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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung eines getrockneten Kollagen-Schwammes.
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Kollagen-Schwamm wird in großem Maße als Material für
medizinische Artikel wie künstliche Haut verwendet. Der Kollagen-
Schwamm wird im allgemeinen mit den folgenden Verfahren
hergestellt. Eine wässrige Lösung von Atherokollagen wird
direkt oder gegebenenfalls nach Homogenisierung unter
Eiskühlung in eine geeignete Form gegeben; der Formkörper wird unter
Erhalt eines mikroporösen Schwammes lyophilisiert, und der
erhaltene Schwamm wird wie folgt vernetzt. Der lyophilisierte
Schwamm wird auf eine Temperatur von etwa 100 bis etwa 110º
C erhitzt, um ein intramolekulares Vernetzen zu erreichen,
welches Wasserbeständigkeit verleiht, und er wird in
Anwesenheit eines Vernetzungsmittels weiterbehandelt, um
intermolekulares Vernetzen einzuleiten, was den Schwamm gegenüber
Hydrolyse mit Kollagenase resistent macht. Die hier verwendete
Bezeichnung "Vernetzen" umfaßt das oben genannte
intramolekulare Vernetzen und intermolekulare Vernetzen. Nach der
Vernetzungsbehandlung wird der Schwamm mit destilliertem
Wasser oder physiologischer Salzlösung gewaschen, uxn das
Vernetzungsmittel zu entfernen. Danach wird das destillierte
Wasser oder die Salzlösung durch eine wässrige Lösung von
Alkohol ersetzt. Der in die Alkohollösung getauchte Schwamm
wird in einem dicht geschlossenen Behälter gelagert und vor
dem Gebrauch daraus entnommen. Bei Verwendung wird die
Alkohollösung in dem Schwamm durch eine physiologische
Salzlösung ersetzt; sodann ist der Schwamm gebrauchsfertig,
z. B. als künstliche Haut.
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Der Kollagen-Schwamm, der in nassem Zustand - wie oben
beschrieben - gelagert wird, verändert jedoch seine
Eigenschaften und wird unvorteilhafter Weise zur Verwendung als
künstliche Haut ungeeignet. Des weiteren ist der nasse Schwamm
beim Verpacken, beim Transport oder bei der Sterilisation
unbequem zu handhaben, was erhöhte kosten verursacht, so daß
er unzweckmäßig ist.
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Zur Lösung dieses Problems haben die Erfinder den folgenden
Versuch unternommen. Der in herkömmlicher Weise hergestellte
und vernetzte Kollagen-Schwamm wird direkt abermals
lyophilisiert, sterilisiert und anstelle der Lagerung durch Eintauchen
in Alkohollösung trocken gelagert. Bei dem Versuch wurde der
vernetzte Kollagen-Schwamm mit physiologischer Salzlösung oder
destilliertem Wasser gewaschen, um das Vernetzungsmittel zu
entfernen. Dann wurde der Schwamm abermals lyophilisiert,
worauf dieser merklich schrumpfte und einen harten
Oberflächengriff ergab, mit anderen Worten, er schrumpfte so viel,
daß er zur Verwendung als künstliche Haut ungeeignet war. Die
Erfinder wendeten die Lyophilisierung auch bei geringerer
Temperatur an, um eine Kontraktion zu verhindern, fanden
jedoch, daß der Schwamm während des Trocknens leicht zur
Rißbildung neigte, was dessen Verwendbarkeit als künstliche
Haut einschränkte. Soweit bekannt, ist kein vernetzter
Kollagen-Schwamm, der in trockenem Zustand gelagert werden
kann, für diese Zwecke erhältlich.
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Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Kollagen-
Schwamm zu schaffen, der die vorgenannten Probleme nicht
aufweist und der in trockenem Zustand gelagert werden kann,
ohne daß sich seine Eigenschaften über einen längeren Zeitraum
verändern, und ein Verfahren zur Herstellung eines
getrockneten Kollagen-Schwammes zur Verfügung zu stellen.
