DE69305091T2

DE69305091T2 - Methode zur behandlung oder verhütung von fettleibigkeit

Info

Publication number: DE69305091T2
Application number: DE69305091T
Authority: DE
Inventors: Ross G Clark
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1992-10-29
Filing date: 1993-10-26
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2013-10-27
Also published as: DK0669832T3; ES2095086T3; MD1486F2; GR3022074T3; DE69305091D1; EP0669832B1; ATE143267T1; EP0669832A1; MD960245A; LV11987A; JPH08502969A; CA2145501A1; WO1994009813A1; AU5451294A; LV11987B; TJ286B; CA2145501C; AU675996B2; MD1486G2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifif die Verwendung von IGF-1 und Wachstumshormon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Fettleibigkeit, insbesondere bei Menschen.

Beschreibung des Hintergrunds und verwandter Gebiete

Die Fettleibigkeit ist eine chronische Krankheit, die in der modernen Gesellschaft sehr häufig auftritt und nicht nur mit einem sozialen Stigma behaftet ist, sondern auch mit einer verkürzten Lebenserwartung und verschiedenen medizinischen Problemen einhergeht; Beispiele dafür sind: nachteilige psychische Entwicklungen, Fortpflanzungsstörungen wie z.B. polyzystische Eierstockerkrankungen, dermatologische Störungen wie z.B. Infektionen, Krampfadern, Acanthosis nigricans und Ekzeme, körperliche Nichtbelastbarkeit, Diabetes mellitus, Insulin-Resistenz, Hypertonie, Hypercholesterinämie, Cholelithiasis, Osteoarthritis, orthopädische Verletzungen, thromboembolische Erkrankungen, Krebs und koronare Herzerkrankungen. Rissanen et al. British Medical Journal, 301: 835-837 (1990).
Fettleibige Personen besitzen zumeist niedrige Basisspiegel an Wachstumshormon (GH und können keine beträchtlichen Mengen GH als Reaktion auf verschiedene Reize, z.B. das wachstumshormon-freisetzende Hormon (GHRH), sekretieren. Williams, New Engl. J. Med., 311:1403(1984); Kopelman, Clin. Endocrinol., 23:87(1985); Kopelman, Clin. Endocrinol., 24: 157 (1986); Loche, Clin. Endocrinol., 27: 145 (1987); Ghigo et al. Metabolism, 41: 560-563 (1992). Das Ansprechen des GH auf GHRH bei fettleibigen Ratten zeigt sexuellen Dimorphismus. Cocchi et al., Pharmacol. Res., 25: Suppl.2, 336- 337 (1992). Dieses Unvermögen, GH zu sekretieren, wurde als das Ergebnis einer Hypothalamus-Störung postuliert (Kopelman, 1986, s.o.), was zu einem chronischen Zustand von Somatostatin-Hypersekretion führt. Cordido, J. Clin. Endocrinol. Metab., 68: 290 (1989). Diese Störung der GH-Sekretion scheint das Ergebnis - und nicht eine Ursache - von Fettlelbigkeit zu sein, da sie zumindest teilweise durch Gewichtsabnahme reversibel ist.
Es wurde zwar angenommen, daß das Unvermögen fettleibiger Personen, GH freizusetzen, auf die Rückkopplungshemmung zurückzuführen ist, die durch erhöhte Plasmaspiegel des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF-1) hervorgerufen wird (Loche et al., Clin. Endocrinol., 27: 145-153 [1987]), doch man konnte keine Korrelation zwischen IGF-1 und Übergewichtsanzeichen feststellen. Cordido et al., Horm. Res., 36:187-191(1991). Somit steht Adipositas nicht mit einem Sinken der IGF- 1-Werte in Zusammenhang. Hochberg et al., Metabolism, 41:106-112 (1992); Gama et al., Clin. Chim. Acta, 188: 31-38 (1990); Rosskamp et al., Eur. J. Pediatr., 146: 48-50 (1987). Außerdem wird die eingeschränkte hGH-Stimulation in fettleibigen Personen durch ein geändertes Verhältnis zwischen hGH- und IGF-1-Werten nicht erklärt. Jungmann et al., Med. Klin., 86: 237-240 (1991), und auch die Verringerung der Insulinspiegel im Blut führt nicht zu einer ausgeprägteren Fähigkeit, GH zu sekretieren. Chalew et al., Inter. J. Obesity, 1 6: 459-463 (1992).
Bestimmte Krankheiten wie z.B. Diabetes mellitus, insbesondere Diabetes, die im Erwachsenenalter einsetzt, oder Diabetes vom Typ II, zeigen eine größere Häufigkeit von Fettleibigkeit. Man stellte fest, daß geringe IGFBP-1-Werte bei Fettleibigkeit mit erhöhten Insulin-Werten in Zusammenhang stehen, die ihrerseits mit der Fettverteilung im Körper und der Insulin-Resistenz in Zusammenhang stehen. Chronisch niedrige Werte an IGFBP-1 können die IGF-Bioaktivität sowie seine Rückkopplungsregulierung der GH-Sekretion fördern, wodurch sie zu den metabolischen und mitogenen Folgen der Fettleibigkeit beitragen. Conover et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 74: 1355-1360 (1992).
Bestehende Therapien gegen Fettleibigkeit sind z.B. herkömmliche Kost bei gleichzeitiger körperlicher Ertüchtigung, stark kalorienreduzierte Kost, Verhaltenstherapie, Pharmakotherapie mit Appetitzüglern, thermogene Arzneimittel, Nahrungsmittel- Absorptionshemmer, mechanische Geräte wie z.B. Kieferdrähte, Taillenbänder bzw. - gürtel und Ballone sowie chirurgische Eingriffe. Jung und Chong, Clinical Endocrinology, 35: 11-20 (1991); Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55: 538S-544S (1992). Modifiziertes proteinsparendes Fasten ist laut Berichten ein wirksames Mittel zur Gewichtsverringerung bei Jugendlichen. Lee et al., Clin. Pediatr. 31: 234-236 (April 1992). Die beschränkte Kalorienzufuhr als Behandlung von Fettleibigkeit bewirkt einen Abbau von Körperproteinspeichern und führt zu einem negativen Stickstoffgleichgewicht. Proteinangereicherte Diäten sind daher als Mittel zur Verringerung des Stickstoffverlusts während der beschränkten Kalorienzufuhr heute sehr beliebt. Da solche Diäten nur eine mäßige Stickstoffeinsparung bewirken, ist eine wirksamere Möglichkeit der Bewahrung fettarmer Körpermasse und Proteinspeicher erforderlich. Außerdem würde die Behandlung von Fettleibigkeit verbessert werden, wenn ein solches Diätprogramm auch zu einem schnelleren Verlust von Körperfett führte. Verschiedene derartige Behandlungsansätze wurden veröffentlicht, siehe z.B. Weintraub und Bray, Med. Clinics N. Amer., 73: 237 (1989); Bray, Nutrition Reviews, 49: 33 (1991).
GH spielt bei der Regulierung von somatischem Wachstum und Stoffwechsel eine wichtige Rolle. Die metabolischen Wirkungen von GH wurden in frühe insulinähnliche Wirkungen, die mit verstärkter Glukose-Verwertung und erhöhtem Aminosäure- Transport in Zusammenhang stehen, und in anti-insulinähnliche Wirkungen, die mit der Stimulation der Lypolyse und der Verringerung der Glukose-Verwertung in Zusammenhang stehen, eingeteilt. GH fördert die Stickstoff-Speicherung. Bray et al., J. Clin Endocrinol. Metab., 33: 293 (1971).
Die IGF-1-Produktion steht unter dem dominanten stimulierenden Einfluß von GH, und einige IGF-1-Bindeproteine werden auch durch GH beeinflußt. Siehe Tanner et al., Acta Endocrinol., 84: 681-696 (1977); Uthne et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 39: 548-554 (1974). Ein allgemeiner Überblick über IGF-1 findet sich in Baxter, Advances in Clinical Chemistry, 25: 49 (1986); Clemmons und Underwood, Clinics in Endocrin. and Metab., 15; 629 (1986). Die Verabreichung von IGF-1 und CH durch Injektion zur Erzielung einer Gewichtszunahme sowie anabolischer und wachstumsfördernder Effekte bei Säugetieren, einschließlich bei Diabetes-Patienten, ist in US-A-5.126.324 (veröffentlicht am 30.Juni 1992) geoffenbart.
Es ist bekannt, daß GH die Lipolyse bei Tieren sowie normalen und fettleibigen Menschen beschleunigt. Raben und Hollenberg, J. Clin. Invest., 38: 484 (1959); Mautalen und Smith, J. Clin. Endocrinol. Metab., 25: 495 (1965); Felig et al., J. Clin Invest., 50: 411 (1971); Jorgenson, Endocr. Reviews, 12 (1991); Martin et al., Inter. J. Obesity, 13: 327-335 (1989); Pfadt und Angulo, Arch. Dis. Child., 66: 1261 (1991); Jeevanandam et al., Surgery, 111: 495-502 (1992). GH wurde zusammen mit einem Phenylethanderivat verabreicht, um Gewichtszuwachs zu erhöhen und die antilipogene Aktivität bei Tieren zu verstärken (siehe US-A-4.792.546, veröffentlicht am 20.Dezember 1988). Eine lipolytische Zusammensetzung unter Verwendung eines Wachstumsfaktors wie z.B. eines Nerven-Wachstumsfaktors, eines Epidermis-Wachstumsfaktors und eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors ist in WO 92/11 838, veröffentlicht am 23.Juli 1992, beschrieben. Die Möglichkeit der Verwendung von GH zur Behandlung von Fettleibigkeit wird durch Rivlin, "The Use of Hormones in the Treatment of Obesity", in: Childhood Obesity, Hg. Winick (John Wiley & Sons: New York, 1975), S.151-162, sowie Rivlin, Intern. J. Dermatol., 15: 446-449 (1976) beschrieben.
Beispiele für Modelle, die zeigen, daß die Verabreichung von GH an fettleibige Personen die Lipolyse stimulieren könnte, umfassen hypophysektomierte Ratten mit ventromedialen Hypothalamus-Läsionen, wo GH Hyperphagie sowie die Entwicklung von Fettleibigkeit verhinderte (York und Bray, Endocrinology, 90: 885-894 [1972], sowie genetisch bedingt fettleibige Zucker-fa/fa-Ratten, die eine verringerte Lipidablagerung aufweisen. Martin und Jeanrenaud, Int. J. Obesity, 9: 99-104 (1985). Siehe auch Williams und Frohman, Pharmacotherapy, 6: 311-318 (1986) und Rivlin, New. Engl. J. Med., 292: 26(1975).
Verschiedene Untersuchungen der GH-Verabreichung an Kinder mit GH-Mangel, von denen viele fettleibig sind, zeigten, daß eine der frühesten und auffälligsten Veränderungen der Verlust von Fettgewebe war. Novak et al., Mayo Clin. Proc., 47: 241- 246 (1972); Collipp et al., Metabolism, 22: 589-595 (1973); Parra et al., Metabolism, 28: 851-857 (1979). Darüber hinaus besitzen fettleibige Erwachsene als Reaktion auf eine GH-Injektion erhöhte Spiegel an freier Fettsäure, was auf eine verstärkte Lipolyse schließen läßt. Mautalen und Smith, J. Clin. Endocrinol., 25: 495-498 (1965); Blasse, Diabetologia, 4: 20-25 (1968); Bray, Metab., 29:119-1 22 (1969).
Weiters bewirkte die GH-Injektion bei fettleibigen Patienten, die eine kohlehydratreiche Kost zu sich nahmen, einen größeren Verlust an Körperfett als die Injektion eines Vehikels. Snyder et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 69: 745 (1989). Man stellte weiters fest, daß exogenes GH das Körperfett reduziert und die fettfeie Masse bei älteren Frauen, die eine Störung der endogenen GH-Freisetzung aufweisen (Crist er al., Metabolism, 36:1115-1117 [1987]), sowie körperlich fitten Erwachsenen mit normaler Sekretion (Crist et al., J. Appl. Physiol., 65: 579-584 [1988]), erhöht. Diese Änderungen traten ohne Änderung der Ernährungsgewohnheiten oder der körperlichen Aktivitäten ein. Es wurde durch zumindest eine Forschergruppe berichtet, daß GH die Fettoxidation während der beschränkten Kalorienzufuhr erhöht. Bray, J. Clin. Endocrinol. Metab., 29: 119 (1969). Andere Forscher jedoch (Clemmons et al., J. Clin. Endocrinol. Metab, 64: 878-883 [1987]; Snyder et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 67: 54-61 [1988]; Snyder et al., Am. J. Clin. Nutr., 52: 431-437 [1990] stellten keine durch GH hervorgerufene Verstärkung des Körperfettverlusts fest, wenn das Hormon während eines Programms beschränkter Kalorienzufuhr an fettleibige Erwachsene verabreicht wurde. Man stellte fest, daß exogenes GH das Körperfett fettleibiger Frauen in offensichtlicher Abwesenheit einer signifikanten Kilokalorien-Beschränkung verringert, wobei diese Wirkung mit der endogenen GH-Sekretion oder der Körperzusammensetzung nicht in Zusammenhang steht. Skaggs und Crist, Horm. Res., 35: 19-24 (1991).
Einige der Symptome des Alterns, z.B. die Ausdehnung der Fettgewebemasse, konnten laut Berichten durch dreimal wöchentlich erfolgende GH-Behandlung gelindert werden. Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323:1-6 (1990); Crist et al., Metabolism, 36: 1115-1117 (1987).
Berichten zufolge senkt IGF-1 die Blut-Glukosewerte bei Ratten und Menschen (einschließlich fettleibigen Patienten) und eignet sich zur Behandlung von Diabetes und den Sekundärwirkungen von Hyperinsulinämie. Froesch et al., TEM, Mai/Juni 1990, S.254-260; Guler et al., N. Eng. J. Med., 317: 137-140 (1987); US-A-4.988.675, veröffentlicht am 29.Januar 1991; Carlsson et al., J. Endocrin., 122: 661-670 (1989); Zenobi et al., J. Clin. Invest., 89: 1908-1913 (1992). Im Gegensatz zu GH besitzen IGF- 1 und Insulin eine bekannte anti-lipolytische Wirkung. Zapf et al., J. Clin. Invest., 77: 1768-1775 (1986); Guler et al., N. Engl. J. Med., 317: 137-140 (1987); Zapf et al., Eur.J. Biochem., 87: 285-296 (1978); Bolinder et al., Clin. Endocrinol. Metab., 65: 732-737 (1987); Giacca et al., Diabetes, 39: 340-347 (1990). Außerdem wurde beobachtet, daß fettleibige Zucker-Ratten gegenüber der Wirkung von IGF-1 und Insulin auf den Glukose- und Aminosäure-Stoffwechsel resistent sind. Jacob et al., Diabetes, 41: 691- 697 (1992).
Die jüngste Untersuchung der Auswirkung von IGF-1 auf die Körperzusammensetzung wurde durch Cottam et al. (Endocrinology, 130: 2924-2930 [1992]) durchgeführt, der rekombinanten menschlichen IGF-1 (dreimal täglich bei einer Dosis von 150 µg/kg/Tag 8 Wochen lang) kastrierten männlichen Schafen injizierte, die mit pelletiertem Luzernenspreu-Futter ernährt wurden. Die Behandlung führt zu einer Erhöhung der ICF-1- Werte, einem Sinken des Plasma-Insulins und eine Gewichtszunahme von Schienbein, Milz und Niere. Trotz seiner offensichtlichen Wirksamkeit übte IGF-1 keinen nennenswerten Einfluß auf das Körperfett aus. Diese Autoren führen an, daß ihre Ergebnisse mit ihren früheren Untersuchungen übereinstimmen (Siddiqui et al., J. Endocrinol., 124: 151-158 [1990]), die ähnliche Körperzusammensetzungen bei gleichen Körpergewichten von Mäusen zeigten, die hinsichtlich hoher und niedriger Plasma-IGF-1- Konzentrationen ausgewählt wurden. Die Forscher schlossen daraus, daß die Auswirkungen von GH auf die Verringerung von Körperfett nicht nur durch im Kreislauf befindliches IGF-1 vermittelt werden.
In einer weiteren Untersuchung wurde ein katabolischer Zustand in jungen Ratten durch Diabetes, Dexamethason oder Darmresektion hervorgerufen; die katabolischen Tiere wurden dann mit IGF-1- oder IGF-1-Analogen behandelt. Ballard et al., in Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors, Hg. Spencer, S.617-627 (1991). Die Autoren berichteten, daß die IGF für eine Tendenz hin zu einem geringeren Prozentsatz an Körperfett verantwortlich waren.
In einer Langzeitstudie (Guler et al., Acta Endo., 121: 456-464 [1990]) wurden Zwergpudel 130 Tage lang mit 6 mg/Tag an rekombinantem IGF-1 behandelt. Es wurde keine Änderung des gesamten Körperwachstums, jedoch ein verringerter Körpermasse- Index festgestellt, der - so vermuten die Autoren - durch IGF-1 hervorgerufen worden sein könnte. Sie führen aber gleichzeitig an, daß diese Vermutung nur mit größter Vorsicht zu beurteilen sei und daß rekombinanfer menschlicher IGF-1 durchaus den Kohlehydrat- und Fettstoffwechsel in zu GH entgegengesetzter Weise ändern kann.
In der hypophysektomierten Ratte übte die IGF-1-Behandlung bei Dosierungen, die zu einer starken Gewichtszunahme des Körpers und der Organe führten, auf die chemische Zusammensetzung der Haut oder des Rumpfes keinen Einfluß aus. Insbesondere wurde der Prozentsatz an Fett durch die IGF-1-Behandlung nicht geändert. Clark und Cronin Abstract D8, 2nd International IGF Symposium, San Francisco, CA, 1991.
In einer kürzlich publizierten Zusammenfassung über den damaligen Wissensstand auf dem Gebiet der Insulin- und IGF-1-Auswirkungen auf verschiedene Gewebe (Froesch et al., TEM, 254-260 (Mai/Juni 1990) heißt es auf S.256, daß man erwarten könne, daß kleine Dosen an IGF-1 Fettgewebe nicht beeinflussen, und daß dies bei Ratten beobachtet wurde. Es wird auch angeführt, daß die in vivo IGF-1-Verabreichung an Ratten einen viel größeren Einfluß auf Muskel- als auf Fettgewebe ausübte (unter Bezugnahme auf Zapf et al., J. Clin. Invest., 77:1 768 [1 986]). Bei Menschen sei - so die Forscher - das hypoglykämische Potential von IGF-1 im Vergleich zu Insulin relativ größer als sein antilipolytisches Potential (unter Bezugnahme auf Guler et al., N. Engl. J. Med., 317:137[1987]).
Es wurde auch festgestellt, daß zwar mit Insulin behandelte, hypophysektomierte Ratten ihre Nahrungsaufnahme mehr als unbehandelte hypophysektomierte Ratten steigerten (Salter et al., Can. J. Biochem. Physiol., 35:913 [1957]), doch die Nahrungsaufnahme junger, nicht fettleibiger Zwergratten blieb durch GH- oder IGF-1-Infusionen unberührt. Skottner et al., Endocrinology, 124: 2519-2526 (1989).
Daten zeigten, daß viele der Auswirkungen von CH bei Nagetieren vom Verabreichungsmuster des CH abhängen. Robinson und Clark, in Growth Hormone - Basic and Clinical Aspects, Hg. Isaksson et al., S.109-127 (1987). Tiere wurden in vielen unterschiedlichen Dosierungsschemen mit GH behandelt. Es wurde gezeigt, daß die Dauerinfusion von GH das Körperfett in genetisch bedingt fettleibigen Zucker-Ratten verringert. Martin et al., April 1992, FASEB Meeting, Anaheim, CA, USA. Beim Menschen wurden GH-Dosierungsprogramme, die eine zweimal tägliche und tägliche sowie einmal, zweimal und dreimal wöchentliche Verabreichung vorsahen, ebenso wie "intermittierende" Programme auf ihre Auswirkung auf das Körperwachstum in Kindern mit GH-Mangel untersucht. Die Daten zeigen, daß häufige - tägliche - Injektionen von GH die bevorzugte Verabreichungsdosierung darstellen (diese Dosierung hat sich auch im klinischen Bereich durchgesetzt). Die Daten bei Ratten zeigen auch, daß häufige Injektionen von GH zu einem größeren Knochenwachstum und einer stärkeren Gewichtszunahme führen als seltene GH-Injektionen und daß das kontinuierliche Aussetzen gegenüber GH durch Infusion nicht so wirksam ist wie häufige, intermittierende Injektionen von GH. Es wurde jedoch aufgezeigt, daß Infusionen von GH alleine bzw. in Kombination mit IGF-1 in Mengen, die eine dauerhafte wirksame Plasma-GH-Konzentration aufrechterhalten, zur Stimulierung des Immunsystems (auf GH-ansprechende Lymphgewebe) eines Wirtsäugetiers oder -vogels notwendig sind. Siehe WO 93/00109, veröffentlicht am 7.Januar 1993.
Angesichts der Verbreitung der Fettleibigkeit in unserer Gesellschaft und der damit verbundenen, oben besprochenen schwerwiegenden Folgen könnte jedes therapeutische Arzneimittel, das sich möglicherweise zur Gewichtsverringerung fettleibiger Menschen eignet, eine nachhaltig positive Auswirkung auf deren Gesundheit besitzen. Auf dem Gebiet besteht die Notwendigkeit, ein Arzneimittel zu entwickeln, das das gesamte Körpergewicht fettleibiger Patienten reduziert, bis sie - ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen - ihr ideales Körpergewicht erreichen, und das es weiters fettleibigen Menschen ermöglicht, dieses geringere Körpergewicht zu halten.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Behandlungsprogramm bereitzustellen, das darauf abzielt, das Körpergewicht fettleibiger Patienten auf ein normales, ideales Körpergewicht zu reduzieren.
Ein weitereres Ziel ist die Bereitstellung einer Therapie gegen Fettleibigkeit, die dazu führt, daß die betreffenden Patienten ihr verringertes Körpergewicht über einen langen Zeitraum beibehalten.
Ein weiteres Ziel ist die Vorbeugung von Fettleibigkeit und - sobald die Behandlung begonnen hat - das Stoppen ihres Fortschreitens bzw. die Vorbeugung von Krankheiten, die direkte oder indirekte Folgen von Fettleibigkeit sind, wie z.B. Arteriosklerose und die polyzystische Eierstockerkrankung.
Diese und andere Ziele sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.

