DE69100231T2 - Verfahren zur erhöhung der fertilität bei männchen. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Fortpflanzungsfähigkeit bei männlichen Saugetieren mit einer geringen Spermienanzahl.
• Inhibin ist ein Glykoprotein, das durch verschiedene Gewebe, einschließlich der Geschlechtsdrüsen, der Hypophyse, des Gehirns, des Knochenmarks, der Placenta und der Nebennierendrüse, erzeugt wird. Es wurde ursprünglich durch seine Fähigkeit identifiziert, die Ausscheidung von follikelanregendem Hormon (FSH) durch die Hypophyse zu hemmen. De Jong und Sharpe, "Nature" 263: 71-72(1976); Schwartz und Channing, "Proc.Natl.Acad.Sci.USA", 74: 5721-5724 (1977). Derartige preferentielle Regulation der Gonadotropinausscheidung hat viel Interesse hervorgerufen und viele Laboratorien in den letzten 50 Jahren zu dem Versuch angeregt, diese Substanz unter Anwendung verschiedener Bioassays aus Extrakten aus Hoden, Spermatozoen, rete testis-Fluid, Samenplasma und Eierstockfollikelfluid zu isolieren und zu charakterisieren. Rivier et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun." 133: 120(1985); Ling et al., "Proc.Natl.Acad.Sci.USA" 82: 7217 (1985); Fukuda et al., "Mol.Cell Endocrinol." 44: 55(1985). Die Inhibinstruktur, aus mehreren Spezien charakterisiert, besteht aus zwei durch Disulfidbrücken verbundenen Untereinheiten : einer α - und entweder einer βA- oder einer βB-Kette.
• Nach der Identifizierung von Inhibin wurde gezeigt, daß Aktivin in Follikelfluid als eine natürlich auftretende Substanz vorhanden ist. Es ist festgestellt worden, daß Aktivin fähig ist, die FSH-Freisetzung durch Ratten-Vorhypophysezellen anzuregen. Vale et al., "Nature" 321: 775-779 (1986); Ling et al., "Nature" 321: 779-782 (1986). Aktivin besteht aus einem Homodimer oder Heterodimer aus Inhibin-β-Untereinheiten, die βA- oder βB-Untereinheiten sein können. Vale et al., "Recent Prog.Horm.Res." 44: 1-34(1988). Zwischen Menschen-, Schweine-, Rinder- und Ratten-Aktivinen gibt es eine 95-100%ige Aminosäurenkonservierung der β-Untereinheiten. Die βA- und βB-Untereinheiten innerhalb einer bestimmten Spezies sind zu etwa 64-70% homolog. Die Aktivin-βA- und -βB-Homodimere ("Aktivin A" bzw. "Aktivin B") sind in Follikelfluid identifiziert worden, und beide Moleküle sind geklont und ihre Gene exprimiert worden. Mason et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun." 135: 957 (1986); EP-Veröffentlichung Nr. 222,491 vom 20. Mai 1987; Mason et al., "Molecular Endocrinol." 3: 1352-1358 (1989). Die vollständige Sequenz der βB-Untereinheit wird in den "Serono Symposium Publications" unter dem Titel "Inhibin- Non-Steroidal Regulation of Follicle Stimulating Hormone Secretion" Hrsg. H.G. Burger et al., Kurzfassung von A.J. Mason et al., Band 42, 5.77-88 (Raven Press: New York, 1987) mit dem Titel "Human Inhibin and Activin: Structure and Recombinant Expression in Mammalian Cells." veröffentlicht.
• Sowohl Aktivin A als auch Aktivin AB, bisher jedoch noch nicht Aktivin B, sind aus natürlichen Quellen isoliert worden. Es ist berichtet worden, daß Aktivin mRNA (βA- und βB-Untereinheiten), Bioaktivität und Immunaktivität durch testikuläre Leydig-Zellen von nicht geschlechtsreifen Ratten und Schweinen erzeugt worden sind. Lee et al., "Science" 243: 396-398 (1989); Lee et al., in den "Serono Symposium Publications" unter dem Titel "The Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis", Hrsg. Cooke und Sharpe, Band 50 (Raven Press: New York, 1988), S. 21-27. Vor kurzem ist festgestellt worden, daß Aktivin A Erythropoietin stimulierende Wirkung sowie FSH-freisetzende Wirkung aufweist. Siehe EP-Veröffentlichung Nr. 210,461 vom 4. Februar 1987 (worin das Protein als BUF-3 bezeichnet wird), Eto et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun." 142: 1095-1103 (1987) und Murata et al., "Proc.Natl.Acad.Sci. USA", 85: 2434-2438 (1988) (worin das Aktivin als EDF bezeichnet wird), und Yu et al., "Nature" 330: 765-767 (1987) (worin das Aktivin als FRP bezeichnet wird). In diesen Systemen wirkt Inhibin den Wirkungen von Aktivin entgegen.
