NL9000917A

NL9000917A - Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van (precursor) eiwitten en voor de (micro) biologische bereiding van eiwitten.

Info

Publication number: NL9000917A
Application number: NL9000917A
Authority: NL
Original assignee: Holland Biotechnology
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1990-04-18
Publication date: 1991-05-16
Also published as: FI921847L; DE69029663D1; ES2099714T5; ATE147437T1; CA2069929A1; JP3191111B2; JPH05504051A; DK0497828T4; EP0497828B1; ES2099714T3; EP0497828A1; DE69029663T3; WO1991006314A2; US5989856A; FI105348B; GR3023013T3; DE69029663T2; EP0693286A1; DK0497828T3; FI921847A0

Description

Nw 3133 BESCHRIJVING

Farmaceutisch preparaat met endoproteolytische activiteit; werkwijze voor endoproteolytische processing van (precursor) eiwitten en voor de (micro)biologische bereiding van eiwitten

De uitvinding heeft zowel betrekking op een farmaceutisch preparaat, dat een endoproteolytische activiteit bezit, als op een werkwijze voor de (micro)biologische bereiding van een eiwit en voor het in vitro klieven van een eiwit, in het bijzonder een precursor-eiwit, door het eiwit met een endoproteolytisch werkzaam enzym te behandelen.

De hierin beschreven uitvinding vloeit voort uit een nader onderzoek naar de mogelijke fysiologische betekenis van furine, een in de Europese octrooiaanvrage EP-A-0 246 709 beschreven humaan eiwit dat het expressieprodukt is van het in het genoom stroomopwaarts van het humane fes/fps proto-oncogen gelegen fur~ gen. Uit de genoemde octrooiaanvrage en andere publikaties van dezelfde research groep (Roebroek et al, Molec. Biol. Rep. 12., 1986, 117-125; Roebroek et al, EMBO J. £, 1986, 2197-2202; en . Schalken et al, J. Clin. Invest. M, 1987, 1545-1549) blijkt dat op basis van de toen beschikbare, beperkte DNA gegevens niet de functie van het produkt van het fur-gen kon worden vastgesteld. Wel kon worden bepaald dat het furine waarschijnlijk een aan membranen geassocieerd eiwit is dat een functie heeft waarbij bepaalde herkenningsstrukturen een rol spelen. Ook is destijds waargenomen dat het fur-gen als een 4,5 kb mRNA tot expressie komt in lever, nier, milt, thymus en hersenen, terwijl echter de expressie in longweefsel zeer gering is; in niet kleincellige longcarcinomen bleek daarentegen een sterk verhoogde expressie op te treden, op grond waarvan een bruikbaarheid van het fur-gen als tumor-marker is gesuggereerd.

In het kader van het bovenstaand aangeduide onderzoek is inmiddels de volledige nucleotidenvolgorde van een genomisch DNA fragment van ongeveer 21 kbp, waarin het fur-gen gelegen is, bepaald (Van den Ouweland et al, Nucl. Acids Res. 12, 1989, 7101-7102), terwijl ook de nucleotidenvolgorde van het corresponderende fur cDNA is bepaald (Van den Ouweland et al, Nucl. Acids Res. 1&, 1990, 664). Op basis daarvan is het nu mogelijk om het fim-gen volledig te karakteriseren, zowel op het niveau van genomische organisatiestruktuur als ook op het niveau van de coderende sequenties. Uit deze coderende nucleotiden-sequenties kan voorts ook de aminozurenvolgorde van het furine worden afgeleid.

Een computeranalyse van deze aminozurenvolgorde heeft nu verrassenderwijze aan het licht gebracht dat furine een grote verwantschap vertoont met subtilisine-achtige proteasen zoals in gist worden gecodeerd door het KEX1 gen van Kluyveromyces lactis en het KEX2 gen van Saccharomvce.s cerevisiae en dat furine kennelijk de hoger-eukaryotische vorm (gevonden bij de mens en bij dieren, zoals aap, kat, rat, muis, kip, en Drosophila) van deze endoproteasen is. Meer in het bijzonder is gebleken, dat het furine een bepaalde mate van homologie vertoont met het katalytische domein van de tot op heden beschreven bacteriële subtilisinen (ca. 20 enzymen) zoals thermitase van Thermoactinomyces vulgaris en subtilisine BPN' van Bacillus amyloliquefaciens, en een opvallend grote homologie vertoont met subtilisine-achtige proteasen zoals het expressieprodukt van het KEX1 gen van de gist Kluyveromyces lactis en het expressie-produkt van het KEX2 gen van de gist Saccharomyces cerevisiae. Het 794 aminozuren bevattende furine vertoont in het gebied van de aminozuren 97 tot 577 een overall homologie van ca. 80,0% met de aminozuren 123-584 van het expressieprodukt van het genoemde KEX1 gen (nl. 41,6% identieke aminozuren en 38,3% conservatieve vervangingen) en een overall homologie van ca. 78,9% met de aminozuren 134-597 van het expressieprodukt van het genoemde KEX2 gen (nl. 39,4% identieke aminozuren en 39,5% conservatieve vervangingen). Deze aminozuurgebieden van de gistproteasen omvatten de subtilisine-achtige katalytische domeinen. Het subtilisine-achtige domein van furine bevindt zich in een amino-terminaal furine-fragment, omvattende de aminozuren 108-464.

