DE69121715T2

DE69121715T2 - Die kombination des wachshormons und des insulin-ähnlichen wachstumsfaktors-i stimuliert das wachstum

Info

Publication number: DE69121715T2
Application number: DE69121715T
Authority: DE
Inventors: Ross Clark; Michael Cronin
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1990-06-07
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2011-06-01
Also published as: US5597797A; DK0536226T3; US5126324A; JP2961708B2; EP0536226A1; ATE141799T1; WO1991018621A1; CA2083159C; CA2083159A1; HK1007954A1; JPH05507278A; DE69121715D1; GR3021713T3; ES2093708T3; EP0536226B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Förderung des Wachstums von Patienten, insbesondere von jenen mit verzögerter Wachstumsrate oder Gewichtsverlust, unter Verwendung einer Kombination natürlicher Hormone. Außerdem reduziert die Kombination das Ausmaß des Ungleichgewichts der Glukose- Homeostase, das hervorgerufen wird, wenn irgendeines der beiden Hormone alleine verabreicht wird.

Beschreibung verwandter Gebiete

Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I (IGF-I) ist ein Polypeptid, das natürlich in menschlichen Körperflüssigkeiten vorkommt, beispielsweise in Blut und menschlicher Zerebrospinalflüssigkeit. Die meisten Gewebe und besonders die Leber erzeugen IGF-I gemeinsam mit spezifischen IGF-bindenden Proteinen. Diese Moleküle stehen unter der Steuerung des Wachstumshormons (GH). Wie GH ist IGF-I ein hochwirksames anabolisches Protein. Siehe Tanner et al., Acta Endocrinol., 84: 681-696 (1977); Uthne et al.,, J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 548-554 (1974). IGF-I wurde aus menschlichem Serum isoliert und rekombinant produziert. Siehe z.B. EP-A-123.228 und 128.733.
Verschiedene biologische Aktivitäten von IGF-I wurden identifiziert. Forscher stellten fest, daß beim Menschen eine intravenöse Bolusinjektion von IGF-I die Blutglukose- Werte verringert. Siehe Guler et al., N. Eng. J. Med., 317: 137-140 (1987). Weiters fördert IGF-I das Wachstum in verschiedenen metabolischen Zuständen, die durch niedrige IGF-I-Werte gekennzeichnet sind, z.B. in hypophysektomierten Ratten [Guler et al., Endocrinology, 118: Supp 129 Abstract, Skottner et al., J. Endocr., 112: 123-132 (1987); Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4889-4893 (1988); Froesch et al., in Endocrinology, mtl. Congress Series 655, Hg. Labrie und Proulx (Amsterdam: Excerpta Medica, 1984), S.475-479], diabetischen Ratten [Scheiwiller et al., Nature, 323:169- 171 (1986)] und Zwergratten. [Skottner et al., Endocrinology, 124: 2519-2526 (1989)] Das Nierengewicht hypophysektomierter Ratten nimmt bei subkutanen Infusionen von IGF-I über einen längeren Zeitraum beträchtlich zu. Guler et al., Proceedings of the 1st European Congress on Endocrinology, 103: Abstract 12-390 (Kopenhagen, 1987). Die Nieren von Snell-Zwergmäusen und Zwergratten zeigten ein ähnliches Verhalten. van Buul-Offers et al., Pediatr. Res., 20: 825-827 (1986); Skottner et al., Endocrinology s.o. Eine zusätzliche Verwendung von IGF-I ist seine Verabreichung, um die glomeruläre Filtration und den Nierenplasmafluß in menschlichen Patienten zu verbessern. Siehe EP 327.503, veröffentlicht am 9 August 1989; Guler et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1989).
Das menschliche Wachstumshormon (hGH) ist ein einkettiges Polypeptid aus 191 Aminosäuren (Molekulargewicht 21.500). Disulfidbindungen verbinden die Positionen 53 und 165 und die Positionen 182 und 189. Niall, Nature, New Biology, 230: 90 (1971). Menschliches GH ist ein hochwirksames Anabolikum, insbesondere aufgrund der Hemmung der Ausscheidung von Stickstoff, Phosphor, Kalium und Kalzium. Die Behandlung hypophysektomierter Ratten mit GH kann zumindest einen Teil der Wachstumsrate eines intakten Tiers wiederherstellen. Moore et al., Endocrinology, 122: 2920-2926 (1988). Unter seinen auffälligsten Wirkungen in hypopituitären (mit GH- Mangel) Patienten ist das beschleunigte lineare Wachstum von Knochenwachstumsplattenknorpel, das zu einer größeren Körperstatur führt. Kaplan. Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, II: Charles C. Thomas, 1964).
Im jahr 1957 wurde postuliert, daß der Mechanismus der GH-Wirkung auf die GH- induzierte Produktion von Somatomedinen (danach als IGF-I identifiziert und bezeichnet) in der Leber zurückzuführen sei, die im Kreislauf transportiert werden, um alle GH-Wirdungen zu erzielen. Salmon und Daughaday, J. Lab. Clin. Med., 49: 825- 836 (1957). Viele Untersuchungen über die Beziehungen zwischen GH, IGF-I, Knorpel, kultivierten menschlichen Fibroblasten, Skelettmuskel und Wachstum unterstützten diese Somatomedin-Hypothese. Siehe z.B. Phillips und Vassilopoulou-Sellin, N. Engl. J. Med., 302: 372-380; 438-446 (1980); Vetter et al., J. Cm. Invest., 7:1903-1908 (1986); Cook et al., J. Cm. Invest., 81: 206-212 (1988); Isgaard et al., Endocrinology, 123: 2605-2610 (1988); Schoenle et al., Acta Endocrin., 108:167-174 (1985).
Eine weitere Theorie besagt, daß GH einen direkten Einfluß auf Chondrozyten ausübt, der nicht von zirkulierendem IGF-I abhängt. Beispielsweise zeigten zahlreiche in vivo- Untersuchungen das Längswachstum von Röhrenknochen in Ratten auf, die hGH direkt in die Schienbein-Wachstumsplatte injiziert [Isaksson et al., Science, 216: 1237-1239 (1982); Russell und Spencer, Endocrinology, 116: 2563-2567 (1985)], oder durch arterielle Zufuhr zu einem Glied [Schlechter et al., Am.]. Physiol., 250: E231-235 (1986)] erhielten. Zusätzlich stellte man fest, daß die Vermehrung kultivierter Kaninchen-Ohr- und Rippen-Chondrozyten durch hGH in Kultur stimuliert wird [Madsen et al., Nature, 304: 545-547 (1983)], wobei dies mit einem direkten GH-Effekt oder einem durch lokale, GH-abhängige IGF-I-Produktion vermittelten indirekten GH- Effekt konsistent ist. Ein solches autokrines oder parakrines Modell der Wachstumsstimulation wurde durch eine Vielzahl experimenteller Beweise untermauert. Schlechter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7932-7934 (1986); Nilsson et al., Calcif. Tissue Int., 40: 91-96 (1987). Nilsson et al. zeigten, daß die einstellige arterielle Infusion von IGF-I zwar keine Reaktion in Form von Längenwachstum des Schienbeins hypophysektomierter Ratten bewirkte, daß aber die Infusion von hGH ein solches Wachstum hervorrief. Außerdem konnte der Einfluß von GH auf die funktionelle Reifung menschlicher fötaler Inselzellen in vitro durch Zugabe von IGF-I nicht reproduziert werden, was auf eine direkte und keine durch Somatomedin vermittelte Wirkung von GH für diese Zellen schließen läßt. Otonkoski et al., Diabetes, 37:1678-1683 (1988).
Eine dritte Theorie bezüglich der Wirkung von GH und IGF-I besagt, daß GH die Differenzierung von Stammzellen fördert, wodurch sie auf Proliferationsstimulierung durch IGF-I ansprechen. Green et al., Differentiation, 29: 195-198 (1985). Obwohl dieses Modell eines eine lokale IGF-I-Produktion bewirkenden GH (als duale Effektortheorie bezeichnet) für bestimmte Zellarten bestätigt wurde [Zezulak und Green, Science, 233: 551-553 (1986)], konnte nicht bewiesen werden, daß es auch für das Skelettwachstum Gültigkeit besitzt. Man stellte fest, daß sowohl GH als auch Testosteron das Skelettwachstum in einem hypophysektomierten, präpubertären Lamm ohne Änderung der im Kreislauf befindlichen IGF-I-Konzentrationen stimulieren konnten, wobei diese Ergebnisse die Möglichkeit nicht ausschlossen, daß der wachstumsfördernde Einfluß von GH durch lokale Wirkung an der Stelle der Osteogenese hervorgerufen wurde. Young et al., J. Endocrin., 121: 563-570 (1989). Weiters stimuliert GH laut Berichten die Epiphysenplattenbreite des Schienbeins der hypophysektomierten Ratte, ohne die im Kreislauf befindlichen IGF-I-Konzentrationen zu erhöhen. Orlowski und Chernausek, Endocrinol., 123: 44-49 (1988).