• Es wird festgestellt, daß ein als Follikel- oder follikulär regulatorisches Protein bekanntes Protein mit einem Molekulargewicht von 12 000 bis 15 000 die Aromatasespiegel hemmt, die Bildung von reifen Eizellen im wesentlichen unabhängig von steroidalen Geschlechtshormonen reguliert und die Fortpflanzungsfähigkeit bei männlichen Ratten durch systemische Behandlung verringert. Es beeinflußt nicht direkt die Gonadotropinproduktion der Hypophyse. Siehe US-PS-4,734,398; Tsutsumi et al., "Fertil.Steril." 47: 689 (1987); Lew et al., "Obstet. and Gynecol." 70: 157-162 (1987); diZerega et al., "Meiotic Inhibition: Molecular Control Of Meiosis" (Alan R. Liss, Inc., 1988), S. 201-226; diZerega et al., "J.Steroid Biochem." 27: 375-383 (1987); Montz et al., "Am.J.Obstet.Gynecol." 436-441 (15. Feb. 1984); Ahmad et al., "The Anatomical Record", 224: 508-513 (1989). Dieses Protein, das auch als FRP bezeichnet wird, ist gereinigt und teilweise sequenziert worden, und ist in keiner Weise mit dem als Aktivin bekannten FSH-freisetzenden Protein verwandt, das von den Salk-Forschern in ihren frühen Arbeiten als FRP bezeichnet wird.
• Vor kurzem ist die Exprimierung von Inhibin-Untereinheiten, für die jeweils ein gesondertes Gen kodiert, in mehreren Geweben neben Eierstock und Hoden gezeigt worden. Inhibin α, βA und βB mRNAs wurden in Placenta-, Hypophyse-, Nebennieren-, Knochenmark-, Nieren-, Wirbelsäulen- und Gehirngewebe nachgewiesen. Meunier et al., "Proc.Natl.Acad.Sci.USA", 85: 247 (1988). Die Exprimierung der Inhibin-Untereinheits-mRNAs variierte auf gewebespezifische Art um ein Mehrfaches, was auf unterschiedliche Funktionen dieser Proteine je nach ihrem Assoziationsmuster und ihrer Produktionsstelle hindeutet.
• Inhibin und Aktivin gehören zu einer Familie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren. Der Prototyp dieser Familie ist der transformierende Wachstumsfaktor-α (TGF-β) (Derynck et al., "Nature" 316: 701-705 (1985)), der nach einer Quelle FSH-freisetzende Wirkung aufweist. Ying et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun.", 135:950-956 (1986). Andere Elemente der TGF-β-Familie umfassen die Mullerian-Hemmsubstanz, den dekapentaplegischen Fliegen-Genkomplex und das Produkt von Xenopus Vg-1 mRNA.
• Beim Menschen scheiden wachsende präovulatorische Follikel und Gelbkörper als Reaktion auf FSH-Stimulierung Inhibin in den Kreislauf aus. Lee und Gibson, "Aust.J.Biol.Sci.", 38: 115-120 (1985); McLachlan et al., "Fertil.Steril.", 48: 1001 (1987). So spielen mit Inhibin verwandte Peptide wichtige Rollen bei der Regulierung der Geschlechtsdrüsenfunktionen über eine Hypophyse-Rückkopplungsschleife. Bei Ratten-Primärkulturen von Hodenzellen und Scheiden-interstitiellen Eierstockzellen ist berichtet worden, daß Inhibin die durch luteinisierendes Hormon (LH) angeregte Androgenbiosynthese erhöht, während Aktivin die Androgenproduktion unterdrückt. Hsueh et al., "Proc.Natl.Acad.Sci. USA", 84: 5082-5086 (1987). Anderen Forschern ist es nicht gelungen, diese Beobachtungen zu wiederholen. deKretser und Robertson, "Biology of Reproduction", 40: 33-47 (1989), insbesondere Seite 41. Hemmwirkungen von TGF-β auf Leydig-Zellsteroidogenese sind ebenfalls beschrieben worden. Lin et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun.", 146: 387(1987); Fauser und Hsueh, "Life Sci.", 43: 1363(1988); Avallet et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun.", 146: 575(1987). Bei Granulosazellen ist berichtet worden, daß Aktivin Progesteronproduktion hemmt (und TGF-β sie verstärkt). Ignotz und Massague, "J.Biol.Chem." 261:4337 (1986). Es wurde festgestellt, daß in Primärkulturen von Granulosazellen Aktivin und Inhibin sowie TGF-β die Hormonsynthese und -ausscheidung jeweils auf unterschiedliche Art beeinflussen. Adashi und Resnick, "Endocrinology" 119: 1879 (1986); Ying et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun.", 136:969 (1986); Hutchinson et al., "Biochem.Biophys.Res.Commun.", 146: 1405 (1987); Mondschein et al., "Endocrinology", 123: 1970 (1988); Feng et al., "J.Biol.Chem.", 261: 14167 (1986). Diese Moleküle haben auf die FSH-abhängige Granulosazellfunktion sowohl positive als auch negative Wirkungen. Garson et al., "J.Reprod.Fert.", 85: 735-746 (1989). Es wird auch angesprochen, daß einzelne Mitglieder der TGF-β/Inhibingenfamilie die Eierstockfunktion regulieren, nicht nur durch direkte Wirkung auf Follikelzellen, sondern auch indirekt durch die Beeinflussung der Produktionsrate anderer Mitglieder dieser Familie. Zhiwen et al., "Molecular and Cellular Endocrinology", 58: 161-166 (1988).
