliegende Erfindung in Frage.
• Bei der Herstellung eines gewünschten reifen Polypeptids mittels Coexpression mit PACE kann man sich unter anderem folgender Verfahren bedienen. Erstens kann man einen einzelnen Vektor, der Codiersequenzen sowohl für PACE als auch das heterologe Vorstufenpeptid enthält, in eine ausgewählte Wirtszelle insertieren. Man kann jedoch auch zwei getrennte Vektoren, die jeweils für PACE bzw. das heterologe Vorstufenpolypeptid codieren, in einen Wirt insertieren. Wird die gewählte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert, so werden die zwei Polypeptide produziert und stehen miteinander in Wechselwirkung, wodurch das Proprotein in das reife Protein gespalten wird.
• Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von zwei transformierten Wirtszellen, bei denen eine Wirtszelle lösliches rekombinantes PACE exprimiert, während die andere Wirtszelle das heterologe Vorstufenpolypeptid, das in das Medium sezerniert werden wird, exprimiert. Diese Wirtszellen können unter Bedingungen, die die Expression und Sekretion bzw. Freisetzung des rekombinanten PACE als auch die Expression, Sekretion oder Freisetzung des Vorstufenpolypeptids sowie dessen Spaltung in die reife Form durch das extrazelluläre PACE gestatten, cokultiviert werden. Bei diesem Verfahren bevorzugt man das PACE-Polypeptid ohne die Transmembrandomäne, so daß es in das Medium sezerniert.
• In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, über mehrere Kopien, nämlich zwei oder mehr, des die Expressionsproduktvorstufe exprimierenden Gens relativ zu dem PACE-Gen,, oder umgekehrt zu verfügen. Dies kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Man kann zum Beispiel getrennte Vektoren oder Plasmide verwenden, wenn der das für PACE codierende Polynukleotid enthaltende Vektor über eine höhere Kopienzahl verfügt als der die für das heterologe Vorstufenpolypeptid codierende Polynukleotidsequenz enthaltende Vektor, oder umgekehrt. Ist dies der Fall, so wäre es wünschenswert, über unterschiedliche Marker auf den zwei Plasmiden zu verfügen, um die Beibehaltung des Plasmids in dem Wirt weiter zu garantieren. Es ist jedoch auch möglich, daß eines oder beide Gene in das Wirtsgenom integriert werden, und eines dieser Gene könnte mit einem amplifizierenden Gen assoziiert sein (z.B. dhfr oder eines der Metallothionein-Gene).
• Man könnte jedoch auch zwei transkriptionsregulatorische Regionen mit unterschiedlichen Transkriptionsinitiationsgeschwindigkeiten verwenden, wodurch man entweder das PACE-Gen oder das Vorstufenpolypeptid verstärkt (relativ zu dem anderen Gen) exprimiert. Eine weitere Möglichkeit wäre die Verwendung von unterschiedlichen Promotern, wobei ein Promoter fur ein niedriges Niveau der konstitutiven Expression von entweder PACE oder dem Vorstufenpolypeptid sorgt, während der zweite Promoter für ein hohes Niveau an induzierter Expression des anderen Produkts sorgt. Für die ausgewählten Wirtszellen sind verschiedenste Promoter bekannt und können vom Fachmann leicht für die Erfindung ausgewählt und verwendet werden.
• Durch Verwendung dieser Verfahren kann die natürliche Menge an PACE stark erhöht und/oder die Proteaseaktivität verlängert werden, wodurch die Expressionsproduktvorstufe einem wirksameren Processing unterzogen wird.
A. Expression von PACE in Säugetieren
• Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können dadurch durchgeführt werden, daß man eine für PACE oder eines seiner Fragmente codierende Polynukleotidsequenz in einen geeigneten Säugetier-Expressionsvektor insertiert. Der PACE-haltige Vektor wird dann in eine ausgewählte Säugetierzellinie transformiert. Die Schaffung von Zelllinien, die PACE exprimieren, stellt einen bequemen, wirksamen Mechanismus für die Produktion hoher PACE-Mengen sowie für die Produktion von stärker weiterverarbeiteten biologisch aktiven Proteinen dar.
• Bei Verfahren, bei denen PACE und ein Vorstufenpolypeptid coexprimiert werden, kann ein einzelner Vektor die PACE-DNA enthalten und ein anderer Vektor kann die gewählte Vorstufen-DNA enthalten, wobei jede unter der Kontrolle einer gewählten Expressionskontrollsequenz steht. Es können jedoch auch sowohl PACE- als auch Vorstufen-DNA-Sequenz auf einem einzigen rekombinanten Vektormolekül vorliegen, wobei sie hier operativ mit den jeweiligen Expressionskontrollsequenzen verknüpft sein können oder eine gemeinsame Expressionskontrollsequenz teilen können. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß ein die PACE-DNA enthaltender Vektor in eine Wirtszellinie transfiziert wird, von der bekannt ist, daß sie das gewünschte Proprotein exprimiert, oder ein Vektor, der die DNA für das gewünschte Protein enthält, kann in eine Zelle transfiziert werden, von der bekannt ist, daß sie PACE exprimiert.
• Bei der Konstruktion der Vektoren werden aus dem Stand der Technik bekannte Techniken verwendet. Die bei solch einer Konstruktion verwendete sequenzspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandeln mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen durchgeführt, die im allgemeinen vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Enzyme angegeben sind.
• Bei einem geeigneten Expressionsvektor handelt es sich um einen, der mit der gewünschten Funktion (z.B. vorübergehende Expression, Dauerexpression, Integration, Replikation, Amplifikation) kompatibel ist und in der die Kontrollelemente mit der Wirtszelle kompatibel sind. Im allgemeinen enthalten die verwendeten Vektoren ausgewählte Regulatorsequenzen, die mit den DNA-Codiersequenzen PACE und der gewählten Vorstufe operativ verknüpft sind und zur Kontrolle der Replikation und deren Expression in ausgewählten Wirtszellen fähig sind.
• Vektoren, die sich für die Replikation in Säugetierzellen eignen, sind zum Beispiel Viren-Replikationseinheiten, oder Sequenzen, die die Integration der für PACE codierenden Sequenz in das Wirtsgenom garantieren. Zu diesen geeigneten Vektoren können zum Beispiel solche gehören, die sich von dem Simian-Virus SV40, Retroviren, Rinder-Papillomavirus, Vacciniavirus und Adenovirus ableiten. Die Bestandteile des Vektors, z.B. Replikationseinheiten, Selektionsgene, Enhancer, Promoter usw., können aus natürlichem Ausgangsmaterial stammen oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden (siehe Kaufman et al, J. Mol. Biol. 159:511-521 (1982); und Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:689-693 (1985)].
• Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist ein von Vacciniaviren abgeleiteter Vektor. Hier ist die heterologe DNA in das Vaccinia-Genom insertiert. Die Techniken, mit denen Fremd-DNA in das Vacciniavirus-Genom insertiert werden, sind in der Fachwelt bekannt; zum Beispiel wird homologe Rekombination verwendet. Die heterologe DNA wird im allgemeinen in ein Gen insertiert, das unwesentlicher Art ist, zum Beipiel das Thymidin- Kinase-Gen (tk), das auch als selektierbarer Marker dient. Plasmid-"Shuttle"-Vektoren, die die Konstruktion rekombinanter Viren wesentlich erleichtern, sind bereits beschrieben worden [siehe zum Beispiel Mackett et al. (1984), Chakrabarti et al. (1985); Moss (1987)1. Die Expression des heterologen Polypeptids findet dann in Zellen oder Individuen, die mit dem lebenden rekombinan ten Vacciniavirus immunisiert sind, statt.
• eeignete Säugetier-Expressionsvektoren enthalten üblicherweise eine oder mehrere Eukaryonten-Transkriptionseinheiten, die zur Expression in Säugetierzellen fähig sind. Die Transkriptionseinheit hat mindestens ein Promoterelement, das die Transkription von Fremd-DNA- Sequenzen vermittelt. Promoter, die sich für Säugetierzellen eignen, sind in der Fachwelt bekannt, darunter Viruspromoter, wie der des Simian-Virus 40 (SV40), cytomegalievirus (CMV), Rous-Sarcom-Virus (RSV), Adenovirus (ADV) sowie Rinderpapillomavirus (BPV).
• Außerdem kann die Transkriptionseinheit auch noch eine Terminationssequenz und poly(A)-Additionssequenzen, die mit der bzw. den für PACE und/oder die Vorstufe codierende(n) Sequenz(en) operativ verknüpft sind., haben. Die Transkriptionseinheit kann auch eine Enhancer-Sequenz haben, die die Expression von PACE und/oder der Vorstufe verstärkt.
• Durch das gegebenenfalls vorhandene Enhancer Element (Enhancer) in Kombination mit den oben beschriebenen Promotereiten wird das Expressionsniveau typischerweise erhöht. Bei einem Enhancer handelt es sich um eine beliebige regulatorische DNA-Sequenz, die, wenn mit einem endogenen oder heterologen Promoter verknüpet, die Transkription bis auf das Tausendfache stimulieren kann, wobei die Synthese an der normalen mRNA-Startsequenz beginnt. Enhancer wirken auch dann, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts vom Transkriptionsstart liegen, und zwar entweder in normaler oder umgekehrten. Orientierung, oder in einem Abstand zum Promoter von über 1000 Nukleotiden [Maniatis et al. Science, 236:1237 (1987); Alberts et al., Molecular Biolocy of the Cell. [Molekularbiologie der Zelle], 2. Ausg. (1989)]. Von Viren abgeleitete Enhancer-Elemente können besonders nützlich sein, da sie üblicherweise über einen breiteren Wirtsgrad verfügen. Dazu gehören zum Beispiel der Enhancer des frühen Gens von SV40 [Dijkema et al., EMBO J, 4:761 (1985)] und die von der langen terminalen Sequenzwiederholung (LTR) des Rous-Sarcom-Virus [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777 (1982b)] und von dem Human- Cytomegalievirus [Boshart et al., Cell, 41:521 (1985)] abgeleiteten Enhancer/Promoter. Außerdem sind einige Enhancer regulierbar und werden nur bei Vorhandensein eines Induktors, z.B. eines Hormons oder eines Metallions [Sassoni-Corsi und Borelli, Trends Genet. 2:215 (1986); Maniatis et al. Science, 236:1237 (1987)] aktiv.
• Sequenzen, die eine Amplifizierung des Gens bewirken, können ebenfalls wünschenswert sein, wie auch Sequenzen, die für selektierbare Marker codieren. Selektierbare Marker für Säugetierzellen sind in der Fachwelt bekannt, darunter zum Beispiel Thymidinkinase, Dihydrofolatreduktase (gemeinsam mit Methotrexat als DHFR- Amplifizierungsmittel), Aminoglycosid-Phosphotransferase, Hygromycin-B-Phosphortransferase, Asparaginsynthetase, Adenosindesaminase, Metallothionien, sowie Gene für Antibiotikaresistenz, wie Neomycin.
• Die Vektor-DNA kann aber auch ganz oder teilweise das Rinderpapillomavirus-Genom Elusky et al, Cell, 36:391-401 (1984)] enthalten und in Zellinien wie C127-Mauszellen als stabiles episomales Element vorliegen.
• Bei dem in den unten stehenden Beispielen verwendeten Vektor handelt es sich um pMT3, einem Abkömmling des oben beschriebenen Vektors pMT2. Der Fachmann kann auch andere Säugetier-Expressionsvektoren konstruieten, die mit dem pMT3-PACE-Vektor vergleichbar sind (siehe Beispiel 1), z.B. dadurch, daß er die DNA-Sequenz von PACE aus pMT3 in einen anderen Vektor wie pJT3 oder pJT4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)] unter Verwendung gut bekannter rekombinationsgentechnischer Verfahren insertiert. Die im vorliegenden Text beschriebenen Säugetierzell-Expressionsvektoren können mittels Techniken, die in der Fachwelt gut bekannt sind, synthetisiert werden. Weitere geeignete Expressionsvektoren für Expression in Säugetieren, von denen in der Fachwelt eine Vielzahl bekannt ist, können ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
• Für die Transformation einer geeigneten Säugetierwirtszelle kann man einen oder mehrere ausgewählte(n) für PACE und/oder das Vorstufenpolypeptid codierende(n) Vektor(en) verwenden. Verfahren für die Einführung von heterologen Polynukleotiden in Säugetierzellen sind in der Fachwelt bekannt, darunter dextranvermittelte Transfektion, Fällung mit Calciumphosphat, polybrenvermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einkapselung des Polynukleotids bzw. der Polynukleotide in Liposomen sowie direkte Mikroinjektion von DNA in Zellkerne.
