DE69105114T2 - Methode zur erhöhung der fruchtbarkeit weiblicher säuger. - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Inhibin zur Steigerung der Fruchtbarkeit weiblicher Säuger.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
• Inhibin ist ein Glykoprotein, das durch verschiedene Gewebe erzeugt wird, u.a. durch die Gonaden, die Hypophyse, das Gehirn, das Knochenmark, die Plazenta und die Nebennieren. Es wurde zuerst durch seine Fähigkeit identifiziert, die Sekretion von follikelstimulierendem Hormon (FSH) durch die Hypophyse zu hemmen. De Jong und Sharpe, Nature, 263: 71-72 (1976); Schwartz und Channing, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74: 5721-5724 (1977). Eine solche bevorzugte Regulierung der Gonadotropinsekretion erregte großes Interesse und sorgte dafür, daß viele Laboratorien in den letzten 50 Jahren versuchten, diese Substanz unter Verwendung verschiedener Bioassays aus Hodenextrakt, Spermatozoen, ret-testis-Flüssigkeit, Samenplasma und Eierstockfollikelfluid zu isolieren und charakterisieren. Rivier et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 133: 120 (1985); Ling et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82: 7217 (1985); Fukuda et al., Mol.Cell Endocrinol., 44: 55 (1985). Die Struktur von Inhibin, das aus verschiedenen Spezien charakterisiert wurde, besteht aus zwei über Disulfidbrücken verbundenen Untereinheiten: einer α- und entweder einer βA- oder βB- Kette.
• Nach der Identifizierung von Inhibin wurde gezeigt, daß Activin als natürlich vorkommende Substanz im Follikelfluid vorliegt. Es stellte sich heraus, daß Adivin die FSH-Freisetzung durch Ratten-Hypophysenvorderlappenzellen stimulieren kann. Vale et al., Nature, 321: 776-779 (1986); Ling et al., Nature, 321: 779-782 (1986). Activin besteht aus einem Homodimer oder Heterodimer von Inhibin β-Untereinheiten, die βA- oder βB-Untereinheiten sein können. Vale et al., Recent Prog.Horm.Res., 44: 1-34 (1988). Es existiert eine 95-100%ige Aminosäurekonservierung von β-Untereinheiten zwischen Human-, Schweine, Rinder- und Rattenactivinen. Die βA- und βB- Untereinheiten innerhalb einer bestimmten Spezies sind zu etwa 64-70% homolog. Die Activin βA- und βB-Homodimere ("Activin A" bzw. "Activin B") wurden in Follikelfluid identifiziert, und beide Moleküle wurden geklont und ihre Gene exprimiert. Mason et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 135: 957 (1986); EP-A Nr. 222.491, veröffentlicht am 20. Mai 1987; Mason et al., Molecular Endocrinol., 3: 1352-1358 (1989). Die vollständige Sequenz der βB-Untereinheit ist in Serono Symposium Publications unter dem Titel "Inhibin- Non-Steroidal Regulation of Follicle Stimulating Hormone Secretion", Hg. H.G. Burger et al., Abstract durch A.J. Mason et al., Band 42, S. 77-88 (Raven Press, 1987) unter dem Titel "Human Inhibin and Activin: Structure and Recombinant Expresson in Mammalian Cells" veröffentlicht.
• Sowohl Activin A als auch Activin AB, doch bislang noch nicht Activin B, wurden aus natürlichen Quellen isoliert. Es wurde berichtet, daß Activin-mRNA (βA- und βB- Untereinheiten), Bioaktivität und Immunaktivität durch Hoden-Leydigzellen bei nicht erwachsenen Ratten und Schweinen erzeugt werden. Lee et al., Science, 243: 396-398 (1988); Lee et al., in Serono Symposium Publications unter dem Titel "The Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis", Hg. Cooke und Sharpe, Band. 50 (Raven Press: New York, 1988), S. 21-27. Vor kurzer Zeit wurde festgestellt, daß Activin A eine Erythropoietin-stimulierende Aktivität sowie eine FSH-freisetzende Aktivität aufweist. Siehe EP-A Nr. 210.461, veröffentlicht am 4. Februar 1987 (wo das Protein als BUF-3 bezeichnet wird). Eto et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 142: 1095-1103 (1987) und Murata et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA., 85: 2434-2438 (1988) (wo das Activin als EDF bezeichnet wird) sowie Yu et al., Nature, 330: 765-767 (1987) (wo das Adivin als FRP bezeichnet wird). In diesen Systemen antagonisierte Inhibin die Wirkungsweise von Activin.
• Kürzlich wurde die Expression von Inhibinuntereinheiten, die jeweils durch ein getrenntes Gen kodiert wurden, in verschiedenen anderen Geweben außer den Eierstöcken und Hoden aufgezeigt. Inhibin α, βA, und βB mRNAs wurden in Plazenta-, Hyphophysen-, Nebennieren-, Knochenmark- und Gehirngewebe nachgewiesen. Meunier et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85: 247-251 (1988). Die Expression der Inhibinuntereinheiten-mRNAs variierte um ein Mehrfaches in gewebespezifischer Weise, was auf verschiedene Funktionen für diese Proteine je nach ihrem Assoziationsmuster und Produktionsstelle schließen läßt.
• Inhibin und Activin sind Mitglieder eine Familie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren. Der Prototyp dieser Familie ist der transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGFβ) (Derynck et al., Nature, 316: 701-705 (1985)), der gemäß einer Quelle auch eine FSH-freisetzende Aktivität aufweist. Ying et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 135: 950-956 (1986). Andere Mitglieder der TGFβ- Familie sind die Muller'sche Hemmsubstanz, der Fliegen-Dekapentaplegie- Genkomplex und das Produkt von Xenopus Vg-1-mRNA.