• Es wurde berichtet, daß Aktivin A und Inhibin das Wachstum von zwei Geschlechtsdrüsenzellinien regulieren, was darauf hinweist, daß diese Proteine die Vermehrung sowie die Funktionen von Geschlechtsdrüsenzellen regulieren können. Gonzalez-Manchon und Vale, "Endocrinology", 125: 1666-1672 (1989). Es ist vorgeschlagen worden, daß die Ausscheidung von Inhibin durch den Gelbkörper die Konzentration von FSH in der lutealen Phase des Zyklus und somit die Hemmung der Follikelentwicklung unterdrückt. Baird et al., "Ann.N.Y.Acad.Sci.", 541: 153-161 (1988).
• Ein Überblicksartikel postuliert, daß Inhibin zumindest einer der Faktoren ist, der die Anzahl der zum Ovulieren vorgesehenen Follikel bestimmt, und daß eine Einflußnahme auf die Wirkung von Inhibin zur Regulierung der Fruchtbarkeit beitragen könnte. De Jong "Physiol.Rev." 68: 555 (1988). Viele Forscher haben die Vermutung angestellt, daß Inhibin aufgrund seiner FSH-Hemmwirkung nützlich für die männliche und weibliche Empfängnisverhütung sein könnte. Sheth und Moodbidri, "Adv.Contracept." 2: 131-139 (1986); Findlay, "Fertil.Steril.", 46: 770 (1986); van Dissel-Emiliani et al., "Endocrinology", 125: 1898-1903 (1989); Bhasin et al., "Endocrinology", 124: 987991 (1989). Jedoch bezweifelt ein anderer Autor, daß Inhibin die Spermatogenese hemmen kann (Bremner et al., "J.Clin.Invest.", 68: 1044 (1981) zitierend) und sagt, daß Inhibin auch gewisse direkte Stimulierungswirkungen auf die Spermatogenese haben könnte. Baker et al., "Clin.Reprod. and Fert.", 2: 161-174 (1983).
• Die Verteilungen der α-, βA und βB-Untereinheiten von Inhibin/Aktivin-Polypeptiden wurden am Hoden von Ratten untersucht. Es wurde festgestellt, daß beim Rattenhoden sowohl Sertoli- als auch interstitielle Zellen Inhibin/Aktivin-Untereinheiten produzieren, und die α- und β-Untereinheiten durch verschiedene Typen von interstitiellen Zellen in nicht geschlechtsreifen Ratten erzeugt werden. Roberts et al., "Endocrinology" 125: 2350 (1989).
• Es wurde auch festgestellt, daß immunreaktive Inhibin-Untereinheiten in multiplen Zellen im Hoden vorhanden sind und daß die Mengen an immunanfärbbaren Untereinheiten im samenproduzierenden Epithel unterschiedlich reguliert sind. Shaha et al., "Endocrinology", 125: 1941 (1989).
• Es ist berichtet worden, daß Aktivinbiowirksubstanz in vitro durch interstitielle Zellen ausgeschieden wird, während Sertoli-Zellen Inhibin oder eine Mischung aus Inhibin und Aktivin ausscheiden. Lee et al., in den "Serono Symposium Publications", oben, Lee et al., "Science", oben.
• Bei vielen in den Hoden erzeugten Substanzen ist gezeigt worden, daß sie die Testikulärfunktion lokal regulieren. Mather, in "Mammalian Cell Culture", Hrsg. J.Mather (Plenum Publishing Corp. 1984) S. 167-193. Während Inhibin und Aktivin primär als Rückkopplungsregulatoren der Hypophysenfunktion betrachtet worden sind, scheint es im Lichte jüngster Daten über mehrfache Stellen der Produktion und Wirkung im Hoden wahrscheinlich, daß sie auch eine Rolle als lokale Regulatoren der Testikulärfunktion spielen.
• Das Ausbleiben von Empfängnis bzw. Schwangerschaft ist ein Übel, das nicht weniger als eines von sechs Ehepaaren dazu veranlaßt, medizinische Hilfe in Anspruch zu nehmen. Bei zumindest 40% dieser Paare wird entdeckt, daß eine Defizienz beim Mann vorliegt. Etwa 61% der nicht fortpflanzungsfähigen Männer zeigen bei Testikulärbiopsie Hypospermatogenese. Diese Patienten weisen teilweises Geschlechtsdrüsenepithelversagen auf und haben Oligospermie und normale Testosteronspiegel. Die Krankheitsursache ist oft idiopathisch, kann aber auch mit antineoplastischen Mitteln, Kryptorchismus oder Varikozelen in Verbindung stehen.
• Es wird angenommen, daß die Reifung unreifer Keimzellen in Spermatozoen (Spermatogenese) beim Mann durch die Gonadotropine (LH und insbesondere FSH) und Androgene (Testosteron) reguliert wird. Die gegenwärtigen Behandlungen für Fortpflanzungsunfähigkeit beim Mann aufgrund von Oligospermie basieren auf dieser Annahme. Diese umfassen die Herbeiführung von Rebound von durch Testosteron- oder anabolische Androgen-induzierter Azoospermie; die Verabreichung von exogenen Gonadotropinen oder Gonadotropin freisetzendem Hormon; die Verwendung von Clomiphenzitrat oder Tamoxifen zum Anregen der endogenen Gonadotropinausscheidung; die Verabreichung geringer Dosen an Mesterolon und oralem synthetischen Androgen; und die Verwendung eines Aromataseinhibitors wie Testolakton.