• Säugetierzellinien, die als Expressionswirte zur Verfügung stehen, sind in der Fachwelt bekannt, darunter viele immortalisierte Zellinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind. Zu den Säugetierwirtszellen gehören zum Beispiel insbesondere Primatenzellinien sowie Nagetierzellinien, darunter auch transformierte Zellinien. Für die stabile Integration der Vektor-DNA und die anschließende Amplifizierung der integrierten Vektor-DNA, die beide auf konventionellem Weg durchgeführt werden, werden vorzugsweise Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) als Säugetierwirtszelle der Wahl verwendet. Zu den anderen geeigneten Zelllinien gehören HeLa-Zellen, Junghamster-Nierenzellen (BHK), Affennierenzellen (COS-1), menschliche Leberzellkarzinomzellen (z.B. Hep G2), mit Humanadenovirus transformierte 293-Zellen, Maus-L-929-Zellen, HaK-Hamsterzelllinien, Maus-3T3-Zellen aus Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen sowie verschiedene andere Zellinien, was jedoch nicht als Beschränkung aufzufassen ist. Eine weitere geeignete Säugetierzellinie ist die Zellinie CV-1. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die sich von in-vitro-kultiviertem Primärgewebe ableiten sowie Primärexplantate sind ebenso geeignet. In Frage kommende Zellen können für das Selektionsgen genotypisch defizient sein oder können ein sich dominant verhaltendes Selektionsgen enthalten.
• Die Auswahl geeigneter Säugetierzellinien sowie Trans formations-, Kultur-, Amplifikations-, Screeningsowie Produktproduktions- und -reinigungsverfahren sind in der Fachwelt bekannt. Siehe z.B. Gething und Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981), oder auch Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985), oder Howley et al., US-Patent Nr. 4 419 446.
• Die Wirtszellen, die mit dem die PACE-DNA tragenden Vektor bzw. den die PACE-DNA tragenden Vektoren transformiert wurden, sowie die gewählte Vorstufen-DNA werden selektiert, z.B. auf übliche Weise, und können dann unter geeigneten Bedingungen gegebenenfalls unter Amplifikation eines oder beider eingeführter Gene kultiviert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man eine geeignete Zelle oder Zellinie, die mit einer für PACE codierenden DNA-Sequenz und einer für die gewählte Vorstufe codierenden DNA- Sequenz transformiert worden ist, kultiviert, wobei jede codierende Sequenz unter der Kontrolle einer transkriptionsregulatorischen Sequenz steht. Das exprimierte reife Protein wird sodann mit geeigneten Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, aus dem Kulturmedium (oder, falls intrazellulär exprimiert, aus der Zelle) gewonnen, isoliert und gereinigt.
• Bezüglich der γ-carboxylierten Proteine wird zur Zeit in der Theorie erwogen, daß die Expression von PACE in Säugetierzellen die Wirksamkeit von γ-Carboxylierung, einer postranslationellen Modifikation, die für die biologische Wirksamkeit gewisser reifer Proteine erforderlich ist, erhöht. Das Verfahren ist insbesondere bei dem Processing von Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsproteinen nützlich. Insbesondere ist das Verfahren bei dem Processing und der γ-carboxylierung von anderen Proteinen, darunter Protein C, Protein S, Prothrombin faktor IX, Faktor VII, Faktor X sowie γ-Carboxyglutamatprotein aus Knochen, nützlich. So gestattet zum Beispiel die Coexpression von PACE mit solch einem Propeptid ein hohes rekombinantes Expressionsniveau von biologisch aktiven reifen Proteinen.
• Außerdem läßt sich ein hohes Niveau an rekombinanter Expression funktioneller Proteine auch durch Verwendung des vorliegenden Verfahrens erzielen, indem man PACE mit Proteinen, die einem stärkeren Processing unterzogen worden sind und die von anderen Genen exprimiert werden, exprimiert. So kann zum Beispiel die Coexpression von PACE mit nicht-Vitamin-K-abhängigen Propeptiden, die für biologische Wirksamkeit zwar eine Spaltung, aber keine γCarboxylierung erfordern, hohe Ausbeuten an funktionellen reifen Proteinen liefern.
• Eines dieser Proteine, die durch das vorliegende Verfahren in hohen funktionellen Ausbeuten exprimiert werden können, ist das morphogene Protein aus Knochen (BMP), insbesondere BMP-2 (siehe z.B: E. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2220-2224 (1990)1. Zu weiteren solchen Proteinen, die durch die vorliegende Erfindung in hohen funktionellen Ausbeuten produziert werden können, gehören der Tumorwachstumsfaktor β (TGF-β), der Wachstumsfaktor aus Blutplättchen (PDGF) sowie die oben im einzehen angeführten Vorstufen.
• Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung von auf rekombinantem Weg erhaltenen PACE für das in-vitro-Processing von Nervenwachstumsfaktor sowie monobasischem Propiomelanocortin. PACE kann auch beim Processing von Proteinen wie z.B. Insulin und bei der Reifung von Viren, wie z.B. HIV und Hepatitis C, die ebenfalls ein Processing der Vorstufe an paarweise auftretenden basischen Aminosäureresten erfordern, nützlich sein.
• Während Säugetierzellen als Wirte für die Coexpression von PACE und einem Säugetier-Proprotein bevorzugt werden, wird angenommen, daß Mikroorganismen- und Insektenzellen geeignete Wirte für solch eine Expression von PACE und Säugetier-Proproteinen sowie gewünschtenfalls für die Expression von aus Mikroorganismen oder Insekten stammenden Proproteinen sein können.
B. Expression von PACE in Mikroorganismenzellen
• Das PACE-Gen oder eines seiner Fragmente kann in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Mikroorganismensystem wie z.B. Pilzen, darunter Hefe, oder Bakterien exprimiert werden. Zu den Fragmenten können z.B. "truncated"-Formen des PACE-Gens gehören. Zu "truncation" gehört z.B. die Deletion der Transmexnbranregion und/oder der cysteinreichen Region, was jedoch nicht als Begrenzung aufzufassen ist.
• Für pilzliche Expressionssysteme können sowohl Hefe als auch fadenförmige Pilze als Wirte verwendet werden. Expressionssysteme mit fadenförmigen Pilzen sind zum Beispiel Aspergillus, wie in EPO Veröff. Nr. 357 127 beschrieben (am 7. März 1990 veröffentlicht), sowie Acremonium chrysogenum, beschrieben in EPO Veröff. Nr. 376 266 (am 4. Juli 1990 veröffentlicht).
• Zu einem Hefeexpressionssystem können typischerweise ein oder mehrere der folgenden Bestandteile gehören: Promotersequenz, Fusionspartnersequenz, Leader Sequenz sowie Transkriptionsterminationssequenz. Diese Elemente können zu einer Expressionskassette kombiniert werden, die in einem Replikon, vorzugsweise mit einem selektierbaren Marker, bewahrt werden kann.
• Bei einem Hefepromoter handelt es sich um eine beliebige DNA-Sequenz, die zur Bindung von Hefe-RNA- Polymerase und Initiation der Transkription einer Codiersequenz (z.B. eines Strukturgens) stromabwärts (3') in mRNA fähig ist. Ein Promoter verfügt über eine Transkriptionsinitiationsregion, die sich üblicherweise proximal vom 5'-Ende der Codiersequenz befindet. Diese Transkriptionsinitiationsregion enthält typischerweise eine Bindungsstelle für RNA-Polymerase ("TATA-Box") sowie einen Transkriptionsstart. Ein Hefepromoter kann auch über eine zweite Domäne verfügen, die als stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenz (UAS) bezeichnet wird und die bei Vorhandensein üblicherweise distal von dem Strukturgen liegt. Die UAS gestattet eine regulierte (induzierbare) Expression. Konstitutive Expression findet bei Abwesenheit einer UAS statt. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder gefördert oder verringert wird.
• Bei der Hefe handelt es sich um einen Gärer mit einem aktiven Stoffwechselablauf, weshalb Sequenzen, die für Enzyme des Stoffwechselablaufs codieren, besonders nützliche Promotersequenzen darstellen. Dies sind z.B. Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPO Veröff. Nr. 284044), Enolase, Glycokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, Glycerolaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP bzw. GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase sowie Pyruvatkinase (PyK) (EPO Veröff. Nr. 329203). Das für saure Phosphatase codierende Hefegen PH05 stellt ebenfalls nützliche Promotersequenzen zur Verfügung [Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:1 (1983)].
• Außerdem agieren auch synthetische Promoter, die nicht natürlich vorkommen, als Hefepromoter. So können zum Beispiel die UAS-Sequenzen eines Hefepromoters mit der Transkriptionsaktivierungsregion eines anderen Hefepromoters verbunden werden, wodurch man einen synthetischen Hybridpromoter erhält. Solch ein Hybridpromoter ist z.B. die mit der GAP-transkriptions aktivierenden Region verbundene ADH-Regulatorsequenz [US-Patente Nr. 4 876 197 und 4 680 734]. Weitere Beispiele von Hybridpromotern sind Promoter, die aus den Regulatorsequenzen der Gene ADH2, GAL4, GAL10 oder PHO5 in Kombination mit der transkriptionsaktivierenden Region eines Gens für glycolytische Enzyme, wie z.B. GAP oder PyK, bestehen [EPO Veröff. Nr. 164556]. Außerdem gehören zu den Hefepromotern natürlich vorkommende Promoter, die nicht aus Hefe stammen und die Hefe-RNA-Polymerase binden und die Transkription initiieren können. Zu solchen Promotern gehören unter anderem [Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11:1078 (1980); Henikoff et al., Nature 283:835 (1981); Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96:119 (1981); Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae" [Expression bakterieller Antibiotikareesistenzgene der Hefe Saccharomyces cerevisiae] in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance [Medizinisch, ökologisch und wirtschaftlich wichtige Plasmide] (Hrsg. K.N. Timmis und A. Puhler, 1979); Mercerau-Puigalon et al., Gene, 11:163 (1980); und Panthier et al., Curr. Genet., 2:109 (1980)].
• Das PACE-Gen oder eines seiner Fragmente kann intrazellulär in Hefe exprimiert werden. Eine Promotersequenz kann direkt mit dem PACE-Gen oder einem seiner Fragmente verbunden sein, wobei es sich bei der ersten Aminosäure am N-terminalen Ende des rekoxnbinanten Proteins immer um Methionin handeln wird, das von dem ATG-Startcodon codiert wird. Falls erwünscht, kann das Methionin vom Protein am N-terminalen Ende durch invitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
• Intrazellulär exprimierte Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression des PACE-Gens oder Fragments dar. Eine für den N-terminalen Teil eines stabilen Proteins codierende DNA-Sequenz, ein Fusions partner, ist typischerweise mit dem 5'-Ende der für das gewünschte Polypeptid codierenden heterologen DNA fusioniert. Bei Expression liefert dieses Konstrukt ein Fusionsprodukt aus den beiden Aminosäuresequenzen. So kann zum Beispiel das Hefe- oder Human-Superoxiddismutase-Gen (SOD-Gen) mit dem 5-terminalen Ende des PACE-Gens oder einem seiner Fragmente verbunden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Amionsäuresequenzen codiert gegebenenfalls für eine spaltbare Stelle. Siehe z.B. EPO Veröff. Nr. 196056. Ein Ubiquitin-Fusionsprotein stellt ein weiteres Beispiel dar. Bei solch einem Ubiquitin- Fusionsprotein bleibt vorzugsweise eine Stelle für ein Processing-Enzym (z.B. Ubiquitin-spezifische Processing- Protease) beibehalten, um das Ubiquitin von dem PACE-Polypeptid abzuspalten. Auf diese Weise kann so ein reifes PACE-Polypeptid isoliert werden [siehe PCT Wo 88/024066].
• PACE-Polypeptide können jedoch auch aus der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden, und zwar dadurch, daß man chimerische DNA-Moleküle schafft, die für ein Fusionsprotein mit einem Leader-Sequenz-Fragment codieren, das für die Sekretion des PACE-Polypeptids in Hefe sorgt. Zwischen dem Leader-Fragment und dem PACE-Gen oder einem seiner Fragmente wird vorzugsweise für Processing-Stellen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Typischerweise codiert das Leader-Sequenz-Fragment für ein Signalpeptid mit hydrophoben Aminosäuren, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
• DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann aus Genen für sezernierte Hefeproteine stammen, wie z.B. das Hefe-Invertase-Gen und das A-Faktor-Gen [US-Patent 4 588 684]. Es existieren jedoch auch Leader, die nicht aus Hefe stammen, wie z.B. ein Interferon- Leader, die ebenfalls eine Sekretion in Hefe bewirken
• Bei einer bevorzugten Klasse von Sekretions Leadern liegt ein Fragment des Hefe-Gens für alpha-Faktor vor, das sowohl eine "Prä"-Signalsequenz als auch eine "Pro"-Region enthält. Verwendbare Arten von alpha-Faktor- Fragmenten sind z.B. der vollständige Prä-Pro-alpha- Faktor-Leader (ungefähr 83 Aminosäurereste) sowie "truncated" alpha-Faktor-Leader (typischerweise ca. 25 bis ca. 50 Aminosäurereste). Zu weiteren Leadern, bei denen ein alpha-Faktor-Leaderfragment, das für Sekretion sorgt, verwendet wird, gehören Hybrid-alpha-Faktor-Leader mit einer Prä-Sequenz einer ersten Hefe, jedoch einer Pro-Region aus einem zweiten Hefe-alpha-Faktor. Siehe z.B. PCT WO 89/02463.