Später wurde eine Untersuchung durchgeführt, um den "direkten" in vitro-Einfluß von GH auf epiphysäre und artikuläre Chondrozyten zu reproduzieren, um zu bestimmen, ob dieser Einfluß durch IGF-I in lokaler autokriner oder parakriner Weise vermittelt wird. Trippel et al., Pediatr. Res., 25: 76-82 (1989). Es zeigte sich, daß menschlicher GH artikuläre oder epiphysäre Kaninchen-Chondrozyten oder Rinderepiphysen- Chondrozyten nicht stimuliert, während IGF-I sowohl mitotische als auch differenzierte Zellfunktionen in epiphysären und artikulären Chondrozyten stimuliert. Die Autoren geben an, daß die Daten nahelegen, daß die Rolle von IGF-I bei der Skelettentwicklung komplex und sowohl hinsichtlich der durch ihn regulierten Zellfunktionen als auch hinsichtlich der regulierten Zellpopulationen unterschiedlich sein kann, wodurch weitere Untersuchungen erforderlich sind, um die Beziehung zwischen IGF-I und GH zu definieren.
Es wurde berichtet, daß die Wachstumsreaktion auf die gemeinsame Zugabe von GH und IGF-I statistisch nicht von jener von GH alleine zu unterscheiden war, wenn der Zuwachs des Körpergewichts, die Knochenlänge oder die Epiphysenknorpelbreite des Schienbeins gemessen wurden. Skottner et al., J. Endocr. s.o. [intravenöse Infusion von bGH (10 mu/Tag) über 8 Tage und met-IGF-I (mit spezifischer Aktivität von 3400 U/mg, 120 µg/Tag) während der letzten 4 Tage]; Isgaard et al., Am. J. Physiol., 250: E367-E372 (1986) [5 µg IGF-I und 1 µg hGH, 5 Tage lang täglich lokal injiziert]. Weiters stellte sich heraus, daß IGF-I (bei subkutaner Injektion oder Infusion bzw. intravenöser Infusion) im Vergleich zu hGH ein schwacher Wachstumsförderer in hypophysektomierten Ratten ist, selbst wenn er in Kombination mit geringen Mengen an hGH infundiert wird. Robinson und Clark, Acta Paediatr. Scand Supp., 347: 93-103 (1988).
Was Osteoblasten-ähnliche Zellen in Kultur betrifft, wird die direkte Proliferationsstimulierung durch hGH zumindest teilweise durch IGF-I-ähnliche Immunreaktivität vermittelt [Ernst und Freosch, Biochem. Biophy. Res. Commun., 151: 142-147 (1988)]; die Autoren stellten fest, daß IGF-I und hGH nur dann additive Effekte auf die Osteoblasten-Proliferation hatten, wenn die exogene IGF-I-Konzentration jene des endogen produzierten IGF-I in großem Ausmaß übertraf. Eine weitere in vitro- Untersuchung zeigte, daß gereinigter menschlicher und synthetischer IGF-I die Synthese artikulärer Chondrozyten-DNA von Erwachsenen und die Proteoglycan-Synthese stimulierte; GH übte auf keinen der beiden Vorgänge einen Einfluß aus; in Kombination mit IGF-I zugegebenes GH steigerte die Proteoglycan-, die zellassozuerte Proteoglycanund die Keratansulfat-Synthese auf höhere Werte als mit IGF-I alleine. Smith et al., J. Orthop. Res., 7: 198-207 (1989). Die getrennte Verabreichung von hGH und IGF-I verbessert, wie sich herausstellte, die menschliche Granulozytenbildung, wobei die Wirkung von hGH auf Knochenmark-Vorläuferzellen offensichtlich durch parakrinen IGF-I vermittelt wird. Merchav et al., J. Clin. Invest., 81: 791-797(1988): Merchav et al. führten auch an, daß die Myelozyten-Koloniebildung in Kulturen deutlich gesteigert wurde, die mit kombinierten Minimalkonzentrationen von IGF-I und hGH stimuliert wurden, während kombinierte Maximalkonzentrationen beider Peptide keine additive Wirkung ausübten. Basierend auf neüen immunohistochemischen Daten bezüglich des GH-Rezeptors wurde angenommen, daß GH bei der Erfüllung seiner wachstumsfördernden Funktion im Magen-Darm-Trakt unabhängig von bzw. synergistisch mit Leber-IGF-I wirken kann. Lobie et al., Endocrinol., 126: 299-306 (1990). Es wurde gezeigt, daß die Vorbehandlung hypophysektomierter Ratten mit GH (jedoch nicht mit IGF-I) die Bildung von Chondrozyten-Kolonien fördert und die Chondrozyten in vitro gegenüber IGF-I empfindlich macht. Lindahl et al., Endocrinol., 121: 1070-1075 (1987). Die Autoren nehmen an, daß GH die Koloniebildung durch IGF-I-unabhängige Mechanismen hervorruft und daß IGF-I ein zweiter Effektor der GH- Wirkung ist. Weiters sorgte die Behandlung hypophysektomierter Tiere mit einer einzelnen hGH-Dosis für eine Wiederherstellung von IGF-I-mRNA in Parenchym- und Nichtparenchym-Zellen auf das in intakten Tieren vorgefundene Ausmaß. van Neste et al., J. Endocr., 119: 69-74 (1988).
Es wurde jedoch auch berichtet, daß IGF-I die GH-Gentranskription und GH-Sekretion auf der Ebene der Hypophyse durch einen Hemmungs-Rückkopplungs- Steuermechanismus direkt unterdrückt. Namba et al., Endocrinol., 124: 1794-1799 (1989); Yamashita et al., J. Bio. Chem., 262: 13254-13257 (1987). Weiters wurde berichtet, daß die maximale durch hGH erzielte Stimulation des Glukose-Stoffwechsels in 3T3-Adipozyten nur ein Bruchteil der durch verschiedene IGFs erzielten Stimulation ist, wobei dies anzeigt, daß extrazelluläre IGFs die Wirkung von hGH auf den Glukose- Stoffwechsel in diesen Adipozyten nicht imitieren. Schwartz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 8724-8728 (1985). Außerdem stellte man fest, daß menschliches GH die IGF- I-stimulierte Leydig-Zellen-Steroidgenese nicht weiter steigert. Horikawa et al., Eur. J. Pharmacol., 166: 87-94 (1989). Ein weiteres negatives Ergebnis bestand darin, daß die Kombination von Hühner-Wachstumshormon und menschlichem IGF-I die Zellproliferation und metabolische Aktivität kultivierter Epiphysenwachstumsplatten- Chondrozyten nicht mehr stimulierte als menschlicher IGF-I alleine. Rosselot et al., The Endocrine Society 72nd Annual Meeting, Abstract 202, S. 75, aus "Program and Abstracts", das vor der Konferenz in Atlanta, GA am 20-23. Juni 1990 veröffentlicht wurde. Es wurde überdies berichtet, daß sowohl hGH als auch hIGF-I das Wachstum in Mutanten-Zwergratten fördern können, doch sie unterscheiden sich sowohl quantitativ als auch qualitativ hinsichtlich ihrer Wirkungsweise. Skottner et al., Endocrinology, s.o. Zusätzlich wurde ein Verlust von IGF-I-Rezeptoren in kultivierten artikulären Rinder- Chondrozyten nach der Vorinkubation der Zellen mit pharmakologischen Dosen von hGH oder bGH festgestellt. Watanabe et al., j. Endocr. 107:275-283 (1985). Die Notwendigkeit großer Mengen an GH wird der extrem niedrigen Affinität von GH- Bindungsstellen auf diesen Zellen zugeschrieben. Die Autoren mutmaßen, daß lebende Organismen einen Schutzmechanismus aufweisen, um überflüssiges übermäßiges Wachstum des Körpers zu vermeiden, was zu einer Regulierung der IGF-I-Rezeptoren nach unten führt.
US-A-4.857.505 (veröffentlicht am 15. August 1989) offenbart die Verwendung eines Addukts eines Wachstumshormons, eines Wachstumsfaktors, IGF-I oder eines Fragments davon, das kovalent an ein aktiviertes Polysaccharid gebunden ist, um höhere Halbwertszeiten, einen gesteigerten Gewichtszuwachs in den Tieren und eine höhere Milchproduktion zu erhalten.
Bekannte Nebenwirkungen der hGH-Behandlung sind die Natriumretention und die Ausdehnung des extrazellulären Volumens [Ikkos et al., Acta Endocrinol. (Kopenhagen), 32: 341-361(1959); Biglier et al., J. Cm. Endocrinol. Metab. 21: 361-370(1961)] sowie Hyperinsulinämie und Hyperglykämie. Die wichtigste, auffälligste Nebenwirkung von IGF-I ist die Hypoglykämie. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 5.0.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Kombination von IGF-I und GH bereitzustellen, die eine größere Auswirkung auf das Wachstum eines Patienten hat als eines der beiden Hormone alleine.
Ein weiteres Ziel liegt darin, ein Verfahren zur Behandlung von Patienten (Kinder oder Erwachsene) bereitzustellen, bei denen man eine reduzierte anabolische Wirkung von GH (z.B. durch eine herabgesetzte Fähigkeit, eine IGF-I-Reaktion auf das GH hervorzururen) oder diabetogene Wirkungen oder andere Nebenwirkungen bei der Behandlung mit GH alleine bzw. Hypoglykämie bei der Behandlung mit IGF-I alleine feststellt.
Diese und andere Ziele sind für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig.