• Beim Menschen sekretieren wachsende Präovulationsfollikel und der Corpus luteum als Reaktion auf die FSH-Stimulierung Inhibin in den Blutkreislauf. Lee and Gibson, Aust.J.Biol.Sci. 115-120 (1985); McLachlan et al., Fertil.Steril., 48:1001 (1987). Somit spielen Inhibin-verwandte Peptide bei der Modulierung der Gonadenfunktionen über eine Hypophysen-Rückkopplungsschleife eine wichtige Rolle. In Ratten-Primärkulturen von Hodenzellen und Eierstockscheiden-Interstitialzellen verstärkt Inhibin laut Berichten die durch das leutinisierende Hormon (LH) stimulierte Androgenbiosynthese, während Activin die Androgenproduktion unterdrückt. Hsueh et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84: 5082-5086 (1987). Andere Forscher konnten diese Beobachtungen nicht wiederholen. deKretser und Robertson, Biology of Reproduction, 40: 33-47 (1989).
• Die hemmenden Wirkungen von TGF-β auf Leydigzellen-Steroidbildung wurden auch beschrieben. Lin et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 146: 387 (1987); Fauser und Hsueh, Life Sci., 43:1363 (1986); Avallet et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 146: 575 (1987). Es stellte sich heraus, daß in Primärkulturen von Granulosazellen Activin und Inhibin sowie TGF-β in ihrer jeweils eigenen Weise die Hormonsynthese und -sekretion beeinflussen. Adashi und Resnick, Endocrinology, 119: 1679 (1966); Ying et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 136: 969 (1966); Hutchinson et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 146: 1405 (1987); Mondschein et al., Endocrinology, 123: 1970 (1988); Feng et al., J.Biol.Chem., 261: 14167 (1966). Diese Moleküle weisen sowohl positive als auch negative Auswirkungen auf die FHS-abhängige Granulosazellfunktion auf. Carson et al., J.Reprod.Fert., 85: 735-746 (1969). Es wird auch vermutet, daß einzelne Mitglieder der TGF-β Inhibingenfamilie die Eierstockfunktion nicht nur durch direktes Einwirken auf die Follikelzellen, sondern auch indirekt durch das Beeinflussen der Produktionsrate anderer Mitglieder dieser Familie regulieren. Zhiwen et al., Molecular and Cellular Endocrinology, 56: 161-166 (1968).
• Activin A und Inhibin modulieren laut Berichten das Wachstum von zwei Gonadenzellinien, wobei dies darauf schließen läßt, daß diese Proteine die Vermehrung sowie die Funktionen der Gonadenzellen regulieren können. Gonzalez-Manchon und Vale, Endocrinology, 125: 1666-1672 (1989). Es wurde angegeben, daß die Sekretion von Inhibin durch das Corpus luteum die Konzentration von FSH in der lutealen Phase des Zyklus und somit die Hemmung der Follikelentwicklung unterdrückt. Baird et al., Ann.N.Y.Acad.Sci., 541: 153-161 (1968).
• Ein zusammenfassender Artikel postuliert, daß Inhibin zumindest einer der Faktoren ist, welche die Anzahl der zum Eisprung bestimmten Follikel bestimmt, und daß die Beeinflussung der Wirkung von Inhibin zur Regulierung der Fruchtbarkeit beitragen könnte. De Jong, Physiol.Rev., 66: 555 (1968). Viele Forscher mutmaßten, daß Inhibin aufgrund seiner FHS-Hemmungswirkung auf der Ebene der Hypophyse zur männlichen und weiblichen Empfängnisverhütung geeignet sein könnte. Sheth und Moodbidri, Adv.Contracept., 2: 131-139 (1986); Findlay, Fertil.Steril., 46: 770 (1986). Ein anderer Autor bezweifelt, ob Inhibin die Spermatogenese hemmen kann (es wird Bremner et al., J.Clin.Invest., 68: 1044 (1981) zitiert) und stellt fest, daß Inhibin auch eine gewisse direkte stimulierende Wirkung auf die Spermatogenese ausüben kann. Baker et al., Clin.Reprod.and Fert., 2: 161-174 (1983).
• Wenn Schafe mit Inhibin oder der Inhibin α-Kette immunisiert werden, erhöht sich ihre Ovulationsrate aufgrund der Immunneutralisierung von endogenem Inhibin. Cummins et al., J.Reprod.Fertil., 77: 365 (1986); Henderson et al., J.Endocrinol., 102: 305-309 (1984); Forage et al., J.Endocrinol., 114: R1 (1987); Al-Obaidi et al., J.Reprod.Fert., 81: 403-414 (1987). Die gleiche Wirkung wurde bei Ratten beobachtet. Rivier und Vale, Endocrinology, 125: 152 (1989). Darüber hinaus vermuten Rivier und Vale, daß erhöhtes FSH alleine ausreicht, um zusätzliches Follikelwachstum und die Follikelentwicklung zu stimulieren, und daß der Hauptmechanismus, durch den die Behandlung mit Antiinhibin-Serum die Follikelentwicklung fördert, über erhöhte FSH- Werte im Plasma erfolgt. Andere Forscher berichteten, daß die Verabreichung von Inhibin an Schafe je nach dem Behandlungsschema entweder zu einer Anovulation oder zu einer Zunahme der Ovulationsrate führt. Franchimont et al., Rev.Fr.Gynedol.Obstet., 83: 607 (1988).
• Die Modulierung der Inhibinuntereinheit-mRNAs während des Östralzyklus der Ratten wurde intensiv untersucht. Woodruff et al., Science, 239: 1296 (1988). Die integrative Rückkopplungsbeziehung zwischen Eierstock-Inhbin und Activin und Hyphophysen- FHS wurde erst kürzlich teilweise geklärt. Hasegawa et al., in Inhibin: Non-Steroidal Regulation of FHS Secretion, Hg. J.Burger et al., 42: 119-133 (New York: Raven Press, 1987); Woodruff et al., Science, 239: 1296-1299 (1988). Kurz gesagt erzeugt der Eierstock geringe Inhibinmengen am Abend des Voröstrus. Dadurch kann FSH während des gesamten Östrusvormittags in erhöhten Mengen vorhanden sein (sekundärer FHS- Anstieg). Rivier et al., Science, 234: 205-208 (1986). Der sekundäre FSH-Anstieg sorgt für die Eingliederung einer neuen Follikelmenge in den Ovulationspool und ist für die Einleitung der Expression der Inhibinuntereinheiten-mRNA verantwortlich. Als Folge der Inhibinproduktion wird die Hypophysen-FSH-Sekretion nach unten reguliert. Mit Fortdauer des Zyklus steigen Inhibin-mRNA-Werte in reifenden Follikeln. Follikel, die atretisch werden (nicht ovulierend und hochgradig steroidogen), weisen wenig oder überhaupt keine Inhibin-mRNA auf. Woodruff et al., Growth Factors and the Ovary, Hg. Hirshfield, S. 291-295 (New York: Plenum Press, 1989). Die Ansammlung von Inhibinuntereinheit-mRNA erreicht am Nachmittag des Voröstrus in gesunden Follikeln gleichzeitig mit dem primären LH- und FSH-Ansteigen einen Höhepunkt. Woodruff et al., Science, oben.