• Von Hefe erkannte Transkriptionsterminationssequenzen sind typischerweise regulatorische Regionen, die sich in Richtung 3' vom Translationsstoppcodon befinden und auf diese Weise zusammen mit dem Promoter die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen kontrollieren die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele einer Transkriptionsterminationssequenz und anderer von Hefe erkannter Terminationssequenzen, wie z.B. die für glykolytische Enzyme codierenden Sequenzen, sind dem Fachmann bekannt.
• Die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promoter, (gewünschtenfalls) Leader zweckdienlichen codiersequenzen und Transkriptionsterminationssequenz umfassen, werden üblicherweise zusammen in Expressionskonstrukte eingefügt. Expressionskonstrukte oder Kassetten werden häufig in einem Replikon erhalten, zum Beispiel einem extrachromosomalen Elememt (z.B. Plasmide), die sich zur stabilen Erhaltung in einem Wirt, wie zum Beispiel Hefe oder Bakterien, eignen. Das Replikon kann über zwei Replikationssysteme verfügen, wodurch es zum Beispiel in Hefe für Expressionszwecke und in einem prokaryontischen Wirt für Klonierungs- und Amplifikationszwecke erhalten werden kann. Zu solchen Hefe- Bakterien-"Shuttle"-Vektoren gehört YEp24 [Botstein et al., Gene, 8:17-24 (1979)1, pCl/1 (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4642-4646 (1984)] und YRP17 (Stinchcomb et al., J. Mol. Biol., 158:157 (1982)]. Außerdem kann es sich bei einem Replikon entweder um ein Plasmid mit hoher oder mit niedriger Kopienzahl handeln. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl verfügt üblicherweise über eine Kopienzahl von ca. 5 bis ca. 200, typischerweise ca. 10 bis ca. 150. Ein Wirt mit einem Plasmid in hoher Kopienzahl verfügt bevorzugt über mindestens ca. 10, besonders bevorzugt mindestens ca. 20 Kopien. Je nach der Wirkung auf den Wirt des Vektors und die PACE Polypeptide kann man entweder einen Vektor mit hoher oder mit niedriger Kopienzahl wählen. Siehe z.B. Brake et al., Zitat oben.
• Die Expressionskonstrukte konnen jedoch auch in das Hefegenom mit einem integrierenden Vektor integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten typischerweise zumindest eine Sequenz, die mit einem Hefechromosom homolog ist, welche eine Integration des Vektors gestattet, und enthalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen scheinen das Ergebnis von Rekombinationen zwischen homologer DNA in dem Vektor und dem Hefechromosom zu sein [Orr-Weaver et al., Methods in Enzvmol., 101:228-245 (1983)]. Ein integrierender Vektor kann durch Auswahl der geeigneten homologen Sequenz für Einschluß in den Vektor an einen spezifischen Lokus in der Hefe gesteuert werden. Siehe Orr-Weaver et al., Zitat oben. Es können ein oder mehrere Expressionskonstrukte integriert werden, was möglicherweise die Mengen an produziertem rekombinanten Protein beeinflußt (Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6750 (1983)]. Die in dem Vektor vorliegenden Chromosomen sequenzen können entweder in Form eines einzelnen Segments in dem Vektor vorkommen, was zur Integration des gesamten Vektors führt, oder in Form zweier Segmente, die zu benachbarten Segmenten in dem Chromosom homolog sind und das Expressionskonstrukt in dem Vektor flankieren, was zur stabilen Integration ausschließlich des Expressionskonstrukts führt.
• Extrachromosomale Expressionsvektoren und integrierende Expressionsvektoren können über selektierbare Marker verfügen, die die Selektion von transformierten Hefestämmen gestatten. Zu den selektierbaren Markern gehören biosynthetische Gene, die in dem Hefewirt exprimiert werden können, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7 sowie das G418-Resistenzgen, die Hefezellen mit Resistenz gegen Tunicamycin bzw. G418 ausstatten. Außerdem kann ein geeignete selektierbarer Marker Hefe mit der Fähigkeit ausstatten, in der Gegenwart toxischer Verbindungen, wie z.B. Metallen, wachsen zu können. So gestattet zum Beispiel das Vorhandensein von CUP1 Hefen, in der Gegenwart von Kupferionen zu wachsen [Butt et al., Microbiol. Rev., 51:351 (1987)].
• Es können jedoch auch mehrere der oben beschriebenen Bestandteile zusammen in Transformationsvektoren eingebracht werden. Transformationsvektoren enthalten typischerweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replikon erhalten wird oder in einen integrierenden Vektor wie oben beschrieben weiterentwickelt wird.
• Expressions- und Transformationsvektoren, und zwar entweder extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, wurden für die Transformation in viele Hefen entwickelt z.B. wurden bisher Transkriptionsvektoren u. a. für folgende Hefen entwickelt: Candida albicans [Kurtz, et al., Mol. Cell. Biol., 6:142 (1986)], Candida maltosa [Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25:141 (1985)1; Hansenula polymorpha [Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986); Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202:302 (1986)]; Kluyveromyces fragilis [Das et al., J. Bacteriol. 158: 1165 (1984)]; Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154:737 (1983); Van den Berg et al., Bioltechnobav 8:135 (1990)1; Pichia guillerimondii [Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25:141 (1985)1; Pichia pastoris [Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5:3376 (1985); US-Patente 4 837 148 und 4 929 5551; Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978)]; Ito et al., J. Bacteriol. 153:163 (1983)1; Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature 300:706 (1981) und Yarrowia lipolytica [Davidow, et al., Curr. Genet. 10:380471 (1985) und Gaillardin et al., Curr. Genet. 10:49 (1985)].
• Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Hefewirte sind im Stand der Technik gut bekannt; dazu gehört typischerweise entweder die Transformation von Spheroplasten oder von mit Alkali-Kationen behandelten intakten Hefezellen. Die Transformationsverfahren unterscheiden sich normalerweise je nach zu transformierender Hefeart. Siehe z.B. Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6:142 (1986); Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25:141 (1985) für Candida. Siehe z.B. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986); Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202:302 (1986) für Hansenula. Siehe z.B. Das et al., J. Bacteriol. 158:1165 (1984); De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154:1165 (1983); Van den Berg et al., Bioltechnobav 8:135 (1990) für Kluyveromyces. Siehe z.B. Bio/Ttechnology 8:135 (1990) für Kuyveromyces. Siehe z.B. Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5:3376 (1985); Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25:141 (1985); US-Patente 4 837 148 sowie 4 929 555 für Pichia. Siehe z.B. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978); Ito et al., J. Bacteriol. 153:163 (1983) für Saccharomyces. Siehe z.B. Beach und Nurse, Nature 300:706 (1981) für Schizosaccharomyces. Siehe z.B. Davidow et al., Curr. Genet. 10:39 (1985); Gaillardin et al., Curr. Genet. 10:49 (1985) für Yarrowia.
• Außerdem kann das PACE-Gen oder eines seiner Fragmente in einem bakteriellen System exprimiert werden. Hier ist ein bakterieller Promoter eine beliebige DNA-Sequenz, die zur Bindung von bakterieller RNA-Polymerase und Initiation der Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. eines Strukturgens) in mRNA stromabwärts (3") fähig ist. Ein Promoter verfügt über eine Transkriptionsinitiationsregion, die sich üblicherweise proximal vom 5'-Ende der Codiersequenz befindet. Diese Transkriptionsinitiationsregion enthält typischerweise eine Bindungsstelle für RNA-Polymerase sowie einen Transkriptionsstart. Ein bakterieller Promoter kann auch über eine zweite Domäne, die als Operator bezeichnet wird, verfügen, und diese zweite Domäne kann mit einer benachbarten RNA-Polymerasebindungsstelle, an der die DNA-Synthese beginnt, überlappen. Der Operator gestattet eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Genrepressorprotein an den Operator binden und so die Transkription eines spezifischen Gens inhibieren kann. Bei Fehlen negativ regulatorischer Elemente, wie z.B. dem Operator, kann konstitutive Expression stattfinden. Außerdem kann eine positive Regulation durch eine Genaktivatorprotein-Bindungssequenz erzielt werden, die sich - wenn vorhanden - normalerweise proximal (5') von der RNA-Polymerasebindungsstelle befindet. Solch ein Genaktivatorprotein ist zum Beispiel das Katabolit-Aktivatorprotein (CAP), das die Initiation der Transkription des lac-Operons in Escherichia coli unterstützt {Raibaud et al., Annu. Rev. Genet. 18:173 (1984)]. Die regulierte Expression kann so entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder gefördert oder verringert wird.
• Sequenzen, die für Stoffwechselablaufenzyme codieren, stellen besonders nützliche Promotersequenzen dar. Solche Promotersequenzen sind zum Beispiel von Enzymen abgeleitet, die Zucker metabolisieren, wie z.B. Galactose, Lactose (lac) [Chang et al., Nature 198:1056 (1987)] sowie Maltose. Dazu gehören weiterhin Promoter sequenzen, die sich von biosynthetischen Enzymen ableiten, z.B. Tryptophan (trp) [Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8:4057 (1980); Yelverton et al., Nucl. Acids Res. 9:731 (1981); US-Patent 4 738 921; EPO Veröff. Nr. 36 776 und 121 775]. Das β-Lactomase-(bla)-Promotersystem [Weissman, "The aloning of Interf eron and Other Mistakes" (Klonieren von Interferon und andere Fehler] in Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser, 1981)] sowie die Promotersysteme der Bakteriophagen Lambda PL [Shimatake et al., Nature 292:128 (1981)] und T5 (US-Patent 4 689 406] liefern ebenfalls nützliche Promotersequenzen.
• Außerdem agieren synthetische Promoter, die nicht in der Natur vorkommen, ebenfalls als bakterielle Promoter. So können zum Beispiel die Transkriptions aktivationssequenzen eines Bakterien- oder Bakteriophagenpromoters mit den Operon-Sequenzen eines anderen Bakterien- oder Bakteriophagenpromoters verbunden werden, wodurch ein synthetischer Hybridpromoter geschaffen wird [US-Patent 4 551 433]. So ist z.B. der tac-Promoter ein trp-lac-Hybridpromoter mit sowohl den trp-Promoter- als auch den lac-Operon-Sequenzen, der vom lac-Repressor reguliert wird [Amann et al., Gene 25:167 (1983); de Boer et al., Proc. Natl. Acad Sci. 80:21 (1983)]. Außerdem können zu den bakteriellen Promotern natürlich vorkommende Promoter nichtbakteriellen Ursprungs zählen, die bakterielle RNA-Polymerase binden und die Transkription initiieren können. Ein natürlich vorkommender Promoter nichtbakterieller Herkunft kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionsniveaus gewisser Gene in Prokaryonten zu erzeugen. Ein Beispiel eines gekoppelten Promotersystems ist das RNA-Polymerase-Promoter-System des Bakteriophagen T7 [Sturdier et al., J. Mol. Biol. 18:113 (1986); Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci 82:1074 (1985)]. Außerdem kann ein Hybridpromoter aus einem Bakteriophagenpromoter und einer E. coli-Operatorregion bestehen (EPO Veröff. Nr. 267 851].
• Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotersequenz ist auch eine wirksame Ribosomenbindungsstelle für die Expression des PACE-Gens oder eines seiner Fragmente in Prokaryonten nützlich. Bei E. coli wird die Ribosomenbindungsstelle mit Shine-Dalgamo (SD)-Sequenz bezeichnet; sie enthält ein Startcodon (ATG) und eine 3-9 Nukleotide lange Sequenz 3-11 Nukleotide stromaufwärts vom Startcodon [Shine et al., Nature 254:34 (1975)]. Es wird angenommen, daß die SD-Sequenz die Bindung von mRNA an das Ribosom durch Basenpaarung zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende von E. ccli 165-rRNA fördert [Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA" [Genetische Signale und Nukleotidsequenzen in Boten-RNA] in Biological Regulation and Development: Gene Expression [Biologische Regulation und Entwicklung: Genexpression] (Hrsg. R.F. Goldberger, 1979)]. Zur Expression eukaryontischer Gene und prokaryontischer Gene mit schwachen Ribosombindungsstellen [Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli" [Epression klonierter Gene in Echerichia coli] in Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch], Zitat oben].
• PACE kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotersequenz kann direkt mit dem PACE-Gen oder einem seiner Fragmente verbunden werden, wobei es sich in diesem Fall bei der ersten Aminosäure am N-terminalen Ende immer um ein Methionin, welches vom ATG-Startcodon codiert wird, handeln wird. Gegebenenfalls kann Methionin am N-terminalen Ende von dem Protein durch Inkubation in vitre mit Bromcyan oder durch Inkubation in vivo oder in vitre mit einer bakteriellen Methionin-N-Terminus- Peptidase abgespalten werden.
• Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression dar. Typischerweise ist eine für den N-terminalen Teil eines endogenen Bakterienproteins oder eines anderen stabilen Proteins codierende DNA-Sequenz mit dem 5'-Ende der heterologen für PACE codierenden Sequenzen fusioniert. Bei der Expression sieht dieses Konstrukt die Fusion der beiden Aminosäuresequenzen vor. So kann zum Beispiel das Zellgen des Bakteriophagen Lambda mit dem 5'-Ende des PACE-Gens oder einem seiner Fragmente verbunden und in Bakterien exprimiert werden. Bei dem erhaltenen Fusionsprotein bleibt vorzugsweise eine Stelle für ein Processing-Enzym (Faktor Xa) erhalten, um das Bakteriophagenprotein von dem PACE-Gen [Lakune] oder einem seiner Fragmente abzuspalten [Nagai et al., Nature 309:810 (1984)].
• Fusionsproteine können auch mit Sequenzen des lacZ-Gens [Jia et al., Gene 60:197 (1987)], des trpE-Gens [Allen et al., J. Biotechnol., 5:93 (1987); Makoff et al., J. Gen. Microbiol. 135:11 (1989)] und dem Chey-Gen [EPO Veröff. Nr. 324 647] hergestellt werden. Die DNA-Sequenz am der Verbindungsstelle der beiden Aminosäurensequenzen codiert gegenbenenfalls für eine spaltbare protein. Solch ein Fusionsprotein enthält die Ubiquitin- Region, die vorzugsweise eine Stelle für ein Processing- Enzym beibehält (z.B. Ubiquitin-spezifische Processing- Protease), um das Ubiquitin von dem PACE-Polypeptid abzuspalten. Durch dieses Verfahren können reife PACE-Polypeptide isoliert werden (Miller et al., Bioltechnology, 7:698 (1989)].
• Es können jedoch auch PACE-Polypeptide aus der Zelle sezerniert werden, und zwar dadurch, daß man chimerische DNA-Moleküle schafft, die für ein Fusions protein mit einem Signalpeptid Sequenzfragment, das für die Sekretion der PACE-Polypeptide in Bakterien sorgt, codieren [US-Patent Nr. 4 336 336]. Das Signalsequenzfragment codiert typischerweise für ein Signalpeptid mit hydrophoben Aminosäuren, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der sich zwischen der inneren und der äußeren Membran der Zelle befindet (Gram-negative Bakterien), sezerniert. Es liegen vorzugsweise Processing-Stellen vor, die entweder in vivo oder in vitro gespaltet werden können und für die zwischen dem Signalpeptidfragment und dem PACE-Polypeptid codiert wird.
• DNA, die fur geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte bakterielle Proteine stammen, wie z.B. dem E. coli-Gen für äußeres Membranprotein (ompA) [Masui et al., in Experimental Manipulation of Gene Expression (1983); Ghrayeb et al., EMBO J. 3:2437 (1984)] sowie die E. coli-Signalsequenz für alkalische Phosphatase (phoA) [Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212 (1985)]. Als weiteres Beispiel kann die Signalsequenz des alpha-Amylase-Gens aus verschiedenen Bazillus-Stämmen zur Sekretion heterologer Proteine von B. subtilis verwendet werden [Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582 (1982); EPO Veröff. Nr. 244 042].
• Die von Bakterien erkannten Transkriptionsterminationssequenzen sind typischerweise regulatorische Regionen, die sich in 3'-Richtung vorn Translationsstoppcodon befinden und die daher gemeinsam mit dem Promoter die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Transkriptionsterminationssequenzen enthalten häufig DNA-Sequenzen (mit ca. 50 Nukleotiden), die zur Bildung von Stiel-und-Öse-Strukturen fähig sind, welche die Transkriptionstermination unterstützen. Hierzu gehören zum Beispiel Transkriptionsterminationssequenzen, die sich von Genen mit starken Promotern ableiten, wie zum Beispiel dem trp-Gen in E. coli, sowie anderen biosynthetischen Gene.
• Die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promoter, (falls gewünscht) eine Signalsequenz, die zweckdienliche codierende Sequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz enthalten, werden gemeinsam in Expressionskonstrukte eingeführt. Expressionskonstrukte werden häufig in einem Replikon erhalten, wie zum Beispiel einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmiden), das stabil in einem Wirt wie z.B. Bakterien erhalten werden kann. Die Beschreibung ähnlicher Replikon-Systeme, darunter von Parametern für die Kopienzahl, sind detailliert oben im Zusammenhang mit Hefeexpressionssystemen beschrieben. Diese Beschreibung ist auch auf Bakteriensysteme anwendbar.
• Die Expressionskonstrukte können jedoch auch mit einem integrierenden Vektor in das Bakteriengenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten typischerweise mindestens eine Sequenz, die zu dem Bakterienchromosom, das die Integration des Vektors gestattet, homolog ist. Integrationen scheinen das Ergebnis von Rekombinationen zwischen homologer DNA in dem Vektor und dem Bakterienchromosom zu sein. Mit DNA aus verschiedenen Bacillus-Stäinmen konstruierte integrierende Vektoren integrieren zum Beispiel in das Bacillus-Chromosom [EPO Veröff. Nr. 127 328]. Integrierende Vektoren können auch Bakteriophagen- oder Transposon-Sequenzen enthalten.
• Extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte können typischerweise selektierbare Marker enthalten, die die Selektion transformierter Bakterienstämme gestatten. Selektierbare Marker können in dem Bakterienwirt exprimiert werden, darunter zum Beispiel Gene, die Bakterienresistenz gegen Medikamente wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin verleihen [Davies et al., Annu. Rev. Microbiol. 32:469 (1978)]. Zu den selektierbaren Markern gehören z.B. auch biosynthetische Gene, wie zum Beispiel bei Vorgängen der Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthese.
• Manche der oben angeführten Bestandteile können jedoch auch in Transformationsvektoren kombiniert werden. Transformationsvektoren enthalten typischerweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replikon erhalten oder zu einem wie oben beschriebenen integrierenden Vektor weiterentwickelt wird.
• Expressions- und Transformationsvektoren, sowohl extrachromosomale Replikons als auch integrierende Vektoren, wurden bislang für die Transformation in viele Bakterien entwickelt. Zum Beispiel wurden Expressionsvektoren für die folgenden Bakterien entwickelt: Bacillus subtilis [Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582 (1982); EPO Veröff. Nr. 36 259 und 63 953; PCT WO 84/04541]; E. coli Eshimatake et al., Nature, 292:128 (1981); Amann et al., Gene, 40:183 (1985); Studier et al., J. Mol. Biol. 189:113 (1986); EPO Veröff. Nr. 36 776, 136 829 und 136 907; Britische Patentanmeldung mit der fortlaufenden Nr. 8418273]; Streptococcus cremoris [Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54:655 (1988)]; Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54:655 (1988)]; Streptomyces lividans (US- Patent Nr. 4 745 056].
• Verfahren zur Einführung von exogener DNA in bakterielle Wirte sind aus der Technik gut bekannt; dazu gehören typischerweise die Transformation von Bakterien, die entweder mit CaCl&sub2; oder anderen Mitteln wie zweiwertigen Kationen und DMSO behandelt wurden. DNA kann auch mittels Elektroporation in Bakterienzellen eingeführt werden. Die Transformationsverfahren hängen normalerweise von der zu transformierenden Bakterienart ab. Siehe z.B. (Masson et al., FEMS Microbiol. Lett. 60:273 (1989); Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582 (1982); EPO Veröff. Nr. 36 259 und 63 953, PCT WO 84/04541, Bacillus], (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856 (1988); Wang et al., J. Bactoriol. 172:949 (1990) für Campylobacter]; (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110 (1973); Dower et al., Nucleic Acids Res. 16:6127 (1988); Kushner, "An improved method for transformation of Escherichia coli with Colel-derived plasmids" (Verbessertes Verfahren zur Transformation von Escherichia coli mit von ColE1 abgeleiteten Plasmiden] in Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering [Gentechnik: Bericht des Internationalen Symposiums über Gentechnik] (Hrsg. H.W. Boyer und S. Nicosia, 1978); Mandel et al., J. Mol. Biol. 53:159 (1970); Taketo, Biochim. Biophys. Acta 949:318 (1988) für Escherichia], [Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett. 44:173 (1987) für Lactobacillus]; (Fiedler et al., Anal. Biochem 170:38 (1988) für Pseudomonas]; [Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett. 66:203 (1990) für Staphylococcus]; [Barany et al., J. Bacteriol. 144:698 (1980); Harlander, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation" (Transformation von Streptococcus lactis durch Elektroporation] in Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti und R. Curtiss III, 1987); Perry et al., Infec. Immun. 32:1295 (1981); Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54:655 (1988); Somkuti et al., Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412 (1987) für Streptococcus].
C. Expression in Insektenzellen
• Bei einem Aspekt der Erfindung wird ein verstärktes Processing eines Vorstufenpolypeptids zu einem reifen Polypeptid dadurch erzielt, daß man für PACE codierende DNA-Sequenzen in eine Insektenwirtszelle einführt, wodurch man eine rekombinante Insektenzelle erhält. Das Vorstufenpolypeptid und PACE sind insofern verwandt, als die Vorstufe über mindestens eine selektive spaltbare Peptidbindung verfügt, die von PACE gespalten werden kann. Der Transkriptionsstart und die Expression von PACE gestattet eine im Vergleich zum nichtmodifizierten Wirt verstärkte PACE-Produktion.
• Das für PACE codierende Polynukleotid wird in einen geeigneten Insektenexpressionsvektor insertiert und ist operativ mit den Kontrolleinheiten innerhalb dieses Vektors verbunden. Bei der Konstruktion des Vektors verwendet man aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren. Sobald die erwünschte PACE-DNA-Sequenz erhalten ist, können verschiedene Konstrukte hergestellt werden.
• Im allgemeinen gehören zu den Bestandteilen des Expressionssystems ein Transfervektor, üblicherweise ein Bakterienplasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirusgenoms sowie eine geeignete Restriktionsstelle für die Insertion des zu exprimierenden heterologen Gens bzw. der zu exprimierenden heterologen Gene enthält; ein Wildtyp-Baculovirus mit einer Sequenz, die zu dem baculovirusspezifischen Fragment in dem Transfervektor homolog ist, was die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirusgenom gestattet, sowie geeignete Insektenwirtszellen und Wachstumsmedien.
• Nachdem die PACE-DNA-Sequenz in den Transfervektor insertiert worden ist, werden der Vektor und das Wildtyp-Virusgenom in eine Insektenwirtszelle transfiziert, wo man Vektor und Virusgenom rekombinieren läßt. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert und rekombinante Plaques werden identifiziert und gereinigt. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzellexpressionssysteme sind auf dem Markt in Form eines Bestecks erhältlich, unter anderem von Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"-Besteck). Diese Techniken sind im allgemeinen dem Fachmann bekannt und bei Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (im folgenden mit "Summers und Smith" bezeichnet) genau beschrieben.
• Vor Insertion der PACE-DNA-Sequenz in das Baculovirusgenom werden die oben beschriebenen Bestandteile, die einen Promoter, (falls erwünscht) einen Leader, die zweckdienliche Codiersequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, typischerweise zu einem Zwischen-Transplacierungskonstrukt (Transfervector) zusammengefügt. Dieses Konstrukt kann entweder ein einzelnes Gen und operativ verbundene regulatorische Elemente, multiple Gene, jedes mit seinem eigenen Satz operativ verbundener regulatorischer Elemente, oder multiple Gene, die vom gleichen Satz regulatorischer Elemente reguliert werden, enthalten. Zwischen-Transplacierungskonstrukte werden häufig in einem Replikon erhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmide), das sich zur stabilen Erhaltung in einem Wirt wie z.B. einem Bakterium eignet. Das Replikon verfügt über ein Replikationssystem, wodurch es in einem geeigneten Wirt für Klonierungs- und Amplifikationszwecke erhalten werden kann.
• Der zur Zeit am häufigsten verwendete Transfervektor für die Einführung von Fremdgenen in AcNPV ist pSc373. Viele andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, sind ebenfalls bereits entwickelt worden. Dazu gehört zum Beispiel pVL985 (das das Polyhedrin-Startcodon von ATG zu ATT ändert und das 32 Basenpaare stromabwärts von dem ATT eine BamHI-Klonierstelle einführt) [siehe z.B. Luckow und Summers, Virology, 17:31 (1989)].
• Das Plasmid enthält üblicherweise auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal [Miller et al., Ann. Rev. Microbiol., 42:177 (1988)] sowie ein prokaryontisches Gen für Ampicillinresistenz (amp) und Replikationsstart für die Selektion und Vermehrung in E. coli.
• Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculoviruspromoter. Bei einem Baculoviruspromoter handelt es sich um eine beliebige DNA-Sequenz, die zur Bindung einer Baculovirus-RNA-Polymerase und Initiation der stromabwärts ablaufenden (von 5' nach 3') Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. eines Strukturgens) in mRNA fähig ist. Ein Promoter verfügt über eine Transkriptionsinitiationsregion, die sich üblicherweise proximal vom 5'-Ende der codierenden Sequenz befindet. Diese Transkriptionsinitiationsregion enthält typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle sowie einen Transkriptionsstart. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch über eine zweite, Enhancer genannte Domäne verfügen, die sich, so vorhanden, üblicherweise distal vom Strukturgen befindet. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
• Strukturgene, die in großen Mengen im Spätstadium eines Virusinfektionszyklus transkribiert werden, stellen besonders nützliche Promotersequenzen zur Verfügung. Dazu gehören zum Beispiel Sequenzen, die sich von dem für das Viruspolyhedronprotein codierenden Gen ableiten [Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" Eregulation der Genexpression bei Baculoviren], in The Molecular Biology of Baculoviruses [Molekulare Biologie von Baculoviren] (Hrsg. Walter Doerfler, 1986); EPO Veröff. Nr. 127 839 sowie 155 4761 sowie von dem für das p10-Protein codierenden Gen ableiten [Vlak et al., J. Gen. Virol. 69:765 (1988)].
• DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann sich von Genen für sezernierte Insekten- oder Baculovirenproteine, wie zum Beispiel dem Baculovirus- Polyhedrin-Gen [Carbonell et al., Gene, 73:409 (1988)], ableiten. Da jedoch die Signale für postranslationelle Modifikationen bei Säugetierzellen (wie Signalpeptidspaltung, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung) anscheinend von Insektenzellen erkannt werden und die für Sekretion und Akkumulation im Kern erforderlichen Signale zwischen Zellen von Wirbellosen und Wirbeltieren ebenfalls konserviert zu sein scheinen, ist es auch möglich, Leader, die nicht von Insekten stammen, wie zum Beispiel solche, die von Genen abgeleitet sind, welche für menschliches α-Interferon [Maeda et al., Nature 315:592 (1985)1; menschliches gastrinfreisetzendes Peptid [Lebacq-verheyden et al., Molec. Cell. Biol. 8:3129 (1988)1; menschliches IL-2 [Smith et al., Proc. Vatl. Acad. Sci. USA, 82:8404 (1985)]; Mäuse-IL-3 [Miyajima et al., Gene 58:273 (1987)] sowie menschliche Glucocerebrosidase [Martin et al., DNA, 7:99 (1988)] codieren, einzusetzen, um für Sekretion in Insekten zu sorgen.
• In manchen Fällen - wie oben beschrieben - kann es wünschenswert sein, über mehrere Kopien, d.h. zwei oder mehr, des die Expressionsproduktvorstufe exprimierenden Gens in Bezug auf die PACE-DNA-Sequenz zu verfügen, oder umgekehrt. Zu einigen Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung gehören die rekombinante Produktion multipler Proteine, zum Beispiel PACE und eines oder mehrere heterologe Vorstufenpolypeptide. Dies kann durch mehrere verschiedene Strategien erzielt werden. Zum Beispiel kann PACE durch die Expression eines für PACE codierenden Gens in dem im vorliegenden Text beschriebenen Baculovirus/Insektenzellexpressionssystem produziert werden. Das so produzierte PACE kann dann dazu verwendet werden, ein heterologes Vorstufenpolypeptid enzymatisch zu spalten, wodurch man eine reifere Form des Proteins erhält. Es können natürlich sowohl PACE als auch das Vorstufenpolypeptid durch unabhängige Baculovirus/Insektenzellexpressions systeme produziert und anschließend vermischt werden.
• Es ist auch möglich, PACE und eines oder mehrere Vorstufenpolypeptide gleichzeitig durch Expression der entsprechenden Gene in der gleichen Insektenzelle zu produzieren. Jedes Gen kann in die Insektenzelle durch einen eigenen Transformationsvorgang eingeführt werden, zum Beispiel eigene Transfektionen, Transfektion und Infektion mit Baculovirus oder multiple Infektionen mit Baculovirus. Verschiedene Kombinationen sind für den Fachmann leicht zu erkennen. Auch können Transfervektoren konstruiert werden, die über zwei oder mehr Sätze operativ verbundener expressionsregulierender Elemente wie oben beschrieben verfügen. Jeder Satz Expressionselemente verfügt über eine eindeutige Restriktionsstelle, in die jeweils ein unterschiedliches Gen insertiert werden kann. Bei jedem Satz Elemente kann der gleiche Promotertyp verwendet werden, oder man kann für jeden Satz einen anderen Promoter verwenden. Durch Verwendung von verschiedenen Promotern mit unterschiedlichen relativen Wirksamkeiten kann das Enzym/Substratverhältnis von PACE und Vorstufenpolypeptiden optimiert werden.
• Schließlich kann ein Transfervektor konstruiert werden, der multiple für PACE codierende Gene sowie ein oder mehrere Vorstufenpolypeptide enthält, und zwar so, daß alle Gene als polycistronische Botschaft unter der Kontrolle eines einzigen Satzes von Regulatorelementen exprimiert werden. Das entstandene Polyprotein kann einem Processing unterzogen werden, wodurch man die einzelnen Teile enthält, und zwar entweder durch die autokatalytische Wirkung des PACE-Teils oder durch Einführung von Erkennungsstellen für eine sequenzspezifische Endopeptidase, wie z.B. Signalpeptidase, zwischen funktionelle Domänen.
• Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert oder, wenn es mit den richtigen regulatorischen Sequenzen exprimiert wird, sezerniert werden. Zu einer guten intrazellulären Expression von nichtfusionierten Fremdproteinen sind normalerweise heterologe Gene erforderlich, die im Idealfall über eine kurze Leader-Sequenz mit geeigneten Translationsinitiationssignalen, die einem ATG-Startsignal vorangehen, verfügen. Falls gewünscht, kann Methionin von dem reifen Protein am N-terminalen Ende durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
• Es ist jedoch auch möglich, rekombinante Polyproteine oder Proteine, die nicht natürlich sezerniert werden, aus der Insektenzelle dadurch zu sezernieren, daß man chimerische DNA-Moleküle schafft, welche für ein Fusionsprotein mit einem Leader-Sequenzfragment, das für die Sekretion des heterologen Proteins aus Insektenzellen sorgt, codieren. Typischerweise codiert das Leader- Seguenzfragment für ein Signalpeptid mit hydrophoben Aminosäuren, die die Transiokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum steuern.
• Nachdem die PACE-DNA-Sequenz und/oder das für die Expressionsproduktvorstufe codierende Gen insertiert worden ist bzw. sind, wird ein Insektenzeliwirt mit der heterologen DNA des Transfer-Vektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus cotransformiert, üblicherweise durch Cotransfektion. Der Promoter und die Transkriptionsterminationsseguenz des Konstrukts enthält üblicherweise einen Baculovirusgenom-Abschnitt von 2-5 kb. Verfahren zur Einführung von heterologer DNA in die gewünschte Sequenz im Baculovirus sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Stimmers und Smith, Zitat oben; Ju et al., (1987), Zitat oben; Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3:2156 (1983) sowie Luckow und Stimmers (1989), Zitat oben]. Zum Beispiel kann in ein Gen wie das Polyhedrin-Gen durch homologe doppelte Crossover- Rekombination insertiert werden; man kaml jedoch auch in eine in das gewünschte Baculovirusgen eingefügte Restriktionsenzym-Schnittstelle insertieren (Miller et al., Bioessays, 4: 91 (1989)]. Wird die DNA-Sequenz in den Expressionsvektor an die Stelle des Polyhedringens kloniert, so wird sie sowohl auf der 5'- als auch der 3'-Seite von polyhedrinspezifischen Sequenzen flankiert und liegt stromabwärts von dem Polyhedrinpromoter.
• Der neugebildete Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in ein infektiöses rekombinantes Baculovirus verpackt. Homologe Rekombination tritt mit niedriger Häufigkeit auf (zwischen ca 1% und ca. 5%); bei den meisten nach der Cotransfektion produzierten Viren handelt es sich daher noch immer um Wildtypviren. Es ist daher ein Verfahren zur Identifikation von rekombinanten Viren erforderlich. Der Vorteil des Expressionssystems ist, daß zur Unterscheidung rekombinanter Viren optisch gescreent werden kann. Das von dem nativen Virus produzierte Polyhedrin-Protein wird in den Kernen infizierter Zellen zu einem späten Zeitpunkt nach der Virusinfektion in sehr großen Mengen produziert. Angehäuf tes Polyhedrin-Protein bildet Einschlußkörper, die ebenfalls eingebettete Teilchen enthalten. Diese Einschlußkörper, die bis zu 15 µm groß sind, sind stark lichtbrechend, wodurch sie hellglänzend erscheinen und leicht unter dem Lichtmikroskop wahrgenommen werden können. Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, verfügen über keine Einschlußkörper. Um zwischen rekombinanten Viren und Wildtypviren zu unterscheiden, wird der Transfektionsüberstand nach in der Fachwelt bekannten Techniken auf eine Insekten-Einzelzellschicht als Plaques plattiert. Das heißt, daß die Plaques unter dem Lichtmikroskop auf Vorhandensein (was Wildtypvirus anzeigt) oder Abwesenheit (was rekombinantes Virus anzeigt) von Einschlußkörpern untersucht. ["Current Protocols in Microbiology", Band 2 (Hrsg. Ausubel et al.) unter 16. 8 (Erganzungsbd. 10, 1990); Summers und Smith, Zitat oben; Miller et al. (1989), Zitat oben].
• Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Infektion in verschiedene Insektenzellen entwickelt. Zum Beispiel wurden rekombinante Baculoviren unter anderem schon für die Folgenden entwickelt" Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni [P.C.T.Veröff. Nr. W089/046699; Carbonell et al., J. Virol. 56:153 (1985); Wright, Nature 321:718 (1986); Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156 (1983), sowie allgemein Fraser et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225 (1989)].
• Zellen und Zellkulturmedien sind sowohl für die Direkt- als auch die Fusionsexpression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus/Expressionssystem im Handel erhältlich. Die Zellkulturtechnik ist allgemein in der Fachwelt bekannt Esiehe z.B. Suxnmers und Smith, Zitat oben].
• Die modifizierten Insektenzellen können dann in einem geeigneten Nährmedium, das die stabile Erhaltung des bzw. der in dem modifizierten Insektenwirt vorhandenen Plasmids/Plasmide gestattet, kultiviert werden. Ist das Gen für das Expressionsprodukt unter induzierbarer Kontrolle, so kann der Wirt bis zu einer hohen Dichte kultiviert und die Expression induziert werden. Ist jedoch die Expression konstitutiv, so wird das Produkt fortlaufend in das Medium exprimiert und das Nährmedium muß ständig umgewälzt werden, während man das betreffende Produkt entfernt und erschöpfte Nährstoffe zusetzt. Das Produkt kann mit bekannten Techniken wie chromatographie (z .B. HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie), Elektrophorese, Dichtegradientzentrifugation, Lösungsmittelextraktion usw. aufgereinigt werden. Gegebenenfalls kann das Produkt je nach Bedarf weiter aufgereinigt werden, um im wesentlichen die Insektenproteine, die ebenfalls in das Medium sezerniert werden oder durch Lyse von Insektenzellen entstehen, zu entfernen, wobei man ein Produkt erhält, das zumindest im wesentlichen frei von Wirtszellbestandteilen, z.B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden, ist.
D. Hinterlegung von biologischem Material
• Mit einem das PACE-Gen von Fig. 2 enthaltenden Plasmid, PACE/pBS24.1, transformierte Wirtszellen des Escherichia coli-Stamms HB101 wurden am 30. November 1990 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, hinterlegt und mit der Bezeichnung PACE/bBS24.1 in E. coli bezeichnet. Diese Hinterlegung wird unter den Bedingungen des Budapester Abkommens zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke erhalten werden. Die Eingangsnummer lautet ATCC 68486.
• Diese Hinterlegung geschieht lediglich aus Zweckmäßigkeitsgründen für die Fachwelt und ist kein Eingeständnis, daß eine Hinterlegung gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist. Die Nucleinsäureseguenz dieses Plasmids sowie die Aminosäuresequenz des von ihm kodierten Polypeptids sind bezugsmäßiger Bestandteil des vorliegenden Texts und im Falle eines Widerspruchs mit der im vorliegenden Text gegebenen Beschreibung ausschlaggebend. Zur Herstellung oder Verwendung bzw. zum Verkauf des hinterlegten Materials kann eine Lizenz erforderlich sein, und keine solche Lizenz wird hiermit vergeben.
• Der folgende experimentelle Teil soll lediglich beispielhaften Charakter haben und beschränkt den Schutzumfang des vorliegenden Textes in keiner Weise. Die folgenden Beispiele beschreiben zur Veranschaulichung die Konstruktion von Plasmiden für die Expression und Produktion von PACE in Säugetierzellen sowie die Coexpression von PACE und dem Blutgerinnungsfaktor Faktor IX in Säugetierzellen.
Beispiel 1 - Konstruktion von PACE-cDNA
• In diesem Beispiel wird die Konstruktion einer zusammengesetzten rekombinanten cDNA, die für Säugetier- PACE kodiert, sowie die Charakterisierung des von ihr kodierten Polypeptids veranschaulicht. Die cDNA wurde aus zwei getrennten cDNAs, die für unterschiedliche Teile des PACE-Moleküls kodieren, konstruiert.