Zusammenfassung der Erfindung

Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von IGF-1 und Wachstumshormon bei der Herstellung eines Medikamens zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Fettleibigkeit in einem Säugetier, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge an IGF-1 und GH an das Säugetier. Das GH wird optimalerweise solcherart verabreicht, daß seine therapeutisch wirksame Konzentration im Blut des Säugetiers für die Dauer seiner Verabreichung kontinuierlich beibehalten wird. Eine solche GH-Verabreichung umfaßt korrekterweise die Verwendung von GH, dessen Langzeitwirkung entweder durch Verlängerung der Gegenwart von GH im Blut oder durch Bewirken einer langsamen Freisetzung von GH an einer Injektionsstelle erreicht wird. Eine kontinuierliche GH-Verabreichung sieht auch eine Verabreichung durch Dauerinfusion bzw. durch Injektionen vor, die mehr als einmal täglich gegeben werden.
Bei einer bevorzugten Verabreichungsmethode ist GH über bis zu zehn Aminosäurereste, vorzugsweise über den N-terminalen Methionin- oder den Lysin-Rest, von menschlichem GH (hGH) kovalent gebunden, wobei höhere Substitutionen im allgemeinen die Verweilzeit des Proteins im Kreislauf erhöhen. Vorzugsweise sind solche Gruppen über eine Amidverbindung mit dem GH verbunden, die vom 4- Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonatester oder dem N-Hydroxysuccinimid- (NHS) Ester eines Polyethylenglykols (PEG), eines monomethylsubstituierten Homopolymers von PEG oder einer Polyoxyethylenglyzerincarbonsäure bereitgestellt wird. Das bevorzugteste Polymer ist hierin PEG, das an bis zu 10 Resten befestigt ist (vorzugsweise 2 bis 8 PEG- Moleküle pro hGH-Molekül).