• Seit dem ersten erfolgreichen in vitro-Fertilisationsverfahren im Jahre 1978 versuchte man, Arzneimittel oder Hormone zu verwenden, um eine Mehrfach-Follikel- und Oozytenentwicklung zu induzieren. Somit konnten in-vitro- Fertilisationsschwangerschaften dazu führen, daß bei Frauen nach der Verwendung von Clomiphencitrat und menschlichem Choriongonadotropin eine Mehrfach- Follikelentwicklung bei endocrin-normalen Patienten eingeleitet wird. Trounson et al., Science, 212: 681-684 (1981). Es wurde mehrfach aufgezeigt, daß sich die geeignete Anwendung von vermischten exogenen Gonadotropinen FSH und LH bei der Einleitung des Eisprungs oder der Mehrfach-Eigewinnung während der in-vitro- Fertilisationstherapie als wirkungsvoll erweist. Die Eierstockstimulierung durch Verabreichung von exogenen Gonadotropinen ist jedoch schwierig durchzuführen. Ein weiteres brauchbares Mittel ist FSH alleine oder in Kombination mit einem Gonadotropin-freisetzenden Hormonantagonisten, wie dies in der US PS 4.845.077 beschrieben ist.
• Die Behandlungen mit FSH oder einer Mischung von FSH und LH führen zu erhöhten Inhibinserum-Werten während der follikularen und frühen lutealen Phase des Zyklus. McLachlan et al., Lancet, 1: 1233-1234 (1986); Tsonis et al., J.Clin.Endocrinol.Metab., 66: 915 (1988); Buckler et al., J.Endocrin., 122: 279-285 (1989); Tsuchiya et al., Fert.Steril., 52: 88 (1989). Ein anderer Forscher stellte jedoch fest, daß zum Zeitpunkt des Eisprungs weder die Inhibinaktivität noch die Follikelwerte von Steroiden oder Gonadotropinen adäquate Kriterien zur Voraussage des endgültigen Erhalts von Oozyten in einem in-vitro-Fertilisationsprotokoll sind. Lefevre et al., Fert.Steril., 46: 325 (1986).
• Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Inhibin zur Steigerung der Fruchtbarkeit bei jenen Patienten zu verwenden, die auf Gonadotropin oder andere Behandlungen nicht ansprechen.
• Ein weiteres Ziel besteht darin, den Eisprung zum Zwecke der in-vitro-Fertilisation und des Embryotransfers einzuleiten.
• Diese und andere Ziele sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.
Zusammenfassung der Erfindung
• Ein Verfahren zur Erhöhung der Fruchtbarkeit eines weiblicher Säugers umfassend das Verabreichen einer wirksamen Inhibinmenge an den Eierstock des Säugers.
• In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Erhöhung der Fruchtbarkeit bereit, umfassend eine wirksame Inhibinmenge in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
• Es stellte sich heraus, daß Inhibin die Follikelentwicklung während des Übergangs vom Diöstrus zum Proöstrus reguliert. In-vivo-Untersuchungen erfolgten durch einseitige Injektion von Inhibin in unreife Eierstöcke weiblicher Ratten und Analyse des Reifens des Antralfollikels durch Untersuchen der Morphologie, des Follikeldurchmessers und durch Einbau von 3H-Thymidin in entstehende Follikel. Die Ergebnisse zeigen überraschenderweise, daß das Wachstum und die Entwicklung der Eierstockfollikel durch lokale Verabreichung von Inhibin an den Eierstock aufrechterhalten werden kann. Somit steht für weibliche Säuger mit Unfruchtbarkeit aufgrund inadäquater Follikelentwicklung, die auf die Gonadotropinbehandlung nicht ansprechen, eine Alternativtherapie zu Verfügung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Fig.1 ist ein Graph der Follikelverteilung in Ratteneierstöcken, die einerseits mit Salzlösung (Kontrolle) und anderseits mit Serumgonadotropin von trächtigen Stuten behandelt sind (PMSG-behandelt).
• Fig.2 ist ein Graph der Follikelverteilung in mit Inhibin und Activin behandelten Eierstöcken, wobei die Sterne stark atretische Reaktionen anzeigen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
• Der hierin verwendete Ausdruck "Inhibin" bezieht sich auf die Heterodimere von α- und β-Ketten von Inhibin, Präproformen und Proformen, gemeinsam mit Glykosylierungs- und/oder Aminosäuresequenzvarianten davon. Nach dem Abspalten vom reifen Protein kann der Vorläuferabschnitt nichtkovalent mit dem reifen Protein assoziiert werden. Inhibin A bezieht sich auf Inhibin mit den Ketten α und βA. Inhibin B bezieht sich auf Inhibin mit den Ketten α und βB.
• Die intakte isolierte Präpro- oder Prodomäne oder reife βA-, βB- und α-Sequenzen werden durch jedes beliebige Mittel, darunter synthetische und/oder rekombinante Mittel, synthetisiert, sie werden jedoch vorzugsweise in rekombinanter Zellkultur synthetisiert, wie dies beispielsweise in der US PS 4.798.865, veröffentlicht am 17. Januar 1969, beschrieben ist.