• cDNAs, die für PACE kodieren, wurden folgendermaßen molekular kloniert. Unter Verwendung von Poly(A)&spplus; mRNA, die aus der menschlichen Leberzellinie HEPG2 isoliert worden war, wurde in dem Hefeexpressionsvektor pAB23BXN eine orientierte cDNA-Bibliothek konstruiert. pAB23BXN leitet sich von pAB23BX ab [D. Schild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2916 (1990)], in das ein synthetischer Polylinker, der BstX1- und Not1-Stellen enthielt, für die unidirektionelle cDNA-Klonierung insertiert wurde. Um einen Klon mit 3 295 bp aus der Bibliothek zu isolieren, wurden Oligonucleotid-Sonden verwendet. Diese Sonden wurden unter Verwendung der Sequenz eines partiellen cDNA-Klons (3,1 kb) synthetisiert, von dem angenommen wird, daß er für einen Teil des fur-Genprodukts kodiert [A.J.M. Roebroek et al., EMBO J. 5:2197 (1986)].
• Um das 5'-Ende der PACE-cDNA zu isolieren, wurde eine zweite cDNA-Bibliothek aus HEPG2-Poly (A)&spplus; RNA-mRNA in λZAPII [Stratagen] unter Verwendung einer spezifischen, intern gestarteten Botschaft konstruiert. Mit dem längsten aus dieser Bibliothek isolierten Klon wurde eine zusammengesetzte cDNA für PACE konstruiert. Die zusammengesetzte cDNA enthält 4 351 bp und verfügt über 388 bp einer 5'-nichttranslatierten Region, eine mutmaßliche kodierende Sequenz, die 794 Aminosäuren entspricht, sowie 1597 bp einer 3'-nichttranslatierten Region, darunter zwei Terminator-Codons sowie ein Schwanz von 17 dA-Resten.
• Die vollständige sequenz der zusammengesetzten PACE-cDNA und die codierte Proteinsequenz ist in Figur 2 dargestellt, wobei die codierte Proteinsequenz oberhalb der cDNA-Sequenz dargestellt ist. Die Numerierung beruht auf dem wesentlichen offenen Leseraster (ORF) in der cDNA.
• Aufgrund der Struktur der zusammengesetzten PACE- cDNA wird folgendes abgeleitet. Die Translation von PACE wird vermutlich am ATG-Startkodon am Nucleotid Nr. 1 initiiert. Obwohl sich vier ATG-Codons stromaufwärts von Nucleotid Nr. 1 befinden, ist das ATG am Nucleotid Nr. 1 das einzige Methionin-Codon innerhalb des Leserasters in der 5'-Region der cDNA, und die folgenden 26 Aminosäuren stellen eine klassische hydrophobe Signalsequenz dar, die üblicherweise mit einem membrangebundenen Protein assoziiert ist. Die Signalpeptidase-Spaltstelle liegt zwischen den Aminosäuren Nr. 26-27.
• Ein großes offenes Leseraster kodiert für ein PACE-Vorstufenprotein mit einem berechneten Molekular gewicht von 86,7 kD. Zusätzlich befinden sich verschiedene paarweise auftretende basische Aminosäurereste in der amino-terrninalen Region der PACE-Vorstufe (Figur 2) und könnten proteolytische/autolytische Processing- Sequenzen darstellen. Die kodierende Sequenz enthält drei consensus-Sequenzen für N-gebundene Glykosylierung und zweiundzwanzig Cysteinreste. Die aktive Sequenz befindet sich in dem offenen Leseraster und beinhaltet eine Dreiergruppe von Aminosäuren: Asparaginsäure (Asp Nr. 153), Histidin (His Nr. 194) und Serin (Ser Nr. 368). Eine cysteinreiche Region (CRR) ist ebenfalls vorhanden und befindet sich wie in Figur 2 dargestellt in der Nähe des Abschnitts von Aminosäure Cys Nr. 587 bis Aminoäure Cys Nr. 675. Eine mutmaßliche hydrophobe Transmembrandomäne (TM) befindet sich stromabwärts von der cysteinreichen Region, ungefähr in dem Abschnitt von Aminosäure Val Nr. 716 bis Aminosäure Leu Nr. 738.
• Die 3'-nichttranslatierte Region ist relativ lang (1597 bp) und enthält ein mögliches Polyadenylierungssignal (ATTAAA) an den Nudeotiden Nr. 3939-3943 des zusammengesetzten Klons. Besonders bemerkenswert sind mehrere Regionen mit einer umfangreichen möglichen Sekundärstruktur, die kodierende Sequenzen enthalten, sowie die 3'-nichttranslatierten Sequenzen in der Nähe des Terminator-Codons.
Beispiel 2 - Plasmidkonstruktion und Expression von PACE- cDNA in Säugtier-COS-1-Zellen
• Dieses Beispiel veranschaulicht die Expression von rekombinanter PACE-cDNA in COS-1-Zellen. Das Säugetierzellexpressionssystem wurde folgendermassen konstruiert.
• Man verwendet ein "truncated" PACE-cDNA-Fragment von 2,47 kbp, das mittels PCR aus der zusammengesetzten PACE-cDNA hergestellt wurde. Bei dem Verfahren wurden synthetische Primer verwendet, die bis zu dem 5'-Ende der für PACE kodierenden Sequenz und bis ungefähr 70 bp in die 3'-nichttranslatierte Region hinein hybridisierten. Der 5'-Primer schuf eine EcoRI-Stelle für die Klonierung in pBluescript SK [Stratagene]. Der 3'-Primer schuf eine Sah-Klonierstelle. Alle PCR-Produkte wurden mit der M13- Didesoxy-Sequenziermethode überprüft.
• Das aus pbluescript-PACE stammende PACE-cDNA Fragment mit 2,47 kbp (EcoRI-SalI) enthielt die 794 Codons umfassende, für PACE kodierende Sequenz (Figur 1) sowie 74 Basen einer 3'-nichttranslatierten Sequenz vor einer Sah-Stelle [van den Ouweland et al., Zitat oben]. An dem 5'-Ende wurde die unmittelbar vor dem ATG befindliche Sequenz unter Verwendung des EcoRI-PCR-Primers so modifiziert, daß sie der Consensus-Translationsstartsequenz entsprach.
• Die 2,47 kb lange "truncated" cDNA wurde in die Kloniertstelle (EcoRI-SalI) des auf SV40 beruhenden Expressionsvektors pMT3 insertiert, wodurch das Plasmid pMT3-PACE erhielt. Der Vektor pMT3 leite sich von dem Vektor pMT2 ab [R.J. Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 9"946 (1989)], in dem die für DHFR codierende Region an der 3'-seite der Klonierstelle entfernt worden war. pMT3 wurde unter der Eingangsnummer ATCC 40348 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockkwille, MD (USA), hinterlegt. pMT3 kann auch ausgehend von pMT2- vWF hergestellt werden, da bei der ATCC unter der Eingangsnummer ATCC Nr. 67122 hinterlegt ist [siehe PCT- Anmeldung PCT/US87/00033].
• DNA aus dem erhlatenen Vektro, nämlich pMT2-PACE, wurde gereinigt und zwecks vorübergehender Expression in mit SV40 transformierte Affennierenzellen (COS-1) eingeführt, und zwar unter Verwendung einer bei Chen, C.A., und Okayama, H., BioTechniques, 6:632-638 (1988); und C. Chen und H. Okayama, Mol. Cell. Biol. 7-745 (1987). beschriebenen Calciumphosphat-Transfektionsvorschrift. Die Zelle wurde mit 40 µm Plasmid pro 10-cm-Schale in 10 ml Medium oder im Falle von Cotransfektionen in einem äquimolaren Verhältnis der Plasmide mit insgesamt 60 µg pro 10-cm-Schale in 10 ml Medium transfiziert.
• Im die Synthes von PACE zu verfolgen, wurden mit pMT3-PACE transfizierte COS-1-Zellen 48-60 Stunden nach der Transfektion mit S-markierten Aminosäuren, zum Beispiel ³&sup5;S-Met und ³&sup5;S-Cys in einem Medium ohne diese Aminosäuren, z.B. Cys und Met, radioaktiv markiert, Nichtransfizierte Zellen wurden ähnlich behandelt. Nach 30-minütiger Pulsdauer wurden Zelleextrakte durch Lyse in Lysepuffer NP-40 [A.J. Doner und R.J. Kaufman (1990). Meth. Enzymol., 185:577 (1990)] hergestellt bzw. durch Entfernung des Markiermediums und dessen Ersatz durch Vollmedium für die weitere Inkubation einer "Chase"- Untersuchung unterzogen. Die Zelextrakte und das konditionierte Medim wurden mit Proteaseinhibitoren behandelt und nach dem bei Wise and al., Cell, 52:229-236 (1988) beschriebenen Verfahren einer Immunfällung unterzogen.
• Die Immunfällungen wurden mit einem gegen ein PACE-E.coli-Fusionsprotein hergestellten Kaninchen-Anti- PACE-Antiserum durchgeführt. Das Kaninchen-Anti-PACE- Antiserum wurde gegen die katalytische Domäne von PACE dadurch erzeugt, daß man die Aminosäuren 146 bis 372 von PACE als Human-Superoxiddismutase(SOD)-Fusionsprotein in E. coli exprimierte. Das DNA-Fragment für die Expression wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt und in den Superoxiddismutase(SOD)-Fusionsvektor PTAC7 [Steimer et al., J. Virol., 58:9 (1986)] kloniert. Das induzierte Fusionsprotein wurde durch präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt, eluiert und zur Immunisierung von Kaninchen in Freundschem Voll- Adjuvans verwendet.
• Die immungefällten Proben wurden dann durch SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese [SDS-PAGE; (A 8%; B,C 6% Acrylamid)] analysiert. Die Gele wurden zwecks Fluorographie in Enhance [Dupont] hergestellt.
• In den Lysaten der COS-1-Kontrollzellen, die nicht mit pMT3-PACE transfiziert worden waren, wurden keine mit Anti-PACE-Antiserum immunreaktivem Proteine nachgewiesen. In Extrakten aus mit pMT3-PACE transfizierten Zellen wurden jedoch immunreaktive Typen, die in die Gele hauptsächlich in Form eines Doublets von ungefähr 90 kD wanderten, nachgewiesen. Diese PACE-Immunfällungen wurden mit dem Endoglycosidaseenzym N-Glucanase [Genyzme] unter Verwendung des bei A.J. Dorner und R.J. Kauman (1990), Zitat oben, beschriebenen Verfahrens behandelt. Das Ergebnis dieser Behandlung war eine Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität der markierten Proteine in den Gelen, was mit dem Vorhandensein von an Asparagin gebundenen Oligosacchariden übereinstimmt. Die Komplexität der Banden wurde jedoch durch diese Verdauungen nicht vollständig reduziert, was darauf schließen läßt, daß der Ursprung der beobachteten Heterogenität in dem exprimierten PACE nicht in differenzieller Glycosylierung liegen mag.
• Um die Sekretion von PACE zu untersuchen, wurden die ³&sup5;S-markierten Zellen über einen 12-stündigen "Chase"-Zeitraum in einem Medium mit überschüssigen nichtmarkierten Aminosäuren inkubiert. Mit den sezernierten Produkten aus dem konditionierten Medium sowie in Zell-Lysaten wurden Immunfällungen mit dem Anti- PACE-Antiserum durchgeführt. Das Medium aus den mit pMT3- PACE transfizierten Zellen ergab ein immunreaktives Protein, das in den Gelen als 75-kD-Polypeptid wanderte. Die relative Menge des immungefällten 75-kD-PACE- Polypeptids, das in dem konditionierten Medium beobachtet wurde, betrug 5 bis 10 mal weniger als das, was nach der 12-stündigen "Chase"-Dauer in dem Zell-Lysat nachgewiesen wurde bzw. innerhalb der Zelle verblieb.
• Dieser sezernierte PACE-Typ, der sich in scheinbarer Größe von dem intrazellulären Typ unterscheidet, könnte ein "truncated" Molekül, dem die Transmembranund/oder Intrazellulärdomäne fehlt, darstellen. Der Größenunterschied kann möglicherweise auf Autoproteolyse an den paarweise auftretenden Argininresten Nr. 497-498 aufgrund der starken Überproduktion von PACE in den transfizierten COS-1-Zellen zurückzuführen sein.
• Ausgedehntere "Pulse-Chase" -Versuche zeigten, daß das PACE-Translationsprodukt im Vergleich mit einem anderen vollständigen Membran-Glycoprotein (Influenza- Hämmagglutinin) bei Synthese in ähnlichem Ausmaß nicht in starken Maß innerhalb der Zelle akkumuliert.
Beispiel 3 - Coexpression von PACE und vWF in COS-1- Zellen
• In diesem Beispiel wird die Wirkung von rekombinanter PACE-Expression auf das Processing von von-Willebrand-Faktor (vWF), einem an der Blutgerinnung beteiligten Protein, das während der Coexpression der beiden rekombinanten Polypeptide in COS-1-Zellen produziert wird, gezeigt.