Zusammenfassung der Erfindung

Demzufolge bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Förderung des Wachstums eines Säugetiers, umfassend das Verabreichen wirkungsvoller Mengen an IGF-I und GH an das Säugetier, um sein Wachstum über das Wachstum hinaus zu fördern, das unter Verwendung der gleichen Menge an IGF-I oder GH alleine wie bei der Verwendung von IGF-I bzw. GH in Kombination erzielt wird.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung eine zellfreie, wachstumsfördernde Zusammensetzung, umfassend Mengen von IGF-I und GH in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, die eine größere Wachstumsförderung eines Säugetiers erzielen als die Wachstumsförderung, die man unter Verwendung der gleichen Menge an IGF-I oder GH alleine wie bei der Verwendung von IGF-I bzw. GH in Kombination erzielt.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung eine wachstumsfördernde Zusammensetzung, die IGF-I undgh in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger bei einem pH-Wert von etwa 6, der ein Tensid enthält, umfaßt.
Die Literatur zeigt, daß die Rolle von IGF-I bei der Skelettentwicklung in Verbindung mit GH komplex ist, wobei die Beweise für verschiedene Theorien der GH- Wirkungsweise widersprüchlich und nicht schlüssig sind. Wenn GH über die Produktion von zirkulierendem IGF-I (die Somatomedin-Hypothese) wirkt, könnte man nicht erwarten, daß eine maximale Dosis an GH durch systemische Verabreichung von IGF-I verstärkt wird. Wenn GH lokal die Produktion von IGF-I bewirkt, ist es unwahrscheinlich, daß die hohen lokalen Konzentrationen an IGF-I, die durch diese zweite Theorie vorhergesagt werden, durch systemisches Verabreichen von IGF-I reproduzierbar wären. Wenn einige Wirkungsweisen von GH keine IGF-I-Bildung mit sich bringen, könnte die Zugabe von GH die Wirkung von IGF-I steigern. Angesichts der Verwirrung darüber, welche dieser drei Theorien nun korrekt ist, gab es keine klare Grundlage, um den Einfluß der Verabreichung einer Kombination von GH und IGF-I an ein Säugetier auf den Körper und das Knochenwachstum vorherzusagen.
Überraschenderweise wurden ein deutlich größerer täglicher Zuwachs an Körpergewicht, ein stärkeres Knochen längenwachstum und ei ne größere Epi physenbreite des Schienbeins nach der Kombinationsbehandlung von IGF-I und GH erzielt als mit den gleichen Dosen von IGF-I bzw. GH alleine. Die additive Wirkung von IGF-I und GH bestand nicht für alle Gewebe, was eine Selektivität bezüglich des gesamten Körperwachstums, der Knochen und Knorpel nahelegt. Außerdem steigerte IGF-I die wachstumsfördernde Wirkung von GH selbst bei dessen maximal wirkungsvoller Dosis und kann eine geringe GH-Dosis verstärken, um eine maximale Wachstumsreaktion zu erzielen. Somit kann IGF-I in Kombination mit geringeren Dosen an GH verwendet werden, um das Wachstum jener unreifer Patienten zu fördern, die ihre maximale Wachstumsrate nach der Behandlung mit maximalen Dosen an GH alleine erreichten und dann ein Sinken ihrer jährlichen Wachstumsrate verzeichneten. Dies ist eine Wirkung, die bei allen wachstumsgestörten Patienten nach mehreren Monaten Behandlung weitverbreitet ist. Die Kombination könnte auch verwendet werden, um die Wachstumsreaktion von Patienten, die spät in ihrer Entwicklung sind und Wachstumsverzögerung zeigen und die nur mehr einige Jahre Möglichkeit zur therapeutischen Intervention haben, zu vergrößern. Die Kombination kann auch dazu dienen, jene Patienten zu behandeln, die Nebenwirkung wie z.B. diabetogene Symptome bei maximalen Dosen an GH oder Hypoglykämie bei maximalen Dosen an IGF-I aufweisen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Figuren 1A und 1B zeigen Graphen des kumulativen Körpergewichtszuwachses im Verlauf von 7 Tagen für jede Gruppe behandelter, hypophysektomierter, erwachsener, männlicher Ratten für zwei Replikatversuche 1 bzw. 2, die in einem Abstand von 1 Monat durchgeführt wurden (Mittelwerte ± Standardabweichung).
Fig.2 zeigt ein Balkendiagramm der Zunahme der Knochenwachstums- Epyphysenplatten-Breite nach 7 Tagen hGH- und/oder IGF-I-Behandlung hypophysektomierter Ratten (Mittelwerte ± Standardabweichung).
Figuren 3A und 3B zeigen Graphen des Knochenlängenwachstums bzw. der Epiphysenplatten-Breite (eine von Fig.2 getrennte Untersuchung) für jede Gruppe hypophysektomierter Ratten, die mit hGH alleine, mit IGF-I oder des(1-3)-IGF-I alleine bzw. in Kombination mit hGH behandelt wurden (Mittelwerte ± Standardabweichung).
Fig.4 zeigt einen Graph des Gewichtszuwachses in hypophysektomierten Ratten im Verlauf einer Woche als Funktion der hGH-Konzentration (log-Dosis), worin Ratten mit IGF-I (2,4 mg/kg/Tag) unter Verwendung von Minipumpen und mit täglichen hGH- Injektionen behandelt wurden (Mittelwerte ± Standardabweichung).
Fig.5 zeigt einen Graph des Gewichtszuwachses in Zwergratten im Verlauf einer Woche als Funktion der hGH-Konzentration (log-Dosis), worin Ratten mit IGF-I (1,2 mg/kg/Tag) unter Verwendung von Minipumpen und mit täglichen hGH-Injektionen behandelt wurden (Mittelwerte ± Standardabweichung).
Fig.6 zeigt einen Graph des Gewichtszuwachses in hypophysektomierten Ratten unter Verwendung dreier unterschiedlicher Dosen an IGF-I oder des (1-3)-IGF-I, die 7 Tage lang subkutan durch Minipumpen infundiert wurden (Mittelwerte ± Standardabweichung).
Fig.7 zeigt einen Graph des Gewichtszuwachses in hypophysektomierten Ratten unter Verwendung dreier unterschiedlicher Dosen an hGH, die 7 Tage lang täglich subkutan injiziert wurden (Mittelwerte ± Standardabweichung).
Fig.8 zeigt Säulendiagramme der Wachstumsrate in cm/Jahr von Patienten mit verschiedenen Wachstumshemmungs-Ätiologien, die entweder keiner früheren Behandlung (Prev Rx No) oder einer vorherigen Behandlung (Prev Rx Yes) unterzogen wurden. N ist die Anzahl an Patienten beim angegebenen Dosiswert von hGH in Einheiten von mg/kg). Fig.8A zeigt die Daten für das erste Jahr der hGH-Behandlung, Fig.8B die Daten für das zweite Jahr der hGH-Behandlung.
Fig.9 zeigt Säulendiagramme der jährlichen (12-Monats-) Wachstumsrate in cm/Jahr von Patienten, die mit der angegebenen Dosis von hGH in den Altersbereichen 1-2, 3-5, 6- 8, 9-11, 12-14, 15-17 und + über 17 Jahren behandelt wurden. N zeigt die Anzahl an Patienten in jeder Altersgruppe an.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

A. Definitionen

Der Ausdruck "Säugetier" bezieht sich hierin auf Menschen und Tiere und umfaßt Nutztiere wie Rinder, Schafe und Schweine. Das bevorzugte Säugetier ist hierin der Mensch. Der Ausdruck "Nichterwachsener" bezieht sich auf Säugetiere ab dem perinatalen Alter (z.B. Säuglinge mit niedrigem Geburtsgewicht) bis zur Pubertät, wobei die letzteren ihr volles Wachstumspotential noch nicht ausgeschöpft haben.
"IGF-I" bezieht sich hierin auf den insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor aus jeder beliebigen Spezies, einschließlich aus Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden und vorzugsweise Menschen, in Nativsequenz- oder Variantenform und aus jeder beliebigen natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quelle. Zur Verwendung bei Tieren ist die Form von IGF-I aus der jeweils behandelten Spezies vorzuziehen, d.h. Schwein- IGF-I zur Behandlung von Schweinen, Schafs-IGF-I zur Behandlung von Schafen, Rinder-IGF-I zur Behandlung von Rindern usw. Bevorzugt wird zur Verwendung beim Menschen hierin in menschlicher Nativsequenz-Form vorliegender, reifer IGF-I verwendet, mehr bevorzugt ohne ein N-terminales Methionin, der beispielsweise durch das Verfahren aus EP 230869, veröffentficht am 5. August 1987; EP-128.733, veröffentlicht am 19. Dezember 1984; oder EP-288.451, veröffentlicht am 26. Oktober 1988 hergestellt wurde. Noch bevorzugter wird dieser Nativsequenz-IGF-I rekombinant produziert und ist bei Genentech, Inc., South San Francisco, CA für klinische Untersuchungen erhältlich. Zur Verwendung ist weiters IGF-I vorzuziehen, der eine spezifische Aktivität von mehr als 14.000 Einheiten/mg aufweist, die durch einen Radiorezeptor-Assay mittels Plazentamembranen bestimmt wird (erhältlich bei KabiGen AB, Stockholm).
Die bevorzugtesten IGF-I-Varianten sind jene, die in PCT WO 87/01038, veröffentlicht am 26. Februar 1987, und PCT WO 89/05822, veröffentlicht am 29. juni 1989, beschrieben sind, d.h. jene, worin zumindest der Glutaminsäure-Rest an Position 3 aus dem N-Terminus des reifen Moleküls fehlt, oder jene mit einer Deletion von bis zu 5 Aminosäuren am N-Terminus. Bei der bevorzugtesten Variante sind die ersten drei Aminosäuren aus dem N-Terminus deletiert (als Gehirn-IGF, tIGF-I, des(1-3)-IGF-I oder des-IGF-I bezeichnet).
"GH" bezieht sich hierin auf Wachstumshormon aus jeder beliebigen Spezies, z.B. aus Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden und vorzugsweise Menschen, in Nativsequenz- oder Variantenform und aus jeder beliebigen Quelle (natürlich, synthetisch oder rekombinant). Zur Verwendung beim Tier ist die Form von GH aus der jeweils behandelten Spezies vorzuziehen, d.h. Schweine-GH zur Behandlung von Schweinen, Schafs-GH zur Behandlung von Schafen, Rinder-GH zur Behandlung von Rindern usw. Zur Verwendung beim Menschen ist hierin in Nativsequenz vorliegendes, reifes, menschliches GH mit oder ohne Methionin an seinem N-Terminus vorzuziehen. Weiters ist rekombinantes hGH vorzuziehen, d.h. solches, das mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt wird. Am bevorzugtesten ist menschliches Methionyl- Wachstumshormon (met-HGH), das z.B. durch das in US-A-4.755.465 (veröffentlicht am 5. Juli 1988) und das von Goeddel et al., Nature, 282: 544 (1979) beschriebene Verfahren in E.coli hergestellt wird. Das durch Genentech, Inc. unter dem Markennamen PROTROPIN verkaufte Met-hGH ist mit natürlichem Polypeptid identisch, außer daß ein N-terminaler Methioninrest vorhanden ist. Diese hinzugefügte Aminosäure ist das Ergebnis des bakteriellen Proteinsynthese-Prozesses.
Ein weiteres bevorzugtes hGH zur menschlichen Verwendung ist ein rekombinantes hGH (rhGH), das für Kliniken und Forscher von Genentech, Inc. unter dem Markennamen Nutropin und im Handel bei Eli Lilly erhältlich ist, das diesen Methioninrest nicht aufweist und eine identische Aminosäuresequenz besitzt wie das natürliche Hormon. Siehe Gray et al., Biotechnology, 2:161(1984). Sowohl met-hGH als auch rhGH besitzen äquivalente Wirksamkeit und pharmakokinetische Werte. Moore et al., s.o.
Der Ausdruck "Wachstum" bezieht sich auf die Dynamik des Staturwachstums eines Menschen während des Säuglingsalters, der Kindheit und der Jugendzeit, die sich in einer normalen Wachstumskurve zeigt. Das Wachstum bezieht sich somit auf das durch Chondrozyten angetriebene Wachstum der linear produzierenden Knochenplatte, zum Unterschied vom Wachstum der Osteoblastenzellen, die aus einem anderen Teil des Knochens stammen. Die Wiederherstellung eines normalen Wachstumsverhaltens würde es dem Patienten ermöglichen, sich einer zufriedenstellenderen Wachstumskurve anzunähern. Beispiele von Patienten, die gegenüber GH relativ resistent sind, die jedoch eine Behandlung zur Herbeiführung einer anabolischen Wirkung brauchen, umfaßt solche mit dem Ullrich-Turner-Syndrom, Kinder mit GH-Mangel, die als Reaktion auf die GH-Behandlung ein schlechtes Wachstumsverhalten zeigen, Kinder, die etwa 2-3 Jahre vor dem Schließen ihrer Wachstumsplatte eine Verlangsamung oder Verzögerung ihrer normalen Wachstumskurve aufweisen, so daß alleine verabreichtes GH das Wachstum der Kinder nicht mehr fördern könnte, sogenannte "kleinwüchsige" normale Kinder sowie Patienten, bei denen die IGF-I-Reaktion auf GH chemisch (d.h. durch Glukokortikoid-Behandlung) oder durch einen natürlichen Zustand blockiert wurde, z.B. bei erwachsenen Patienten, bei denen die IGF-I-Reaktion auf GH natürlich reduziert ist.