• Es liegt im erfindungsgemäßen Schutzbereich, Inhibin aus anderen Tieren als dem Menschen, z.B. aus Schweine oder Rinderquellen, zu verwenden, um Menschen zu behandeln. Beispielsweise sind die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen der Schweineinhibin-α-Kette in der US PS 4.798.885, oben, beschrieben. Es ist ebenso wünschenswert, andere Säugetierspezien wie Haus- oder Nutztiere sowie Zoo-, Sporttiere und Kuscheltiere zu behandeln; Humaninhibin wird dabei ebenso wie Inhibin aus anderen Quellen in geeigneter Weise verwendet.
• Im allgemeinen sind Aminosäurevarianten mit dem relevanten Abschnitt der Säugetier- α- oder β-Kettensequenzen im wesentlichen homolog, die in der US PS 4. 798.885, oben, angeführt sind. Im wesentlichen homolog bedeutet, daß mehr als etwa 60% der primären Aminosäuresequenz des homologen Polypeptids mit der Sequenz der Inhibinkette übereinstimmt, wenn sie/es ausgerichtet ist, um die Anzahl der Aminosäureresteübereinstimmungen zwischen den beiden Proteinen zu maximieren. Die Ausrichtung zur Maximierung der Resteübereinstimmung umfaßt das Verschieben des Amino- und/oder Carboxylterminus, gegebenenfalls das Einführen von Zwischenräumen und/oder das Löschen von Resten, die als Einfügungen im Kandidaten vorhanden sind. Typischerweise sind Aminosäurevarianten zu mehr als etwa 70% mit den korrespondierenden Nativsequenzen homolog.
• Zwar ist die Stelle zum Einsetzen einer Sequenzvariation vorbestimmt, doch die Mutation an sich muß nicht vorbestimmt sein. Um z.B. die Leistung der Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann am Zielcodon oder der Zielregion eine Zufallsmutagenese erfolgen, und es können die exprimierten Inhibinmutanten hinsichtlich der optimalen Kombination der gewünschten Aktivität gescreent werden. Techniken zur Durchführung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA mit bekannter Sequenz sind wohlbekannt, z.B. M13-Primermutagenese.
• Die Mutagenese erfolgt durch das Bilden von Aminosäureeinsätzen, üblicherweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, oder von Löschungen von etwa 1 bis 30 Resten. Substitutionen, Löschungen, Einsetzungen oder jede beliebige Unterkombination können zur Erreichung eines Endkonstrukts kombiniert werden. Vorzugsweise wird jedoch Substitutionsmutagenese durchgeführt. Offensichtlich dürfen die Mutationen in der kodierenden DNA die Sequenzen nicht aus dem Leserahmen rücken und schaffen vorzugsweise keine Komplementärregionen, die eine sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten.
• Kovalente Modifizierungen von Inhibin sind im erfindungsgemäßen Schutzbereich enthalten und umfassen kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Gruppen. Kovalente Derivate werden durch Anhängen von Funktionalitäten an Gruppen, die sich in den Inhibin-Aminosäureseitenketten oder an den N- oder C- Termini befinden, mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren hergestellt. Diese Derivate umfassen z.B.: aliphatische Ester oder Amide des Carboxylterminus oder der Carboxyl-Seitenketten enthaltende Reste, z.B. Aspartylreste; O-Acylderivate von Hydroxylgruppen-enthaltenden Resten wie Aryl oder Alanyl; und N-Acylderivate der aminoterminalen Aminosäure- oder Aminogruppen enthaltenden Reste, z.B. Lysin oder Arginin. Die Acylgruppe ist aus der Gruppe von Alkylgruppen (darunter C3 bis C10 n- Alkyl) ausgewählt, wodurch Alkanoylspezien gebildet werden, sowie carbozyklische oder heterozyklische Verbindungen, wodurch Aroylspezien gebildet werden. Die reaktiven Gruppen sind vorzugsweise difunktionale Verbindungen, die an sich zur Verwendung beim Vernetzen von Proteinen an unlösliche Matrizen über reaktive Seitengruppen bekannt sind, z.B. m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester. Bevorzugte Derivatisierungsstellen sind an Histidinresten.
• Der Ausdruck "Verabreichung an den Eierstock" bedeutet nicht nur die Injektion in den Eierstock, z.B. durch intrabursale Verfahren, sondern umfaßt auch Techniken, welche die den Eierstock umgebende Region mit Inhibin überfluten, sodaß das Inhibin in den Eierstock absorbiert wird. Dies kann durch einen Einschnitt in den Unterleib oder durch den Eierstock mit oder ohne Verwendung einer Sonde erfolgen. Zusätzlich kann das Inhibin in ein den Eierstock speisendes Gefäß vorzugsweise unter Verwendung eines mikroskopischen Verfahrens injiziert werden. Weiters kann das Inhibin in ein Implantat gesetzt werden, das in die Nähe des Eierstocks eingesetzt wird und über welches das Inhibin in den Eierstock absorbiert wird. Andere Techniken eignen sich ebenfalls, soferne das Ergebnis darin besteht, daß Inhibin dem Eierstock lokal zugeführt wird und den erfindungsgemäßen Zielen gerecht wird.
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Inhibin zur Erhöhung der Fruchtbarkeit von weiblichen Säugern, darunter von Sport-, Zoo-, Haus- und Nutztieren wie Hunden, Katzen, Vieh, Schweinen, Pferden, Affen und Schafen, sowie von Menschen. Die Notwendigkeit einer Fruchtbarkeitssteigerung ist im allgemeinen auf eine unzulängliche Eierstockfollikel-Entwicklung zurückzuführen.
• Das Inhibin wird dem Säugetier wie oben besprochen über den Eierstock zugeführt. Die spezifische Verabreichungsweise hängt z.B. von der Krankengeschicht des Patienten ab.
• Die in der Therapie zu verwendende Inhibinzusammensetzung wird gemäß der bewährten medizinischen Praxis formuliert und dosiert, wobei man den klinischen Zustand des einzelnen Patienten, das Verabreichungsverfahren, den Verabreichungszeitplan und andere für den Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt. Die "wirksame Menge" wird für die erfindungsgemäßen Zwecke durch solche Überlegungen bestimmt.