• Bei vWF handelt es sich um ein multimeres Plasmaprotein, das üblicherweise in Endothehumzellen als großes Vorstufenpolypeptid (Prä-Pro-vWF) synthetisiert wird. Bei Translokation in das endoplasmatische Reticulum (ER) finden an dem Vorstufenpolypeptid eine Signalpeptidspaltung sowie die Hinzufügung von N-gebundenen Oligosacchariden statt. In dem ER bildet Pro-vWF carboxylterminal verknüpfte, über Disylfidbrücken gebundene Dimere, Die be Transport in den Golgi- und Trans-Golgi- Abschnitt verschiedenen komplizierten Processing-Schritten unterzogen werden. Zu diesen Schritten gehören: Processing von N-gebundenen Kohlenhydraten, O- Glycosylierung, Zusammenbau von über Disulfidbrücken gebundenen Multimerern, sowie Propeptidspaltung [R.I. Handin und D.D. Wagner, in Progress in Hemostasis and Thrombosis, Band 9, Hrsg. B.S. Coller (W.B. Saunders, Philadelphia, 1989), Seiten 233-259].
• In Entothelzellen wird vWF sowohl auf konstitutivem als auch auf regulirtem Weg sezerniert. Die Transfektion eines vWF-cDNA-Expressionsvektors in COS-1- Zellen steuert die Synthese von Prä-Pro-vWF [D.T. Bonthron et al., Nature, 324:270 (1986)]. Obwohl COS-1- Zellen über eine Protease verfügen, die zum Erkennen und zur Spaltugn des vWF-Propeptids fähig ist, ist dieser Vorgang jedoch ineffizient. So stellen ungefähr 50% des sezernierten Proteins aus einer typischen Ezpressionsuntersuchung nichtgespaltene Pro-vWF dar.[R.J. Wise et al., Cell., 52:229 (1988)]. Wenn PACE das vWF-Propeptid erkennt und spaltet, dann müßte die Coexpression von PACE und Pro-vWF zu einer verstärkten Umwandlung von Pro-vWF in die reife Form führen.
• Um die Umwandlung durch PACE von Pro-vWF in die reife Form nachzuweisen, wurden COS-1-Zellen entweder mit pMT3-PACE oder pMT2-vWF transfiziert [D.T> Bonthron et al., Nature, 324:270 (1986)] oder mit beiden Plasmide cotransfiziert. Die Zellen wurden mit 40 µm Plasmid oder, im Falle der Cotransfektion, mit einem äquimolaren Verhältnis von Plasmiden von insgesamt 60 µm pro 10-cm- Schale in 10 ml Medium transfiziert. Die transfierten Zellen wurden 30 Minuten mit ³&sup5;S-Aminosäuren pulsmarkiert und wie im Beispiel 2 beschrieben lysiert oder durch Entfernung des Markierungsmediums und Ersatz mit Vollmedium für weitere Inkubation einer "Chase"-Behandlung unterzogen.
• Die Zellextrakte und Proben des konditionierten Mediums wurden mit Proteaseinhibitoren behandelt und einer Immunfällung unterzogen. Die Immunfällung wurde mit einem polyklonalen Anti-vWF-Antikörper (Dako Corp.), der spezifisch den reifen Teil von vWF erkennt, durchgeführt. Die gleichen Proben wurden auch mit einem monoklonalen Antikörper, der für das Propeptid von vWF spezifisch ist (anti-vWAgII), einer Immunfällung unterzogen.
• In der Immunfällung von Zellextrakten aus Zellen, die 30 Minuten lang mit Anti-vWF-Antikörper pulsmarkiert worden waren, wurde bei COS-1-Zellen, die nur mit pMT2-vWF transfiziert worden waren, nur eine einzelkettige Pro-vWF-Vorstufe nachgewiesen. Das konditionierte Medium ergab ungefähr gleiche Mengen an gespaltenen (reifen) und ungespaltenen (Pro-vWF-)Formen.
• Im Gegensatz dazu wurden nach 30-minütiger Pulsdauer bei Zellextrakten von mit pMT2-vWF und pMT3- PACE cotransfizierten COS-1-Zellen das Propeptid mit 100 kD und die reife Untereinheit mit 225 kD nachgewiesen. Dies zeigt, daß zu diesem Zeitpunkt eine beträchtliche Propeptidspaltung stattfand. Im konditionierten Medium war nach einer 12-stündigen "Chase"-Dauer der sezernierte vWF vollständig zu dem reifen Protein mit 225 kD verarbeitet worden. Die Analyse des aminoterminalen Endes des mit ³&sup5;S-Met markierten 225-k kD- Produktsnach 21 Zyklen automatisierten Edman-Abbaus und anschließender Szintillationszählung lieferte Ergebnisse, die mit einer Spaltung an der richtigen Stelle innerhalb der vWF-Vorstufe übereinstimmten.
• Durch Spaltung des Pro-vWF in die reife Form des vWF erhält man auch das vWF-Propeptid. Die Produktion dieses Propeptids wurde in den obigen Untersuchungen ebenfalls verfolgt. Das Vorhandensein dieses Propeptids wurde durch Immunfällung mit einem gegen das Propeptid gerichteten monoklonalen Antikörper, der auch unter der Bezeichnung vWF-Antigen II bekannt ist EP.J. Fay et al.; Nature, 232:995 (1986)], aufgezeigt. Die durch Immunfällung erhaltenen Produkte wurden wie oben beschrieben durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert.
• Aus den Ergebnissen geht hervor, daß Immun- Niederschläge aus Extrakten von Zellen, die nur mit pMT2- vWF transfiziert worden waren, pro-vWF, der keinem Processing unterzogen worden war, ergaben (aufgrund des Vorhandenseins von nichtgespaltenem Propeptid im Vorstufenmolekül). Immun-Niederschläge von Extrakten aus Zellen, die mit pMT2-vWF und pMT3-PACE cotransfiziert worden waren, ergaben das vWF-Propeptid, das in den Gelen in Form eines Dubletts bei 100 kD wanderte. Nach Verdauung mit N-Glycanase reduzierte sich das Dublett auf einen einzigen Typ, was anzeigte, daß der scheinbare Unterschied bezüglich der Molekulargewichte auf differenzieller Glycosylierung beruhte.
• Unter Verwendung einer ähnlichen Analyse wurden auch die konditionierten Zellmedien auf das Vorhandensein von Propeptid untersucht. Immun-Niederschläge des konditionierten Mediums der mit pMT2-vWF transfizierten Zellen ergaben das freie Propeptid sowie Multimere von vWF. Die Multimere enthielten eine Mischung aus reifem vWF und Pro-vWF, was zeigte, daß in den einfach transfizierten COS-1-Zellen unvollständiges Processing stattgefunden hatte. Die mit Anti-Agil-Antikörper erhaltenen Immun- Niederschläge aus dem konditionierten Medium von cotransfizierten Zellen ergaben jedoch nur freies Propeptid, was zeigte, daß der Pro-vWF vollständig in die reife Form umgewandelt worden war.
• In diesen Untersuchungen zum Nachweis des Propeptids wurde die Bildung von vWF-Multimeren in den Medien einzeln transfizierter und cotransfizierter Zellen durch nichtreduzierende Agarosegel-Elektrophorese bestätigt, wobei im wesentlichen das von R.J. Wise et al., Cell, 52:229 (1988), beschriebene Verfahren verwendet wurde. Die elektrophoretische Analyse mit Agarosegel zeigte, daß die vWF-Multimere in den Medien aus den einzeln und den cotransformierten Zellen in vergleichbarer Menge vorlagen.
Beispiel 4 - Substratspezifität von PACE
• Um die Erkennungsspezifität des rekombinanten PACE für Substrate mit einer Lys-Arg- oder Lys-Lys- Spaltstelle zu prüfen, wurden Untersuchungen mit Mutanten in der Spaltstelle von Pro-vWF durchgeführt. Eine mit vWF DES bezeichnete Mutante enthielt einen nichtkonservativen Austausch von Lys-Arg-Ser (KRS) gegen Asp-Glu-Ser (DES) an der Spaltstelle des Propeptids. Die andere mit vWF KKS bezeichnete Mutante enthielt einen konservativen Austausch von Lys-Lys-Ser gegen Lys-Arg-Ser an der Spaltstelle des Propeptids.
• Plasmide, die die vWF-Genmutationen enthielten, wurden mit pMT3-PACE cotransfiziert, um die Spaltbarkeit ihrer Expressionsprodukte mit PACE zu bestimmen. Die Untersuchung wurde wie oben in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt
• Die Analyseergebnisse zeigten, daß bei Transfektion der COS-1-Zellen mit dem für vWF DES codierenden Plasmid das markierte Produkt als ungespaltener Pro-vWF- Typ sezerniert wurde. Die gleichen Ergebnisse wurden mit COS-1-Zellen erhalten, die sowohl mit dem vWF-DES-Plasnid als auch mit pMT3-PACE cotransformiert worden waren.
• Wurden die Expressionsprodukte von mit dem für vWF KKS codierenden Plasmid transfizierten COS-1-Zellen geprüft, so wurde wiederum das markierte Produkt als ungespaltener Pro-vWF-Typ sezerniert. Bei Prüfung der Expressionsprodukte von Cotransformanten, die sowohl PACE als auch das KKS-Mutationsprotein exprimierten, so wurde festgestellt, daß, obwohl der sezernierte vWF teilweise im ungespaltenen Zustand verblieb, die Spaltung von Propeptid in beträchtlichem Umfang stattgefunden hatte.
• Aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen mit den mutierten vWF-Sequenzen geht hervor, daß ein nichtkonservativer Austausch an der natürlichen Lys-Arg- Spaltstelle von Pro-vWF die Spaltung durch coexprimiertes rekombinantes PACE verhindert. Ein konservativer Austausch von Lys-Lys gegen Lys-Arg stellt jedoch noch immer ein annehmbares Substrat für die rekombinante Protease dar.
Beispiel 5 - Expression von PACE in CHO-Zellen
• Dieses Beispiel veranschaulicht die Transformation von Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) mit der für PACE kodierenden Sequenz. Geeignete Vektoren wurden folgendermaßen konstruiert. pMT3-PACE wurde mit Sah zur Linearisierung an dem 3'- Ende der PACE-cDNA verdaut. Die Sah-Stelle wurde mit dNTPs und Klenow-Fragmenten aufgefüllt. Der EcoRI-Linker wurde mit einem stumpfen Ende ligiert und dann mit EcoRI verdaut. Die PACE-cDNA wurde auf einem Gel isoliert und dann mit EcoRI-linearisiertem pMT2-EMC-DHFR ligiert. Bei dem letztgenannten Plasmid handelt es sich um einen Nebenabkömmung von pED4, der bei R. Kaufman et al., Nucl. Acids Res., 19(16):4485-4490 (1991) beschrieben ist.
• Für die Plasmid-Minipräparation nahm man transformierte DH5α-Kolonien mit einem Zahnstocker auf. Die Orientierung der Inserte wurde mit KpnI, BamHI und Bg1Tl bestimmt. Der Klon mit der richtigen Orientierung wurde für die Plasmidpräparation in großem Maßstab gezüchtet. Der Rest der DNA aus der Minipräparation wurde für die Transfektion von zwei CHO-Zellinien verwendet.
• Zur Transfektion von CHO-Zellen auf 60-mm- Kulturschalen in OPTIMEM-Medium verwendete man ein Lipofektionsbesteck [BRL]. Bei den beiden Ausgangszelllinien handelte es sich um CHO-DUKX und PM5F-0.1, wobei es sich um eine vWF-produzierende Linie handelt, die sich von PM5F durch Selektion auf Resistenz gegen 0,1 µm DCF ableitet.
• Nach Aufteilung der Zellen auf 100-mm-Platten begann man mit der α-Selektion. Die Linie CHO-DOKX wurde in α-MEM/10% dialysiertem fötalem Kälberserum (FCS) selektiert. Die Linie PM5F wurde in α-MEM-AAU/10% dialysiertem FCS selektiert. Während dreitägiger Selektion auf α-Medium zeigten beide Linien gutes Wachstum. Diese α-selektierten Zellen wurden aufgeteilt. Jeweils eine Platte mit einer Zellinie (mit PACE-DUKX-α und PM5F-PACE-α bezeichnet) wurde 10 Tage in α-Medium passagiert und dann zur Aufbewahrung tiefgefroren.
• Vier Tage später versetzte man das Selektionsmedium mit Methotrexat (MTX) (0,05 µM). über ungefähr eine Woche bildeten sich viele Kolonien. Diese Kolonien wurden geramscht und für die Selektion mit 0,1 µm Methotrexat ungefähr eine Woche später aufgeteilt. Wiederum bildeten sich viele Kolonien, die geramscht, aufgeteilt und in Selektionsmedium mit 0,1 µm Methotrexat weitergeführt wurden. Diese amplifizierten Ramsche wurden dann zwecks Aufbewahrung tiefgefroren.