Voor de hier genoemde subtilisine-achtige proteasen wordt naar de volgende publikaties verwezen: Tanguy-Rougeau et al, FEBS Letters 234. 1988, 464-470; Mizuno et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 156. 1988, 246-254; Meloun et al, FEBS Letters 183, 1985, 195-200; Markland et al, J. Biol. Chem. 242. 1967, 5198-5211; Mizuno et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 159. 1989, 305-311; Bathurst et al, Science 235, 1987, 348-350; Thomas et al, Science 241. 1988, 226-230; Foster et al, Biochemistry 29. 1990, 347-354; Fuller et al, PNAS USA ££, 1989, 1434-1438;

Julius et al, Cell ül, 1984, 1075-1089; Bourbonnais et al, J. Biol. Chem. 263. 1988, 15342-15347; Cosman et al, Dev. Biol. Stand. Jü, 1988, 9-13; Schubert Wright et al, Nature 221. 1969, 235-242; Cunningham et al, Yeast 5., 1989, 25-33; Davidson et al, Nature 333. 1988, 93-96.

Zoals uit de bovenstaand vermelde publikaties blijkt, is vooral het expressieprodukt van het KEX2 gen van de gistsoort Saccharomyces cerevisiae goed bestudeerd en gekarakteriseerd.

Het is een membraan-geassocieerd, van calciumionen afhankelijk endopeptidase met een enzym-specificiteit voor gepaarde basische aminozuurresiduen; substraateiwitten worden door dit als een "restrictie"-endopeptidase aan te duiden enzym (naar analogie van de naamgeving bij restrictie-endonucleasen waarbij een bepaalde nucleotidenvolgorde bepalend is voor splitsing van het-DNA) gekliefd op de carboxyl plaats van paren van basische aminozuren die arginine bevatten. De locatie van het enzym is waarschijnlijk in een struktuur van het Golgi complex. Het subtilisine-achtige domein en de Ca2+-activeringssequenties liggen in het aminoterminale deel van het eiwit. In de gist Saccharomyces cerevisiae is het endopeptidase betrokken bij de proteolytische processing van voorlopers (precursors) van killer toxine en paringsferomoon alfa factor, d.w.z. van pro-killer toxine en pro-alfa factor. Het endopeptidase blijkt verder in staat tot een correcte klieving van de muize-neuroendocrine-peptide precursor prepro-opiomelanocortine na introductie in bepaalde mutante zoogdiercellijnen met gestoorde proteolytische processing, alsmede in staat tot processing van proalbumine tot rijp albumine en in staat tot processing van de precursor van het plasma C-eiwit.

Op grond van de gevonden overeenkomsten tussen de genoemde bekende endopeptidasen en het furine wordt gepostuleerd dat het furine een restrictie-endopeptidase is dat voor de processing van eiwitten, meer in het bijzonder de processing van precursor-eiwitten van polypeptide hormonen, groeifactoren, toxinen, enzymen, of andere typen van biologisch relevante eiwitten kan worden gebruikt. Hierbij kan enerzijds worden gedacht aan een toepassing in vitro, anderzijds aan een toepassing in vivo, waaronder een toepassing in het kader van een therapeutische behandeling. Voor dergelijke toepassingen zal het humane furine geschikter kunnen zijn dan de genoemde bekende endopeptidasen van niet-humane herkomst, of meer in het algemeen een dierlijk "furine" geschikter kunnen zijn dan een endopeptidase afkomstig van lagere organismen. Hetzelfde geldt voor nog niet geïsoleerde analoga of verwanten van furine, hierin aangeduid als furine-achtige enzymen, behorende tot een grotere familie van restrictie-endoproteolytische enzymen waarvan furine de eerst gevonden vertegenwoordiger is. De verschillende leden van deze familie zullen grote structurele gelijkenis vertonen, hoewel de sequentiehomologie zeer beperkt kan zijn, mogelijk zelfs beneden 50% homologie. Binnen deze familie zullen verschillende enzymklassen kunnen worden onderscheiden, zoals een groep van . furine-achtige enzymen die betrokken zijn bij processing van constitutief gesecreteerde eiwitten en een groep van furine-achtige enzymen die betrokken zijn bij processing van eiwitten waarvan de secretie gereguleerd is (secretie via secretoire granula).