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig.1 zeigt den Körpergewichtszuwachs bei weiblichen, jungen (6-9 Wochen alten), nicht fettleibigen dw/dw-Ratten im Verlauf von 8 Tagen bei Verabreichung von Exzipiens (leere Balken), einmal täglichen GH-Injektionen (breite Diagonallinien), zweimal täglichen GH-Injektionen (enge Diagonallinien) und GH durch Minipumpen- Infusion (ausgefüllte Balken). Alle Figuren und der Text zeigen Mittelwerte ± Standardabweichungen, wobei die statistische Signifikanz im Text beschrieben ist.
Fig.2 zeigt die ICF-1-Spiegel in Serum nach 8-tägiger Behandlung für die wie in Fig.1 behandelten Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu Fig.1 angeführt wird.
Fig.3 stellt die tägliche kumulative Körpergewichtszunahme in fettleibigen dw/dw- Ratten im Laufe einer 14-tägigen Behandlungsdauer dar. Die leeren Kreise sind Exzipient, die ausgefüllten Kreise hGH-Pumpe, die ausgefüllten Quadrate hGH in einer Dosis von 500 µg einmal pro Tag und die leeren Quadrate hGH in einer Dosis von 250 µg zweimal pro Tag.
Fig.4 stellt die endgültige Gewichtszunahme in fettleibigen dw/dw-Ratten nach 14- tägiger Behandlung dar, wobei die leeren Balken Exzipient, die ausgefüllten Balken hGH in einer Dosis von 500 µg durch Pumpe, die schraffierten Balken hGH einmal täglich und die diagonalen Linien hGH in einer Dosis von 250 µg zweimal täglich anzeigen.
Fig.5 zeigt das Gewicht des retroperitonealen Fettpolsters nach 14-tägiger Behandlung fettleibiger dw/dw-Ratten, wobei die Balken wie bei obiger Fig.4 sind.
Fig.6 zeigt die Körpergewichtsänderung bei weiblichen dw/dw-Ratten nach 14-tägiger Behandlung. Die Rattengruppen waren wie folgt: fettreich/ fettreich Vergleich (offene Balken), fettreich/fettreich hGH-Injektion (Schraffierung links), fettreich/fettreich hGH- Pumpe (ausgefüllt), fettreich/getreidereich (breite Diagonallinien), fettreich/getreidereich hGH-Injektion (mittlere Diagonallinien), fettreich/getreidereich hGH-Pumpe (enge Diagonallinien) und fettreich/ getreidereich Vergleich (Schraffierung rechts).
Fig.7 zeigt das retroperitoneale Fettspeichergewicht in dw/dw-Ratten nach 14-tägiger Behandlung, wobei der Schlüssel in der Legende zu Fig.6 angeführt ist.
Fig.8 zeigt die kumulativen Körpergewichtsänderungen bei weiblichen, fettleibiger dw/dw-Ratten in einem 14-tägigen Behandlungsverlauf. Die Cruppen waren wie folgt: Vergleich (leere Quadrate), hHG durch tägliche Injektion (ausgefüllte Kreise) oder hGH- Infusion durch Minipumpe (ausgefüllte Quadrate).
Fig.9 zeigt die tägliche Nahrungsaufnahme weiblicher, fettleibiger dw/dw-Ratten in einem 14-tägigen Behandlungsverlauf, wobei der Schlüssel in der Legende zu Fig.8 erklärt ist.
Fig.10 zeigt das Fettspeichergewicht in Gramm von fettleibigen, weiblichen dw/dw- Ratten nach 14-tägiger Behandlung. Die Gewichtsgruppen waren: Vergleich (leere Balken), hGH durch tägliche Injektion (diagonale Linien) oder hGH-Infusion durch Minipumpe (ausgefüllte Balken).
Fig.11 zeigt die mittlere kumulative Gewichtszunahme von zehn Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten nach 14-tägiger Behandlung. Die Gruppen waren (v.l.n.r.): fettleibiger Verglich (offene Balken), hGH 300 µg Pumpe (durchgehende Diagonallinien), hGH 100 µg Pumpe (unterbrochene Schraffierung), hGH 300 µg Injektion (enge Diagonallinien), hGH 100 µg Injektion (horizontale Linien), IGF-1 (dunkle Schraffierung), hGH Pumpe/IGF-1 (ausgefüllter Balken), hGH Injektion/IGF-1 (helle Schraffierung), PEG-GH (breite Diagonallinien) und fettarmer Vergleich (sehr helle Schraffierung).
Fig.12 zeigt die kumulative tägliche Körpergewichtsänderung in einem 14-tägigen Behandlungsverlauf bei fettleibigen weiblichen dw/dw-Ratten. Die Gruppen waren: Vergleich (leere Quadrate), IGF-1 (ausgefüllte Quadrate), GH durch tägliche Injektion (leere Kreise), GH Infusion (ausgefüllte Kreise) und GH Infusion plus IGF-1 (ausgefüllte Quadrate).
Fig.13 zeigt das retroperitoneale Fettpolstergewicht nach 14-tägiger Behandlung bei 10 Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu obiger Fig.11 beschrieben ist.
Fig.14 zeigt das Verhältnis zwischen retroperitonealem Fettpolster und Körpergewicht (x10) nach 14-tägiger Behandlung für die 10 Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu obiger Fig.11 beschrieben ist.
Fig.15 zeigt das Gonaden-Fettpolstergewicht nach 14 Tagen für die 10 Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu obiger Fg.11 beschrieben ist.
Fig.16 zeigt die Insulin-Werte in Serum nach 14 Tagen bei den 10 Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu obiger Fig.11 beschrieben ist.
Fig.17 zeigt die IGF-1-Werte in Serum nach 14 Tagen bei den 10 Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu obiger Fig.11 beschrieben ist.
Fig.18 zeigt die Serumwerte (mg/dl) von Glukose, Cholesterin und Triglyzeriden nach 14 Tagen bei den 10 Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu obiger Fig.11 beschrieben ist.
Fig.19 zeigt die Serumwerte (mg/dl) von Harnstoff-Stickstoff, -Kalzium und -Phosphor nach 14 Tagen bei den 10 Gruppen weiblicher dw/dw-Ratten, wobei der Schlüssel in der Legende zu obiger Fig.11 beschrieben ist.
Fig.20 zeigt die Auswirkung von IGF-1, GH und einer Kombination von GH und IGF-1 auf die Fettmasse bei subkutaner Verabreichung an AIDS-Patienten. Die ausgefüllten schwarzen Balken zeigen Plazebo, die Balken mit einem schwarzen Hintergrund und weißen Strichen GH, die getüpfelten Balken IGF-1 und die Balken mit einem weißen Hintergrund und schwarzen Linien GH und IGF-1. Die Anzahl an pro Gruppe behandelter Patienten ist durch die N-Ziffern unter den Balkengraphen angezeigt, und die y-Achse zeigt die Änderung der Fettmasse (kg) ab dem Ausgangswert an.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

A. Definitionen

"Fettleibigkeit" bezieht sich hierin auf einen Zustand, bei dem ein Säugetier einen Körpermasseindex (Body Mass Index, BMI), der als Gewicht (kg) pro Größe² (Meter) errechnet wird, von zumindest 25,9 aufweist. Üblicherweise besitzen Menschen mit Normalgewicht einen BMI von 19,9 bis weniger als 25,9.
Fettleibigkeit kann hierin jede beliebige Ursache besitzen (genetisch oder umweltbedingt). Beispiele von Störungen, die zu Fettleibigkeit führen können bzw. die Ursache von Fettleibigkeit sind: Überessen und Bulimie, polyzystische Eierstockerkrankung, Craniopharyngiom, Prader-Willi-Krankheit, Fröhlich-Krankeit, Diabetes vom Typ II, Patienten mit GH-Mangel, normale Kleinwüchsigkeit, Turner- Syndrom und andere pathologische Zustände, die eine verringerte Stoffwechselaktivität oder eine Abnahme des Ruheenergieaufwands als Prozentsatz der gesamten fettfreien Körpermasse aufweisen, z.B: Kinder mit akuter Lymphoblasten-Leukämie.
"Behandlung" bezieht sich auf die Verringerung des BMI des Säugetiers auf weniger als 25,9 sowie auf das Halten dieses Gewichts über einen Zeitraum von zumindest 6 Monaten. Die Behandlung führt günstigerweise zu einer Verringerung der Nahrungsmittel- bzw. Kalorienaufnahme des Säugetiers.
"Vorbeugung" bezieht sich auf die Vorbeugung gegen Fettleibigkeit, wenn die Behandlung vor dem Beginn des fettleibigen Zustands einsetzt. Wenn die Behandlung bei bereits fettleibigen Patienten einsetzt, kann man davon ausgehen, daß eine derartige Behandlung die medizinischen Folgeerscheinungen der Fettleibigkeit bzw. deren Fortschreiten verhindert; Beispiele dafür sind: Arteriosklerose, Diabetes vom Typ II polyzystische Eierstockerkrankung, kardiovaskuläre Erkrankungen, Osteoarthritis, dermatologische Störungen, Hypertonie, Insulin-Resistenz, Hypercholesterinämie, Hypertriglyzeridämie und Cholelithiasis.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung somit die Hemmung und/oder die völlige Unterdrückung der Fettbildung in fettleibigen Säugetieren, d.h. die übermäßige Ansammlung von Lipiden in Fettzellen, die eines der Hauptmerkmale menschlicher und tierischer Fettleibigkeit ist, sowie die Verringerung des gesamten Körpergewichts. In einem weiteren Aspekt verbessert die Erfindung die Zustände, die eine Folge der Krankheit sind, wie z.B. das Vorbeugen gegen - oder das Anhalten des Fortschritts der polyzystischen Eierstockerkrankung, sodaß die betreffende Patientin nicht länger unfruchtbar ist, und die Erhöhung der Insulin-Empfindlichkeit; außerdem bewirkt sie, daß die Verwendung von Insulin bei einem Diabetes-Patienten, z.B. einem mit Diabetes, die im Erwachsenenalter einsetzte, oder mit Diabetes vom Typ II, in einem weniger großen Ausmaß bzw. überhaupt hicht erforderlich ist.
Der Ausdruck "Säugetiere" umfaßt hierin Nutztiere wie Rinder, Schafe und Schweine und insbesondere die Fleischlieferanten darunter, Haustiere, Sporttiere, Zootiere und Menschen, wobei die letzteren vorzuziehen sind. Der Ausdruck "nicht erwachsen" bezieht sich auf Säugetiere vom perinatalen Alter bis zur Pubertät, wobei die letzteren ihr volles Wachstumspotential noch nicht erreicht haben. Fettleibige Menschen mit "GH-Mangel" sind jene ohne GH-Funktion, wie z.B. Menschen ohne Hypophyse oder mit einem GH-Rezeptor- bzw. GH-Bindeprotein-Mangel.
"GH" bezieht sich auf das Wachstumshormon aus jeder beliebigen Spezies, darunter aus Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden und vorzugsweise aus Menschen in Nativsequenz- oder in Variantenform sowie aus jeder beliebigen Quelle, aus natürlichen, synthetischen oder rekombinanten. Zur tierischen Verwendung ist die Form von GH aus der gerade behandelten Spezies vorzuziehen, wie z.B. Schweine-GH zur Behandlung von Schweinen, Schafe-GH zur Behandlung von Schafen, Rinder-GH zur Behandlung von Rindern usw.
Zur Anwendung beim Menschen ist hierin die menschliche Nativsequenz, reifes GH mit oder ohne Methionin an seinem N-Terminus vorzuziehen. Auch rekombinantes hGH ist vorzuziehen, d.h. jenes, das mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt wird. Mehr vorzuziehen ist menschliches Methionyl-Wachstumshormon (met-hGH), das durch E.coli erzeugt wird, z.B. durch das Verfahren gemäß US-A- 4.755.465, veröffentlicht am 5.Juli 1988, und Goeddel et al., Nature, 282:544 (1979. Met-hGH, das unter dem Markennamen Protropin durch Genentech, Inc. verkauft wird, ist identisch mit natürlichem Polypeptid, außer daß ein N-terminaler Methionin-Rest vorhanden ist. Diese angefügte Aminosäure ist das Ergebnis des bakteriellen Proteinsynthese-Prozesses. Weiters ist ein rekombinantes hGH vorzuziehen, das Kliniker und Forscher unter dem Markennamen Nutropin von Genentech, Inc. beziehen können und das im Handel bei Eli Lilly erhältlich ist. Diesem letzteren hGH fehlt dieser Methionin-Rest, und es besitzt eine Aminosäuresequenz, die identisch mit jener des natürlichen Hormons ist. Siehe Gray et al., Biotechnology, 2:161 (1984). Sowohl Methionyl-hGH als auch hGH besitzen eine gleiche Wirksamkeit und die gleichen pharmakokinetischen Werte. Moore et al., Endocrinology, 122: 2920-2926 (1988). Ein weiterer geeigneter hGH-Kandidat ist eine hGH-Variante, die eine Plazentaform von GH mit reiner somatogener und ohne laktogener Aktivität ist (siehe US-A-4.670.393, veröffentlicht am 2.Juni 1987). Weiters sind GH-Varianten umfaßt, wie sie in WO 90/04788, veröffentlicht am 3.Mai 1990, und WO 92/09690, veröffentlicht am 11.Juni 1992, beschrieben sind.
"IGF-1" bezieht sich hierin auf insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor aus jeder beliebigen Spezies, darunter aus Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden, Vögeln und vorzugsweise Menschen in Nativsequenz oder in Variantenform sowie aus jeder beliebigen Quelle, aus natürlichen, synthetischen oder rekombinanten. IGF-1 wurde aus menschlichem Serum isoliert und rekombinant produziert. Siehe z.B. EP-1 23.228 und 128.733.
Zur Anwendung bei Tieren ist die Form von IGF-1 aus der gerade behandelten Spezies vorzuziehen, z.B. Schweine-IGF-1 zur Behandlung von Schweinen, Schafe-IGF-1 zur Behandlung von Schafen, Rinder-IGF-1 zur Behandlung von Rindern usw. Bevorzugt ist hierin zur menschlichen Verwendung menschlicher, reifer LGF-1 mit Nativsequenz, noch bevorzuger ohne ein N-terminales Methionin, hergestellt z.B. gemäß dem Verfahren aus EP-230.869, veröffentlicht am 5.August 1987; EP-1 28.733, veröffentlicht am 19.Dezember 1984; oder EP-288.451, veröffentlicht am 26.Oktober 1988. Noch bevorzugter wird dieser Nativsequenz-IGF-1 rekombinant produziert und ist bei Genentech, Inc., South San Francisco, CA für klinische Forschungen erhältlich. Weiters ist zur Verwendung IGF-1 vorzuziehen, der eine spezifische Aktivität von mehr als etwa 14.000 Units/mg aufweist, wie dies durch Radiorezeptor-Assay mittels Plazentamembranen bestimmt wird, wie jener der z.B. bei KabiGen, Stockholm erhältlich ist.
Die bevorzugten IGF-1-Varianten sind jene, die in US-A-5.077.276, veröffentlicht am 31.Dezember 1991, und PCT WO 87/01038, veröffentlicht am 26.Februar 1987, und PCT WO 89/05822, veröffentlicht am 29.Juni 1989, beschrieben sind, d.h. jene, worin zumindest der Glutaminsäure-Rest an Position 3 vom N-Terminus des reifen Moleküls fehlt, oder jene mit einer Deletion von bis zu fünf Aminosäuren am N-Terminus. Bei der bevorzugtesten Variante fehlen die ersten drei Aminosäuren vom N-Terminus (verschiedentlich als Gehirn-IGF, tlGF-1, des(1-3)-IGF-1 oder des-IGF-1 bezeichnet).
Die Aussage, daß die GH-Verabreichung vorzugsweise solcherart erfolgt, daß "ihre therapeutisch wirksame Konzentration im Blut des Säugetiers für die Dauer seiner Verabreichung kontinuierlich beibehalten wird", bezieht sich auf die GH- Verabreichung, die durch Faktoren wie Verabreichungsweise, Formulierung, Verabreichungsprogramm, -modus, -zeitplan oder andere Faktoren usw. zu einer therapeutisch wirksamen Plasma- oder Serumkonzentration von GH während jenes Zeitraums führt, über den das GH an das Säugetier verabreicht wird. Gemäß dieser Definition ist das GH in einer Konzentration vorhanden, die zur Behandlung der Fettleibigkeit nach der vorliegenden Definition ausreicht und wirksam ist.