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Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung eines getrockneten Kollagen-Schwammes zur
Verfügung zu stellen, wobei ein vernetzter Kollagen-Schwamm
lyophilisiert werden kann, ohne daß die unerwünschte
Kontraktion und unerwünschtes Brechen bzw. Rissigwerden
auftreten.
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Diese und andere Aufgaben der Erfindung gehen aus der
folgenden Beschreibung hervor.
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Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung eines riß bzw. bruchfreien getrockneten Kollagen-
Schwammes mit einem Schrumpfungsfaktor bis zu 14% geschaffen,
wobei der Schrumpfungsfaktor als prozentuale Flächenabnahme
angegeben ist, errechnet aus der Differenz zwischen der
Flächengröße vor und nach der Lyophilisierung, und das
Verfahren die Schritte des lmprägnierens des vernetzten
Kollagen-Schwamms mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen
organischen Lösungsmittels, das Gefrieren des Schwamms bei
einer Temperatur von -80º C oder weniger und das Trocknen des
Schwamms unter Vakuum umfaßt.
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Die Forschungen ergaben das Folgende. Wenn der vernetzte
Kollagen-Schwamm mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen
organischen Lösungsmittels vor der Lyophilisierung imprägniert
wird, kann die Lyophilisierung erfolgen, ohne daß Risse bzw.
Brüche bei einer niedrigen Temperatur von -80º C oder darunter
auftreten, die ausreicht, um die Kontraktion des Schwamms zu
verhindern. Es wird ein Kollagen-Schwamm erhalten, dessen
Oberfläche sich wie die von künstlichen Häuten anfühlt. Der
getrocknete Kollagen-Schwamm kann in trockenem Zustand ohne
Veränderung der Eigenschaften über einen längeren Zeitraum
gelagert werden. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesen
neuen Erkenntnissen.
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Der erfindungsgemäße vernetzte Kollagen-Schwamm kann durch
Lyophilisierung einer wässrigen Lösung von Atherokollagen zu
dem Schwamm, einer intramolekularen Vernetzungsreaktion des
Schwamms durch Erhitzen zur Verleihung von Wasserbeständigkeit
und einer intermolekularen Vernetzungsreaktion in Anwesenheit
eines Vernetzungsmittels zur Verleihung von
Widerstandsfähigkeit gegenüber Hydrolyse durch Kollagenase hergestellt werden.
Eine wässrige Lösung von Atherokollagen kann in herkömmlicher
Weise hergestellt werden, indem man Protease in einem sauren
Bereich auf Tiergewebe einwirken läßt, das einen hohen Gehalt
an Kollagen hat wie z. B. Haut von Säugetieren, Eingeweide,
Sehnen etc., um das Kollagen löslich zu machen. Die wässrige
Lösung von Atherokollagen wird auf eine Konzentration von 0,2
bis 5 Gew./Vol-% eingestellt und erforderlichenfalls unter
Rühren und Kühlen mit Eis homogenisiert, um ein Schäumen
einzuleiten. Danach wird die Atherokollagenlösung in eine
geeignete Form gegeben, gefroren und getrocknet und ergibt
einen mikroporösen Schwamm. Das Gefrieren und Trocknen kann
unter herkömmlichen Bedingungen erfolgen. Der Schwamm wird bei
einer niedrigen Temperatur von -20 bis -50º C gefroren und bei
einer Temperatur von -30 bis 40º C in einem Vakuum von 0,01
bis 0,2 mm Hg vakuumgetrocknet. Der in dieser Stufe erhaltene
Schwamm hat eine weiße Farbe und weist Poren mit einem
durchschnittlichen Durchmesser von 5 bis 1000 um, vorzugsweise
50 bis 120 um und ein prozentuales Porenvolumen von 90 bis 99%
auf.
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Der so erhaltene Schwamm wird erhitzt, um intramolekulares
Vernetzen zu bewirken, welches Wasserbeständigkeit verleiht.