Via recombinant DNA technieken is het mogelijk om grote hoeveelheden van het eiwit furine in handen te krijgen. In prokaryoten kan het fur gen tot expressie gebracht worden als een fusie-eiwit met beta-galactosidase (pUR vectorsysteem) of het anthranilaat synthetase (pATH vectorsysteem). Een andere mogelijkheid is de synthese van het fusie-eiwit glutathion-S-transferase-furine (pGEX). Het voordeel van deze benadering is dat het furine afgesplitst kan worden met behulp van thrombine. Het furine kan in prokaryoten ook als zodanig gesynthetiseerd worden door het cDNA op de juiste wijze achter een geschikte promoter te plaatsen. Het pUR en pATH vectorsysteem zijn in de reeds genoemde Europese octrooiaanvrage beschreven. pGEX is commercieel verkrijgbaar. Gebruikmakend van de sterke SV4 0-promoter kan het fur cDNA in geschikte eukaryotische cellen tot expressie gebracht worden. In verband met glycosylering van het eiwit heeft deze benaderingswijze voor bepaalde doeleinden de voorkeur.

De opzuivering van furine kan geschieden volgens standaard biochemische technieken in aanwezigheid van protease-remmers. Furine is actief in een relatief zuur milieu met een pH van 5,5, zoals dat voorkomt in secretoire granula, maar ook bij pH 7,5 behoudt het eiwit zijn activiteit. Hierdoor kan in vitro gebruik gemaakt worden van een 0,2 M natriumacetaat-buffer (pH 5,5) of Tris-HCl buffer (pH 7,0). De activiteit van het enzym furine is afhankelijk van de aanwezigheid van Ca2+ ionen. Voor de in vitro enzym-activiteit blijkt een calcium-concentratie van 2-5 mM optimaal. De aanwezigheid van metaalchelatoren als EDTA zal de activiteit van furine sterk remmen. Verder moet de aanwezigheid van zware metaal-ionen als Zn2+, Hg2+ en Cu2+ vermeden worden. De stof o-fenanthroline bindt zware metalen behalve Ca2+ en heeft zo geen negatieve invloed op de enzymatische activiteit van furine. Lage concentraties van fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en diisopropylfluorofosfaat (DFP) tot 5 mM hebben geen remmende invloed. Bij hogere concentraties PMSF wordt de enzym functie wel geremd. Een in vitro incubatie gedurende twee uur bij 37°C is voldoende voor de processing van het te klieven eiwit.

Furine kan gebruikt worden voor de endoproteolytische processing van diverse eiwitten. Hierdoor is het o.a. mogelijk om in vitro geproduceerde precursor-eiwitten specifiek te klieven zodat biologisch actieve preparaten ontstaan die mogelijk hun toepassing kunnen vinden als geneesmiddel voor de behandeling van ziekten waarbij de splitsing van de precursors niet of in onvoldoende mate plaatsvindt. Algemeen kan gesteld worden dat furine bruikbaar is bij de processing van 'biologisch relevante eiwitten.

Ook kan het eiwit furine zijn toepassing vinden als een geneesmiddel, waardoor patiënten die deficiënt zijn voor een endoprotease behandeld kunnen worden door toediening van furine, waardoor alsnog een adequate processing van precursor-eiwitten mogelijk is. Hierdoor kunnen de klievingsproducten hun functie uitvoeren en zal het eventueel storend hoge gehalte aan precursor-eiwitten verlaagd kunnen worden.

Furine is mogelijk ook toepasbaar voor het opruimen van deposities met substraat-eiwitten in bijv. de bloedbaan, zodat obstructies van vitale organen verholpen kunnen worden door het toedienen van furine.

Furine. is verder ook toepasbaar bij commerciële productie van allerlei biologisch actieve stoffen (bijv. andere enzymen) indien processing daarin een productie-stap is.

De uitvinding betreft op de eerste plaats een farmaceutisch preparaat, dat een of meer farmaceutisch aanvaardbare dragers, verdunningsmiddelen of hulpstoffen, alsmede een endoproteoly-tisch werkzame hoeveelheid van furine of van een furine-achtig enzym, of een endoproteolytische activiteit bezittend fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym omvat.

De proteolytische activiteit blijft ook behouden als de carboxy-terminale regio met daarin het transmembraan domein is afgesplitst. In plaats van het complete furine of furine-achtige enzym kan derhalve volgens de uitvinding ook gebruik worden gemaakt van een fragment van het enzym dat nog het deel, dat voor de proteolytische activiteit verantwoordelijk is, bevat.