• Allgemein kann man vorschlagen, daß die pharmazeutisch wirksame Gesamtmenge des pro Dosis verabreichten Inhibins im Bereich von etwa 1 ug/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag des Patientengewichts liegt, obwohl, wie bereits erwähnt, diese Menge von zahlreichen therapeutischen Überlegungen abhängt. Vorzugsweise beträgt diese Dosis nicht mehr als 10 ug/kg/Tag. Der entscheidende Faktor bei der Auswahl einer geeigneten Dosis ist das erzielte Ergebnis, das durch Steigerung der Follikelentwicklung oder durch andere Kriterien gemessen wird, die dem Praktiker als zweckmäßig erscheinen.
• Zur Verabreichung wird Inhibin im allgemeinen durch Vermischen in einem erwünschten Reinheitsgrad in einer Dosierungseinheit-injizierbaren Form (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert, d.h. mit einem Träger, der für den Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch ist und mit den anderen Ingredientien der Formulierung kompatibel ist. Beispielsweise enthält die Formulierung vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, die bekanntermaßen für Polypeptide schädlich sind.
• Im allgemeinen werden Formulierungen durch gleichmäßiges und enges In-Kontakt- Bringen des Inhibins mit flüssigen Trägern und/oder feinteiligen festen Trägern gebildet. Im Bedarfsfall wird das Produkt zur erwünschten Formulierung geformt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Beispiele solcher Trägervehikel sind Wasser, Salzlösung, Ringer'sche Lösung und Dextroselösung. Nichtwässerige Vehikel wie stabilisierte Öle und Äthyloleate eignen sich ebenso wie Liposome.
• Der Träger enthält geeigneterweise kleine Mengen an Additiven, z.B. Substanzen, die die Isotonität und chemische Stabilität verbessern. Solche Materialien sind bei den vorliegenden Dosierungen und Konzentrationen für den Empfänger nichttoxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Nitrat und andere Salze organischer Säuren; Antioxidantien wie Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie Serumalbumin, Gelatin oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glyzin, Glutamin- und Aspartinsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate wie Zellulose oder ihre Derivate, Glukose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Gegenionen wie Natrium und/oder nichtionische Tenside wie Tween, Pluronics oder PEG.
• Das Inhibin wird typischerweise mit einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml bei physiologischem pH-Wert in derartigen Vehikeln formuliert. Man beachte, daß die Verwendung bestimmter obiger Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von Inhibinsalzen führt.
• Das zur therapeutischen Verabreichung zu verwendende Inhibin muß steril sein. Die Sterilität erreicht man am besten durch das Filtrieren durch Sterilfiltrationsmembranen (z.B. 0,2 u-Membranen).
• Therapeutische Inhibinzusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, z.B. in ein Fläschchen mit einem durch eine subkutane Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen.
• Inhibin wird üblicherweise in Einheits- oder Mehrfachdosisbehältern, z.B. abgedichteten Ampullen oder Fläschchen, als wässerige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution gelagert. Als Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10 ml-Fläschchen mit 5 ml sterilgefilterter 1%iger (w/v) wässeriger Inhibinlösung gefüllt, und die resultierende Mischung wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstituieren des lyophilsierten Inhibins unter Verwendung von 5 ml sterilem Wasser oder Ringer'scher Lösung gebildet.
• Die Inhibintherapie wird geeigneterweise mit anderen vorgeschlagenen oder herkömmlichen fruchtbarkeitssteigernden Therapien kombiniert. Beispielsweise kann Inhibin mit anderen Fruchtbarkeitsmitteln verabreicht werden, die man zur Erhöhung der Anzahl verfügbarer Eier verwendet. Weiters kann man das Inhibin mit Mitteln kombinieren, die die Wirkungen der bekannten Fruchtbarkeitsmittel wie der Gonadotropinhormon-freisetzenden Antagonisten verstärken oder mit diesen synergistisch sind.
• Beispielen von Wirkstoffen, die zur Herbeiführung von gesteuerter Mehrfachfollikelreifung verwendet werden, umfassen Clomiphencitrat oder menschliche Menopausegonadotropine, z.B. FSH (beschrieben in der US PS 4.845.077), oder eine Mischung von FSH und LH, und/oder menschliche Choriongonadotropine. Zur Verringerung der ausgeprägten individuellen Variabilität als Ansprechen auf die Therapie mit menschlichem Menopausegonadotropin kann ein Gonadotropin- freisetzender Hormonantagonist verabreicht werden. Typische Gonadotropin- freisetzende Hormonantagonisten werden beschrieben durch: Rees et al., J.Med.Chem., 17: 1016 (1974); Coy et al., Peptides, 1976 (Loffed Ed., Editions de L'Université de Bruxelles 1977), S. 463; Beattie et al., J.Med.Chem., 18: 1247 (1975); Channabasavaiah et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 86: 1266(1979), und in den US PSen 4.317.815 und 4.431.635. Dazu gehören (Ac-pClPhe¹, pClPhe², DTrp³, DArg&sup6;, DAla¹&sup0;)GnRH HCl, [D-Phe²]-LHRH, [D-Phe², D-Phe&sup6;]-LHRH, [D-Phe², Phe³, D-Phe&sup6;]-LHRH, [D-Phe², D- Trp³, D-Phe&sup6;)-LHRH, [D-p-F-Phe-D-Ala&sup6;]-LHRH und [Ac-D-Phe¹, D-Phe², D-Trp3,6]- LHRH.
• Die Inhibin- und Fruchtbarkeitswirkstoffe werden je nach z.B. Dosierung, klinischem Zustand des Patienten, usw. geeigneterweise durch getrennte oder gleiche Mittel, durch getrennte oder gleiche Verabreichungswege und zu gleichen oder unterschiedlichen Zeitpunkten zugeführt. Es ist nicht erforderlich, daß solche Fruchtbarkeitsmittel in den Inhibinzusammensetzungen an sich enthalten sind, obwohl dies zweckmäßig ist, wenn solche Arzneien über den gleichen Verabreichungsweg zugeführt werden.