B. Durchführungsarten der Erfindung

IGF-I wird durch jedes geeignete Verfahren, einschließlich auf parenteralem, intranasalem oder oralem Weg, direkt an das Säugetier veräbreicht. Es muß nicht auf dem selben Weg und kann systemisch verabreicht werden. Die konkrete Verabreichungsart hängt z.B. von der Krankengeschichte des Patienten (einschließlich jeglicher wahrgenommener oder erwarteter Neben- bzw. reduzierter anabolischer Wirkungen unter Verwendung von hGH oder IGF-I alleine) und dem zu korrigierenden Wachstumsfehler ab. Beispiele der parenteralen Verabreichung umfassen die subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle und intraperitoneale Verabreichung. Am bevorzugtesten erfolgt die Verabreichung durch Dauerinfusion (z.B. unter Verwendung von Minipumpen wie etwa osmotischer Pumpen) oder durch Injektion z.B. mit Hilfe intravenöser oder subkutaner Mittel. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung sowohl von IGF-I als auch von GH subkutan. Die Verabreichung kann auch als Einzelbolus bzw. als langsam freisetzende Depotformulierung erfolgen. Am bevorzugtesten wird der IGF-I durch Dauerinfusion (am bevorzugtesten subkutan) verabreicht, und das GH wird täglich subkutan durch Injektion verabreicht.
Weiters wird der IGF-I geeigneterweise gemeinsam mit seinem Bindeprotein, z.B. BP53, verabreicht, das in WO 89/09268 (veröffentlicht am 5. Oktober 1989) und durch Martin und Baxter, J. Bio. Chem., 261: 8754-8760 (1986) beschrieben ist. Dieses Protein ist eine säurestabile Komponente mit etwa 53 kd auf einem nichtreduzierenden SDS-PAGE- Gel eines 125-150 kd-Glykoproteinkomplexes, der in menschlichem Plasma vorhanden ist, die meisten endogenen IGF's trägt und der auch durch GH reguliert wird. Günstigerweise wird der IGF-I zur Verabreichung auch mit einem Rezeptor, Antikörper oder Antikörperfragment gekoppelt. Das GH kann ebenfalls verabreicht werden, indem es an ein anderes Agens, z.B. einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder eines seiner Bindeproteine, gekoppelt wird.
Die in der Therapie zu verwendende(n) IGF-I- und GH-Zusammensetzung(en) werden in einer mit der bewährten medizinischen Praxis in Einklang stehenden Weise formuliert und dosiert, wobei man den klinischen Zustand des einzelnen Patienten (besonders die Nebenwirkungen der Behandlung mit hGH oder IGF-I alleine bzw. die Wachstumsverlangsamung nach GH-Dauerbehandlung), die Verabreishungsstelle der IGF-I- und GH-Zusammensetzung(en), das Verabreichungsverfahren, das Verabreichungsschema und andere dem Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt. Die "wirksamen Mengen" jeder Komponente werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung somit durch solche Überlegungen festgelegt und müssen Mengen sein, die das Wachstum des behandelten Patienten über jene Wachstumsförderung hinaus fördern, die man durch Verwendung der gleichen Mengen an IGF-I oder GH alleine erzielt.
Als allgemeiner Vorschlag liegt die pharmazeutisch wirksame Gesamtmenge jedes parenteral verabreichten IGF-I und GH pro Dosis im Bereich von etwa 1 mg/kg/Tag bis 100 mg/kg/Tag bezogen auf das Körpergewicht des Patienten, obwohl - wie bereit erwähnt - der therapeutische Spielraum sehr groß ist. Noch bevorzugter beträgt diese Dosis zumindest 0,1 mg/kg/Tag und am bevorzugtesten zumindest 1 mg/kg/Tag für jedes Hormon. Im Falle der Dauergabe werden IGF-I und GH typischerweise bei einer Dosisrate von etwa 1 µg/kg/Stunde bis etwa 50 µg/kg/Stunde entweder durch 1-4 Injektionen pro Tag oder durch subkutane Dauerinfusionen z.B. mittels einer Minipumpe verabreicht. Es kann auch ein Beutel für intravenöse Lösungen verwendet werden. Der entscheidende Faktor bei der Auswahl der geeigneten Dosis ist das erzielte Ergebnis, das als sich an den normalen Bereich annähernde Steigerungen des Körpergewichtszuwachses, der fettfreien Körpermasse oder des Staturwachstums bzw. durch andere Kriterien zum Messen des hierin definierten Wachstums, die dem Praktiker als geeignet erscheinen, bestimmt wird.
IGF-I und GH werden auch günstigerweise über Systeme mit Langzeitfreisetzung verabreicht. Geeignete Beispiele von Zusammensetzungen mit Langzeitfreisetzung sind halbdurchlässige Polymermatrizen in Form geformter Gegenstände, z.B. Filme oder Mikrokapseln. Matrizen mit Langzeitfrei setzung sind Polylactide (US-A-3.773.919, EP 58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)); Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), und R. Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., ebda.) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP-133.988). IGF-I-Zusammensetzungen mit Langzeitfreisetzung umfassen auch in Liposome eingeschlossenen IGF-I. Liposome, die IGF-I enthalten, werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP-52.322; EP-36.676; EP-88.046; EP-143.949; EP-142.641; JP-A-83-118008; US-A- 4.485.045 und 4.544.545 und EP-102.324. Üblicherweise sind die Liposome klein (etwa 200-800 Ängström) und unilamellar, worin der Lipidanteil mehr als etwa 30 Mol% Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Verhältnis zur optimalen IGF-I- und GH-Therapie abgestimmt wird.
Für die parenterale Verabreichung werden in einer Ausführungsform IGF-I und GH im allgemeinen formuliert, indem beide jeweils mit dem erwünschten Reinheitsgrad in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt werden, d.h. einem, der bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen gegenüber Rezipienten nicht toxisch und mit anderen Ingredientien der Formulierung verträglich ist. Beispielsweise enthält die Formulierung vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, die erwiesenermaßen für Polypeptide schädlich sind.
Im allgemeinen werden Formulierungen durch jeweils gleichmäßiges und enges In- Kontakt-Bringen des IGF-I und GH mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden hergestellt. Dann wird das Produkt - falls erforderlich - zur erwünschten Formulierung geformt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Beispiele solcher Trägervehikel sind Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung. Nichtwäßrige Vehikel wie z.B. nichtflüchtige Öle und Ethyloleat sind hierin ebenso wie Liposome geeignet.
Der Träger enthält günstigerweise geringe Mengen an Additiven wie z.B. Substanzen, die die Isotonie und chemische Stabilität verbessern. Solche Materialien sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für Empfänger nicht toxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze; Antioxidantien wie z.B. Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatin oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate einschließlich Cellulose oder ihrer Derivate, Glukose, Mannose oder Dextrine; Cheliermittel wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; Gegenionen wie z.B. Natrium und/oder nichtionische Tenside wie z.B. Polysorbate, Poloxamere oder PEG.
IGF-I und GH werden typischerweise in solchen Vehikeln mit einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1-10 mg/ml, bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis 8 einzeln formuliert. IGF-I voller Länge ist im allgemeinen nur bei einem pH- Wert von nicht über etwa 6 stabil; des(1-3)-IGF-I ist bei etwa 3,2-5 stabil; hGH ist bei einem höheren pH stabil, z.B. bei 7,4-7,8. Man beachte, daß die Verwendung bestimmter der obigen Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von IGF-I- oder GH-Salzen führt.
Weiters werden IGF-I und GH, vorzugsweise der IGF-I voller Länge, günstigerweise gemeinsam in einem geeigneten Trägervehikel formuliert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, die keine Zeilen enthält. In einer Ausführungsform hängt der für die Formulierung verwendete Puffer davon ab, ob die Zusammensetzung sofort nach dem Vermischen verwendet oder zur späteren Verwendung gelagert wird. Bei Verwendung sofort nach dem Vermischen kann ein Gemisch aus IGF-I voller Länge und GH in Mannit, Glycin und Phosphat, pH 7,4, formuliert werden. Wenn das Gemisch gelagert werden soll, wird es in einem Puffer bei einem pH von etwa 6 (z.B. Citrat) mit einem Tensid formuliert, das die Löslichkeit des GH bei diesem pH steigert, z.B: 0,1 % Polysorbat 20 oder Poloxamer 188. Das endgültige Präparat kann eine stabile Flüssigkeit oder ein lyophilisierter Feststoff sein.
Die zur therapeutischen Verabreichung zu verwendenden IGF-I und GH müssen steril sein. Die Sterilität wird geeigneterweise durch Filtration durch Sten lfi ltrationsmembranen (z. B. 0,2 pm-Membranen) erzielt. Therapeutische IG F-I- und GH-Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise in einen Beutel bzw. ein Fläschen für eine intravenöse Lösung mit einem durch eine hypodermische Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen.
IGF-I und GH werden üblicherweise in Behältern für Einzel- oder Mehrfachdosen, z.B. in abgedichteten Ampullen oder Fläschchen, als wäßrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstituierung gelagert. Äls Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10 ml-Fläschchen mit 5 ml sterilgefilterter 1%-iger (w/v) wäßriger GH-Lösung gefüllt und das resultierende Gemisch lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstituieren des lyophilisierten GH unter Verwendung bakteriostatischen Injektionswassers gebildet.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
(i) werden IGF-I und GH an einen nichterwachsenen Menschen verabreicht;
(ii) dienen IGF-I und GH der Verabreichung an einen Menschen; sind IGF-I und GH in menschlicher Nativsequenz vorliegender, reifer IGF-I bzw. in menschlicher Nativsequenz vorfiegendes, reifes GH; und liegt IGF-I als des(1-3)-IGF-1 in einer sterilen isotonischen Lösung vor, die Essigsäure enthält, pH 3,2 bis 4,5;
(iii) dienen IGF-I und GH der Verabreichung an einen Menschen; sind IGF-I und GH in menschlicher Nativsequenz vorliegender, reifer IGF-I bzw. in menschlicher Nativsequenz vorliegendes, reifes GH; und liegt IGF-I in -einer sterilen isotonischen Lösung vor, die einen Citratpuffer enthält, pH 6;
(iv) dienen IGF-I und GH der Verabreichung an einen Menschen; sind IGF-I und GH in menschlicher Nativsequenz vorliegender, reifer IGF-I bzw. in menschlicher Nativsequenz vorliegendes, reifes GH; und ist GH rekombinantes GH in einer sterilen, isotonischen Lösung, die Mannit und einen Phosphatpuffer enthält, pH 7,4-7,8;
(v) dienen IGF-I und GH der Verabreichung an einen Menschen; und wird eine wirksame Menge an GH verwendet, die geringer als die Dosis ist, die eine maximale Wachstumsreaktion unter Verwendung von GH alleine erzielt;
(vi) dienen IGF-I und GH der Verabreichung an einen Menschen; und wird eine wirksame Menge an GH verwendet, die größer als die Dosis ist, die eine maximale Wachstumsreaktion unter Verwendung von GH alleine erzielt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung bieten weiters:
(vii) eine zellfreie wachstumsfördernde Zusammensetzung mit Mengen an IGF-I und GH in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, die das Wachstum eines Säugetiers wirksam und stärker fördern als eine äquivalente Dosis von jeweils IGF-I und GH alleine, welche Zusammensetzung lyophilisiert ist;
(viii) eine zellfreie wachstumsfördernde Zusammensetzung mit Mengen an IGF-I und GH in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, die das Wachstum eines Säugetiers wirkungsvoll und stärker fördern als eine äquivalente Dosis von jeweils IGF-I und GH alleine, worin der Träger ein Citratpuffer bei pH 6, der ein Tensid enthält, oder ein Phosphatpuffer (pH 7,4) mit Mannit ist;
(ix) eine wachstumsfördernde Zusammensetzung mit IGF-I und GH in einem Citratpuffer (pH 6) der Polysorbat oder Poloxamertensid enthält.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch den Schutzbereich der Erfindung in keiner Weise einschränken. Alle Literatur- und Patentangaben sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.