• Der Nutzen dieser Behandlungen ist mit keiner Untersuchung schlüssig belegt worden, obwohl ein Bericht darauf hinweist, daß nur Klomiphenzitrat eine statistisch signifikante Wirkung ausübt. Es ist jedoch gezeigt worden, daß Klomiphen, wenn es in hohen Dosen von Frauen verwendet wird, problematisch ist. Des weiteren können die Gonadotropine und Androgene primär auf indirekte Art über Stimulierung von Sertoli- und/oder Leydig-Zellfaktoren wirken, die das Keimepithel direkt beeinflussen.
• Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Steigerung der Fortpflanzungsfähigkeit von Männern mit Oligospermie unter Verwendung eines Fertilitätsmittels zu schaffen, das direkte Anregung der Spermienproduktion durch lokale Verabreichung verursacht.
• Es ist ein weiteres Ziel, ein Fertilitätsmittel zur Behandlung von Hypospermatogenese zu schaffen, das sowohl sicher als auch wirksam ist.
• Dieses Ziel und andere Ziele werden Fachleuten mit einschlägigem Wissen klar sein.
• Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Steigerung der Fortpflanzungsfähigkeit bei einem männlichen Säugetier, das Keimepithelversagen aufweist, welches Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Aktivinmenge an das Säugetier umfaßt.
• In einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Steigerung der Fortpflanzungsfähigkeit bei männlichen Säugetieren, die Keimepithelversagen aufweisen, welche Zusammensetzung eine wirksame Menge an Aktivin in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
• Figur 1 zeigt eine graphische Darstellung der Aufnahmemenge an 3H-Thymidin nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden Behandlung von Ratten-Sertoli- und Keimzellencokulturen durch Aktivin A-Hinzufügung (A, 100 ng/ml), Inhibin.Hinzufügung (I, 100 ng/ml) oder Kontrolle (C). Alle Bedingungen enthielten Medium plus 5F (das Insulin, 5 ug/ml; Transferrin, 5 ug/ml; α-Tokopherol, 5 ug/ml; EGF, 5 ng/ml und Aproteinin, 25 ug/ml ist.
• Figur 2A zeigt eine graphische Darstellung der zytometrischen DNA-Flußquantifizierung von Inhibin-behandelten Ratten Sertoli und Keimzellencokulturen bei 48 Stunden im Vergleich zu einer Kontrolle (5F). Figur 2B zeigt eine ähnliche graphische Darstellung, die die Aktivinbehandlung mit einer Kontrolle (SF) vergleicht.
• Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Aktivin" auf Homo- oder Heterodimere von β-Ketten von Inhibin, Präproformen und Proformen, gemeinsam mit Glykosylierungs- und/oder Aminosäuresequenzvarianten davon. Nach der Spaltung vom reifen Protein kann der Vorläuferabschnitt mit dem reifen Protein nicht kovalent assoziiert werden. Mit Aktivin A ist Aktivin mit den beiden Ketten von βA gemeint. Aktivin AB bezieht sich auf Aktivin mit den Ketten βA und βB. Aktivin B bezeichnet Aktivin mit den beiden Ketten von βB.
• Die intakten isolierten Präpro- oder Probereiche oder reifen βA- und βB-Sequenzen werden auf geeignete Weise durch jedes Mittel synthetisiert, einschließlich synthetischer und/oder rekombinanter Mittel, werden aber vorzugsweise in rekombinanter Zellkultur synthetisiert, beispielsweise wie in der US-PS-4,798,885 vom 17. Januar 1989 beschrieben.
• Es liegt im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, Aktivin von anderen Tieren als Menschen, beispielsweise Schweine- und Rinderquellen, einzusetzen, um Menschen zu behandeln. Zum Beispiel sind die Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Schweine-Aktivin-β-Kette in den Figuren 2A und 2B der US-PS-4,798,885, oben, zu finden. Ebenso können, wenn es gewünscht wird, andere Säugetierspezien wie domestizierte und landwirtschaftlich genutzte Tiere und Sport-, Zoo- oder Haustiere, zu behandeln, menschliches Aktivin sowie Aktivin von anderen Spezien auf geeignete Weise eingesetzt werden.
• Im allgemeinen sind die Aminosäuresequenzvarianten im wesentlichen homolog mit dem relevanten Abschnitt der beispielsweise in der US-PS-4,798,885, oben, dargelegten Säugetier-β-Kettensequenzen. Im wesentlichen homolog bedeutet, daß mehr als etwa 60% der primären Aminosäuresequenz des homologen Polypeptids der Sequenz der Aktivinkette entsprechen, wenn sie ausgerichtet ist, um die Anzahl an Aminosäurerestübereinstimmungen zwischen den beiden Proteinen zu maximieren. Ausrichtung zur Maximierung der Übereinstimmungen der Reste umfaßt das Verschieben des Amino- und/oder Carboxylterminus, das Einfügen von Zwischenräumen nach Bedarf und/oder das Löschen von Resten, die als Einfügungen im Kandidaten vorhanden sind. Typischerweise sind die Aminosäuresequenzvarianten zu mehr als etwa 70% mit den entsprechenden nativen Sequenzen homolog.
• Während die Stelle zum Einfügen einer Sequenzvariation vorbestimmt ist, ist es nicht notwendig, daß die Mutation an sich vorbestimmt ist. Um beispielsweise die Leistungsfähigkeit der Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, können Zufallsmutagenese am Zielkodon oder dem Zielbereich durchgeführt und die exprimierten Aktivinmutanten auf die optimale Kombination der gewünschten Wirkung gescreent werden. Techniken zur Durchführung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind wohlbekannt, beispielsweise M13-Primermutagenese.