B. Durchführungsarten der Erfindung

GH in Kombination mit IGF-1 wird durch jedes geeignete Verfahren, z.B. parenteral intranasal, oral oder durch Absorption durch die Haut, direkt an das Säugetier verabreicht. Sie müssen nicht über den gleichen Weg und können lokal oder systemisch verabreicht werden. Die jeweilige Verabreichungsweise jedes Mittels hängt z.B. von der Krankengeschichte des Patienten einschließlich aller wahrgenommenen oder mutmaßlichen Nebenwirkungen oder verringerter anabolischer Wirkungen unter Verwendung von hGH oder IGF-1 alleine ab. Beispiele der parenteralen Verabreichung sind die subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle und intraperitoneale Verabreichung.
GH und IGF-1 werden so verabreicht, daß sie in wirksamen Mengen vorhanden sind Das GH kann diskontinuierlich, d.h. zu bestimmten Zeitpunkten (z.B. einmal täglich) in Form einer Injektion einer bestimmten Dosis verabreicht werden, wobei zum Zeitpunkt der Injektion ein Anstieg der GH-Konzentration in Plasma und dann ein Abfall der GH- Konzentration in Plasma bis zum Zeitpunkt der nächsten Injektion festzustellen ist. Ein weiteres diskontinuierliches Verabreichungsverfahren ergibt sich aus der Verwendung vieler erhältlicher Implantationsgeräte, die für eine intermittierende Freisetzung des Wirkstoffs sorgen, wie z.B. für einen anfänglichen Schub und eine anschließende Verzögerung bis zur Freisetzung des Wirkstoffs. Siehe z.B. US-A-4.767.628, Spalte 2, Zeilen 19-37.
Bevorzugter wird jedoch das GH so verabreicht, daß es während der Verabreichungsdauer des GH kontinuierlich im Blut vorhanden ist. Am bevorzugtesten wird dies durch Mittel wie Dauerinfusion über eine Minipumpe wie z.B. eine osmotische Minipumpe erzielt. Alternativ dazu eignen sich häufige GH-Injektionen (d.h. mehr als einmal täglich, z.B. zwei- oder dreimal täglich).
In einer weiteren Ausführungsform kann GH unter Verwendung von GH- Formulierungen mit Langzeitwirkung verabreicht werden, die entweder das Ausscheiden von GH aus dem Blut verzögern oder eine langsame Freisetzung von GH z.B. an einer Injektionsstelle bewirken. Die Formulierung mit Langzeitwirkung, die das Ausscheiden von GH aus Plasma verzögert, kann in der Form von GH, das mit einem Makromolekül, komplexiert oder (durch reversible oder irreversible Bindung) kovalent konjugiert ist, wie z.B. einem oder mehreren seiner Bindeproteine (WO 92/08985 veröffentlicht am 29.Mai 1992), oder einem wasserlöslichen Polymer, das aus PEG- und Polypropylenglykol- (POG) Homopolymeren und Polyoxyethylenpolyolen ausgewählt ist, d.h. jene, die in Wasser bei Raumtemperatur löslich sind, vorliegen.
Ein gut charakterisiertes GH-Bindeprotein ist das Wachstumshormon-Bindeprotein mit hoher Affinität (GHBP), das die extrazelluläre Domäne des GH-Rezeptors bildet das sich im Blutkreislauf befindet und in verschiedenen Spezies als GHBP agiert (Ymer und Herington, Mol. Cell. Endocrino., 41:153 [1985]; Smith und Talamantes, Endocrinology 123:1489-1494 [19881; Emtner und Roos, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 296- 302 [1990], einschließlich des Menschen. Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 62: 134-141 (1986); EP-366.710, veröffentlicht am 9.Mai 1990; Herington et al., J. Clin. Invest., 77: 1817-1823 (1986); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987). Ein zweites BP mit geringerer Affinität für GH wurde ebenfalls beschrieben; es scheint mit dem GH- Rezeptor strukturell nicht verwandt zu sein. Baumann und Shaw, J. Clin. Endocrinol. Metab., 70: 680-686 (1990).
Alternativ dazu kann das GH mit einem Polymer komplexiert oder daran gebunden werden, um seine Halbwertszeit im Blutkreislauf zu erhöhen. Beispiele von Polyethylenpolyolen und Polyoxyethylenpolyolen, die sich für diesen Zweck eignen, umfassen Polyoxyethylenglyzerin, Polyethylenglykol, Polyoxyethylensorbitol, Polyoxyethylenglukose o.dgl. Das Glyzerin-Rückgrat von Polyoxyethylenglyzerin ist das gleiche Rückgrat, das z.B. bei Tieren und Menschen in Mono-, Di- und Triglyzeriden auftritt.
Das Polymer muß kein bestimmtes Molekulargewicht aufweisen, doch es ist vorzuziehen, daß es zwischen etwa 3.500 und 100.000, noch bevorzugter zwischen 5.000 und 40.000, liegt. Vorzugsweise ist das PEG-Homopolymer unsubstituiert, doch es kann auch an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sein. Vorzugsweise ist die Alkylgruppe eine C1-C4-Alkylgruppe und am bevorzugtesten eine Methylgruppe. Am bevorzugtesten ist das Polymer ein unsubstituiertes Homopolymer von PEG, ein monomethylsubstituiertes Homopolymer von PEG (mPEG) oder Polyoxyethylenglyzerin (POG) und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis 40.000.
Das GH ist über einen oder mehrere Aminosäurereste des GH mit einer reaktiven Endgruppe auf dem Polymer kovalent verbunden, wobei dies hauptsächlich von den Reaktionsbedingungen, dem Molekulargewicht des Polymers usw. abhängt. Das Polymer mit der oder den reaktive(n) Gruppe(n) wird hierin als aktiviertes Polymer bezeichnet. Die reaktive Gruppe reagiert selektiv mit freien Amino- oder anderen reaktiven Gruppen auf dem GH. Man beachte jedoch, daß die Art und Menge der ausgewählten reaktiven Gruppe sowie die Art des eingesetzten Polymers zur Erzielung optimaler Ergebnisse vom jeweils verwendeten GH abhängen, sodaß vermieden wird, daß die reaktive Gruppe mit zu vielen besonders aktiven Gruppen auf dem GH reagiert. Da man dies nicht zur Gänze vermeiden kann, ist zu empfehlen, daß im allgemeinen (je nach Proteinkonzentration) von etwa 0,1 bis 1.000 Mol, vorzugsweise 2 bis 200 Mol, aktiviertes Polymer pro Mol Protein verwendet wird. Die Endmenge an aktiviertem Polymer pro Mol Protein ist ein Kompromiß zur Beibehaltung der optimalen Aktivität, während gleichzeitig - falls dies möglich ist - die Halbwertszeit des Proteins im Blutkreislauf optimiert wird.
Während die Reste jede beliebige reaktive Aminosäure auf dem Protein sein können wie z.B. eines oder zwei Cysteine bzw. die N-terminale Aminosäuregruppe, ist die reaktive Aminosäure vorzugsweise Lysin, die durch ihre freie &epsi;-Aminogruppe mit der reaktiven Gruppe des aktivierten Polymers verbunden ist bzw. Glutamin- oder Asparaginsäure, die mit dem Polymer durch eine Amidbindung verbunden sind.
Die kovalente Modifikationsreaktion kann durch jedes geeignete Verfahren stattfinden, das im allgemeinen beim Umsetzen aktiver Materialien mit inerten Polymeren zur Anwendung kommt, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5-9, noch bevorzugter bei 7- 9, wenn die reaktiven Gruppen auf dem GH Lysingruppen sind. Im allgemeinen umfaßt das Verfahren die Herstellung eines aktiven Polymers (mit zumindest einer terminalen Hydroxylgruppe), das Herstellen eines aktiven Substrats aus diesem Polymer und das anschließende Umsetzen des GH mit dem aktiven Substrat zur Herstellung des GH, das sich zur Formulierung eignet. Die obige Modifikationsreaktion kann durch verschiedene Verfahren erfolgen, die einen oder mehrere Schritte umfassen können. Beispiele von Modifikationsreagentien, die zur Herstellung des aktivierten Polymers in einer Ein- Schritt-Reaktion verwendet werden können, umfassen Cyanursäurechlorid (2,4,6- Trichlor-S-triazin) und Cyanursäurefluorid.
In einer Ausführungsform findet die Modifikationsreaktion in zwei Schritten statt, worin das Polymer zuerst mit einem Säureanhydrid wie z.B. Bemsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid umgesetzt wird, um eine Carbonsäure zu bilden, und die Carbonsäure dann mit einer Verbindung umgesetzt wird, die mit der Carbonsäure reagieren kann, um ein aktiviertes Polymer mit einer reaktiven Estergruppe zu bilden, die mit GH reagieren kann. Beispiele solcher Verbindungen sind N-Hydroxysuccinimid, 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure u.dgl., wobei vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid oder 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure verwendet werden. Monomethylsubstituiertes PEG kann z.B. bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise bei etwa 100-110ºC, 4 Stunden lang mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden. Die so hergestellte Monomethyl-PEG-Glutarsäure wird dann in der Gegenwart eines Carbodiimid-Reagens wie z.B. Dicyclohexyl- oder Isopropylcarbodiimid mit N-Hydroxysuccinimid umgesetzt, um das aktivierte Polymer, Methoxypolyethylenglykolyl-N-succinimidylglutarat, zu erzeugen, das mit GH umgesetzt werden kann. Dieses Verfahren ist ausführlich in Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186 (1984) beschrieben. Weiters kann beispielsweise das monomethylsubstituierte PEG mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden, gefolgt von der Reaktion mit 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure (HNSA) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid zur Bildung des aktivierten Polymers. HNSA ist durch Bhatnagar et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (Hg.) (Pierce Chemical Co. Rockford, IL, 1981, S.97-100, und in Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) mit dem Titel "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications" beschrieben.
Zu den Verfahren zur Herstellung von an PEG konjugiertem hGH zählen die Verfahren gemäß US-A-4.179.337 über PEG-hGH und US-A-4.935.465, die PEG, das reversibel, doch kovalent mit hGH verbunden ist, offenbart. Andere Verfahren zur Herstellung von PEG-hGH sind wie folgt:
PEGylierung mit Methoxypolyethylenglykolaldehyd (Me-PEG-Aldehyd) durch reduktive Alkylierung und Reinigung erfolgt durch Zugabe von 2 mg/ml hGH in PBS, pH 70, 5 mM Me-PEG-Aldehyd-5000 (Molekulargewicht 5.000 Dalton) und 20 mM NaCNBH3 und vorsichtiges Rühren bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 3 Stunden. Ethanolamin wird dann bis zum Erreichen von 50 mM zugegeben, um das übrige nicht- umgesetzte Me-PEG reduktiv zu amidieren. Das Gemisch wird auf einer Anionenaustauschsäule, FPLC Mono Q, getrennt. Das überschüssige nicht-umgesetzte Me-PEG bindet sich nicht an die Säule und kann dann vom Gemisch getrennt werden. Zwei PEGylierte hGH-Hauptfraktionen werden mit dem offensichtlichen Molekulargewicht von 30 K und 40 K auf reduzierter SDS-PAGE erhalten (im Gegensatz zu 20 K des nicht-umgesetzten hGH)- Der hGH-hGH-Bindeproteinkomplex wird in gleicher Weise PEGyliert, um ein Derivat von 150 K nach Gelfiltration zu ergeben.
Die PEGylierung mit N-Hydroxysuccinimidyl-PEG (NHS-PEG) und die Reinigung erfolgen durch Zugabe von NHS-PEG in einem fünffachen molaren Überschuß der gesamten Lysin-Konzentration von hGH zu einer Lösung, die 2 mg/ml hGH in 50 mM Natriumboratpuffer bei pH 8,5 oder PBS bei pH 7 enthält, und durch einstündiges Vermischen bei Raumtemperatur. Die Produkte werden auf einer Superose Größe 12- Säule und/oder Mono Q von FPLC getrennt. Die Größe des PEGylierten hGH unterscheidet sich in Abhängigkeit vom pH-Wert der Reaktion und beträgt von etwa 300 Kd für den Reaktionslauf bei pH 8,5 bis 40 Kd bei pH 7,0 (gemessen durch Gelfiltration). Der hGH-hGH-Bindeproteinkomplex wird ebenfalls in gleicher Weise PEGyliert und weist ein resultierendes Molekulargewicht von 400 bis 600 Kd aus der Gelfiltration auf.
Die PEGylierung der Cystein-Mutanten von hGH mit PEG-Maleimid erfolgt durch Herstellung einer einzigen Cystein-Mutante von hGH durch stellengerichtete Mutagenese, deren Sekretieren aus einem E.coli-16C9-Stamm (W3110 delta tonA phoA delta E15 delta (argF-lac) 169 deoC2, der kein deoC-Protein erzeugt und in US-A-07/224.520, eingereicht am 26.Juli 1988 und mittlerweile zurückgezogen, beschrieben ist, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist) und deren Reinigen auf einer Anionenaustauschsäule. PEG-Maleimid wird durch Umsetzen von MonomethoxyPEG- Amin mit Sulfo-MBs in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7,5) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gebildet und der Puffer durch Phosphatpuffer (pH 6,2) ersetzt. Als nächstes wird hGH mit einem freien Extra-Cysein 1 Stunde lang eingemischt und das Endgemisch auf einer Mono Q-Säule wie bei mit Me-PEG-Aldehyd PEGyliertem hGH getrennt.
Da Esterbindungen chemisch und physiologisch labil sind, kann es vorzuziehen sein, in der Konjugationsreaktion ein PEG-Reagens einzusetzen, das keine Esterfunktionalität besitzt. Beispielsweise kann man eine Carbamatbindung durch Umsetzen von PEG- Monomethylether mit Phosgen bilden, um das PEG-Chlorformiat zu ergeben. Dieses Reagens könnte dann in gleicher Weise wie der NHS-Ester verwendet werden, um Lysin-Seitenkettenamine zu funktionalisieren. In einem weiteren Beispiel entsteht eine Harnstoffbindung durch Umsetzen eines Amino-PEG-Monomethylethers mit Phosgen. Dies würde ein PEG-Isocyanat ergeben, das mit Lysinaminen reagiert.
Eine bevorzugte Methode der Herstellung von PEG-hGH, das keinen spaltbaren Ester im PEG-Reagens enthält, wird im folgenden beschrieben. Methoxypoly(ethylenglykol) wird in eine Carbonsäure umgewandelt, indem eine Titration mit Natriumnaphthalin erfolgt, um das Alkoxid zu ergeben, gefolgt von einer Behandlung mit Bromethylacetat zur Bildung des Ethylesters, gefolgt von der Hydrolyse zur entsprechenden Carbonsäure durch Behandlung mit Natriumhydroxid und Wasser (siehe Brückmann et al. Macromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981). Die resultierende Carbonsäure wird dann in einen zur Acylierung von hGH geeigneten PEG-N-Hydroxysuccinimidylester durch Reaktion der resultierenden Carbonsäure mit Dicyclohexylcarbodiimid und NHS in Ethylacetat umgewandelt.
Das resultierende NHS-PEG-Reagens wird dann mit 12 mg/ml GH unter Verwendung eines 30-fachen molaren Überschusses bezogen auf GH in einem Natriumboratpuffer, pH 8,5, bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt und auf eine Q Sepharose-Säule in Tris-Puffer aufgebracht sowie mit einem Salzgradienten eluiert. Dann wird es auf eine zweite Säule (Phenyl-Toyopearl) aufgebracht, die in 0,3 M Natriumcitratpuffer, pH 7,8, äquilibriert ist. Das PEGylierte hGH wird dann mit einem umgekehrten Salzgradienten eluiert, gepoolt und der Puffer unter Verwendung einer G25-Entsalzungssäule durch einen Mannitol-, Glycin- und Natriumphosphatpuffer mit pH 7,4 ersetzt, um ein geeignetes formuliertes PEG7-hGH zu ergeben.
Die PEGylierten hGH-Moleküle und der hGH-hGH-Bindeproteinkomplex können durch SDS-PAGE, Gelfiltration, NMR, tryptisches Kartieren, Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrophotometrie und biologischen in vitro-Assay charakterisiert werden. Das Ausmaß der PEGylierung wird günstigerweise zuerst durch SDS-PAGE und Gelfiltration aufgezeigt und dann durch NMR analysiert, die einen spezifischen Resonanzpeak für die Methylenwasserstoffe von PEG aufweist. Die Anzahl an PEG-Gruppen auf jedem Molekül kann aus dem NMR-Spektrum oder durch Massenspektrometrie errechnet werden. Polyacrylamid-Gelelektrophorese in 10% SDS erfolgt günstigerweise in 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 100 mM NACl als Eluierungspuffer. Um aufzuzeigen, welcher Rest PEGyliert ist, kann tryptisches Kartieren durchgeführt werden. PEGyliertes hGH wird demnach bei einem Protein/Enzym-Verhältnis von 100:1 bezogen auf mg bei 37ºC 4 Stunden lang in 100 mM Natriumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Kalziumchlorid pH 8,3, mit Trypsin gespalten und auf pH < 4 angesäuert, um die Spaltung zu stoppen, bevor die Trennung auf einer HPLC Nudeosil C-18 (4,6 mm x 150 mm, 5 µ, 100 Å) erfolgt. Das Chromatogramm wird mit jenem des nicht-PEGylierten Ausgangsmaterials verglichen. Jeder Peak kann dann durch Massenspektrometrie analysiert werden, um die Größe des Fragments im Peak zu verifizieren. Das oder die Fragment(e), das bzw. die PEG-Gruppen trug(en), wird bzw. werden üblicherweise nach der Injektion nicht auf der HPLC-Säule zurückgehalten und verschwindet bzw. verschwinden aus dem Chromatograph. Ein solches Verschwinden aus dem Chromatograph ist ein Anzeichen für die PEGylierung auf jenem speziellen Fragment, das zumindest einen Lysinrest enthalten dürfte. PEGyliertes hGH kann dann durch herkömmliche Verfahren auf seine Fähigkeit, sich an das hGH-Bindeprotein (hGHBP) zu binden, untersucht werden.