BEISPIEL

1. Arbeitsvorschrift

Hypophysektomierte, ausgewachsene, männliche Ratten mit einem Gewicht von 85 bis 105 g (Taconic, NY) wurden 7 Tage nach der Operation erhalten und dann während 10 Tagen alle 2-3 Tage gewogen, um den Eingangskriterien eines Gewichtszuwachses von weniger als 7 g und keines Gesamt-Körpergewichtverlusts zu entsprechen. Die Ratten erhielten Purina-Rattenfutter ad libitum. Jede Tiergruppe wurde in eine Vergleichsgruppe (Exzipient), eine Gruppe mit Zusatz von IGF-I, eine mit Zusatz von des(1-3)-IGF-I, eine mit Zusatz von GH, eine mit Zusatz von IGF-I und GH und in eine Gruppe mit Zusatz von des(1-3)-IGF-I und GH eingeteilt.
Osmotische Alzet-Pumpen (Alza, Palo Alto, CA) wurden implantiert, um entweder Exzipient (10 mM Citratpuffer und 126 mM NaCl, pH 6,0) oder rekombinanten menschlichen IGF-I kontinuierlich zuzuführen (hergestellt in E.coli als Z-Z- Fusionspeptid durch das Verfahren, das allgemein in der am 5. August 1987 veröffentlichten EP-230.869 beschrieben ist, oder im Handel bei Kabigen AB, Stockholm erhältlich ist (spezifische Aktivität ) 14.000 U/mg bestimmt durch Radiorezeptor-Assay mittels Plazentamembranen), oder für klinische Forschungen bei Cenentech, Inc., South San Francisco erhältlich ist). Der IGF-I wurde bei 5 mg/ml in 10 mM Citratpuffer und 126 mM NaCl, pH 6,0, aufgelöst und den Ratten mit einer Rate von 120 µg/Ratte und Tag verabreicht (entspricht 1,2 mg/kg/Tag, vorausgesetzt, daß die Ratten jeweils 100 g wiegen). Diese Rate stellt eine submaximale Dosis dar, die in diesem Modell durchwegs einen Körpergewichtszuwachs erzielt.
Alternativ dazu wurden die Pumpen implantiert, um rekombinanten menschlichen des (1-3)-IGF-I kontinuierlich zuzuführen (hergestellt in E.coli, wie dies allgemein durch PCT WO 87/01038, veröffentlicht am 26. Februar 1987, beschrieben ist, mit einer erwarteten spezifischen Aktivität von mehr als etwa 14.000 U/mg, ermittelt durch Radiorezeptor-Assay unter Verwendung von Plazentamembranen, oder erhältlich als Gehirn-IGF von KabiGen AB, Stockholm, > 14.000 U/mg durch Radiorezeptor-Assay unter Verwendung von Plazentamembranen). Er wurde dann bei 2 mg/ml in 20 mM Essigsäure, pH 3,2, formuliert und bei einer Rate von 0,055, 0,166 oder 0,5 mg/kg/Tag verabreicht.
Den Gruppen mit Zusatz von GH wurde rekombinantes menschliches Methionyl- Wachstumshormon (Protropin, Genentech, Inc., South San Francisco, CA), bei 2 mg/ml aufgelöst in 16 mg/ml Mannit und 5 mM Phosphat (pH 7,8) als Exzipient zugeführt. Das hGH wurde jeden Tag ebenfalls bei submaximalen Dosen (15, 60 und 240 µg/kg und Tag) subkutan injiziert, um die Gewichtszuwachsreaktion zu erzielen. Moore et al., s.o. Alternativ dazu kann rekombinantes (ohne Methionin), menschliches Wachstumshormon (Nutropin , Genentech, Inc.) verwendet und bei 2 mg/ml in 18 mg/ml Mannit, 0,68 mg/ml Clycin und 5 mM Phosphat (pH 7,4) formuliert werden.
Beim Pumpenimplantat erhielten die Tiere Oxytetracyclin in einer einzigen intraperitonealen Injektion als intravitaler Marker des Knochenlängenwachstums.
Die Wachstumsraten der hypophysektomierten Tiere wurden bestimmt, indem die täglichen Körpergewichte und die Organgewichte beim Euthanisieren aufgezeichnet und die Schienbeinknochen zur nachfolgenden Beurteilung der Wachstumsplatte fixiert wurden. Der Knochen wurde entkalkt, in Längsrichtung halbiert und in Paraffin eingebettet, um Schnitte herzöstellen und mit Toluidinblau-einzufärben. Der Abstand zwischen der Keimzellenschicht und dem Übergang von aktiven Chondrozyten zu neuen Knochenablagerungen wurde mikroskopisch mithilfe eines geeichten Mikrometerokulars gemessen. Weiters wurden nicht entkalkte Abschnitte aus dem proximalen Schienbein entnommen und der Abstand zwischen der Wachstumsplatte und der Tetracyclin-Linie, die im verkalktem Knochen festgelegt ist, bestimmt, um das kumulative Knochenlängenwachstum zu beurteilen.
Die verbleibende Lösung wurde aus allen osmotischen Pumpen entfernt und enthielt laut Immunassay entweder Exzipient, IGF-I oder des(1-3)-IGF-I. Weiters war die in der Pumpe jeder Ratte verbleibende Hormonmenge jene, die man nach der siebentägigen Dauerzufuhr bei der durch den Hersteller angegebenen Zufuhrrate erwartete.
Unabhängige Replikat-Untersuchungen (als Untersuchung 1 und Untersuchung 2 bezeichnet) wurden in einem Abstand von einem Monat durchgeführt. Statistische Vergleiche erfolgten durch Varianzanalyse, wobei Nachfolgevergleiche durch den Multiple Range Test von Duncan angestellt wurden. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant eingestuft. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung von 6-8 Tieren pro Gruppe dargestellt. Zwei andere unabhängige Studien bestätigten diese Daten.