• Bei der gemeinsamen Verwendung mit Inhibin werden solche Wirkstoffe typischerweise in kleineren Mengen als bei der Verwendung alleine eingesetzt. Wenn FSH getrennt verwendet wird, ist die wirksame Menge vorzugsweise eine tägliche Menge von etwa 70 bis 220/I.U., noch bevorzugter 1,5 bis 4,0 I.U./kg. Wenn man einen Gonadotropin-freisetzenden Hormonantagonisten gemeinsam mit FSH verwendet, beträgt die tägliche Menge des Gonadotropin-freisetzenden Hormonantagonisten vorzugsweise etwa 1,0 bis 4,0 mg/kg, noch bevorzugter, 1,5 bis 2,5 mg/kg. Weitere Details dieser letzteren Wirkstoffe finden sich in der US PS 4.845.077.
• Eine typische kombinierte Zusammensetzung enthält die oben angeführte Menge Inhibin und etwa 70 bis 220/I.U. FSH in einem geeigneten intraperitonealen Fluid, z.B. lactierter Ringer'scher Lösung.
• Für Frauen, die sich einer Ovulationsinduktion zum Bewirken eines Embryotransfers unterziehen, eignet sich jedes Embryotransferverfahren nach dem Auslösen des Eisprungs durch das Inhibin. Dazu gehören z.B. der in-vitro-Fertilisations- und Embryotransfer (IVT-ET) (Quigly et al., Fertil.Steril., 38: 678 (1982)), Gametenintrafallopischer Transfer (GIFT) (Molloy et al., Fertil.Steril., 47: 289 (1987)) und der pronukleare Stufenröhrentransfer (PROST) (Yovich et al., Fertil.Steril., 48: 351 (1987)). Derartige erfolgreiche Verfahren zeigen eine positive Korrelation mit der Anzahl gewonnener Oozyten und der Anzahl übertragener lebensfähiger Embryonen.
• Wenn der Zeitplan der Abläufe im Eierstock wie erwartet fortschreitet, kann man in der Nähe der Hälfte des Zyklus durch Ultraschall oder Laparoskopie ein oder mehrere Follikel mit erweiterten Gefäßen und deutlicher Durchsichtigkeit auf der Eierstockoberfläche beobachten. Dies ist das herkömmliche Aussehen des dominanten Follikels kurz vor dem Eisprung. Für das typische in-vitro-Fertilisationsprotokoll wird eine Nadel in den Follikel eingeführt, und sein Inhalt, der ein einziger Oozyt sein kann, wird in den spontanen Eierstockzyklus gesaugt. Die Oozytengewinnung erfolgt mittels einer transvaginalen, ultraschallgelenkten Follikelansaugung. Nach dem Absaugen fällt der Follikel zusammen. Wenn der Follikel abgesaugt ist, wird das Ei zur Bewertung seines Zustandes mikroskopisch untersucht.
• Subjektive Kriterien zur Beurteilung der Normalität des Eis umfassen das Bewerten seiner Lebensfähigkeit und Reife durch die Anzahl umgebender Granulosazellen, die Dichte der Schleimbeschichtung, die Dichte der Zona pelludica und die Gegenwart oder Abwesenheit des polaren Körpers. Menschliches Eileiterfluid, das nach Quinn et al., Fertil.Steril., 44: 493 (1985) gewonnen wird und durch 10% wärmeinaktiviertes Material oder fötales Nabelschnurserum ergänzt ist, kann für IVF- und Embryokultur verwendet werden. Reife Oozyten werden mit gewaschenen und gewanderten Spermatozoen (typischerweise 100.000 bis 200.000 pro Ei) nach einem vorbestimmten Zeitraum nach der Ansaugung (z.B. 6 bis 8 Stunden) besamt. Die Befruchtung wird typischerweise 12 bis 18 Stunden nach der Besamung bewertet, und die Oozyten werden in Wachstumsmedien überführt. Nur normal befruchtete Oozyten werden im 2- bis 8-Zellstadium typischerweise 48 bis 56 Stunden nach der Gewinnung den Patienten zugeführt. Erfolgreiche IVF führt nach der Übertragung von Donator-Embryonen zu Schwangerschaften.
• Allgemeine Protokolle für IVF sind unter anderem durch Trounson et al., oben; Trounson und Leeton, in Edwards und Purdy, Hg, Human Conception in vitro (New York: Academic Press, 1982), und Trounson, in Crosignani und Rubin, Hg., in vitro Fertilization and Embryotransfer, S.315 (New York: Academic Press, 1983) geoffenbart.
• Die Gefahr des nicht-hormoninduzierten lutealen Phasenhormonmangels, der bei der IVF auftreten kann, kann durch die Verabreichung der kollektiven Sekretionen für mehr als ein Corpus luteum verringert werden.
• Für das GIFT-Protokoll erfolgt die Oozytengewinnung geeigneterweise durch ein laparoskopisch gelenketes standardmäßiges Follikelansaugeverfahren. Renou et al., Fertil.Steril, 35: 409 (1981). Sobald die Oozyten gesammelt und bewertet sind, werden bei einem typischen Verfahren die Gameten, ein Maximum von fünf Oozyten, zum Eileiter befördert. Eine Samenprobe wird etwa 3 bis 4 Stunden vor der Oozytenabnahme abgenommen, und die Endsuspension bewegungsfähiger Spermatozoen wird auf 100.000 bis 200.00/35 ul eingestellt. Der GIFT-Katheter wird mit Spermasuspention und Oozyten gefüllt. Der Katheter wird in den Eileiter eingeführt, wie dies durch Molloy et al., Fert.Steril., 47: 289 (1987) beschrieben ist, und die Gameten werden übertragen.
• Beim PROST-Protokoll werden alle Verfahren zur Oozytenansaugung, zum Bilden der Samensuspension und zur Besamung mittels der gleichen Vorgangsweise wie beim IVF- Programm durchgeführt. Nach der Beurteilung der Oozytenbefruchtung werden mittels des gleichen Verfahrens wie beim GIFT-Programm zwei Pronuklei-Oozyten in den Eileiter eingesetzt.
• Es folgt eine Erklärung der Erfindung unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele. Diese schränken jedoch den erfindungsgemäßen Schutzbereich nicht ein.