Die verschiedenen angewendeten PEGylierungsverfahren erzeugten verschiedene Arten von PEGyliertem hGH des Wildtyps mit offensichtlichen Molekulargewichten von 35 Kd, 51 Kd, 250 Kd und 300 Kd durch Größenausschluß-Chromatographie, was nahe an ihr hydrodynamisches Nativvolumen heranreichen sollte. Diese wurden als PEG1- hGH, PEG2-hGH, PEG3-hGH bzw. PEG7-hGH bezeichnet. Aus den Ergebnissen des tryptischen Kartierens war ersichtlich, daß bei PEG1-hGH und PEG2-hGH das N- terminale 9-Aminosäuren-Fragment im Chromatogramm fehlte und dieses möglicherweise PEGyliert war, was durch Massenspektrometrie der großen Molekularspezies bestätigt wurde, die im Durchfluß des Flüssigkeitschromatographen gefunden wurde. Anhand des Molekulargewichts in der SDS-PAGE war ersichtlich, daß PEG1- hGH ein PEG auf dem N-terminalen Amin und PEG2-hGH zwei PEG-Moleküle auf dem N-terminalen Amin aufweisen könnte, die ein tertiäres Amid bilden. PEG3-hGH besitzt laut NMR-Ergebnis etwa fünf PEG-Gruppen pro Molekül, und auf der tryptischen Karte fehlten zumindest fünf Peptidfragmente, was nahelegt, daß sie PEGyliert sind. Man nimmt aufgrund der Massenspektrometrie an, daß das PEG7-hGH-Molekül sechs bis sieben PEG-Gruppen pro Molekül aufweist.
Die Stellen für die Addition der PEG-Gruppen an hGH und jene, die für eine solche Konjugation bevorzugte Reste sind, sind N-terminales Methionin oder Phenylalanin Lysin 38, Lysin 41, Lysin 70, Lysin 140, Lysin 145, Lysin 158 und Lysin 168. Zwei Lysine, die nicht PEGyliert zu sein schienen, waren Lysin 115 und Lysin 172.
Das GH wird auch günstigerweise durch Systeme mit Langzeit-Freisetzung verabreicht. Beispiele für geeignete Zusammensetzungen mit Langzeig-Freisetzung sind halbdurchlässige Polymermatrizen in Form ausgestalteter Gegenstände, z.B. Filme oder Mikrokapseln. Matrizen mit Langzeit-Freisetzung umfassen Polylactide (US-A-3.773.919 EP-58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 [1983], Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]), Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP-133.988) oder PLGA-Mikrokügelchen. GH-Zusammensetzungen mit Langzeit-Freisetzung umfassen auch liposomeingeschlossenes GH. GH enthaltende Liposome werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP-52.322; EP-36.676; EP-88.046; EP-143.949; EP-142-641; JP-A-83-118008; US-A- 4.485.045 und 4.544.545; und EP-102.324. Üblicherweise sind die Liposome vom kleinen (etwa 200-800 Ångström) unilamellaren Typ, worin der Lipidanteil größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Anteil auf eine optimale Therapie abgestimmt ist. Außerdem kann eine biologisch aktive Formulierung mit Langzeit-Freisetzung aus einem Addukt des kovalent an ein aktiviertes Polysaccharid gebundenen GH hergestellt werden (siehe US-A-4.857.505, veröffentlicht am 15.August 1989). Weiters beschreibt US-A-4.83 7.381 eine Mikrokügelchen-Zusammensetzung aus Fett oder Wachs bzw. einem Gemisch daraus und GH für langsame Freisetzung.
Der IGF-1 kann durch jedes beliebige Mittel verabreicht werden, einschließlich durch Injektionen (eine oder mehrere pro Tag, z.B. 1-4 täglich) oder Infusionen. Wie bei GH kann IGF-1 so formuliert sein, daß er während des Behandlungsverlaufs kontinuierlich im Blut vorhanden ist, wie dies oben für GH beschrieben ist. Somit kann er kovalent an einem Polymer befestigt sein oder - wie oben beschrieben - zu einer Formulierung mit Langzeit-Freisetzung gebildet werden.
Zudem wird der IGF-1 günstigerweise gemeinsam mit einem oder mehreren seiner Bindeproteine verabreicht, z.B. mit den derzeit bekannt, d.h. IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IBFBP-5 oder IGFBP-6. Der IGF-1 kann zur Verabreichung auch an einen Rezeptor oder Antikörper bzw. ein Antikörperfragment gekuppelt werden. Das bevorzugte Bindeprotein für IGF-1 ist hierin IGFBP-3, das in WO 89/09268, veröffentlicht am 5.Oktober 1989, und durch Martin und Baxter, J. Bio. Chem., 261: 8754-8760 (1986) beschrieben ist. Das glykosylierte IGFBP-3-Protein ist eine säurestabile Komponente von etwa 53 Kd auf einem nichtreduzierenden SDS-PAGE-Gel eines 125-150 Kd-Glykoproteinkomplexes in menschlichem Plasma, der die meisten der endogenen IGFs trägt und auch durch GH reguliert wird.
Die Verabreichung des IGF-Bindeproteins mit IGF-1 kann durch das Verfahren gemäß US-A-5.187.151 durchgeführt werden, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Zusammengefaßt gesagt werden IGF-1 und IGFBP in wirksamen Mengen durch subkutane Bolusinjektion in einem Molverhältnis von etwa 0,5: bis etwa 3:1, vorzugsweise etwa 1:1 verabreicht.
Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung von IGF-1 und GH durch Dauerinfusion, z.B. unter Verwendung intravenöser oder subkutaner Mittel. Noch bevorzugter ist die Verabreichung sowohl für IGF-1 als auch GH subkutan.
GH in Kombination mit IGF-1 wird zur Verwendung in der Therapie so formuliert und dosiert, wie es der bewährten medizinischen Praxis entspricht, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten (insbesondere die Nebenwirkungen der Behandlung mit GH oder IGF-1 alleine oder die Wachstumsverlangsamung nach kontinuierlicher GH-Behandlung), die Zufuhrstelle der IGF-1- und GH-Zusammensetzung(en), das Verabreichungsverfahren, der Verabreichungszeitplan und andere den Praktikern bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Die "wirksamen Mengen" jeder Komponente werden für die Zwecke der Erfindung somit durch solche Überlegungen bestimmt und es sind Mengen, die die Fettleibigkeit eines Patienten deutlicher verringern als durch Verwendung der gleichen Menge an IGF-1 oder GH alleine bzw. Fettleibigkeit oder damit in Zusammenhang stehende Zustände überhaupt nicht entstehen lassen.
Allgemein wird vorgeschlagen, daß die gesamte pharmazeutisch wirksame Menge von jeweils parenteral verabreichtem IGF-1 und GH pro Dosis im Bereich von etwa 1 µg/kg/Tag bis zu 10 mg/kg/Tag des Patienten-Körpergewichts beträgt, obwohl der Therapeut - wie bereits erwähnt - hier einen großen Handlungsspielraum hat. Noch bevorzugter beträgt diese Dosis zumindest 0,01 mg/kg/Tag und am bevorzugtesten für Menschen zwischen etwa 0,01 und 1 mg/kg/Tag für jedes Hormon. Bei Dauerverabreichung werden IGF-1 und GH typischerweise bei einer Dosisrate von etwa 1 µg/kg/Stunde bis etwa 50 µg/kg/Stunde entweder durch 1-4 Injektionen pro Tag oder durch subkutane Dauerinfusionen, z.B. mittels einer Minipumpe, zugeführt. Eine Infusionslösungsbeutel eignet sich ebenfalls. Der entscheidende Faktor bei der Auswahl der zweckmäßigen Dosis ist das erzielte Ergebnis, das durch die Verringerung des gesamten Körpergewichts oder das Verhältnis zwischen fetter und fettfreier Masse bzw. durch andere Kriterien zur Messung der Regulierung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit bzw. zur Vorbeugung von mit Fettleibigkeit in Zusammenhang stehenden Zuständen gemessen wird, wie sie der Praktiker für geeignet hält.
Man beachte, daß Praktiker, die Dosen für IGF-1 und GH bestimmen, die bekannten Nebenwirkungen der Behandlung mit diesen Hormonen berücksichtigten sollten. Die Nebenwirkungen von hGH umfassen die Natrium-Retention und die Ausdehnung des extrazellulären Volumens (Ikkos et al., Acta Endocrinol. (Kopenhagen), 32:341-361 [1959]; Biglieri et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 21:361-370 [1961] sowie Hyperinsulinämie und Hyperglykämie. Die wichtigste Nebenwirkung von IGF-1 ist Hypoglykämie. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2868-2872 (1989). Die Kombination von IGF-1 und GH kann zu einer Milderung der unerwünschten Nebenwirkungen beider Mittel (z.B. Hypoglykämie bei IGF-1 und Hyperinsulinämie bei GH) sowie zur Wiederherstellung der Blutwerte von GH führen, dessen Sekretion durch IGF-1 unterdrückt wird.
Zur parenteralen Verabreichung werden in einer Ausführungsform IGF-1 und GH im allgemeinen formuliert, indem sie jeweils bei einem erwünschten Reinheitsgrad in einer in Dosierungseinheiten injizierbaren Form (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt werden, d.h. mit einem, der bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch ist und mit anderen Ingredientien der Formulierung verträglich ist. Die Formulierung enthält z.B. vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, deren Schädlichkeit für Polypeptide bekannt ist.
Im allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und enges In-Kontakt- Bringen von IGF-1 und GH mit flüssigen Trägern oder feinteiligen festen Trägern oder beiden hergestellt. Falls erforderlich, wird das Produkt dann zur erwünschten Formulierung geformt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Empfängerblut isotonisch ist. Beispiele für solche Trägervehikel sind Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung Nichtwäßrige Vehikel wie z.B. nichtflüchtige Öle und Ethyloleat kommen so wie Liposome ebenfalls in Frage.
Der Träger enthält günstigerweise kleine Mengen an Additiven wie z.B. Substanzen, die die Isotonie und chemische Stabilität steigern. Solche Materialien sind für die Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch; Beispiele sind Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren bzw. ihre Salze; Antioxidantien wie z.B. Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate, einschließliche Cellulose oder ihre Derivate, Glukose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionogene Tenside wie z.B. Polysorbate, Poloxamere oder PEG.
IGF-1 und GH werden typischerweise jeweils einzeln in solchen Vehikeln bei einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1-10 mg/ml, bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis 8 formuliert. IGF-1 voller Länge ist im allgemeinen bei einem pH-Wert von nicht mehr als etwa 6 stabil; des(1-3)-IGF-1 ist bei etwa 3,2 bis 5 stabil; hGH ist bei einem höheren pH-Wert, z.B. bei 7,4-7,8, stabil. Man beachte, daß die Verwendung bestimmter der obigen Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von IGF-1- oder GH-Salzen führt.
Weiters können IGF-1 und GH, vorzugsweise der IGF-1 voller Länge, gemeinsam in einem geeigneten Trägervehikel formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, die vorzugsweise keine Zeilen enthält. In einer Ausführungsform hängt der zur Formulierung verwendete Puffer davon ab, ob die Zusammensetzung unmittelbar nach dem Vermischen verwendet oder zur späteren Verwendung gelagert wird. Bei Verwendung unmittelbar nach dem Vermischen kann ein Gemisch aus IGF-1 voller Länge und GH in Mannit, Glycin und Phosphat (pH 7,4) formuliert werden. Wenn dieses Gemisch gelagert werden soll, wird es in einem Puffer bei einem pH-Wert von etwa 6 wie z.B. Citrat mit einem Tensid, das die Löslichkeit des GH bei diesem pH- Wert steigert, z.B. 0,1% Polysorbat 20 oder Poloxamer 188, formuliert. Das Endpräparat kann eine stabile Flüssigkeit oder ein lyophilisierter Feststoff sein.
IGF-1 und GH, die zur therapeutischen Verabreichung verwendet werden sollen, sind vorzugsweise steril. Die Sterilität wird am besten durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen (z.B. 0,2 µm-Membranen) erreicht. Therapeutische IGF-1- und GH- Zusammensetzungen werden im allgemeinen in ein Behältnis mit einer sterilen Zugangsöffnung eingefüllt, z.B. in einen Beutel bzw. ein Fläschchen für eine Infusionslösung mit einem durch eine hypodermische Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen.
Der IGF-1 und das GH werden üblicherweise in für Einheiten oder mehrere Dosen vorgesehenen Behältnissen, z.B. in abgedichteten Ampullen oder Fläschchen, als wäßrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution gelagert. Als Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10 ml-Fläschchen mit 5 ml sterilgefilterter, 1% (w/v) wäßriger IGF-1 und GH-Lösungen gefüllt und das resultierende Gemisch lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstituieren des lyophilisierten IGF-1 und GH unter Verwendung von bakteriostatischem Injektionswasser gebildet.
Die GH- und IGF-1-Behandlung kann je nach den Erfordernissen für den einzelnen Patienten mit oder ohne Kosteinschränkung, z.B. mit einer Obergrenze der täglichen Nahrungs- oder Kalorienaufnahme, erfolgen.
Weiters werden GH und IGF-1 günstigerweise in Kombination mit anderen Behandlungen zur Bekämpfung von bzw. Vorbeugung gegen Fettleibigkeit verabreicht. Zweckmäßige Substanzen umfassen z.B. Hormone (Catecholamine, Glucagon, ACTH); Clofibrat; Halogenat; Cinchocain; Chlorpromazin; Appetithemmer, die auf die noradrenergenen Neurotransmitter einwirken wie z.B. Mazindol und Derivate von Phenethylam in, z.B. Phenylpropanolamin, Diethylpropion, Phentermin, Phendimetrazin, Benzphetamin, Amphetamin, Methamphetamin und Phenmetrazin; Arzneimittel, die auf Serotonin-Neurotransmitter einwirken, z.B. Fenfluramin, Tryptophan, 5-Hydroxytryptophan, Fluoxetin und Sertralin; zentral aktive Arzneimittel wie z.B. Naloxon, Neuropeptid-Y, Galanin, Corticotropin-freisetzendes Hormon und Cholecystokinin; ein cholinergener Agonist wie z.B. Pyridostigmin; ein Sphingolipid wie z.B. Lysosphingolipid oder ein Derivat davon (EP-321.287, veröffentlicht am 21.Juni 1989); thermogene Arzneimittel wie z.B. Schilddrüsenhormon; Ephedrin; β-adrenergene Agonisten; auf den Magendarmtrakt einwirkende Arzneimittel wie etwa Enzyminhibitoren, z.B. Tetrahydrolipostatin, unverdauliche Nahrungsmittel wie z.B. Saccharosepolyester und Inhibitoren der Magenentleerung wie z.B. Threochlorcitronensäure oder ihre Derivate; β-adrenergene Agonisten wie z.B. Isoproterenol und Yohimbin; Aminophyllin zur Verstärkung der β-adrenergen-ähnlichen Wirkungen von Yohimbin, ein α&sub2;-adrenergener Blocker wie z.B: Clonidin alleine oder in Kombination mit einem Wachstumshormon-freisetzenden Peptid (US-A-5.120.713, veröffentlicht am 9.Juni 1992); die Darmabsorption beeinflussende Arzneimittel wie etwa Biguanide wie z.B Metformin und Phenformin; Füllmittel wie z.B. Methylcellulose; metabolische Blocker wie z.B. Hydroxycitrat; Progesteron; Cholecystokinin-Agonisten; kleine Moleküle, die Ketosäuren ähneln; Agonisten für Corticotropin-freisetzendes Hormon; eine mit Ergot verwandte, Prolactin hemmende Verbindung zur Verkleinerung der Körperfettspeicher (US-A-4.783.469, veröffentlicht am 8.November 1988); β-3-Agonisten; Bromcriptin; Antagonisten für Opioidpeptide; Antagonisten für Neuropeptid Y; Glukocorticoidrezeptor-Antagonisten; Wachstumshormon-Agonisten; Kombinationen davon; usw. Dies umfaßt alle durch Bray und Greenaway, Clinics in Endocrinol. and Metabol., 5:455 (1976) beschriebenen Arzneimittel.
Diese Adjuvantien können während, vor oder nach der Verabreichung von GH und IGF-1 und durch die gleiche bzw. eine andere Verabreichungsweise wie bzw. als GH und IGF-1 verabreicht werden.
Es folgt eine Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele auf die der Schutzbereich der Erfindung jedoch keinesfalls beschränkt ist. Alle Literatur- und Patentangaben sind ausdrücklich durch Verweise aufgenommen.