• Mutagenese wird durchgeführt, indem Aminosäureeinfügungen, üblicherweise nach Art von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, oder Löschungen von etwa 1 bis 30 Resten vorgenommen werden. Substitutionen, Löschungen, Einfügungen oder jede Subkombination können kombiniert werden, um ein Endkonstrukt zu erreichen. Vorzugsweise wird jedoch Substitutionsmutagenese durchgeführt. Klarerweise dürfen die Mutationen in der kodierenden DNA die Sequenz nicht außerhalb des Leserasters bringen und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten.
• Kovalente Modifikationen von Aktivin sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, und umfassen kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Gruppen. Kovalente Derivate werden durch das Verbinden der Funktionalitäten mit Gruppen, die in den Aktivin-Amionosäureseitenketten oder an den N- oder C-Termini vorhanden sind, auf nach dem Stand der Technik bekannte Art hergestellt. Beispielsweise umfassen diese Derivate: Aliphatische Ester oder Amide des Carboxylterminus oder Reste, die Carboxylseitenketten enthalten, z.B. Aspartylreste; O-Acylderivate von Hydroxylgruppen-hältigen Resten wie Aryl oder Alanyl; und N-Acylderivate der aminoterminalen Aminosäure- oder Aminogruppe-hältigen Reste, z.B. Lysin oder Arginin. Die Acylgruppe ist aus der Gruppe von Alkylgruppen (einschließlich C3- bis C10-Normalalkyl), wodurch Alkanoylspezien gebildet werden, und carbozyklischen oder heterozyklischen Verbindungen ausgewählt, wodurch Aroylspezien geschaffen werden. Die reaktiven Gruppen sind vorzugsweise difunktionelle Verbindungen, die per se zur Verwendung bei der Vernetzung von Proteinen mit unlöslichen Matrizen durch reaktive Seitengruppen bekannt sind, z.B. m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester. Bevorzugte Derivatisierungsstellen befinden sich an Histidinresten.
• Der Ausdruck "Verabreichung an den Hoden" bedeutet nicht nur Injektion in den Hoden, sondern auch Techniken, die zum Fluten des den Hoden umgebenden Bereichs mit Aktivin führen, sodaß das Aktivin in den Hoden absorbiert wird. Außerdem kann das Aktivin in ein Gefäß injiziert werden ,das den Hoden versorgt, wobei vorzugsweise ein mikroskopisches Verfahren verwendet wird. Des weiteren kann das Aktivin in ein Implantat gegeben werden, das nahe dem Hoden angeordnet wird und durch das das Aktivin in den Hoden absorbiert wird. Beispiele umfassen ein intratestikuläres lange wirkendes Depot (z.B. Mikrokugeln) oder ein Implantat mit langsamer Freisetzung. Es können andere Techniken verwendet werden, vorausgesetzt, daß das Ergebnis darin besteht, daß Aktivin lokal an den Hoden angewandt wird und für die hierin angeführten Zwecke wirksam ist.
• Der Ausdruck "Keimepithelversagen" bezieht sich auf Störungen bei männlichen Säugetieren, die als vollständiges oder teilweises Keimepithelversagen gekennzeichnet sein können, vorausgesetzt, daß einige Spermatogonalstammzellen vorhanden sind, wie beispielsweise durch Hodenbiopsieanalyse bestimmt. Beispiele für derartige Störungen umfassen die als teilweises Keimepithelversagen gekennzeichneten, sowie Azoospermie, die bei Patienten vorliegt, die einige Spermatogonalstammzellen aufweisen. Vollständiges Versagen ist mit hohen basalen FSH-Spiegeln verbunden.
• Der Ausdruck "teilweises Keimepithelversagen" bezieht sich auf eine Störung bei Säugetieren, bei denen Oligospermie und intakte steroidogene Leydig-Zellkapazität und Hypophysezellen vorliegen. Derartige männliche Säugetiere weisen normale Testosteronspiegel, aber niedrige Spermienzahlen auf. Die meisten Kliniker betrachten eine Spermiendichte von weniger als 20 Millionen/ml mit adäquatem Volumen, Motilität und Morphologie als Hinweise für niedrige Spermienanzahl. Die Spermienmorphologie ist ein weiterer Indikator, wobei angenommen wird, daß ein Anzeichen für niedrige Spermienanzahl darin besteht, daß der Prozentsatz an abnormalen Spermatozoen über 40 liegt.
• Die als teilweises Keimepithelversagen charakterisierten Störungen können durch Chemikalien oder Arzneimittel wie chemotherapeutische Arzneimittel und Sulfa-Antibiotika sowie Alkohol und illegale Drogen verursacht werden. Andere mögliche Ursachen umfassen genetische Störungen, Infektionen des Genitaltrakts und Varikozelen. Die größte Gruppe der nicht fortpflanzungsfähigen Männer fällt in die Kategorie der idiopathischen Oligospermie ohne eine erkennbare Ätiologie. Die Notwendigkeit für eine Steigerung der Fortpflanzungsfähigkeit ist im allgemeinen auf eine primäre Testikulärstörung, d.h. nicht auf der Ebene des Hypothalamus oder der Hypophyse, zurückzuführen.
• Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Verwendung von Aktivin, um die Fortpflanzungsfähigkeit bei männlichen Säugetieren in der oben angegebenen Patientenpopulation zu erhöhen, einschließlich Sport-, Zoo-, Haus- und Nutztieren wie Hunden, Katzen, Rindern, Schweinen, Pferden, Affen und Schafen, sowie bei Menschen. Vorzugsweise ist die Störung teilweises Keimepithelversagen.
• Das Aktivin wird dem Säugetier mit jeder geeigneten Technik verabreicht, einschließlich parenterale, sublingualer, intratestikulärer, intrapulmonärer und intranasaler Verabreichung. Der spezifische Verabreichungsweg hängt z.B. von der Krankengeschichte des Patienten ab. Beispiele für parenterale Verabreichung umfassen intramuskuläre, subkutane, intravenöse, intraarterielle und intraperitoneale Verabreichung. Vorzugsweise wird das Aktivin über den Hoden verabreicht, wie oben besprochen.
• Die bei der Therapie einzusetzenden Aktivinzusammensetzungen sind auf eine Art formuliert und dosiert, die im Einklang mit guter medizinischer Praxis steht, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle der Abgabe der Aktivinzusammensetzung, das Verabreichungsverfahren, der Zeitplan der Verabreichung und andere den Praktikern bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Die "wirksame Menge" für erfindungsgemäße Zwecke wird daher durch solche Überlegungen bestimmt.
• Als allgemeiner Vorschlag liegt die pharmazeutisch wirksame Gesamtmenge des pro Dosis verabreichten Aktivins im Bereich von etwa 1 ug/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag Körpergewicht des Patienten, obwohl sie, wie oben angegeben, einem großen Ausmaß an therapeutischem Ermessen unterliegt. Vorzugsweise beträgt diese Dosis nicht mehr als etwa 10 ug/kg/Tag. Der Schlüsselfaktor bei der Wahl einer geeigneten Dosis ist das erzielte Ergebnis, wie durch Zunahme der Spermiendichte durch Serumanalyse oder die Anzahl an Spermatozyten oder durch andere Kriterien gemessen, die vom Praktiker als geeignet erachtet werden, z.B. Biopsie.
• Zur Verabreichung wird das Aktivin im allgemeinen formuliert, indem es im gewünschten Reinheitsgrad in einer injizierbaren Einheitsdosisform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger gemischt wird, d.h. einem, der für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist und mit anderen Ingredienzien der Formulierung verträglich ist. Beispielsweise enthält die Formulierung vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie für Polypeptide nachteilig sind.
• Im allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem das Aktivin gleichmäßig und innig mit flüssigen Trägern oder feinteiligen festen Trägern oder beiden in Kontakt gebracht wird. Dann wird das Produkt, wenn erforderlich, in die gewünschte Formulierung geformt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, mehr vorzuziehen eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Beispiele für derartige Trägervehikel umfassen Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung. Nicht-wässrige Vehikel wie fixierte Öle und Äthyloleat sind gemäß vorliegender Erfindung ebenfalls nützlich, ebenso wie Liposome.
• Der Träger enthält geeigneterweise geringe Mengen an Additiven wie Substanzen, die die Isotonität und chemische Stabilität erhöhen. Derartige Materialien sind in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen für die Empfänger nicht toxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Nitrat und andere Salze organischer Säuren; Oxidationshemmer wie Ascorbinsäure; Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie Serumalbumin, Gelatin oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate einschließlich Zellulose und seine Derivate, Glukose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Gegenionen wie Natrium und/oder nichtionische oberflächenaktive Stoffe bzw. Tenside wie Tween, Pluronics oder PEG.
• Das Aktivin ist in solchen Vehikeln typischerweise in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml bei physiologischem pH-Wert formuliert. Es versteht sich, daß die Verwendung bestimmter der vorangehenden Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von Aktivinsalzen führt.
• Zur therapeutischen Verabreichung zu verwendendes Aktivin muß steril sein. Sterilität wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (z.B. 0,2 um Membranen) erreicht.
• Therapeutische Aktivinzusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gegeben, beispielsweise in eine Phiole mit einem Pfropfen, der mit einer hypodermischen Injektionsnadel durchstochen werden kann.
• Aktivin wird üblicherweise in Einheits- oder Mehrfachdosierungsbehältern gelagert, beispielsweise abgedichteten Ampullen oder Phiolen, oder als wässerige Lösung oder als eine lyophilisierte Formulierung zur Rekonstituierung. Als Beispiel für eine lyophilisierte Formulierung werden 10 ml-Phiolen mit 5 ml sterilgefilterter 1%iger (Gewicht/Volumen) wässeriger Aktivinlösung gefüllt, und die resultierende Mischung wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstituieren des lyophilisierten Aktivins unter Verwendung von 5 ml sterilem Wasser oder Ringer-Lösung hergestellt.