Eine bevorzugte Erhitzungstemperatur liegt im Bereich von 100
bis 110º C. Erforderlichenfalls kann das Erhitzen in einem
Vakuum erfolgen, um das Ausmaß des Trocknens zu erhöhen. Dann
wird der Schwamm zum Zwecke der intermolekularen
Vernetzungsreaktion in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels behandelt,
wodurch der Schwamm gegenüber der Hydrolyse durch
Kollagenase resistent wird. Beispiele geeigneter Vernetzungsmittel
sind vielfältig und umfassen herkömmliche Vernetzungsmittel
wie Formaldehyd, Hexamethylendiisocyanat, Glutaraldehyd. Die
Vernetzungsreaktion wird in herkömmlicher Weise durchgeführt,
indem der Schwamm bei Raumtemperatur oder unter Kühlen,
gewöhnlich bei 4 bis 25º C, in eine Lösung eines
Vernetzungsmittels getaucht wird.
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Der vernetzte Schwamm wird kontinuierlich mit destilliertem
Wasser gewaschen, um damit die Lösung des Vernetzungsmittels
zu ersetzen, bis das Lösungsmittel vollständig entfernt ist.
Die Verfahren bis zu dem vorhergehenden Schritt sind auf dem
Fachgebiet bekannt und nicht darauf beschränkt. Es sind viele
Verfahren zum Erhalt des vernetzten Kollagen-Schwamms
anwendbar, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird.
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Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird der so
erhaltene Kollagen-Schwamm mit einer wässrigen Lösung eines
hydrophilen organischen Lösungsmittels imprägniert. Beispiele
geeigneter hydrophiler organischer Lösungsmittel sind
Methanol, Ethanol, Propanol und ähnliche niedere aliphatische
(vorzugsweise C&sub1;-C&sub4;) Alkohole, Aceton und ähnliche niedere
aliphatische (vorzugsweise C&sub3;-C&sub6;) Ketone; von diesen werden
niedere aliphatische Alkohole bevorzugt, am meisten bevorzugt
wird Ethanol. Eine geeignete Konzentration des hydrophilen
organischen Lösungsmittels in der wässrigen Lösung liegt im
Bereich von 5 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 30 Gew.-%,
obwohl diese je nach Typ des organischen Lösungsmittels
variabel ist.
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Der Schwamm kann mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen
organischen Lösungsmittels in der folgenden Weise imprägniert
werden. Der Schwamm, der die Waschüberreste nach der
Vernetzungsreaktion enthält, kann direkt in eine wässrige Lösung
eines organischen Lösungsmittels getaucht werden, um die
Waschreste zu ersetzen. Alternativ kann der Schwamm mit der
Lösung durch Tauchen, Sprühen oder andere geeignete Methoden
imprägniert werden, und zwar nach dem Entfernen der Waschreste
durch Trocknen, Auspressen und Reiben. Während des
lmprägnierungsverfahrens kann die Lösung kontinuierlich zirkulieren.
Gegebenenfall kann der Schwamm ausgedrückt, gerieben oder in
anderer geeigneter Weise behandelt werden, um eine wirksamere
lmprägnierung zu erhalten. Der Schwamm wird mit der Lösung in
solcher Weise imprägniert, daß die Lösung wenigstens 90 Vol.-
% des Schwamms ausmacht.
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Erfindungsgemäß wird der auf diese Weise mit der wässrigen
Lösung des hydrophilen organischen Lösungsmittels
imprägnierte Schwamm bei einer niedrigen Temperatur von -80º C oder
darunter gefroren. Ist die Gefriertemperatur höher als
-80º C, kann leicht eine Kontraktion auftreten.
Erfindungsgemäß wird das Gefrieren ohne eine Rißbildung bei einer
niedrigen Temperatur von -80º C oder darunter, bei der eine
Kontraktion vermieden wird, erreicht. Die bevorzugte
Gefriertemperatur ist -80 bis -135º C. Der gefrorene Schwamm wird in
herkömmlicher Weise bei einer Temperatur von -30 bis 40º C in
einem Vakuum von 0,01 bis 0,2 mm Hg getrocknet.
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Der erfindungsgemäß erhaltene Kollagen-Schwamm weist keine
Risse bzw. Brüche auf und hat einen ausgesprochen geringen
Schrumpfungsfaktor von bis zu 14%, vorzugsweise bis zu 12%.