BEISPIEL 1

Entwicklung eines neuen Tiermodells von nahrungsbedingter Fettleibigkeit und Untersuchung des GH-Verabreichungsmusters bei lipolytischer Gewichtsverringerung

Einleitung

Das Ziel dieser Untersuchungen ist die Entwicklung eines neuen Tiermodells bezüglich nahrungsbedingter Fettleibigkeit und der Vergleich der Auswirkungen unterschiedlicher GH-Verabreichungsmuster in einem solchen Modell auf die Körperzusammensetzung, insbesondere auf die Körperfettmenge. Kürzlich veröffentlichte Zusammenfassungen über die menschlichen Daten (Jorgenson, s.o., S.190) zeigen, daß GH-Injektionen eine Verringerung des Gesamtkörperfetts bewirken können. Beim Menschen wurden jedoch keine systematischen Versuche unternommen (wie z.B. bei den Untersuchungen zur Optimierung der wachstumsfördernden Wirkungen von GH), um die optimalen Dosierungen für die lipolytischen Aktivitäten von GH zu definieren.
Die Zwergratte (dw/dw) ist ein kürzlich entdeckter Mutanten-Rattenstamm mit einem isolierten Mangel an Hypophysen-GH, doch mit offensichtlich normalen Spiegeln anderer Hypophysen-Hormone. Charlton et al., J. Endocr., 119:51-58 (1988); Skottner et al., Endocrinology, 124:2519-2526 (1989). Anfangs interessierte man sich vor allem dafür, ob fettreiche Kost Fettleibigkeit der Zwergratte (dw/dw) hervorruft. Außerdem wollte man feststellen, ob Fettleibigkeit mit der Herbeiführung von Insulin- und/oder IGF-1-Resistenz in Zusammenhang steht. Die fettleibige dw/dw-Ratte könnte dann als Modell bezüglich der menschlichen Krankheit, insbesondere der Diabetes vom Typ II, dienen, die mit Insulin-Resistenz und Fettleibigkeit verbunden ist.
Die Zwergratte (dw/dw) wurde aufgrund ihres angeborenen Mangels an GH und aufgrund der Tatsache ausgewählt, daß der GH-Mangel mit der Fettleibigkeit bei Tieren und beim Menschen in Zusammenhang steht. Die dw/dw-Ratte ist nicht wie das klassische fettleibige Mäusemodel (ob/ob) von Natur aus fettleibig. Mayer et al., Endocrinology, 52: 54-61(1953). Die dw/dw-Ratte besitzt niedrige GH- und daher auch geringe IGF-1-Spiegel im Blut, weshalb sie ein potentiell günstiges Modell zur Untersuchung der Auswirkung von GH und IGF-1 darstellt. Skottner et al., 1989, s.o.
Weibliche Ratten wurden ausgewählt, da sie einen höheren Körperfett-Prozentsatz aufweisen und im allgemeinen mehr zu Fettleibigkeit neigen als männliche Ratten. Schemmel et al., Anat. Rec., 166:437-446 (1969). Die traditionelle Kost, mit der Labortiere üblicherweise gefüttert werden, ist getreidereich und besitzt daher einen sehr niedrigen Fettanteil (etwa 5 Gew.-% Fett). Eine fettreichere Kost (die eher der in der westlichen Welt vorherrschenden menschlichen Kost entspricht) wurde ausgewählt, um Fettleibigkeit in der dw/dw-Ratte zu bewirken.
Die Ziele der vorliegenden Versuche waren:
1) Versuch der Bewirkung der Fettleibigkeit der dw/dw-Ratte oder normaler Ratten durch Kost.
2) Untersuchung der Insul in-Resistenz der fettleibigen Tiere.
3) Untersuchung der Wirksamkeit von GH bei der Verringerung des Körperfettanteils der fettleibigen Tiere.
4) Untersuchung des Musters (Dosierungsprogramms) der GH-Verabreichung bei der Verringerung des Körperfettanteils fettleibiger Tiere.
5) Untersuchung der Auswirkung der Diät (Rückkehr von einer fettreichen zu einer fettarmen Diät) in Kombination mit unterschiedlichen Mustern der GH-Verabreichung, d.h. Untersuchung der Wirksamkeit von GH während des diätbewirkten Gewichtsverlusts.

Versuche I und II

Verfahren und Ergebnisse

Versuch I verglich die Auswirkung einer fettreichen Kost auf das Körpergewicht bei dw/dw-Ratten (mit GH-Mangel) und normalen Ratten (mit ausreichend GH), während Versuch II die Auswirkung der Kost auf das Körpergewicht und die Fettleibigkeit bei dw/dw-Ratten bestätigte. Der Fettleibigkeitsgrad wurde durch die Masse ausgewählter, wohl definierter Fettspeichergewichte sowie durch das Vorhandensein von Insulin- Resistenz bestimmt.