Een geschikt fragment is bijv. het furine-fragment, dat bestaat uit de aminozuren 108-464.

De activiteit van het furine of furine-achtige enzym, of van een endoproteolytisch werkzaam fragment daarvan, kan voorts door het aanbrengen van mutaties gemanipuleerd worden. Daarom strekt de uitvinding zich ook uit over derivaten van furine of furine-achtig enzym, die nog endoproteolytische activiteit bezitten.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm volgens de uitvinding van een dergelijk farmaceutisch preparaat is het furine of het furine-achtige enzym, of het endoproteolytische activiteit bezittende fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym, dat in het preparaat wordt toegepast, verkregen uit prokaryotische dan wel eukaryotische cellen, die door genetische manipulatie met recombinant DNA of RNA het vermogen hebben verkregen om het furine, furine-achtig enzym, fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym al dan niet in de vorm van een fusie-eiwit tot expressie te brengen, waarbij in het geval, dat het furine, furine-achtig enzym, fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym door de cellen als een fusie-eiwit wordt geproduceerd, een opwerking van het fusie-eiwit heeft plaatsgevonden waarbij het furine, furine-achtig enzym, fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym van het fusie-eiwit is afgesplitst.

Een andere mogelijkheid is echter dat men als bron voor het furine of furine-achtig enzym, cellen gebruikt die van nature in staat zijn om het furine resp. het furine-achtige enzym te produceren, bijv. een geschikte tumor-cellijn.

Een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding betreft een farmaceutisch preparaat dat furine zelf bevat.

Een alternatieve bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding betreft een farmaceutisch preparaat, bevattende een aminoterminaal fragment van furine, dat ten minste de aminozuren 108-464 van furine omvat.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het in vitro klieven van een eiwit door het eiwit met een endo-proteolytisch werkzaam enzym te behandelen, waarbij het eiwit volgens de onderhavige uitvinding in tegenwoordigheid van Ca2+ ionen wordt behandeld met furine of een furine-achtig enzym, dan wel een endoproteolytisch werkzaam fragment, derivaat of fusie-eiwit van furine of furine-achtig enzym als endoproteolytisch werkzaam enzym.

De behandeling zal gewoonlijk bij fysiologisch optredende pH en temperatuur waarden worden uitgevoerd, d.w.z. bij een pH binnen het bereik van 4-9 en bij een temperatuur van ca. 37°C.

Het heeft hierbij de voorkeur dat de behandeling bij een pH van 5-7,5, bij voorkeur 5,5-7,0, wordt uitgevoerd.

Ook heeft het volgens de uitvinding de voorkeur dat de behandeling wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 20-50 °C, bij voorkeur 30-40 °C.

Voorts heeft het volgens de uitvinding de voorkeur dat de behandeling bij een calcium concentratie van 1-10 mM, bij voorkeur 2-5 mM, wordt uitgevoerd.

Volgens een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt de behandeling uitgevoerd in tegenwoordigheid van o-fenanthroline of een equivalent middel voor het binden van ionen van andere zware metalen dan calcium.

De werkwijze volgens de uitvinding omvat een behandeling van een te processen substraat als zodanig met furine (of met een furine-achtig enzym) als zodanig, d.w.z. furine in een geïsoleerde of gezuiverde vorm, maar omvat ook een behandeling met of binnen cellen, in het bijzonder genetisch gemanipuleerde zoogdiercellen waarin furine tot expressie komt. Bij voorkeur gaat het hierbij om zorgvuldig geselecteerde, genetisch gemanipuleerde zoogdiercellen (zoals COS-1 cellen, CHO cellen en endotheelcellen) met een sterke expressie van zowel het fur gen als van een voor het te processen substraat coderend gen. Zoals aan de deskundige bekend is, kan een sterk verhoogde expressie door gen-amplificatie of door gebruik van sterke promoters worden gerealiseerd. De uitvinding strekt zich zelfs uit tot toepassingen, waarbij sprake is van transgene dieren, en is dus niet beperkt tot in vitro eiwitproduktie- en eiwitklievings-werkwijzen. De uitvinding omvat derhalve ook zoogdiercellen en zoogdieren, die van recombinant DNA afkomstig DNA, coderend voor furine of furine-achtig enzym, omvatten en tot expressie van het furine of furine-achtig enzym in staat zijn. Als zoogdiercellen zijn bijv. vooral endotheelcellen ideaal voor transport van therapeutische genen en genprodukten door het lichaam vanwege hun distributie over het gehele lichaam (aan het oppervlak van bloedvaten, longweefsel, e.d.) en vanwege hun interactie met allerlei componenten in de circulatie van lichaamsvloeistoffen (de bloedbaan e.d.). Zo zouden endotheelcellen van een patiënt die lijdt aan een of andere ziekte, die het gevolg is van een storing in de processing van pro-eiwitten, na isolatie uit het lichaam genetisch gemanipuleerd kunnen worden om de storing door introductie van een werkzaam fur gen op te heffen en vervolgens zouden de genetisch veranderde cellen weer bij de patiënt terug getransplanteerd kunnen worden. Een dergelijke gentherapie is echter niet tot endotheelcellen beperkt.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding bestaat uit een werkwijze voor de (micro)biologische bereiding van een eiwit door genetisch gemanipuleerde cellen te kweken, die een pro-vorm van het eiwit alsmede furine tot expressie brengen, en eventueel het gevormde eiwit te isoleren. Hierbij kunnen zowel prokaryo-tische als eukaryotische cellen worden gebruikt, waarbij cellen van hogere eukaryoten de voorkeur hebben. Men kan bijv. gist-cellen of liever nog plantecellen gebruiken. Het heeft evenwel in het bijzonder de voorkeur dat men genetisch gemanipuleerde zoogdiercellen gebruikt.