• PM5F-PACE-Zellen ("Ramsch-A"-) Zellen wurden pulsmarkiert. Zwei 100-mm-Platten wurden vor dem Zusammenfließen mit serumfreiem Medium abgespült. Für einen 15-minütigen Puls wurde 1 ml Cys/Met-Defizienzmedium, das mit jeweils 250 µCi 35-S-Met und 35-S-Cys angereichert war, zugegeben. Eine Platte wurde für die Immunfällung des Zellextrakts lysiert. Von der anderen Platte wurde das Medium entfernt und 2 ml Vollmedium (serumfrei) wurde fur eine 12-stündige "Chase"-Behandlung zugegeben. Nach 12 Stunden wurde das konditionierte Medium geerntet und die Zellen für die Immunfällung lysiert. Die Zellyse fand in 1 ml kaltem 0,5%-igem Triton-X-100, [Lekune) M NaCl, 10 µM Tris-HCl (pH 7,5) sowie 5 mM Na&sub2;-EDTA statt. Das konditionierte Medium und der Zellextrakt wurden mit Proteaseinhibitoren versetzt. Immunfällungen wurden mit 0,5 ml Zellextrakt und 1 ml konditioniertem Medium durchgeführt, und zwar mit AntivWF-Antikörper [DAKOI, der mit Affi-Gel gekoppelt war, und mit einem Anti-PACE-Antiserum [Chiron], das sekundär an Protein-A-Sepharose gebunden war.
• Die Fällungen wurden mit kaltem Lysepuffer gewaschen und mit SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse ähnelten den bei den Cotransfektionsversuchen mit PACE plus vWF COS-1 gefundenen Ergebnissen. Bei Anti-PACE wurde eine Dublettbande von 95-100 kDa in dem 15-Minuten- Zellextrakt gefällt. Nach 12 Stunden hatte sich die Intensität dieser Zellextraktbande auf ungefähr das 10-fache verringert. Bei dem konditionierten Medium wurde nach 12 Stunden eine Einzelbande mit 75-80 kDa nachgewiesen. Unter Verwendung des Anti-vWF wurde bestimmt, daß es sich bei dem sezernierten vWF nach 12 Stunden um reifes vWF mit vollständigem Processing handelte. In den Zellextraktproben lagen sowohl Pro-vWF als auch gespaltener vWF vor.
• Diese Ergebnisse unterscheiden sich von den bei der Elternzellinie PM5F beobachteten Ergebnissen dadurch, daß sezernierter vWF nur einem teilweisen Processing unterzogen wird und daß die intrazelluläre Spaltung minimal ist. Bei PM5F-PACE zeigte ein Vergleich der Autoradiographie-Intensitäten der PACE-Banden und der vWF-Banden, daß das PACE-Expressionsniveau ungefähr 1/2 des vWF-Expressionsniveaus beträgt.
• PACE-DUKX ("Ramsch 4/4") wurde auf die oben beschriebene Weise geprüft. Die von Anti-PACE-Immunfällungen erhaltenen SDS-PAGE-Ergebnisse zeigten eine intrazelluläre Dublettbande von 95-100 kDa in pulsierten (30 Minuten) Zellextrakten und eine scheinbare Sekretion eines kleineren immunreaktiven Typs (75-80 kDa) in dem konditionierten Medium mit "Chase"-Behandlung (18 Stunden). Außerdem wurden bei diesem Markierversuch PM5F- PACE-Zellen für Vergleichszwecke analysiert. Die Intensitäten der PACE-Banden bei den Immunfällungen aus den 30-Minuten-Zellextrakten waren bei beiden Zellinien gleich.
Beispiel 6 - Coexpression von PACE und Faktor IX in CHO- Zellen
• Eine CHO-Zellinie, die rekombinanten Faktor IX (IC4) [die Zellinie IC4 wird bei Kaufman et al., J. Biol. Chem., 261:9622-9628 (1986) beschriebenj und Sequenzen des Faktors IX produziert, wurde mit der oben in Beispiel 1 beschriebenen PACE-cDNA, die operativ mit einem anderen amplifizierbaren Marker, Adenosin-Desaminase, verknüpft ist, transfiziert. Der Vektor MT3SV2Ada [R.J. Kaufman et al., Meth. Enzym., 185:537-566 (1990)] wurde deshalb für die Expression von PACE gewählt, weil er eine selektierbare ADA-Transkriptionseinheit, jedoch keine DHFR- Sequenzen enthält und weil das PACE-Fragment nach Verdauung des Vektors mit EcoRI und Sal1 leicht insertierbar war.
• Ein Vektorfragment wurde aus niedrigschmelzender Agarose isoliert, in einem Verhältnis von 5:1 (Fragment zu Vektor) ligiert, mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, verdünnt und zur Transformation von DHS-Bakterien [DR. Douglas Hanahan, Cold Spring Harbor, New York] verwendet. Ein mit ³²p markiertes PACEFragment mit Nick- Translation wurde hergestellt und dazu verwendet, transformierte Kolonien durch Hybridisierung auf Filterpapier zu screenen.
• Positiv hybridisierende Kolonien wurden isoliert und die DNA für eine Verdauung vorbereitet, und zwar mit EcoRI und Sah zwecks Bestätigung der Insertion von PACE und mit BGlII wegen der richtigen Orientierung des Fragments bezüglich des späten Adenovirus-Hauptpromoters in dem Vektor.
• Die DNA einer Kolonie wurde für Elektroporation in die den Faktor IX produzierenden Zellen, nämlich IC4, isoliert. Kolonienramsche wurden für Amplifikation durch Wachstum in 1,0 µm 2'-Desoxycoformycin (DCF) gewählt. Das Vorhandensein von PACE in diesen amplifizierten Linien wurde durch ³&sup5;S-Methioninmarkierung und Immunfällung bestätigt.
• Die biologische Aktivität des Faktor-IX-Proteins in den PACE/IX-Ramschen wurde durch einen Gerinnungstest, der wie bei Kaufman et al., J. Biol. Chem., 261:9622-9628 (1986) beschrieben durchgeführt wurde, untersucht. Die Zellen wurden in p60-Gewebekulturschalen plattiert. Am nächsten Tag wurde das Medium verringert (1,5 ml) und gegen ein α-"definiertes" Medium + 1 µg/ml Vitamin K3 ausgetauscht.
• Es wurde gefunden, daß die PACE/Faktor IX-Ramsche 2,0 bis 3,1mal stärkere biologische Aktivität bezüglich Faktor IX aufweisen als die Ausgangszellinie IC4. Die Ergebnisse eines Radioimmuntests zeigten erhöhte Mengen an γ-carboxyliertem Protein. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt. TABELLE I Faktor-IX-Tests in Original-IC4- und PACE-coexprimierenden Zellinien
• Aus der ersten Elektroporation von MT3-PACE-Ada in IC4-Zellen wurden Zellen in einem α-Medium mit 10% dialysiertem fötalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin, Glutamin, 200 µm Methotrexat sowie Adenosin, Alanosin, Uridin und 0,1 µM DCF selektiert. In Platten, die keine DNA erhielten, wurden ungefähr 25 Kolonien beobachtet.
• Eine zweite Elektroporation wurde durchgeführt; es wurde auf gleiche Weise selektiert, und ungefähr 100 Kolonien wurden in jeden dieser 5 Ramsche geramscht. Wiederum wurden auf Platten, die keine DNA erhielten, keine Kolonien beobachtet.
• Die Expression von PACE wurde in jedem Ramsch durch einen 30-minütigen Puls mit ³&sup5;S-Methionin und eine anschließende zweistündige "Chase"-Behandlung sowie die Immunfällung von Zellextrakten mit α-PACE-Antikörper Echiron Corporation, California] nachgewiesen. In Zellen, die PACE aufgrund der Selektion auf mehr DCF-Resistenz auf höherem Niveau exprimieren, beobachtete man im Vergleich mit der Ausgangszellinie IC4 bis zu 10-fach höhere Niveaus an γ-carboxyliertem Faktor IX.
• Die Coexpression von PACE bewirkte keine nachweisbaren Veränderungen in der Größe des Faktor-IX- Proteins, wie dies durch Immunfällung mit einem α-FIX- Antikörper [Hybridtech] und SDS-Gel-Elektrophorese festgestellt wurde.
Beispiel 7 - Baculovirus-Expression von PACE
• Für die Expression von PACE in Insektenzellen wurden zwei Baculovirus-Expressionskastetten konstruiert. Die Kassette 1 wurde unter Verwendung von PACE/PBS24.1 als PCR-Matrize konstruiert, wobei die Primer fur 102 und fur 103 waren:
• 102: 5'CCA CCT GTC TGA TCA ATG GAG CTG AGG CCC TGG TTG3'
• 103: 5'GAG GCC TGA TCA CTA CTC AGC CAG GTG TGA GGG CAT3'.
• Die Kassette wurde ohne Transmembrandomäne hergestellt. Das PCR-Produkt wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das PCR-Produkt wurde dann mit Bc1I geschnitten und mit dem Vektor PAC373 ligiert, welcher mit BamHI geschnitten und mit Phosphatase behandelt wurde. Die Kassette II wurde unter Verwendung von PACE/pBS24.1 als PCR-Matrize konstruiert, wobei die Primer fur 102 (oben) und fur 104 waren:
• 104: 5'GCA GCC TGA TCA CTA TGG AGG TAC GGG CAG CCC CTC3'.
• Das PCR-Produkt wurde gereinigt und nach dem oben für Konstrukt 1 beschriebenen Verfahren in pAC373 kloniert.
• Die oben dargestellte Beschreibung umfaßt verschiedene Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung, von denen angenommen wird, daß sie für den Fachmann leicht faßlich sind. Wir glauben, daß solche Modifikationen und Änderungen der erfindungsgemäßen zusammensetzungen und Verfahren in den Schutzbereich der beigelegten Ansprüche fallen.

Claims (8)

1. Wirtszelle mit einer rekombinanten DNA-Sequenz, die für PACE, das Enzym, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt, codiert und operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression von PACE gestattet, wobei das PACE aus der Gruppe vollständiges PACE und PACE ohne Transmembrandomäne ausgewählt ist; sowie eine Polynukleotidsequenz, die für ein Vorstufenpolypeptid codiert, wobei das Vorstufenpolypeptid als Substrat für das codierte PACE dient, und welche operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression des Proteinprodukts des Vorstufenpolynukleotids durch die Wirtszelle gestattet.

2. Wirtszelle gemäß Anspruch 1, bei der die rekombinante DNA-Sequenz die Nukleinsäuresequenz von Figur 1 oder 2 enthält.

3. Wirtszelle gemäß Anspruch 2, wobei das Proteinprodukt aus der Gruppe Vorstufe eines Proteins, das für biologische Aktivität gamma-Carboxylierung erfordert, Vorstufenpolypeptid eines Blutgerinnungsproteins, Faktor IX, Protein C, Protein S, Prothrombinfaktor 10, Faktor VII, gamma-Carboxyglutamatprotein aus Knochen, von-Willebrand-Faktor, morphogenes Protein 2 aus Knochen, Tumorwachstumsfaktor β und Wachstumsfaktor aus Blutplättchen ausgewählt ist.

4. Rekombinanter Expressionsvektor, der zur Expression in einer ausgewählten Wirtszelle geeignet ist, mit einer DNA-Sequenz, die für PACE, das Enzym, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt, codiert, wobei die für PACE codierende Sequenz operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression von PACE gestattet, wobei das PACE aus der Gruppe vollständiges PACE und PACE ohne Transmembrandomäne ausgewählt ist; sowie einer Polynukleotidsequenz, die für ein Vorstufenprotein codiert, welches als Substrat für PACE dient, und welche operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression des Proteinprodukts gestattet.

5. Vektor gemäß Anspruch 6, wobei das Proteinprodukt aus der Gruppe Vorstufe eines Proteins, das für biologische Aktivität gamma-Carboxylierung erfordert, Vorstufenpolypeptid eines Blutgerinnungsproteins, Faktor IX, Protein C, Protein S, Prothrombin faktor 10, Faktor VII, gamma-carboxyglutamatprotein aus Knochen, von-Willebrand- Faktor, morphogenes Protein 2 aus Knochen, Tumorwachstumsfaktor P und Wachstumsfaktor aus Blutplättchen ausgewählt ist.

6. Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute eines biologisch aktiven Proteins, wobei man eine Wirtszelle mit (a) einer DNA-Sequenz, die für PACE, das Enzym, das paarweise auftretende basische Aminosäuren umwandelt, codiert und die operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression von PACE gestattet, sowie (b) einer für ein Vorstufenpolypeptid codierenden Nukleotidsequenz, wobei das Vorstufenpolypeptid als Substrat für PACE dient, die operativ mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verbunden ist, die die Expression dieses Proteins gestattet, kultiviert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei man die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die eine Spaltung des Vorstufenpolypeptids durch das exprimierte rekombinante PACE gestatten.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe Eukariontenzelle, Säugetierzelle, Ovarienzelle des Chinesischen Hamsters, Insektenzelle, Bakterienzelle und Hefezelle ausgewählt ist.