VERSUCH I:

Im ersten Versuch wurden weibliche Ratten verwendet, 12 Zwergratten (dw/dw Simonsen Labs, Gilroy, CA, USA) und 12 Sprague-Dawley-Ratten (SD, Charles River, Portage). Die Zwergratten hatten ihr höchstes Körpergewicht (100-140 g) erreicht und waren 120 Tage alt. Die SD-Ratten wurden gewichtsmäßig mit den Zwergratten übereingestimmt. Die SD-Ratten hatten ihr Körperhöchstgewicht nicht erreicht, wogen 100-140 g und waren 40 Tage alt.
Die Ratten wurden statistisch in vier Sechsergruppen aufgeteilt und gewichtsmäßig übereingestimmt, um Ungleichheit beim mittleren Ausgangsgewicht zu beseitigen. Eine Gruppe jedes Stamms wurde 29 Tage lang mit beliebigen Mengen normalen Labor- Pellets gefüttert (4,5 Gew.-% Fett und 9,6 % Fett gemäß dem Kaloriengehalt). Die anderen zwei Gruppen erhielten ebenfalls 29 Tage lang eine unbeschränkte Menge an fettreichem Futter (36,3 Gew.-% Fett und 56,2 % Fett gemäß dem Kaloriengehalt). Das fettreiche Futter wurde durch Vermischen eines Teils Pflanzenfett mit zwei Teilen gemahlenen Pellets gebildet, wodurch eine homogene Paste entstand. Die Ratten wurden zumindest fünfmal wöchentlich gewogen.
Während des ersten Versuchs zeigten sowohl die SD- als auch die Zwergratten eine beträchtliche Gewichtszunahme. Beide Gruppen der SD-Ratten nahmen während der gesamten Untersuchung zu. Überraschenderweise bestand jedoch keine statistische Differenz bezüglich des Körperendgewichts zwischen den fettreich und den getreidereich gefütterten Ratten (fettreiche Kost 102,6 ± 20,2 g, getreidereiche Kost 108,1 ± 18,3 g, t=0,83 gemäß Duncan's Multiple Range-Test; kritischer Wert 2,90). Da die SD-Ratten am Beginn des Versuchs noch nicht erwachsen waren und ihr Körperhöchstgewicht nicht erreicht hatten, war die beobachtete große Gewichtszunahme höchstwahrscheinlich das Ergebnis von normalem Wachstum und nicht einfach die Anhäufung von Fettgewebe.
Die beiden Gruppen Zwergratten steigerten ihr Gewicht im Laufe der Untersuchung, doch im Gegensatz zu den SD-Ratten bestand durchwegs ein klarer und deutlicher Unterschied zwischen der mit fettreicher Kost und der mit getreidereicher Kost ernährten Gruppe an Zwergratten. Diese Differenz trat schon am ersten Tag der unterschiedlichen Ernährung auf (fettreiche Kost 3,2 ± 1,7 g, getreidereiche Kost -1,0 ± 3,3 g, t=4,42 durch Duncan's Multiple Range-Test; kritischer Wert 2,90) und war nach 15 Tagen (fettreiche Kost 23,3 ± 12,5 g, getreidereiche Kost 10,4 ± 5,3 g, t=4,12 durch Duncan's Multiple Range-Test; kritischer Wert 2,90) und am letzten von 29 Tagen noch vorhanden (fettreiche Kost 37,0 ± 18,7 g, getreidereiche Kost 13,3 ± 6,4 g, t=3,7 durch Duncan's Multiple Range-Test; kritischer Wert 2,90). Da das Körpergewicht der Zergratten am Beginn des Versuch den Höchstand erreicht hatte, war ihr Gewichtszuwachs höchstwahrscheinlich auf die Anhäufung von Fettgewebe zurückzuführen.

VERSUCH II:

Im zweiten Versuch waren vier Gruppen zu jeweils sechs Zwergratten vorgesehen, um die obigen Ergebnisse zu wiederholen und zu bestätigen sowie die Insulin- Empfindlichkeit und die Fettmasse zu messen. Wiederum setzte die Gewichtszunahme der fettreich ernährten Ratten sofort ein. Nachdem sie 28 Tage lang dieses Futter erhielten, waren die fettreich ernährten Ratten deutlich (p < 0,001) schwerer (155,7 ± 6,2 g) als die mit Getreide gefütterten Ratten (128,4 ± 11,5 g). Nach 7 Tagen dieser unterschiedlichen Ernährung wurde die Hälfte der Ratten unter Verwendung einer intravenösen Insulin-Injektion (0,4 u/kg) einem Insulin-Verträglichkeitsversuch unterzogen. Zu diesem Zeitpunkt bestand kein Unterschied zwischen den Blutglukose- Reaktionen der zwei Gruppen.
Sowohl die fettleibigen als auch die mageren Ratten erhielten zur Untersuchung der Insulin-Verträglichkeit nach 28 Tagen eine intravenöse Injektion von Insulin (0,4 u/kg). Blut wurde vor und nach der Injektion entnommen, um die Blutglukose zu messen. Die Blutglukose der mit Getreidefutter ernährten Tiere zeigte nach der Insulin-Injektion eine starke Abnahme (von einem Ausgangswert von 162,7 ± 22 mg-% auf 94,0 ± 25,0 mg-% bzw. 56,9% des Anfangswerts nach 20 Minuten). Der stärkste Abfall des Blut- Glukosespiegels wurde nach 20 Minuten festgestellt, nach 40 Minuten stieg er wieder. Die fettreich ernährten Tiere waren gegenüber dieser Insulin-Dosis resistent. Ihre Blut- Glukosekonzentrationen fielen nur auf 89,4 ±2% der Anfangskonzentration (210 ± 23 mg-%), wobei der stärkste Abfall nach 20 Minuten verzeichnet wurde. Diese Reaktionen auf Insulin waren zwischen den Gruppen statistisch unterschiedlich, wobei dies anzeigte, daß eine klare Insulin-Resistenz bei fettreich ernährten Ratten nach 28 - aber nicht nach 7 Tagen - Futterzufuhr herbeigeführt wurde. Die Insul in-Resistenz schien also nicht von der Ernährung, sondern von der Entwicklung der Fettleibigkeit abzuhängen.
Die Fettleibigkeit wurde direkt nach dem Euthanisieren der Tiere gemessen (nach 29 Tagen fettreicher oder fettarmer Ernährung); die parametrialen und retroperitonealen Fettpölster wurden freigelegt, gewogen und zwischen den Gruppen verglichen. Die Fettpölster der fettreich ernährten Tiere waren wesentlich größer als die Fettpölster der mit Getreide ernährten Tiere. Die mittleren parametrialen Fettpolstergewichte (Mittelwert ± SD) betrugen 2,3 ± 0,6 g bei den mit Getreide gefütterten Tieren und 5,2 ± 1,4 bei den fettreich gefütterten Tieren. Eine Einfachanalyse der Varianz für diese Zahlen ergab einen F-Wert von 25,57 mit 1/14 Freiheitsgraden, eine äußerst signifikante Differenz (P < 0,001). Die mittleren retroperitonealen Fettpolstergewichte betrugen 0,9 ± 0,4 g bei den mit Getreide gefütterten Tieren und 2,39 ± 0,7 g bei den fettreich gefütterten Tieren. Die Einweganalyse der Varianz ergab einen F-Wert von 24,67 mit 1/14 Freiheitsgraden bei dieser Messung (statistisch wiederum sehr unterschiedlich).

Diskussion der Beispiele 1 & 2

Die Zielsetzung des ersten Versuchs war ein Vergleich der Zwergratten mit den SD- Ratten hinsichtlich ihrer Neigung zur Fettleibigkeit. Die Zwergratten wurden deutlich fettleibig, die SD-Ratten nicht. Vermutlich verhinderten die normalen endogenen GH- Werte der SD-Ratten die Fettleibigkeit, während die niedrigen Werte bei den dw/dw- Ratten die Fettleibigkeit ermöglichten. Man könnte daher erwarten, daß die prophylaktische Behandlung von Ratten mit GH das Auftreten von Fettleibigkeit verhindern würde.
Das Ziel des zweiten Experiments war aufzuzeigen, daß fettleibige dw/dw-Ratten im Lauf der Zeit aufgrund der Entwicklung von Fettleibigkeit insulin-resistent wurden.
Bei der fettreichen Kost wurde der Kalorien-Fettgehalt mit 56% festgelegt, da dies ein vernünftiges Maximum zu sein schien. Ein höherer Wert würde wahrscheinlich aufgrund des Mangels an ausreichend Protein im Futter zu einer unzulänglichen Proteinzufuhr führen. Außerdem ergab die Konsistenz des Futters bei einem Fett- Getreideverhältnis von 1:2 ein Gemisch, das leicht herzustellen und zu verfüttern war.
Die obigen Untersuchungen zeigen deutlich, daß der GH-Mangel die Tiere zu Fettleibigkeit neigen ließ. Die nächste Versuchsreihe betraf die Frage, wie GH diese Fettleibigkeit umkehren könnte.

Versuche III und IV

Hintergrund

Vor dem Testen der Auswirkung unterschiedlicher GH-Behandlungsprogramme bei fettleibigen dw/dw-Ratten wurden die Auswirkungen dieser Behandlungen bei nichtfettleibigen dw/dw-Ratten gemessen. Bei der ersten Untersuchung wurden junge, weibliche dw/dw-Ratten eingesetzt, bei der zweiten ältere, gesch lechtsreife, männliche dw/dw-Ratten.

lunge weibliche Ratten

Bei jungen (6-9 Wochen alten), nicht-fettleibigen, weiblichen dw/dw-Ratten bestimmt das Muster der GH-Verabreichung die anabolische Reaktion auf GH. Fig.1 zeigt die Körpergewichtszunahme im Verlauf von 8 Tagen bei solchen Ratten (n = 5/Gruppe), die rekombinantes hGH der Marke Nutropin (5-mg Fläschen, mit 2 mg/min 18 mg/ml Mannitol, 0,68 mg/ml Glycin und 5 mM Phosphat, pH 7,4) bei einer Dosis von 240 µg/Tag subkutan in drei unterschiedlichen Verabreichungsprogrammen bzw hGH- Exzipient (den Mannitpuffer ohne hGH) erhielten. Bei einer bestimmten GH-Dosis übte GH, wenn es in zwei Injektionen pro Tag verabreicht wurde, den größten anabolischen Einfluß aus, wobei Dauerinfusionen die nächstwirksame Behandlung waren und tägliche Injektionen die geringste anabolische Wirkung hatten. Die IGF-1-Spiegel im Serum dieser jungen Ratten (Fig.2), das 24 Stunden (einmal-täglich Injektionen) oder 16 Stünden (zweimal-täglich Injektionen) nach der letzten GH-Injektion entnommen wurde, waren entweder niedriger (tägliche Injektion) oder höher (zweimal-täglich Injektion und Minipumpen-Infusion).
Daher erzielte man die größten Gewichtszunahmen (Fig.1) mit Infusionen oder zweimal-täglich Injektionen von GH, begleitet von Zunahmen des Serum-IGF-1.

Geschlechtsreife männliche Ratten

Viel ältere (30 Wochen alte) männliche dw/dw-Ratten wurden zum Testen der Auswirkung des hGH-Verabreichungsmusters auf die Körpergewichtszunahme und das Fettspeichergewicht herangezogen. Bei der Ratte tritt die Geschlechtsreife nach 5-6 Wochen ein, wobei das Körpergewicht nach etwa 15 Wochen seinen Höchststand erreicht; mit 30 Wochen hat eine Ratte demnach ihre Geschlechtsreife und ihre volle Körpergröße erlangt. Eine 30 Wochen alte männliche Ratte besitzt auch viel größere Körperfettspeicher als eine 8-10 Wochen alte Ratte. Aus diesem Grund erhielten drei Gruppen 30 Wochen alter männlicher dw/dw-Ratten hGH (hGH der Marke Nutropin , 5 mg-Fläschchen), entweder durch tägliche Injektionen oder durch Minipumpe, bzw. einen hGH-Exzipienten. Alle Ratten wurden mit einer herkömmlichen, pelletierten, fettarmen Getreidekost gefüttert. Es gab keine Anzeichen, daß die Behandlungen die Nahrungsaufnahme dieser jungen oder älteren nicht-fettleibigen Ratten beeinflussen.
Die Ergebnisse (Tabellen I und II) dieser älteren, mit getreidereicher Kost ernährten, nicht-fettleibigen, männlichen Ratten ähnelten jener der jungen Ratten, d.h. die Infusion von GH bewirkte eine größere Gewichtszunahme als tägliche Injektionen von GH (besonders zu frühen Zeitpunkten nach dem Beginn der Infusion). Die Fettspeicher (epididymal und retroperitoneal) waren durch die GH-Behandlungen nicht wesentlich betroffen. Die durchschnittlichen Speichergewichte wurden durch die GH-Behandlung numerisch erhöht, doch man konnte keine statistische Signifikanz feststellen. Siehe oben erwähnte US-A-5.126.324.
Bei geschlechtsreifen, nicht-fettleibigen Tieren, die eine fettarme Kost erhielten, bewirkte GH daher einen Gewichtszuwachs ohne Änderung der Fettgewebemasse (ob als Injektion oder Infusion), wobei beide Muster der GH-Verabreichung einen Gewichtszuwachs bewirkten und keine unterschiedliche Auswirkung auf die Körperzusammensetzung beobachtet wurde.
Außerdem zeigt Tabelle II, daß die GH-Infusionen im Vergleich zu GH-Injektionen die GHBP- und IGF-1-Konzentrationen im Serum erhöhten. Serumglukose war unverändert, doch die Cholesterin- und Triglyzeridkonzentrationen im Serum wurden im Vergleich zu den Vergleichs- oder GH-injizierten Tieren durch die GH-Infusion deutlich erhöht. TABELLE 1 Wachstumsparameter bei erwachsenen, männlichen dw/dw-Ratten: Behandelt mit Exzipiens, hGH (500 µg, subkutan) durch tägliche Injektion oder durch Infusion TABELLE II Blutparameter bei ausgewachsenen, männlichen dw/dw-Ratten: Behandelt mit Exzipiens, hGH (500 µg, subkutan) durch tägliche Injektion oder durch Infusion
Werte in beiden Tabellen sind Mittelwerte ± SD n = 7-8/Gruppe.
* p < 0,05 gegenüber hGH durch Injektion.