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Der Schwamm hat Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser
von 5 bis 1000 um, vorzugsweise 50 bis 120 um und einen
Porenanteil von 90 bis 99%, und er fühlt sich so weich wie
künstliche Haut an. Demzufolge kann der erfindungsgemäße
Schwamm vorteilhaft als künstliche Haut verwendet werden.
Der getrocknete erfindungsgemäße Kollagen-Schwamm wird
sterilisiert und kann über einen längeren Zeitraum und
sterilen Bedingungen gelagert werden. Selbst nach einer langen
Lagerzeit, z. B. einer Lagerung für 1 bis 3 Jahre, zeigt der
erfindungsgemäße Kollagen-Schwamm keine Veränderung seiner
Eigenschaften. Die Sterilisation kann mit herkömmlichen,
allgemein für medizinische Artikel verwendeten Verfahren
erfolgen, wie Anwendung von Ethylenoxidgas oder durch
Bestrahlung mit Gammastrahlen. Der erfindungsgemäße Kollagen-Schwamm
kann in einem dicht verschlossenen Behälter aus Aluminium
oder dergleichen gelagert werden.
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Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch die
folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele näher beschrieben.
Beispiele 1 und 2
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Eine Menge von 50 g Atherokollagen (Konzentration 0,3
Gew./Vol-%, pH-Wert 3,0), das aus Schweinesehnen stammte,
wurde unter Kühlen mit Eis (unter Rühren bei 1800 bis 2000 UPM
für eine Dauer von 60 Min.) in eine Aluminiumform mit einer
rechteckigen Vertiefung von 10 cm Länge, 7,6 cm Breite und 1,5
cm Tiefe, gegeben und rasch auf -40º C gefroren. Die
gefrorene, geformte Masse wurde 48 Stunden bei 30º C unter einem
Vakuum von 0,1 mm Hg getrocknet und ergab einen Schwamm. Der
Schwamm wurde dann zum Zwecke einer intramolekularen
Vernetzungsreaktion unter Vakuum und unter Erhitzen auf 105º C 24
Stunden getrocknet. Der Schwamm wurde in eine Lösung von 0,2
Gew.-% Glutaraldehyd in 0,05 M Essigsäure getaucht und bei 4º
C für eine Dauer von 24 Stunden einer intermolekularen
Vernetzungsreaktion unterzogen. Es wurde kontinuierlich mit
destilliertem Wasser gewaschen, um die Lösung bis zur
vollständigen Entfernung des Glutaraldehyds zu ersetzen. Der
erhaltene Schwamm hatte eine leicht gelbe Farbe und Poren mit
einem durchschnittlichen Durchmesser von 50 bis 120 um.
Der vernetzte Schwamm wurde dann in eine 15% wässrige Lösung
von Ethanol getaucht, um damit das destillierte Wasser zu
ersetzen, und in einem Kühlschrank mit extrem niedriger
Temperatur bei -80º C (Beispiel 1) oder -135º C (Beispiel 2)
gefroren. Der vollständig gefrorene Schwamm wurde bei 30º C
in einem Vakuum von etwa 0,1 mm Hg für eine Dauer von 24
Stunden in einer Vorrichtung zur Vakuum-Lyophilisierung
getrocknet.
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Auf diese Weise wurden die Kollagen-Schwämme (Beispiel 1 und
2) hergestellt. Die Schwämme erwiesen sich als riß- bzw.
bruchfrei, hatten eine leicht gelbe Farbe und waren mit Poren
von 50 bis 120 um im Durchmesser schwamm-ähnlich.
Vergleichsbeispiel 1
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Ein vernetzter, mit destilliertem Wasser imprägnierter Schwamm
wurde in der gleichen Weise in in Beispiel 1 lyophilisiert,
jedoch ohne daß das destillierte Wasser durch eine wässrige
Lösung von Ethanol ersetzt wurde.
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Die erhaltene Probe des Kollagen-Schwammes wies viele Risse
bzw. Brüche und ein überaus beeinträchtigtes Erscheinungsbild
auf und war daher als künstliche Haut ungeeignet.
Vergleichsbeispiel 2
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Eine Probe eines Kollagen-Schwammes wurde in gleicher Weise
wie in Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß der
vernetzte Schwamm bei -40º C lyophilisiert wurde.