BEISPIEL 1
• 25 Tage alte weibliche Sprage-Dawley Ratten (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) wurden mit einer Kombination von 80 mg/kg Ketamihn HCl (Vetlalar, Aveco Company) und 4 mg/kg Xylozin (Gemini, Rugby Laboratories) anästhesiert. Die linke Rückenlendenregion der Ratte wurde abgeklemmt und mit 70%igem Isopropylalkohol und einer Iodabwischlösung vorbereitet. Ein 5-7 mm breiter Einschnitt wurde knapp caudal der letzten Rippe durch die Hautschichten vorgenommen, bevor ein 3-5 mm breiter Schnitt in das Peritoneum erfolgte. Der Eierstock wurde freigelegt und durch Fassen des umliegenden Fetts vorsichtig nach außen gelegt. Eine Tamponpinzette mit geraden Ösen wurde zwischen das linke Uterushorn und das umliegende Fett gesetzt und geöffnet; auf diese Weise wurde der Eierstock zur Injektion freigelegt. Während das anhaftende Fett zur Stabilisierung gefaßt wurde, injizierte man 10 ul menschliches rekombinantes Inhibin A oder Acitivin A (1 ug/Eierstock, hergestellt und gereinigt nach dem Verfahren der US PS 4.798.885, veröffentlicht am 17. Januar 1989) intrabursal caudal zum Eileiter über eine an einer Tuberculinspritze befestigte Nr.28-Nadel. PMSG, eine Kombination von FHS und LH, wurde mit 25 internationalen Einheiten (IU) intraperitonal injiziert.
• Die Tiere wurden in die folgenden Gruppen eingeteilt:
• Gruppe 1: Salzlösung (n=5=);
• Gruppe 2: PMSG (n=6);
• Gruppe 3: Inhibin A (n=8);
• Gruppe 4: Inhibin A und PMSG (n=7);
• Gruppe 5: Activin A (n=7);
• Gruppe 6: Activin und PMSG (n=8).
• Die Gesamtzahl der bei jedem Experiment verwendeten Tiere ist in Klammern angegeben; zwei unabhängige Wiederholungen sind angegeben. 3H-Thymidin (1 uCi) wurde gemeinsam mit den unten angeführten Hormonen einer zusätzlichen Tiergruppe intrabursal injiziert:
• Gruppe 7: 3H-Thymidin in Salzlösung;
• Gruppe 8: 3H-Thymidin und PMSG;
• Gruppe 9: 3H-Thymidin und Inhibin A;
• Gruppe 10: 3H-Thymidin, Inhibin A und PMSG.
• Bei jedem Tier wurde in einen Eierstock Hormon injiziert, und der andere diente als Kontrolle auf der gegenüberliegenden Seite. Das Dosisvolumen betrug etwa 10 ul. Unmittelbar nach Verabreichung wurde mit einem Tupferträger auf die Injektionsstelle ein leichter Druck angelegt. Der Eierstock wurde vorsichtig reponiert, der Einschnitt mit zwei 9mm-Wundklammern geschlossen und das Tier in den Käfig zurückgebracht und beobachtet, bis es seinen Richtungsreflex wiedererlangte.
• 24 Stunden nach Verabreichung erfolgte eine Nekropsie. Gewebeproben wurden entnommen und als Vorbereitung für die histologische Analyse in 4%iges Formalin gelegt.
• Man fixierte die Eierstöcke 12 Stunden lang in 4%igem Formalin, bettete sie in Paraffin ein und stellte 3 um dicke Mikrotomschnitte her. Die Stufenschnitte wurden alle 50 um auf Mikroskop-Objektträger montiert. 50 um-Intervalle wurden auf Grundlage des Oozytendurchmessers (80 uM) gewählt, sodaß jedes Follikel ohne Wiederholung analysiert wird. Die Schnitte wurden mit Hämotoxylineosin eingefärbt. Gesunde Follikel wurden gegenüber atretischen morphologisch durch die folgenden Kriterien bewertet: Oozytenaussehen, Ausrichtung der Granulosazellschicht und Anzahl der Granulosazellschichten. Woodruff et al., in Growth Factors and the Ovary, Hg., A.N.Hirshfield, S. 291-295 (New York: Plenum Press, 1989); Osman, J.Reprod.Fertil., 73: 261-270 (1985).
• Mit 3H-Thymidin behandelte Eierstöcke wurden analog zu nicht-radioaktiven Proben fixiert und in 3 um dicke Mikrotomschnitte geschnitten. Die Objektträger wurden in eine autoradiographische Emulsion getaucht, 2 bis 4 Wochen lang einer Temperatur von 4ºC belichtet und eingefärbt.
• Der Follikeldurchmesser wurde unter Verwendung des Bioquant Bildanalysesystem bestimmt. Zwei Messungen wurden rechtwinkelig zueinander auf der Höhe der Granulosazellenbrücke zum Keimhügel und Oozyten vorgenommen. Doppelmessungen wurden vermieden, indem das Bild des ersten Schnitts gespeichert wurde und dann neben den nachfolgenden Schnitt gesetzt wurde. Follikel, die im ersten Schnitt gemessen worden waren, wurden nicht gezählt.
• Fig.1 zeigt die Follikelanzahl in jeder Größenklasse nach der intrabursalen Injektion von Salzlösung oder PMSG bei einer repräsentativen Tiergruppe. Fig.2 zeigt die Follikelanzahl in jeder Größenklasse nach der intrabursalen Injektion von Inhibin A oder Activin A für eine repräsentative Tiergruppe.
• Die mit Salzlösung injizierten und die unbehandelten (kontralateralen) Eierstöcke wiesen eine ähnliche Follikelverteilung auf. Mit PMSG behandelte Tiere wiesen eine Follikelverteilung von klein (250 um) bis groß (> 500 um) auf. Die Inhibinbehandlung bewirkte auch, daß eine Follikelwelle in größere Größenklassen vordrang, obwohl diese Veränderung nicht so ausgeprägt war wie bei den mit PMSG behandelten Tieren. Die Auswirkung von Inhibin auf die Follikelgröße von mit PMSG behandelten Tieren unterschied sich nicht von der PMSG-Behandlung alleine.