Met de woorden "pro-vorm" wordt gedoeld op een vorm van het eiwit die nog door processing in het gewenste eiwit moet of kan worden omgezet. Hierbij kan het gaan om een natuurlijke pro- of prepro-vorm van het eiwit, maar ook om een kunstmatige pro-vorm, die het gevolg is van een recombinant DNA construct waarbij het voor het gewenste eiwit coderende gen wordt voorafgegaan door een toegevoegde signaal- of leadersequentie.

Wat de te processen substraten betreft, zullen in het algemeen eiwitten met gepaarde basische aminozuurresiduen als substraat kunnen dienen. De bijkomende aanwezigheid van een basisch aminozuurresidu op de -4 positie ten opzichte van de splitsingsplaats (dus 4 plaatsen vóór de splitsingsplaats) zal daarbij tot een grotere efficiëntie leiden. Als voorbeelden van mogelijke substraten voor processing door furine worden, zonder volledigheid te pretenderen, genoemd: groeifactoren zoals β-Nerve Growth Factor (β-NGF) en insuline, stollingsfactoren zoals von Willebrand Factor, Protein C en Factor X, hormonen en neuropeptiden zoals Proopiomelanocortine, Proenkephaline, Prodynorphine, Provasopressine, Prooxytocine, ProCRF (corticotropine releasing factor), ProGRF (growth hormone releasing factor), Prosomato- statine, Proglucagon, Procalcitonine, ProCGRP (calcitonine gene-related peptide), ProVIP (vasoactive intestinal peptide), Procaerulin en ProELH (egg laying hormone), interleukines, interferonen, en hematopoietische factoren.

De uitvinding kan ook worden toegepast bij proteïnen die op zichzelf geen endoproteolytische processing behoeven. Hierbij valt te denken aan genconstructen waarbij een voor het gewenste eiwit coderende sequentie om redenen van een goede processing (glycosylering) of een gemakkelijke opzuivering (uitscheiding) is gekoppeld aan een geschikte signaalsequentie, zoals bijv. eerder voor de produktie van erythropoietine in gistcellen is voorgesteld door Elliott et al., Gene 7£, 1989, 167-180. In die publikatie wordt een genconstruct beschreven uit de leader regio van prepro-alpha factor, geplaatst voor de erythropoietine sequentie. De processing van de verkregen kunstmatige precursor geschiedt in de gistcellen door het daarin aanwezige KEX2 gen-produkt.

Een nadere toelichting van de uitvinding wordt gegeven aan de hand van de bijbehorende figuren.

Figuur 1 toont de aminozuurvolgorde (in de éénlettercode) van het uit 794 aminozuren bestaande furine.

Figuur 2 toont op schematische wijze het furine gen, cDNA en eiwit.

a. Genomische organisatie van een deel van het fur gen. Exon 1 (ca.120 bp) ligt 7,2 kb stroomopwaarts van exon 2. Het sterretje boven exon 2 toont de positie van het initiatiecodon en de pijlkop boven exon 16 het stopcodon. Niet-coderende sequenties zijn door zwarte boxen weergegeven. B=BamHI: E=E£qRI; K=KpnI; S=Sa1I; P=PstI: X=XbaI.

b. Schematische verdeling van exons in het cDNA van fur.