II. Ergebnisse

Figuren 1A und 1B stellen die kumulativen täglichen Körpergewichtszuwächse der hypophysektomierten Ratten dar, die entweder mit Exzipient, 60 pg/kg/Tag hGH, 1,2 mg/kg/Tag IGF-I oder der hGH/IGF-I-Kombination 7 Tage lang für Untersuchung 1 bzw. Untersuchung 2 behandelt wurden. Der Mittelwert ± Standardabweichung von 7-9 Tieren/Gruppe ist in den Graphen dargestellt; statistische Signifikanz wurde angenommen, wenn p < 0,05. Die Exzipienten-Vergleichsgruppe verzeichnete während der Woche weder einen große Gewichtszunahme noch einen großen Gewichtsverlust, was die Vollständigkeit der Hypophysektomie und die Gesundheit der Tiere in beiden Untersuchungen bestätigte. Das mittlere Körpergewicht wurde durch hGH in dosisabhängiger Weise gesteigert, so daß sich an den Tagen 3-7 die Reaktionen auf alle hGH-Dosen deutlich voneinander unterschieden (siehe Fig.7). Ebenso bewirkte IGF-I einen beträchtlichen Körpergewichtszuwachs, der zum ersten Mal am Tag 2 der Dosierung erkannt wurde und bis zum Tag 7 sehr deutlich vom Exzipienten zu unterscheiden war (2,9 ± 3,5 gegenüber 16 6 ± 2,5 t = 16,86, p < 0,001).
Die Kombination von hGH und IGF-I erzielte einen Körpergewichtszuwachs, der größer als eines der beiden Hormone alleine war und zumindest additiv zu sein schien. Am Tag 7 waren die Körpergewichtszuwächse für den Exzipientenvergleich, IGF-I, hGH und die Kombinationsbehandlungen jeweils: Untersuchung 1: 2,91 ± 3 51 g, 16,6 ± 2,5 g, 12,9 ± 1,2 g und 22,2 ± 2,7 g; Untersuchung 2: -004 ± 2,41 g, 10,8 ± 3 g 904 ± 0,92 g und 19,3 ± 16 g. Der Gewichtszuwachs der Kombinationsgruppe unterschied sich statistisch von den Mittelwerten der anderen drei Gruppen. Beispielsweise war in Untersuchung 1 der mittlere Gewichtszuwachs am Tag 7 bei der Kombinationsgruppe (22,2 ± 2,7 g größer als jener bei GH alleine (12,9 ± 1,2 g, t = 10,80, p ( 0,001) oder bei IGF-I alleine (16,6 ± 2,5 g, t = 6;710, p ( 0,001). Im gleichen Versuch (Daten in Fig.1 nicht dargestellt) steigerte auch des-(1-3)-IGF-I den Gewichtszuwachs (auf 19,9 ± 2,6 g), der bei Zugabe von GH auf 24,7 ± 1,3 g (t = 5,75, p < 0,001) erhöht wurde.
Im Gegensatz dazu wurde früher berichtet, daß bei der intravenösen Verabreichung von nativem Rinder-GH (bGH) an hypophysektomierte Ratten über einen Zeitraum von 4 Tagen und bei der anschließenden Verabreichung von bGH plus Methionin-IGF-I für weitere 4 Tage kein größerer Gewichtszuwachs festzustellen war als bei bGH alleine. Skottner, J. Endocrin., s.o. Neben den unterschiedlichen Verabreichungsarten und Dosierungsschemata dieser zwei Untersuchungen bewirkte selbst Methionyl-IGF-I in diesem früheren Bericht keinen zusätzlichen Gewichtszuwachs. Dieser Versuch zeigt hingegen wiederholt, daß IGF-I und des(1-3)-IGF-I den Körpergewichtszuwachs in hypophysektomierten Ratten fördern und ein additiver Effekt festzustellen war, wenn GH mitverabreicht wurde.
Im Assay über den Gewichtszuwachs hypophysektomierter Ratten besteht eine hervorragende Korrelation zwischen dem Gewichtszuwachs und den Knochenwachstumsreaktionen auf GH. Daher ist es wahrscheinlich, daß ein Gewichtszuwachs von gesteigertem Knochenwachstum begleitet wird, wie dies unten der Fall ist.
Fig.2 zeigt ein Säulendiagramm der Breitenzunahme der Epiphysen-Knochenwachs tumsplatte nach 7 Tagen der hGH- und/oder IGF-I-Behandlung in hypophysektomierten Ratten. Der Mittelwert ± Standardabweichung für 7-9 Raten pro Gruppe ist für Untersuchung 1 dargestellt. Statistisch signifikante Differenzen wurden angenommen, wenn p < 0,05.
In der in Fig.3B gezeigten Untersuchung 2 waren die mit 60 pg/kg/Tag GH (315 ± 35 µm) oder mit 120 µg/Ratte IGF-I (284 ± 20 µm) behandelten Gruppen deutlich (t = 6,859, p < 0,001; bzw. t = 4,00, p < 0,01) von der Exzipientengruppe (235 ± 36 µm) zu unterscheiden; die Plattenbreite für die GH-plus-IGF-I-Gruppe (351 ± 29 µm) unterschied sich sowohl von GH alleine (t = 3,069, p < 0,05) als auch von IGF-I alleine (t = 5,535, p < 0,001). Somit bewirkten in beiden Untersuchungen GH und IGF-I alleine eine deutliche Verbreiterung der Schienbein-Epiphyse im Vergleich zur Vergleichsgruppe, während die gemeinsame Behandlung mit beiden Hormonen eine größere Breite bewirkte als die Behandlung entweder mit GH oder IGF-I alleine, außer bei der hohen Dosis von GH. Außerdem (Fig.38) erhöhte des(1-3)-IGF-I auch die Wachstumsplatten breite auf 300 ± 17 µm im Vergleich zum Exzipienten (t = 5,545, p< 0,001), wobei die zusätzliche Verabreichung von GH wiederum zu einer weiteren Zunahme der Plattenbreite auf 364 ± 31 µm führte, also auf einen Wert, der höher war als bei des(1-3)-IGF-: alleine (t = 5,507, p < 0,001) oder GH alleine (t = 4,193, p(0,01). Die Epiphysenknorpel-Verbreiterung als Reaktion auf diese Hormonbehandlungen glich bezüglich ihres Musters den Körpergewichtsveränderungen (Fig.1).
Wie beim Körpergewichtszuwachs untersuchten andere Forscher die Auswirkungen solcher Kombinationsbehandlungen auf das Wachstum des Schienbeinknochens. GH und IGF, die von Skottner et al., J. Endocrin., s.o., intravenös verabreicht wurden, bewirkten keine deutlich stärkere Reaktion bezüglich des Schienbeinknochenwachstums oder der Epiphysenknorpelbreite als durch die Behandlung mit einem der beiden Hormone alleine. IGF-I bewirkte die Verbreiterung des Epiphysenknorpels und eine Verlängerung des Knochens, übte aber keinen Einflußauf das Körpergewicht aus (siehe oben). In einem anderen Versuch stimulierte die direkte Verabreichung eines dieser Hormone auf die Schienbeinepiphyse das Knochenlängenwachstum. Isgaard et al., s.o. Die Kombination von IGF-I und GH ergab jedoch kein stärkeres Wachstum als durch GH alleine.
Fig.3 zeigt zwei Messungen des Knochenwachstums, das Knochenlängenwachstum (Fig.3A) und die Epiphysenplattenbreite (Fig.38, Untersuchung 2 im Gegensatz zu Untersuchung 1 in Fig.2, wo nur die Epiphysenplattenbreite dargestellt ist), die in hypophysektomierten Ratten bestimmt wurden, die 7 Tage lang mit IGF-I oder des(1-3)- IGF-I alleine bzw. in Kombination mit hGH behandelt wurden. Sowohl bei IGF-I voller Länge als auch bei des(1-3)-IGF-I zeigen die Ergebnisse, daß ihre Kombination mit hGH ein Knochenwachstum oder eine Knorpelausdehnung bewirkte, das bzw. die größer als der Effekt bei der Verwendung eines der beiden Hormone alleine sowie additiv war.
Die relevanten Änderungen der Gewichte der fünf gemessenen Organe sind wie folgt (siehe Tabelle 1). Während GH nicht einheitlich das Herz, die Thymusdrüse und die Milz vergrößerte, steigerten IGF-I und die Kombination von IGF-I und GH deutlich alle Organgewichte im Vergleich zur Exzipientengruppe. Die bevorzugte Wirkung von IGF-I auf die Niere, Milz und Thymusdrüse wurde durch andere Forscher aufgezeigt. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4889-4893 (1988). Ein deutlich stärkerer Effekt der Kombinationsbehandlung wurde nur in Untersuchung 2 gemessen, und zwar für alle Organe außer der Thymusdrüse Die Organ-Körper-Gewichtsverhältnisse (um die Körpergewichtszuwächse berichtigt) wurden durch IGF-I in bezug auf Nieren, Milz und Thymusdrüse gesteigert; die Hormonkombination verstärkte in diesen drei reagierenden Geweben diese Wirkung nicht. im Gegensatz dazu änderte die GH-Behandlung keine Gewichtsverhältnisse zwischen Organen und Körper.
Diese Daten deuten an, daß zumindest ein Teil der Hormonkombinationsreaktion der die Gewichtszunahmen in spezifischen Organen zugeschrieben werden kann. Außerdem zeigen sie an, daß der additive Effekt von IGF-I und GH nicht bei allen Geweben sichtbar war, z.B. beim absoluten Gewicht der Thymusdrüse (Tabelle 1) oder bei allen Organ/Körper-Gewichtsverhältnissen. Die unterschiedliche Empfindlichkeit verschiedener Gewebe auf die Kombination von GH und IGF-I war unerwartet. In einigen Geweben, insbesondere im Gesamtkörperwachstum und bei Knochen und Knorpel, sind IGF-I und GH sowohl wirksam als auch additiv. In anderen Geweben, z.B. in der Thymusdrüse, sind IGF-I und GH beide wirksam, aber nicht additiv, was auf einen selektive Wirkung schließen läßt. Tabelle 1: GH und IGH-I bewirken unterschiedliche Organgewichtsreaktionen
Mittelwert ± Standardabweichung (7-9 Ratten/Gruppe): # bedeutet statistisch unterschiedlich von Exzipienten; ähnliche hochgestellte Zeichen bedeuten Gruppenunterschiede gemäß Duncan-Text nach Varianz-Analyse (ANOVA) bei p < 0,05.