• Die Behandlung mit Activin führte zu atretischen Follikeln, wie dies durch die Sterne gezeigt ist. Interessanterweise führte die Activinbehandlung bei einem PMSG- Hintergrund zu einer ähnlichen Follikelverteilung wie bei PMSG alleine. Die Follikelgröße ist ein Maß für die Fruchtbarkeit; die Follikelgröße nimmt mit der Reifung und der Vorbereitung auf den Eisprung zu und ist somit ein morphologischer Marker des reifenden Oozyten.
• Die Follikelgesundheit wurde durch Verfolgen des Einbaus von 3H-Thymidin in wachsende Follikel überwacht. Mit Salzlösung behandelte präpubertale Follikel zeigten geringe Einbauwerte in murale Granulosazellen, Thecazellen und Zellen des Eihügels (Zellen des Keimhügels und benachbarte Zellen). Nicht alle Follikel dieser Behandlungsgruppe waren markiert. Die PMSG-Behandlung führte zur Stimulierung des Follikelwachstums mit damit einhergehender Verbesserung des 3H-Thymidineinbaus in die sich teilenden Granulosa- und Thecazellen. Außerdem bauten die meisten Follikel verschiedener Größenklassen die Markierung ein.
• Die Injektion von Inhibin bewirkte ein zentripetales Muster markierter Granulosazellen. Zwei Zellschichten waren markiert, nämlich die die Antralhöhle ausrichtenden Zellen und die Zellen in der Nähe der Basalmembran. Wenn Inhibin gemeinsam mit PMSG injiziert wurde, war das Markierungsmuster identisch zu PMSG alleine.
• Somit beeinflußte lokal verabreichtes Inhibin durch Verursachen einer Welle des Follikelwachstums von 250 um bis 350 um die Follikelbildung. Die Größenzunahme ist ähnlich jener, die man beim erwachsenen Tier während des Übergangs vom Östrus zum Metestrus feststellt. Außerdem herrschte Zellteilung in den Granulosazellen der Antrum- und Basalschicht vor. Dieses zentripetale Mitosemuster ist mit dem Muster identisch, über das Hirshfield für erwachsene, in einem Zyklus befindliche Tiere berichtete. Hirshfield, Biol.Reprod., 34: 229-235 (1986). Das gleiche Muster konnte man in mit PMSG behandelten, präpubertären Tieren nicht feststellen. Die Verabreichung von Inhibin an den Eierstock noch nicht erwachsener Ratten bewirkt somit ein Ansprechen unter Follikelentwicklung, die mit dem erwachsenen Follikelwachstum identisch ist. Es scheint, daß der sekundäre FHS-Anstieg für die Follikelauswahl (erwachsenes Tier) ausreicht und daß die Follikelentwicklung durch große exogene Dosen von PMSG (unreifes Tier) aufrechterhalten werden kann, daß jedoch die Inhibinproduktion zur Aufrechterhaltung von Follikeln im Eierstockpool erforderlich ist.
• Zusammenfassend zeigen die in vivo-Daten, daß Ihhibin bei der intragonadalen Aufwärtsregulierung der reproduktiven Funktion so wirksam wie FSH ist. Somit werden weibliche Säuger, die keine vollständig entwickelten Follikel aufweisen, geeigneterweise mit Inhibin behandelt, um den Eisprung zu induzieren und dadurch ihre Fruchtbarkeit zu erhöhen. Weiters scheint Inhibin in vivo ein etwas anderes Verhalten zu zeigen als FSH, ein weiteres Fruchtbarkeitsmittel, was darauf schließen läßt, daß es bei jenen Patienten geeignet sein könnte, die auf FSH nicht ansprechen.

Claims (14)

1. Verwendung von Inhibin bei der Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Fruchtbarkeit weiblicher Säuger, wobei dieses Medikament zur Verabreichung an den Eierstock des Säugers dient, sodaß das Inhibin auf diesen Eierstock die Follikelgenese beeinflussend wirkt und dadurch die Fruchtbarkeit erhöht.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Säuger ein Mensch ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament zur Verabreichung durch Injektion in den Eierstock dient.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Inhibin Schweine oder menschliches Inhibin A oder B ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das Inhibin menschliches Inhibin A ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament zur Verwendung bei einem Verfahren zur Erhöhung der Fruchtbarkeit dient, worin nach Inhibinverabreichung, ungefähr in der Mitte des Zyklus, die Oozyten im Follikel des Säugereierstocks entfernt und mit Spermatozoen vermischt werden, was Befruchtung zur Folge hat.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin die Befruchtung in vitro oder in vivo erfolgt.

8. Pharmazeutisches Produkt, umfassend ein kombiniertes Präparat aus Inhibin und einem Fruchtbarkeitsmittel zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Verwendung beim Erhöhen der Fruchtbarkeit eines weiblichen Säugers.

9. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 8, das eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge an Inhibin und eine wirksame Menge eines Fruchtbarkeitsmittels in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, ist.

10. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 8 oder 9, worin das Inhibin Schweine- oder menschliches Inhibin A oder Inhibin B ist.

11. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 8 oder 9, worin das Fruchtbarkeitsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Klomiphenzitrat, einem menschlichen Menopausalgonadotropin oder einem menschlichen chorionischen Gonadotropin, ausgewählt wird.

12. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 8 oder 9, worin das Fruchtbarkeitsmittel ein follikelstimulierendes Hormon ist, allein oder in Kombination mit leutinisierendem Hormon oder einem Gonadotropin freisetzenden Hormonantagonisten.

13. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 12 zur Verabreichung einer täglichen Menge an follikelstimulierendem Hormon von ungefähr 75 bis 225/I.E. und einer täglichen Menge an einem Gonadotropin freisetzenden Hormonantagonisten von ungefähr 1,0 bis 4,0 mg/kg.

14. Verwendung von Inhibin und einem Fruchtbarkeitsmittel bei der Herstellung eines Medikaments nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13.