c. De vermeende localisatie van de verschillende eiwitdomeinen in furine. Het grootste exon (exon 16) codeert voor bijna het gehele Cys-rijke domein, het transmembraan domein en het cyto-plasmische domein. De exons 2-12 coderen voor de vermoedelijke prepro en katalytische domeinen, met codons voor de actieve site residuen Asp46 (D), His87 (H) en Ser261 (S) resp. in exons 5, 7 en 10. Deze intron/exon verdeling is van eenzelfde complexiteit als in de trypsine familie van serine proteasen is waargenomen. Vertikale pijlen wijzen op paren van basische residuen (Arg-Arg, Lys-Arg) die potentiële autoprocessing sites zijn; de paren van basische aminozuurresiduen Arg3l0-Lys311 en Arg341-Lys342 zijn mogelijk betrokken in proteolytische splitsing. Aangenomen wordt dat de N-terminus van het rijpe eiwit begint bij aminozuurresidu 108, direct achter het triplet van potentiële splitsingsplaatsen (Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg) omdat gebleken is dat een arginine residu (Argl04) op de -4 positie ten opzichte van de voorgestelde splitsingsplaats de efficiency van de splitsing verhoogt.

De gebieden waarin de aminozuursequenties van furine, Kexl (Kiuweromvces lactls) en Kex2 (fiacchaEQroy.ces. cerevisiae) gelijkenis vertonen, omvatten delen van het prepro domein, het gehele katalytische domein (47% identiteit in 322 residuen) en het gehele middendomein (26-31% identiteit in 138 residuen). In het transmembraandomein en het cytoplasmische domein is niet sprake van een significante gelijkenis, terwijl het Cys-rijke domein niet voorkomt in de twee gisteiwitten.

Figuur 3 bevat een vergelijking van de aminozuurvolgorden van (hfur) humaan furine, (kexl) Kexl protease, (kex2) Kex2 protease, (ther) thermitase, (subC) subtilisine Carlsberg, en (subB) subtilisine BPN'.

Aan de rechterkant wordt de nummering van de aminozuurresiduen vanaf de vermoedelijke N-terminus van de rijpe enzymen gegeven, en voor furine ook langs de bovenzijde. Waarschijnlijk heeft furine een prepro segment van 107 residuen, dat eindigt met de sequentie Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg, waarin drie potentiële splitsingsplaatsen voor auto-activering voorkomen.

(T) identieke residuen en (.) conservatieve substituties in alle zes de sequenties; (:) identieke residuen in ten minste vier van de sequenties. Paren van basische residuen in furine, Kexl en Kex2 zijn met kleine letters aangegeven. De ordening van de sequenties is gebaseerd op een meervoudige ordening van meer dan 20 leden van de subtilisine familie van serine proteasen en een superpositie van de door middel van röntgenkristallografie bepaalde driedimensionale strukturen van thermitase, subtilisine Carlsberg en subtilisine BPN'. Deze superpositie van driedimen sionale strukturen leidt tot een uitgebreide consensus kern, getoond door vette balken, met afstanden tussen topologisch equivalente Ca-atomen van minder dan 1,5 A. Aan alle drie de eiwitten gemeenschappelijke secundaire s;truktuurelementen zijn aangeduid als (a) a-helix, (β) β-plaat, (t) β-turn en (s) bend.

Residuen, waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij de substraat- of inhibitorbinding in thermitase, subtilisine Carlsberg en subtilisine BPN', via hoofdketen- or via zijketen-interacties, zijn met een sterretje aangeduid. Essentiële residuen van de actieve site (D, H en S) en van het oxyanion gat (N) zijn onderstreept. De met de sterkste Ca-ionen bindings-plaatsen in thermitase corresponderende lussen zijn met <==Ca==> aangegeven.

Grenzen van exons die coderen voor sequenties van het vermoedelijke katalytische domein van furine liggen achter de residuen 17, 60, 86, 115, 173, 244, 278, 311 en 352.

Figuur 4 toont een schematisch model van het katalytische domein van furine. Het model is gebaseerd op een lint-weergave van subtilisine. De actieve site, bestaande uit de residuen Asp46, His87 en Ser26l, bevindt zich in het midden aan de bovenkant. De C-terminale uitbreiding (streepjeslijnen) met daarin verdere domeinen begint aan de tegenovergestelde zijde van het katalytische domein.

Voorspelde posities van 8 korte inserties (vetgedrukt), waaronder een verlengde N-terminus, ten opzichte van subtilisine bevinden zich in aan het oppervlak gelegen lussen en in verbindingen tussen geconserveerde α-helix en β-plaat secundaire struktuurelementen.