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Die Eigenschaften der Schwämme aus den Beispielen 1 und 2 und
dem Vergleichsbeispiel 2 wurden mit den folgenden Methoden
getestet.
Bestimmung des Schrumpfungsfaktors
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Die Länge und Breite der nach den Beispielen 1 und 2 und dem
Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Schwämme wurde an drei Punkten
jeden Schwammes mittels Gleittastern vor und nach der
Lyophilisierung gemessen. Die Mittelwerte der Messungen wurden zur
Berechnung der Flächengröße multipliziert. Der
Schrumpfungsfaktor wurde als eine prozentuale Abnahme der Fläche,
errechnet aus der Differenz zwischen der Flächengröße vor und nach
der Lyophilisierung, angegeben.
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Von den Proben der hergestellten Schwämme nach jedem der
Beispiele und Vergleichbeispiele wurde ein Durchschnitt von
3 Messungen bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1
angegeben.
Tabelle 1
Lyophilisierungstemperatur (ºC)
Schrumpfungs-Faktor (%)
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Die Brauchbarkeit der Schwamm-Proben als künstliche Haut wurde
von einem Dermatologen bestimmt. Die Ergebnisse sind wie
folgt. Die Schwamm-Probe (Vergleichsbeispiel 2), die durch
Lyophilisierung bei -40º C hergestellt worden war und eine
Schrumpfungsrate von 15,1% aufwies, fühlte sich hart an und
war zum Gebrauch ungeeignet.
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Die Schwamm-Proben, bei denen die Lyophilisierung bei -80º C
und -135º C vorgenommen worden war, waren weich und zum
Gebrauch geeignet. Zum Gebrauch am besten geeignet war die
Schwamm-Probe, die durch eine Behandlung bei -135º C erhalten
worden war.
Gebrauchsfähigkeitsprüfung
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Die nach Beispiel 2 erhaltenen Kollagen-Schwämme (10 cm breit,
20 cm lang, 2 mm dick) wurden mit physiologischer Salzlösung
durchnäßt. Die Schwamm-Proben wurden mittels einem "Autograph
S-100 WZ" (Warenzeichen für das Produkt von Shimadzu
Seisakusho K.K., Japan) mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/Min.
gezogen bis der Schwamm brach, wobei die Festigkeit und die
Dehnung am Brechpunkt sowie der Youngsche Modul anhand der
Steigung der Kurve bestimmt wurden.
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Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Schwamm-Proben, die durch
Waschen mit destillierten Wasser nach der Vernetzungsreaktion
mit Glutaraldehyd in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden als
Schwämme des Vergleichsbeispiels 3 für Vergleichszwecke
verwendet. In der Tabelle 2 werden auch die Ergebnisse von
Vergleichsbeispiel 3 angegeben.
Tabelle 2
Beispiel
Festigkeit (X Dyn/cm²)
Youngscher Modul (X Dyn/cm²)
Dehnung (%)
Lagerfähigkeitstest
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Die nach Beispiel 1 und 2 erhaltenen Kollagen-Schwämme wurden
mit einem Ethylenoxidgas sterilisiert und in ein
Aluminiumgefäß gegeben. Das dicht verschlossene Gefäß wurde in einem
Wärmeschrank unter beschleunigenden Testbedingungen gelagert:
bei einer Temperatur von 50º C und einer Luftfeuchtigkeit von
80%.
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Zu Vergleichszwecken wurde eine Schwamm-Probe durch eine
Vernetzungsreaktion und Waschen in gleicher Weise wie in
Beispiel 1 hergestellt, in eine 70%ige wässrige Lösung von
Ethanol getaucht und unter nassen Bedingungen in einem
Wasserbad mit konstanter Temperatur unter beschleunigenden
Testbedingungen von 50º C gelagert.
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Die Testergebnisse sind wie folgt.
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Schwamm-Probe nach Beispiel 1 und 2: die Schwämme zeigten
selbst nach 3 Monaten keine Farbveränderung.
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Schwamm-Vergleichsprobe: der Schwamm wies eine deutliche
Gelbverfärbung innerhalb von einer Woche auf.