BEISPIEL II

A. Kombinationsuntersuchungen

In den beiden unten beschriebenen Versuchen wurden hypophysektomierte Ratten wie in Beispiel 1 (Untersuchung 3) oder weibliche Zwergratten (60-70 Tage alt, 100-140 g, Untersuchung 4) mit Ketamin/Xylazin anästhesiert. Dann wurden eine (bei den Zwergratten) oder zwei (bei den hypophysektomierten Ratten) osmotische Minipumpen (Alza 2001, Zufuhrrate 1 µl/Stunde/Pumpe) subkutan eingepflanzt. Die Pumpen enthielten entweder den Exzipienten (10 mM Citratpuffer und 126 mM NaCl, pH 6) oder IGF-I (5 mg/ml), so daß die ungefähre verabreichte Dosis 240 µg/Ratte/Tag (2,4 mg/kg unter Annahme von 100 g pro Ratte) für beide Rattenarten betrug. Die verwendete hGH-Formulierung war die gleiche wie in Beispiel 1. Der IGF-I wurde durch direkte Sekretion des IGF-I-Gens aus E.coli gemäß dem Verfahren von EP-128.733 (veröffentlicht am 19. Dezember 1984) oder EP-288.451 (veröffentlicht am 26. Oktober 1988) gebildet und besaß eine erwartete spezifische Aktivität von mehr als etwa 14.000 U/mg (ermittelt durch Rad iorezeptor-Assay mittels Plazentamembranen) bzw. stammte von Kabigen AB (spezifische Aktivität ) 14.000 U/mg) oder von Genentech, Inc., wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Er wurde wie in Beispiel 1 formuliert. In Untersuchung 3 wurde die Löslichkeit von hGH durch Zugabe von 0,1% Tween 20 zu 5 mM Phosphatpuffer (pH 7,8) gesteigert. Das hGH wurde in beiden Studien täglich mittels einer einzigen subkutanen 0,1 ml-Injektion verabreicht.
In Untersuchung 3 (hypophysektomierte Ratten) waren die Versuchsgruppen:
1) Exzipientenpumpe, Exzipienteninjektionen
2) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), Exzipienten injektionen
3) Exzipientenpumpe, hGH-Injektionen (50, 0 mg/kg)
4) Exzipientenpumpe, hGH-Injektionen (10,0 mg/kg)
5) Exzipientenpumpe, hGH-Injektionen (2 mg/kg)
6) Exzipientenpumpe, hGH-Injektionen (0,4 mg/kg)
7) Exzipientenpumpe, hGH-Injektionen (0,08 mg/kg)
8) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (50,0 mg/kg)
9) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (10,0 mg/kg)
10) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (2,0 mg/kg)
11) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (0,4 mg/kg)
12) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (0,08 mg/kg).
In Untersuchung 4 (Zwergratten) waren die Versuchsgruppen:
1) Exzipientenpumpe, Exzipienteninjektionen
2) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), Exzipienten injektionen
3) Exzipienten pumpe, hGH-Injektionen (2,0 mg/kg)
4) Exzipientenpumpe, hGH-Injektionen (0,5 mg/kg)
5) Exzipientenpumpe, hGH-Injektionen (0,125 mg/kg)
6) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (2,0 mg/kg)
7) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (0,5 mg/kg)
8) IGF-I-Pumpe (2,4 mg/kg), hGH-Injektionen (0,125 mg/kg).
Fig.4 zeigt die Ergebnisse der Gewichtszuwächse am Tag 7 in hypophysektomierten Ratten aus Untersuchung 3. Der Exzipient ergab einen Gewichtszuwachs von 4,46 ± 1,66 g, und IGF-I ergab bei 240 µg/Tag einen Gewichtszuwachs von 18,23 ± 1,98 g. Wiederum sorgte die Menge an IGF-I in den Minipumpen für eine deutliche Steigerung der Wirksamkeit der täglichen hGH-Injektionen bei der Steigerung des Gewichtszuwachses. Die Gewichtszuwachsreaktionen auf hGH oder hGH plus IGF-I wurden als Parallellinien-Bioassay gegen die log-Dosis von hGH analysiert. Die zwei Dosis-Reaktions-Linien erfüllten die Kriterien für einen Bioassay, da es statistisch erwiesen war, daß sie linear und parallel sind. Die Wirksamkeit von hGH plus IGF-I war die 26,6fache von jener von hGH alleine (95% Vertrauensbereich, 14,8 bis 51,7), wobei die Differenz zwischen den zwei Dosis-Reaktions-Linien äußerst signifikant war (1,49 Freiheitsgrad (d.f.), F = 169,4, p< 0,0001).
Fig.5 zeigt die Gewichtszuwächse im Verlauf von 7 Tagen aus Untersuchung 4. Der Exzipient ergab einen Gewichtszuwachs von 3,95 ± 3,56 g, und IGF-I ergab bei 240 µg/Tag einen Gewichtszuwachs von 12,15 ± 3, 76 g. Die Gewichtszuwachsreaktionen auf hGH oder hGH plus IGF-I wurden als Parallellinien-Bioassay gegen die log-Dosis von hGH analysiert. Die zwei Dosis-Reaktions-Linien erfüllten die Kriterien für einen Bioassay, da statistisch erwiesen war, daß sie linear und parallel sind. IGF-I und hGH ergaben einzeln beträchtliche Gewichtszuwächse in der Zwergratte. Die Wirksamkeit von hGH plus IGF-I war die 28,9fache von jener von hGH alleine (95% Vertrauensbereich, 7,7 bis 514,6), wobei die Differenz zwischen den zwei Dosis- Reaktions-Linien äußerst signifikant war (1,30 d.f., F = 45, 75, p < 0,0001).

B. Dosis-Reaktions-Kurve von IGF-I alleine

Fig.6 zeigt den Gewichtszuwachs hypophysektomierter Ratten, die mit Exzipient (Citratpuffer wie oben) oder IGF-I bzw. des(1-3)-IGF-I aus Beispiel 1 mit drei unterschiedlichen Dosen 7 Tage lang subkutan mittels Minipumpen unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsvorschrift behandelt wurden. Diese Figur zeigt die minimalen Dosen von IGF-I und des(1-3)-IGF-I für die Bioaktivität in der Ratte.

C. Dosis-Reaktions-Kurve von hGH alleine

Fig.7 zeigt die Gewichtszuwächse hypophysektomierter Ratten, die mit Exzipient oder drei unterschiedlichen Dosen des hGH aus Beispielen 1 und II täglich 7 Tage lang subkutan unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen allgemeinen Arbeitsvorschrift behandelt wurden. Diese Figur zeigt die minimalen Dosen von GH für die Bioaktivität in der Ratte. Am Tag 7 zeigte GH bei niedriger Dosierung einen größeren Gewichtszuwachs als Exzipient (2,9 ± 3,5 g gegenüber 8,6 ± 2,3 g, t = 7,03, p < 0,001), der wiederum weniger als GH mittlerer Dosierung war (12,9± 1,2 g, t = 4,91, p < 0,01).
In den beiden Tiermodellen des GH-Mangels (Untersuchungen 3 und 4) wurde die Wirksamkeit des als tägliche subkutane Injektion verabreichten hGH durch die zusätzliche Behandlung mit IGF-I auf mehr als das 2sfache gesteigert. Dieses Ergebnis bei der hypophysektomierten Ratte könnte durch den relativen Mangel an Hormonen (Schilddrüse und Glukokortikoide) erklärt werden, die bekannterweise die hGH- Wirkung zulassen, was zu einer schlechten IGF-I-Bildung führt. Das Ergebnis bei der Zwergratte jedoch, wo sich zeigte, daß nur hGH fehlt, und alle andere Hormonsysteme (insbesondere die Schilddrüsen- und Nebennierenhormone) normal sind, zeigt, daß die additive Wirkung von hGH und IGF-I unabhängig vom Status der Schilddrüsen- oder Nebenn eren hormone eintritt. Die enge Übereinstimmung der verstärkten Wirksamkeit von hGH aufgrund von IGF-I in den zwei Modellen und die Größenordnung der Wirkung (etwa das 25fache) sind überraschend.
Die in Untersuchung 3 verwendeten Dosen von hGH wurden bei der hypophysektomierten Ratte selten verwendet, und die Literatur gibt keine genauen Auskünife über die hGH-Dosis, die zu einer maximalen Wachstumsreaktion führt. Dosen von 10 und 50 mg/kg/Tag, die als subkutane tägliche Einzelinjektionen verabreicht werden, bewirken eine maximale Wachstumsreaktion. Doch die Dosisreaktionen für die zwei Systeme (hGH und hGH plus IGF-I) waren selbst in diesem 62sfachen Dosisbereich der fünf hGH-Dosen parallel, einschließlich der zwei maximalen Dosen an hGH. Daher kann die maximale Wachstumsreaktion auf hGH deutlich erhöht werden, wenn IGF-I mitverabreicht wird. Dies ist überraschend, da sich zeigte, daß die maximale Gewichtszuwachsreaktion auf IGF-I in der hypophysektomierten Ratte geringer ist als der Gewichtszuwachs als Reaktion auf hGH.
Der Dosierungsbereich von hGH, in dem IGF-I laut Vorhersagen eine additive Auswirkung auf den Gewichtszuwachs hat, ist klarerweise der volle Bereich wirkungsvoller GH-Dosen bei der hypophysektomierten Ratte von 0,01 bis 50 mg/kg. In der Zwergratte sind die maximalen wirkungsame hGH-Dosen nicht bekannt, doch man könnte annehmen, daß 50 mg/kg eine wirkungsame maximale hGH-Dosis ist. Vorherige Arbeiten mit hypophysektomierten Ratten haben gezeigt, daß 2,4 mg/kg IGF-I, eine Woche lang als subkutane Infusion zugeführt, nahezu die maximale Dosis ist, da höhere Dosen an IGF-I zu letaler Hypoglykämie führen. Die minimale wirkungsvolle Dosis von IGF-I in der hypophysektomierten Ratte beträgt etwa 0,1 mg/kg und Tag.
In der Zwergratte wurde 2,4 mg/kg IGF-I verwendet, während bei der hypophysektomierten Ratte IGF-I-Dosen von sowohl 1,2 mg/kg als auch 2,4 mg/kg verwendet wurden (Beispiele I und II), doch trotz der unterschiedlichen verwendeten Dosen an IGF-I wurde eine additive Wirkung von IGF-I und GH beobachtet. Die Gesamtdosis-Reaktionskurven für GH alleine und für GH plus IGF-I waren parallel, was vermuten läßt, daß bei jeder hGH-Dosis, selbst bei einer sehr kleinen hGH-Dosis, die alleine möglicherweise keine meßbare Reaktion ergibt) die Effekte von IGF-I und GH additiv sind. Daher könnte man erwarten, daß bei jeder täglichen Dosis an GH (von 0,01 bis 50 mg/kg) oder IGF-I (von 0,1 bis 2,4 mg/kg) die zwei Moleküle eine additive Wirkungen auf das Körperwachstum ausüben.