Voorspelde posities van twee stabiliserende calcium-ionen, Cal en Ca2 als in thermitase, zijn met gearceerde bollen aangegeven in de uitwendige lussen 98-105 resp. 68-77. Alle zijketen-carboxylgroepen, die voor de coördinatie van deze twee calciumionen als in thermitase nodig zijn, zijn ook in furine in topologisch equivalente residuen in deze lussen aanwezig; verder zijn Asp8 en Asp55 aanwezig voor coördinatie van Cal als in thermitase en subtilisine.

Voorspelde disulfidebruggen Cysl04-Cys253 en Cysl96-Cys226 (of Cysl98-Cys226) zijn met stippellijnen aangegeven.

Negatief geladen zijketengroepen aan de substraat bindende zijde (bovenzijde) van het furine molekuul zijn getekend als gevorkte stelen en corresponderen met de residuen 46, 47, 84, 121, 123, 126, 150, 151, 152, 192, 194, 199, 241, 248, en 255.

De meeste van deze ladingen zijn niet aanwezig in equivalente posities in subtilisinen en thermitase. Veel van deze negatief geladen residuen zouden een directe interactie met gepaarde basische residuen in het substraat kunnen geven, omdat ze waarschijnlijk in of nabij de PI en P2 bindingspockets voor lysine en/of arginine liggen.

Het voor het katalytische domein van furine beschreven model is ook geldig voor de Kexl en Kex2 proteasen omdat in essentie alle hierboven beschreven belangrijke elementen in alle drie de eiwitten aanwezig zijn.

Figuur 5 toont schematisch de strukturele organisatie van prepro-vWF van wild type von Willebrand Factor (bovenste deel) en prepro-vWFgly763 van de mutant vWFgly763 (onderste deel). Inwendige homologe domeinen zijn met open boxen aangegeven; Al, A2 en A3 vertegenwoordigen een verdrievoudigd domein; in B zijn de homologe domeinen Bl, B2 en B3 belichaamd; Cl en C2 vertegenwoordigen een gedupliceerd domein; Dl, D2, D3 en D4 vertegenwoordigen vier herhaalde domeinen en D’ vertegenwoordigt een gedeeltelijk gedupliceerd domein. De getrokken lijn duidt op de overige aminozuursequenties. Het aminoterminale deel bevat een signaalpeptide van 22 aminozuurresiduen. De uit een paar basische aminozuurresiduen bestaande proteolytische splitsings-plaats achter het arginineresidu op positie 7 63 is met een pijl gemarkeerd. De nucleotidensequentie van het DNA gebied rondom de splitsingsplaats is aangegeven, terwijl ook de daaruit afgeleide aminozurensequentie (in de éénlettercode) is gegeven. De punt-mutatie in pro-vWFgly763 is met een sterretje aangeduid.

Thans volgt een voorbeeld van een werkwijze volgens de uitvinding, waarbij van de endoproteolytische activiteit van furine gebruik wordt gemaakt in de processing van de precursor van de von Willebrand Factor (pro-vWF) als substraat. Voor de struktuur van prepro, pro en rijp vWF wordt verwezen naar Verweij et al-, EMBO J. ϋ, 1986, 1839-1847, en Verweij et al., J. Biol. Chem. 263. 1988, 7921-7924. Pro-vWF bestaat uit een pro-polypeptide (741 aminozuurresten) en, aan de C-terminus, rijp vWF (2050 aminozuurresten). Zoals in de bovengenoemde publikaties is uiteengezet ontstaat rijp vWF uit pro-vWF door proteolytische processing naast het paar basische aminozuren Lys762-Arg763 en zijn COS-1 cellen een geschikte gastheer voor de synthese van constitutief uitgescheiden vWF na transfectie van volle-lengte prepro-vWF cDNA. De activiteit van furine in endoproteolytische processing werd zowel voor pro-vWF als voor de in de genoemde literatuur beschreven mutant pro-vWFgly763 getest. Het voor deze mutant pro-vWFgly7 63 coderende DNA bevat een guanosine in plaats van een adenosine op de positie 2407 van volledige-lengte prepro-vWF cDNA. Als gevolg van deze mutatie is de knipplaats Lys762-Arg763 van het propolypeptide vervangen door Lys762-Gly763 in de pro-vWF precursor eiwit mutant.

In transfectie-experimenten met 10 μρ pSVLvWF DNA werden in het geconditioneerde medium het 360 kDa pro-vWF precursor eiwit en het 260 kDa rijpe vWF eiwit aangetroffen in vrijwel gelijke hoeveelheden. Het pSVLvWF DNA is in de genoemde publikaties beschreven, evenals de wijze waarop de DNA transfectie van de COS-1 cellen, de radiolabelling van de cellen en de immuno-precipitatie analyse van vWF-verwante eiwitten in gelabelde kweekmedia en cellysaten worden uitgevoerd. De vorming van rijp vWF in de door transfectie verkregen cellen wordt toegeschreven aan een processing door endogeen furine, dat blijkens immuno-precipitatie analyse met een polyklonaal konijne anti-furine serum in COS-1 cellen tot expressie komt.