• Das Aktivin wird auch durch Systeme mit verzögerter Freisetzung auf geeignete Weise verabreicht. Geeignete Beispiele für Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung umfassen halbdurchlässige Polymermatrizen in der Form geformter Gegenstände, z.B. Filme oder Mikrokapseln. Matrizen zur verzögerten Freisetzung umfassen Polylaktide (US-PS-3,773,919, EP 58,481), Copolymere aus L-Glutaminsäure und Gammaäthyl-L-Glutamat (U.Sidman et al., "Biopolymers" 22, 547-556 (1983)), Poly(2-Hydroxyäthylmethacrylat) (R. Langer et al., "J.Biomed.Mater.Res." 15: 167-277 (1981), und R. Langer "Chem.Tech." 12:98-105 (1982)), Äthylenvinylacetat (R. Langer et al., Id.) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133,988): Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung von Aktivin umfassen auch liposomal eingeschlossenes Aktivin. Aktivin enthaltende Liposome werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt: DE 3,218,121; Epstein et al., "Proc.Natl.Acad.Sci USA", 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., "Proc.Natl.Acad.Sci. USA", 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanische Patentanmeldung Nr. 83-118008; US-PS-4,485,045 und US-PS-4,544,5,45: und EP-102,324. Üblicherweise sind die Liposome vom kleinen (etwa 200-800 Ångström) unilamellaren Typ, bei dem der Lipidgehalt größer als etwa 30 Molprozent Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Anteil auf optimale Aktivintherapie eingestellt wird.
• Aktivintherapie wird auf geeignete Weise mit anderen vorgeschlagenen oder herkömmlichen Therapien zur Steigerung der Fortpflanzungsfähigkeit kombiniert. Beispielsweise kann Aktivin mit anderen Fertilitätsmitteln verabreicht werden, die verwendet werden, um die Vermehrung und Differenzierung von Keimzellen zu stimulieren.
• Beispiele für andere Therapien oder Mittel umfassen die Herbeiführung von Rebound von Testosteron oder anabolischer Androgen-induzierter Azoospermie; die Verabreichung exogener Gonadotropine oder Gonadotropin freisetzender Faktoren wie menschliches Choriongonadotropin (hCG); menschliches klimakterisches Gonadotropin (hMG); gereinigtes FSH oder Gonadotropin freisetzendes Hormon (GnRH). Alternativ dazu kann Clomiphenzitrat oder Tamoxifen in Verbindung mit Aktivin verwendet werden, um die endogene Gonadotropinausscheidung zu stimulieren. Außerdem können geringe Dosen an Mesterolon, einem oralen synthetischen Androgen, oder eines Aromataseinhibitors wie Testolakton verabreicht werden.
• Das Inhibin und die Fertilitätsmittel werden auf geeignete Weise durch getrennte oder dieselben Mittel verabreicht, auf getrenntem oder demselben Verabreichungsweg und zur gleichen oder zu unterschiedlicher Zeit, je nach z.B. der Dosierung, dem klinischen Zustand des Patienten usw. Es ist nicht notwendig, daß derartige Fertilitätsmittel in den Aktivinzusammensetzungen an sich eingeschlossen sind, obwohl das zweckmäßig ist, wenn derartige Arzneimittel auf demselben Verabreichungsweg zugeführt werden.
• Wenn sie gemeinsam mit dem Aktivin verwendet werden, werden derartige Mittel typischerweise in geringerer Dosis eingesetzt, als wenn sie alleine verwendet werden. Wenn hCG verwendet wird, beträgt die wirksame Menge vorzugsweise 1500 bis 2000 I.E. zweimal wöchentlich, bis die Testosteronspiegel im Bereich männlicher Erwachsener liegen. An diesem Punkt wird auch hMG in einer Dosis von etwa einer Ampulle jeden zweiten Tag verabreicht. Wenn Clomiphenzitrattherapie angewendet wird, beträgt die Behandlung typischerweise 25 mg Clomiphenzitrat pro Tag für 21 bis 25 Tage, gefolgt von einer 5- bis 7-tägigen Ruheperiode. Dieser Zyklus wird im allgemeinen für zumindest 24 Wochen wiederholt.
• Eine typische kombinierte Zusammensetzung enthält die obengenannte Menge an Aktivin und etwa 25 mg Clomiphenzitrat in einem geeigneten intraperitonealen Fluid wie milchsaure Ringer-Lösung.
• Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden. Diese sollen jedoch nicht als den Schutzumfang der Erfindung einschränkend aufgefaßt werden.
BEISPIEL 1
• Sertoli-Zellen und Keimzellen von 20 Tage alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Laboratories, Inc. Wilmington, MA) wurden gemeinsam in serumfreien Medien kultiviert. Kulturen wurden nach dem von Mather und Phillips in "Methods for Serum-Free Culture of Cells of the Endocrine System", Hrsg. Barnes und Sato (Alan R. Liss, Inc. New York, 1984), S. 29-45, und Rich et. al, "Endocrinol.", 113: 2284-2293 (1983) beschriebenen Glycin/Kollagenase-Verfahren hergestellt.
• Kurz gesagt wurde der Hoden entfernt und entkapselt und die Röhrchen (tubular) in einer hypertonischen Glycinlösung auseinandergezupft. Das Zurückführen der Röhrchen in isoosmotisches Medium führt zur Lyse des interstitiellen Gewebes ohne Schädigung der Röhrchen. Die Röhrchen wurden dann in kleinere Segmente zerhackt und enzymatisch mit Kollagenase/Dispase behandelt, um die Bodenmembranen und peritubulären Zellen zu entfernen. Die peritubulären Zellen wurden verworfen und die Röhrchenstücke mit 1-5 mm Länge, die Sertoli-Zellen und Spermatogonia und Spermatozyten enthalten, wurden in serumfreies Ham's F12/DME-Medium plattiert, das mit HEPES und Insulin 5 ug/ml; Transferrin, 5 ug/ml; α-Tokopherol, 5 ug/ml; Epidermiswachstumsfaktor (EGF), 5 ng/ml; und Aproteinin, 25 ug/ml (5F) ergänzt war. Nach 20-24 Stunden hatten sich die Sertolizellen am Substrat festgesetzt und verbreitet, um eine Monoschicht zu bilden. Es war zu sehen, daß Spermatozyten als einzelne Zellen oder Gruppen aus zwei Zellen an der Monoschicht hafteten oder unbefestigt im Medium schwammen.