BELSPIEL III

Zwei klinische Szenarien für die Kombinationsbehandlung

Zwei Beispiele relevanter klinischer Szenarien, die zweifellos von der gemeinsamen Verabreichung von GH und IGF-I profitieren, werden nachstehend beschrieben.
1. Patienten, die eine Verlangsamung der Wachstumsrate nach zumindest zwölfmonatiger GH-Verabreichung aufweisen.
Es ist Fachleuten auf dem Gebiet der Pädiatrie und Endokrinologie allgemein bekannt, daß entweder "naive" (ohne vorherige Behandlung) oder zuvor behandelte Patienten (nach einer Pause in der GH-Verabreichung) ein Absinken der Wachstumsrate im zweiten Jahr aufweisen. Dieses Phänomen ist unabhängig von der Ätiologie der Art der kleinwüchsigen Statur bzw. des GH-Mangels (d.h. idiopathische, organische septooptische Dysplasie (S-O-D), Turner o.a.). Siehe Fig.8.
Während der Verlangsamung der Wachstumsrate würde somit die IGF-I-Behandlung gemeinsam mit der GH-Behandlung die jährliche Rate steigern, um diesen Reaktionsverlust während des zweiten Jahrs auszugleichen.
2. Patienten, bei denen die Zeit der GH-Verabreichung zur Erreichung des maximalen Wirkungsgrads begrenzt ist.
Wenn Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose eines GH-Mangels älter sind, steht weniger Zeit zur Verfügung, ihre resultierende kleinwüchsige Statur auszugleichen. Dies ist in Fig.9 dargestellt, wo die jährliche Wachstumsrate für Patienten in 7 Altersgruppen angegeben ist. Älteren Patienten bleiben z.B. bis zum Schließen ihrer Wachstumsplatten nur 2-3 Jahre, wodurch ein weiteres lineares Wachstum unwahrscheinlich wird. Diese Patienten könnten mit der Kombination an IGF-I und hGH behandelt werden, um ihre Wachstumsraten optimieren zu können.

BESPRECHUNG UND ZUSAMMENFASSUNG

Die hierin dargelegten Ergebnisse sind für die Medizin und die Landwirtschaft in jeder Situation, in der die GH- oder IGF-I-Behandlung angewendet wird, von Bedeutung. Dieses System einer kombinierten IGF- und GH-Behandlung würde die Gabe kleinerer Dosen an GH (etwa 25fach weniger) ermöglichen, um die gleichen Reaktionen zu erzielen wie durch Behandlung mit GH alleine. Dies wäre vor allem in jenen Situationen wichtig, wo die Nebenwirkungen der GH-Behandlung (d.h. Hyperinsulinämie, Hyperglykämie) minimiert werden sollen. Bei der Diabetes würde die kombinierte GH- und IGF-I-Behandlung - geringere GH-Dosen sind möglich - die insulinresistente Wirkung des verabreichten GH minimieren. Bei Patienten mit reduzierter anabolischer Wirkung von GH (möglicherweise aufgrund einer verminderten Fähigkeit zur Erzielung einer IGF-I-Reaktion auf verabreichtes GH) würde man erwarten, daß die gemeinsame Behandlung von GH und IGF-I auch eine stärkere anabolische Reaktion bewirkt.
Eine große Patientengruppe, bei der sich das System der kombinierten GH- und IGF-I- Behandlung bewähren könnte, sind erwachsene Patienten mit natürlich reduzierter IGF- I-Reaktion auf GH. Bei Erwachsenen können die unerwünschten Wirkungen von GH (Insulinresistenz) eine direkte Folge einer reduzierten IGF-I-Reaktion auf verabreichtes GH sein. Bei Erwachsenen könnte die gemeinsame Verabreichung von GH und IGF-I mit der Wiederherstellung der Situation in einem jüngeren Tier verglichen werden, in dem eine stärkere IGF-I-Reaktion auf die GH-Behandlung erfolgt.
Die Verabreichungsweise des GH war in den vorliegenden Untersuchungen diskontinuierlich, u.z. durch subkutane Injektion. Bei den größten verwendeten Dosen (50 mg/kg) hätten sich jedoch beträchtliche Konzentrationen an hGH im Blut in physiologisch wirkungsvollen Konzentrationen gehalten, wodurch die Konzentrationen an hGH im Blut immer einen Wert aufweisen würden, der für einen Stimulus für GH- Rezeptoren sorgt. Daher wurde bei der höchsten Dosis das Gewebe im wesentlichen in kontinuierlicher Weise hGH ausgesetzt, so daß die Wachstumsreaktion auf die Verabreichung von hGH als Dauerinfusion durch die gemeinsame Verabreichung von IGF-I wahrscheinlich wahrscheinlich verstärkt würde. Die Wirksamkeit von hGH, das in einer beliebigen Weise verabreicht wird, die das Körperwachstum stimuliert oder anabolisch wäre, würde sich im Falle der gemeinsamen Verabreichung von IGF-I wahrscheinlich erhöhen. Außerdem ist es wahrscheinlich, daß die verbesserte Wirksamkeit des gemeinsam verabreichten hGH und IGF-I weniger häufige Injektionen von hGH oder IGF-I als von hGH alleine ermöglichen würde.
IGF-I wurde als Dauerinfusion zugeführt, da frühere Untersuchungen zeigten, daß als Injektionen alleine verabreichtes IGF-I bei der Förderung des Körperwachstums weniger wirkungsvoll ist. Die Kombination von GH plus IGF-I würde hingegen die Verwendung suboptimaler Systeme der IGF-I-Verabreichung, z.B. Injektionen ermöglichen, wenn diese mit der GH-Behandlung kombiniert sind.
Zusammenfassend gesagt steigert d je gemeinsame Behandlung hypophysektomierter Ratten oder Zwergratten mit Dauerinfusionen aus GH und IGF-I bzw. des(1-3)-IGF-I den Körpergewichtszuwachs, das Knochenlängenwachstum und die Schienbein-Epiphysenverbreiterung im Verhältnis zur Reaktion auf eines der beiden Hormone alleine. Dieses Ergebnis zeigt zum ersten Mal, daß exogener IGF-I bestimmte durch GH eingeleitete Wachstumsreaktionen in zumindest additiver Weise fördern kann. Somit kann IGF-I das Ansprechen auf GH-Behandlung wirkungsvoll erhöhen oder die Menge an GH, die zur Erzielung einer signifikanten Reaktion erforderlich ist, wirkungsvoll senken.

Claims

1. Verwendung von IGF-I und GH zur Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Förderung des Wachstums eines Säugetiers, wobei das Produkt zur systemischen Verabreichung dient und das GH zur Verabreichung mittels Injektion bestimmt ist, so daß das Produkt das Wachstum des Säugetiers über jene Wachstumsförderung hinausgehend steigert, die unter Verwendung jeweils einer äquivalenten Dosis an IGF-I und GH alleine erzielt wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Säugetier ein Mensch ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin der IGF-I mittels kontinuierlicher Infusion verabreicht wird.

4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der IGF-I und das GH getrennt verabreicht werden.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der IGF-I und das GH gemeinsam als Einzelformulierung verabreicht werden.

6. Zellfreie, wachstumsfördernde Zusammensetzung, umfassend Mengen an IGF-I und GH in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, die das Wachstum eines Säugetiers wirkungsvoller fördern als jeweils eine äquivalente Dosis an IGF-I und GH alleine.

7. Wachstumsfördernde Zusammensetzung aus IGF-I und GH in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger mit einem pH-Wert von etwa 6, die ein Tensid enthält.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Mengen an IGF-I und GH in der Zusammensetzung das Wachstum eines Säugetiers wirkungsvoller fördern als jeweils eine äquivalente Dosis an IGF-I und GH alleine.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, weiters umfassend ein Bindeprotein für IGF-I.

10. Pharmazeutisches Produkt zur systemischen Verabreichung zur Wachstumsförderung, umfassend ein kombiniertes Präparat von IGF-I und GH zum gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Einsatz, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin das GH zur Verabreichung mittels Injektion dient und die Mengen an IGF-I und GH das Wachstum eines Säugetiers wirkungsvoller fördern als jeweils eine äquivalente Dosis an IGF-I und GH alleine.