In soortgelijke transfectie-experimenten van COS-1 cellen met 10 μg pSVLvWFgly763 DNA bleek dat pro-vWFgly763 werd gevormd en constitutief in het kweekmedium werd uitgescheiden als een 360 kDa eiwit. Van een endoproteolytische processing tot rijp vWF (260 kDa) was geen sprake.

Hetzelfde resultaat werd gevonden wanneer een cotransfectie van 5 μg pSVLvWFgly763 DNA en 5 μg pSVLfur DNA werd uitgevoerd. Het pSVLfur DNA bestaat uit volledige-lengte fur cDNA (4,1 kb, beginnend 117 nucleotiden stroomopwaarts van het ATG startcodon en eindigend 21 nucleotiden stroomafwaarts van de poly-A additie site) dat in de EcoRI site van pSVL is gekloneerd. Er werd geen processing van pro-vWFgly763 tot rijp vWF waargenomen.

Daarentegen werd bij cotransfectie van COS-1 cellen met 5 μg pSVLvWF DNA en 5 μg pSVLfur DNA een volledige processing van pro-vWF tot rijp vWF gevonden.

Claims

1. Farmaceutisch preparaat, omvattende een of meer farmaceutisch aanvaardbare dragers, verdunningsmiddelen of hulpstoffen, alsmede een endoproteolytisch werkzame hoeveelheid van furine of van een furine-achtig enzym, dan wel van een endoproteolytische activiteit bezittend fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym.

2. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 1, bevattende furine of een furine-achtig enzym, of een endoproteolytische activiteit bezittend fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym, verkregen uit prokaryotische dan wel eukaryotische cellen, die door genetische manipulatie met recombinant DNA of RNA het vermogen hebben verkregen om het furine, furine-achtig enzym, fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym al dan niet in de vorm van een fusie-eiwit tot expressie te brengen, waarbij in het geval, dat het furine, furine-achtig enzym, fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym door de cellen als een fusie-eiwit wordt geproduceerd, een opwerking van het fusie-eiwit heeft plaatsgevonden waarbij het furine, furine-achtig enzym, fragment of derivaat van furine of furine-achtig enzym van het fusie-eiwit is afgesplitst.

3. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 1 of 2, bevat- · tende furine zelf.

4. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 1 of 2, bevattende een aminoterminaal fragment van furine, dat ten minste de aminozuren 108-464 van furine omvat.

5. Werkwijze voor het in vitro klieven van een eiwit door het eiwit met een endoproteolytisch werkzaam enzym te behandelen, waarbij het eiwit in tegenwoordigheid van Ca2+ ionen wordt behandeld met furine of een furine-achtig enzym, dan wel een endoproteolytisch werkzaam fragment, derivaat of fusie-eiwit van furine of furine-achtig enzym, als endoproteolytisch werkzaam enzym.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij de behandeling bij een pH van 5-7,5, bij voorkeur 5,5-7,0, wordt uitgevoerd.

7. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, waarbij de behandeling bij een calcium concentratie van 1-10 mM, bij voorkeur 2-5 mM, wordt uitgevoerd.

8. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 5-7, waarbij de behandeling wordt uitgevoerd in tegenwoordigheid van o-fenanthroline of een equivalent middel voor het binden van ionen van andere zware metalen dan calcium.

9. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 5-8, waarbij de behandeling wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 20-50 °C, bij voorkeur 30-40 °C.

10. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 5-9, waarbij de behandeling wordt toegepast op een precursor-eiwit van een polypeptide hormoon, een groeifactor, een toxine, een enzym, of een ander type biologisch relevant eiwit.

11. Werkwijze voor de (micro)biologische bereiding van een eiwit door genetisch gemanipuleerde cellen te kweken, die een pro-vorm van het eiwit alsmede furine of een furine-achtig enzym tot expressie brengen, en eventueel het gevormde eiwit te isoleren.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij men genetisch gemanipuleerde zoogdiercellen gebruikt.

13. Zoogdiercel, die van recombinant DNA afkomstig DNA omvat dat codeert voor furine of een furine-achtig enzym en die tot expressie van het furine of furine-achtig enzym in staat is.

14. Zoogdier, dat van recombinant DNA afkomstig DNA, coderend voor furine of een furine-achtig enzym, omvat en dat in een of meerdere soorten cellen tot expressie van het furine of furine-achtig enzym in staat is.