• Bei 24 Stunden nach dem Plattieren wurde das Medium getauscht und nicht festgesetzte Zellen wurden verworfen. Frisches 5F-Medium wurde allen Kulturen hinzugefügt, und zu den Versuchsbedingungen wurden zusätzlich 100 ng/ml menschliches rekombinantes Inhibin A oder Aktivin A (hergestellt und gereinigt, wie in der US-PS-4,798,885 vom 17. Januar 1989 beschrieben) hinzugefügt. Alle Bedingungen wurden dreifach geprüft und der gesamte Versuch wurde mehrfach (> 10) wiederholt.
• Zwischen 24 und 48 Stunden der Behandlung erschienen Trauben aus Spermatogonia und eine erhöhte Anzahl an primären Spermatozyten. Diese Zellen erscheinen als verbundene Trauben aus 8-32 Zellen, die an der Sertoli-Zellmonoschicht und großen Zellen in Suspension haften. Bei Inhibin wurde keine derartige Wirkung beobachtet.
• Jedes Näpfchen enthielt 2 Millionen Zellen. Insgesamt 1 uCi 3H-Thymidin wurde jedem Näpfchen nach 24, 48 oder 72 Stunden der Behandlung mit Aktivin oder Inhibin hinzugefügt.
• Die Markierungsaufnahme in Zellen wurde nach 20 Stunden der Inkubation mit 3H-Thymidin gemessen. Zellen wurden durch heftiges Pipettieren mit einem 1 ml Pipettman-Pipettor vom Substrat gelöst, und der gesamte Inhalt des Näpfchens wurde in ein 10 ml-Filternäpfchen übertragen, das zwei Glasfaserfilter und 5 ml kalte 20%ige Trichloressigsäure enthielt. Die ausgefällten Zellen wurden auf dem Filter aufgefangen und zweimal mit kalter 5%iger Trichloressigsäure gewaschen, um nichtaufgenommenes 3H-Thymidin zu entfernen. Die Filter wurden einmal mit kaltem Methanol gewaschen und in einem für wässerige Proben geeigneten Szintillationsfluid gezählt.
• Die Ergebnisse werden in Figur 1 gezeigt. Die Aufnahme war in allen Fällen bei den Aktivin-behandelten Näpfchen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle oder Inhibin-behandelten Näpfchen höher. Bei 48 Stunden Kultivierung hatte das Aktivin die höchste Aufnahme (11,040 cpm ± 1572 SEM) bezogen auf die Kontrolle (4515 ± 597) und Inhibin-behandelte Kulturen (5355 ± 466). Somit erhöht Aktivin die Vermehrung von Spermatozyten.
• Die Wirkung von Inhibin und Aktivin auf die Keimzellendifferenzierung wurde durch zytometrische Fließanalyse quantifiziert. Sertolizellen wurden mit Nilrot (einem selektiven fluoreszierenden Farbstoff für intrazellulare Lipidtröpfchen) gefärbt, und nicht-färbende Keimzellen wurden elektronisch ausgeblendet. Ein DNA-spezifisches Fluorchrom (Hoechst 33342) wurde verwendet, um den Prozentsatz an Keimzellen mit N, 2N oder 4N DNA-Gehalt zu bestimmen, wobei 4N = primäre Spermatozyten. Wie aus den Figuren 2A und 2B zu ersehen ist, wiesen Aktivin-behandelte Kulturen im Vergleich zu Kontroll- oder Inhibin-behandelten Kulturen bei 48 Stunden eine beträchtliche Zunahme im Prozentsatz an 4N-Keimzellen auf.
• Als Schlußfolgerung stimuliert Aktivin die Vermehrung und Differenzierung von testikulären Keimzellen von 20 Tage alten Ratten in vitro, was anzeigt, daß sie die Fortpflanzungsfähigkeit beim Männchen erhöhen. Die Daten weisen auch darauf hin, daß lokale Verabreichung von Aktivin, die für Keimzellen über z.B. ein intratestikuläres Depotverfahren mitogen ist, unabhängig von (oder möglicherweise in Übereinstimmung mit) Anderungen der Gonadotropinausscheidung direkte gonadale Stimulierung der Spermienproduktion verursachen würde.

Claims (8)

1. Verwendung von Aktivin bei der Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Fortpflanzungsfähigkeit bei einem männlichen Säugetier, bei dem Keimepithelversagen vorliegt.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Aktivin Aktivin A, Aktivin AB oder Aktivin B vom Schwein oder Menschen ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin das Aktivin menschliches Aktivin A ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament zur Verabreichung an den Hoden bestimmt ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das Medikament zur Verabreichung durch Injektion in den Hoden bestimmt ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Säugetier ein Mensch ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament in Dosierungsform zur Verabreichung einer Tagesdosis von etwa 1 ug/kg bis 10 mg/kg vorliegt.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Keimepithelversagen teilweises Keimepithelversagen ist.