Einleitung

Bei den nächsten zwei Untersuchungen (Versuche III und IV) erhielten weibliche dw/dw-Ratten 8 Wochen lang fettreiche Kost. Scheinbar bewirkte das fettreiche Futter anfänglich eine rasche Gewichtszunahme; die damit ernährten Ratten wiesen dann eine stabile, jedoch fettleibige Körperzusammensetzung auf. Dieser Schluß wurde aus den relativ mäßigen Gewichtszunahmen zwischen 6 und 8 Wochen einer fettreichen Ernährung und nicht aus einer detaillierten Analyse der Körperzusammensetzung gezogen. Aufgrund dieser Versuche nimmt man an, daß die Untersuchung stabiler, fettleibiger Tiere (im Gegensatz zu Tieren in einer dynamischen Phase der Zunahme der Fettleibigkeit) den herkömmlichen menschlichen Zustand der über lange Zeit stabilen Fettleibigkeit widerspiegeln könnte (wo wahrscheinlich die lipolytische Wirkung der GH-Behandlung zum Tragen kommen würde).
Daher wurden in zwei aufeinanderfolgenden Untersuchungen Ratten bis zur Fettleibigkeit gemästet und dann mit hGH behandelt, um dessen Auswirkung auf den Körpergewichtszuwachs, die Organgewichte und die Fettspeichergröße zu analysieren Man untersuchte die Frage, ob das Muster der GH-Verabreichung ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der lipolytischen Aktivität von GH wäre.
Bei der ersten Untersuchung mit fettleibigen dw/dw-Ratten wurde GH als Infusion oder mittels einer bzw. zweier Injektionen pro Tag zugeführt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß bezüglich der anabolischen Wirkung von GH die lipolytischen Wirkungen der unterschiedlichen GH-Verabreichungsmuster eine ähnliche relative Wirksamkeit aufweisen würden, d.h. daß zwei GH-Injektionen pro Tag wirksamer sein würden als infundiertes GH, das wiederum wirksamer sein würde als eine GH-Injektion pro Tag. Ziel der zweiten Untersuchung war es, die erste zu wiederholen (Behandeln der Ratten mit GH und Beibehalten der fettreichen Kost) und die Auswirkungen gleichzeitiger "Diätisierung" (Rückkehr zu einer fettarmen Ernährung der Ratten) und GH-Behandlungsprogramme zu erforschen.

VERSUCH III

60 weibliche dw/dw-Ratten (105-150 g, 90 Tage alt) wurden in Gruppen untergebracht und 8 Wochen lang ad libitum mit fettreichem Futter und Wasser ernährt. Nach 8 Wochen wurden die schwersten bzw. fettleibigsten 40 Ratten (Durchschnittsgewicht 185 g) für die nachfolgenden Versuchsschritte ausgewählt. Die Ratten wurden anschließend anästhesiert (mit Ketamin/Xylazin, intraperitoneal) und zwei osmotische Alza -Minipumpen (2002, Pumpenrate 0,46 µl/h, Alza Corporation, Palo Alto, CA, USA) subkutan eingesetzt. Die Pumpen wurden entweder mit rekombinantem hGH (5 mg/Fläschchen, Marke Nutropin ) oder hGH-Exzipients gefüllt. Das hGH wurde auf 22,6 mg/ml verdünnt, sodaß 2 Pumpen 22 µl/Tag mal 22,6 µg/µl bzw. etwa 500 µg/Tag hGH zuführen würden. Für die hGH-Injektionen wurden Lösungen aus 5 mg/ml und 2,5 mg/ml hGH gebildet, sodaß 100 µl der 5 mg/ml-Lösung täglich (500 µg/Tag) oder 100 µl der 2,5 mg/ml-Lösung zweimal täglich (zweimal 250 µg, ergibt ebenfalls eine Dosis von 500 µg/Tag) injiziert werden konnten.
Die Behandlungen wurden 14 Tage lang fortgesetzt und die Ratten danach euthanisiert (n = 10/Gruppe):
1) Exzipientenpumpen, Exzipienteninjektionen
2) hGH-Pumpen, Exzipienteninjektionen
3) Exzipientenpumpen, eine hGH-Injektion (500 µg/Tag)
4) Exzipientenpumpen, zwei hGH-Injektionen (2x250 µg/Tag)

VERSUCH IV

Weibliche, 70 Tage alte dw/dw-Ratten wurden in Gruppen untergebracht und erhielten 7 Wochen lang ad libitum fettreiche Kost und Wasser. Eine getrennte Gruppe von 10 Ratten wurde weiterhin mit Getreidekost gefüttert. Nach 7 Wochen fettreicher Ernährung wurden die schwersten bzw. fettleibigsten 42 Ratten für die nachfolgenden Versuchsschritte ausgewählt. Die Ratten wurden dann anästhesiert (mit Ketamin/Xylazin, intraperitoneal) und eine osmotische Alza-Minipumpe (2ML2, Pumpenrate 5,12 µl/h, Alza Corporation, Palo Alto, CA, USA) subkutan eingesetzt. Die Pumpen wurden entweder mit rekombinantem hGH (5 mg/Fläschchen, Marke Nutropin) oder hGH-Exzipients gefüllt. Das hGH wurde auf 4,1 mg/ml verdünnt. Die 2ML2-Pumpe führte 5,12µl/h oder 5,12 mal 24 = 122,88 µl/Tag zu, sodaß mit hGH bei 4,1 µg/µl die Menge an verabreichtem hGH 122,88 mal 4,12 = etwa 500 µg/Tag betrug. Für die hGH-Injektionen wurde eine Lösung aus 5 mg/ml hGH gebildet, sodaß 100 µl der 5 mg/ml-Lösung täglich injiziert werden konnte (500 µg/Tag).
Die Behandlungen dauerten 14 Tage lang (n = 7/Gruppe):
7 Wochen lang fettreiches Futter und fortgesetzte fettreiche Ernährung
1) Exzipientenpumpen, Exzipienteninjektionen
2) hGH-Pumpen, Exzipienteninjektionen
3) Exzipientenpumpen, eine hGH-Injektion/Tag
7 Wochen lang fettreiches Futter und dann fettarme, getreidereiche Kost
4) Exzipientenpumpen, Exzipienteninjektionen
5) hGH-Pumpen Exzipienteninjektionen
6) Exzipientenpumpen, eine hGH-Injektion/Tag
7 Wochen lang Getreidefutter, fortgesetzte Getreidekost
7) Exzipientenpumpen, Exzipienteninjektionen
Die Euthanisierung und Autopsie erfolgten nach 14 Tagen, als die Körperorgane einschließlich der Fettpölster entfernt und abgewogen wurden und Blut zur Bestimmung der Metaboliten und Hormone entnommen wurde.

Ergebnisse der Versuche III und IV

Versuch III

Die Figuren 3 und 4 und die Tabelle III zeigen die Gewichtszunahme bei fettleibigen dw/dw-Ratten im Verlauf von 14 Tagen. Fig.3 zeigt die Zunahme im Lauf der Zeit; Fig.4 und Tabelle III zeigen die Endzunahme. Statistisch signifikante Effekte sind in Tabelle III veranschaulicht. Die mit Exzipienten behandelten Ratten hielten ihr Körpergewicht (-5 g); wenn die Ratten täglich mit GH-Injektionen behandelt wurden, nahmen sie zu (21 g). Wurde jedoch GH durch Infusion oder zweimal tägliche Injektionen zugeführt, traten Gewichtsverluste auf (-34 bzw. -24 g). Diese deutlichen Unterschiede der Körpergewichtsreaktion auf unterschiedliche GH-Verabreichungsmuster waren unerwartet. Vor allem die Gewichtsabnahme nach der GH-Behandlung war das Gegenteil der in Fig.1 und Tabelle I veranschaulichten erwarteten Ergebnisse.
Das Gewicht des retroperitonealen Fettpolsters der dw/dw-Ratten ist in Fig.5 und Tabelle III dargestellt. GH, das in täglichen Injektionen 14 Tage lang mit 500µg/Tag/Ratte zugeführt wurde, reduzierte das Körperfett weder im retroperitonealen, noch im mesenterischen oder im Eierstock/Gonaden-Fettspeicher signifikant, doch wenn die Ratten durch GH-Infusion oder zwei GH-Injektionen täglich behandelt wurden, trat in allen drei Speichern Fettverlust ein (Tabelle III) Dieser dramatische Verlust an Körperfett unterschied sich wiederum von den in Tabelle I für nicht-fettleibige Ratten dargestellten Ergebnissen. Daher zeigten die Fettspeicheränderungen die gleiche Tendenz wie die Körpergewichtsänderungen als Reaktion auf unterschiedliche GH-Verabreichungsmuster bei den fettleibigen dw/dw-Ratten.
Die IGF-1-, GHBP-, Glukose-, Cholesterin- und Triglyzeridspiegel im Serum von dw/dw- Ratten zum Zeitpunkt der Euthanisierung sind in Tabelle IV dargestellt. Die ICF-1- Spiegel im Serum fettleibiger Ratten wurden durch tägliche GH-Injektion erhöht blieben aber durch Infusionen oder zweimal tägliche GH-Injektionen unverändert. Serum-GHBP blieb durch die Behandlung unverändert. Im Vergleich zu täglichen GH- Injektionen übten GH-Infusionen oder zweimal tägliche GH-Injektionen eine unterschiedliche Wirkung auf die Glukose- und Triglyzeridkonzentrationen im Serum aus.
Es ist lehrreich, die GH-Behandlung bei nicht-fettleibigen dw/dw-Ratten (Tabellen I und II) mit der GH-Behandlung bei fettleibigen dw/dw-Ratten (Tabellen III und IV) zu vergleichen. Bei nicht-fettleibigen Ratten (Tabelle I), steigerte GH ungeachtet seines Zufuhrprogramms die Gewichtszunahme und hatte keinen Einfluß auf Körperfettspeicher. Bei fettleibigen Ratten (Tabelle III) beobachtete man entweder eine Gewichtszunahme oder eine Gewichtsabnahme. Bei nicht-fettleibigen Ratten erhöhte die hGH-Infusion die IGF-1, GHBP-, Cholesterin- und Triglyzeridwerte im Vergleich zur hGH-Injektion (Tabelle II). Doch bei fettleibigen Ratten nahmen die IGF-1- und Glukosewerte aufgrund der GH-Infusion im Vergleich zur GH-Injektion ab, und man konnte keinen Anstieg der GHBP-, Cholesterin- oder Triglyzeridwerte feststellen (Tabelle IV). Es geht deutlich hervor, daß unterschiedliche hGH-Verabreichungsprogramme auf viele Messungen bei nicht-fettleibigen und fettleibigen Ratten sehr unterschiedliche Auswirkungen haben. TABELLE III Wachstumsparameter bei fettleibigen, fettreich ernährten, weiblichen dw/dw-Ratten, behandelt mit: Exzipiens, hGH (500 µg, subkutan) entweder durch Infusion oder durch einmal oder zwei mal täglich erfolgende Injektion TABELLE IV Blutparameter bei fettleibigen, fettreich ernährten, weiblichen dw/dw-Ratten, behandelt mit: Exzipient, hGH (500 µg, subkutan) entweder durch Infusion oder durch einmal oder zweimal täglich erfolgende Injektion
Werte in beiden Tabellen sind Mittelwerte ± SD, n = 10/Gruppe.
* p < 0,05 gegenüber hGH durch Injektion.

Versuch IV

Fig.6 zeigt die kumulative Gewichtszunahme bei dw/dw-Ratten nach 14 Tagen. Die ersten drei Gruppen (fett/fett) erhielten während der gesamten Dauer fettreiches Futter; bei den zweiten drei Gruppen wechselte man am Beginn der GH-Behandlung von einer fettreichen zu einer getreidereichen Ernährung, die siebente Gruppen (Getreide/Getreide) wurde während der gesamten Dauer mit getreidereicher Kost gefüttert. GH wurde durch tägliche Injektion oder Minipumpen-Infusion 14 Tage lang mit 500 µg/Tag/Ratte verabreicht. Die Ratten, die während der gesamten Versuchsdauer fettreich oder getreidereich gefüttert wurden, hielten ihr Körpergewicht 14 Tage lang, doch wenn die fettreich ernährten Ratten auf eine Getreidekost umgestellt wurden, nahmen sie erwartungsgemäß ab. Wenn Ratten mit täglichen GH-Injektionen behandelt wurden, nahmen sie ungeachtet des Futters zu. Somit wurde der Effekt der Umstellung von einer fettreichen auf eine getreidereiche Kost ausgeschaltet, wenn GH durch Injektion verabreicht wurde. Bei Verabreichung von GH durch Infusion hingegen trat unabhängig vom Futter Gewichtsverlust ein.
Bei der fettreich/fettreich-Ernährung nahmen mit GH injizierte Ratten zu (14 ± 25 g), während GH-infundierte Ratten abnahmen (-44 ± 18 g, p < 0,001 gegenüber GH-injiziert). Bei der fettreich/getreidereich-Ernährung nahmen die mit GH injizierten Ratten wiederum zu (27 ± 17 g), während die GH-infundierten Ratten abnahmen (-21 ± 36 g, p < 0,01 gegenüber GH-injiziert). Wiederum gibt es deutliche Unterschiede bei der Körpergewichtsreaktion auf unterschiedliche GH-Verabreichungsmuster bei fettleibigen Ratten, selbst wenn sie "diätisiert" werden.
Fig.7 zeigt das Gewicht des retroperitonealen Fettpolsters bei dw/dw-Ratten. Die Fettleibigkeit der fettreich ernährten Ratten läßt sich durch Vergleichen der Balken 1 und 7 ermitteln; die Speicher der fettreich ernährten Ratten besitzen ein Durchschnittsgewicht von 5806 mg, jene der mit Getreide gefütterten Ratten 1137 mg (fünffacher Unterschied der Fettleibigkeit). Die Reaktionen auf die GH-Behandlung waren besonders überraschend. Durch tägliche Injektionen 14 Tage lang mit 500 µg/Tag/Ratte verabreichtes GH sorgte für keine deutliche Verringerung des Körperfetts, doch wenn Ratten mittels Infusion mit GH behandelt wurden, trat ungeachtet der Ernährung ein statistisch signifikanter Fettverlust ein.
Bei der fettreich/fettreich-Ernährung waren die Gewichte der retroperitonealen Pölster GH-injizierter Ratten (6110 ± 3400 mg) größer (p < 0,001) als die Pölstergewichte der fettreich/fettreich-ernährten-GH-infundierten Ratten (1542 ± 1168 mg). Bei der fettreich/getreidereich-Ernährung waren die retroperitonealen Pölstergewichte der mit GH-injizierter Ratten (4444 ± 2570 mg) wiederum größer (p < 0,05) als die Pölstergewichte der fettreich/getreidereich-ernährten-GH-infundierten Ratten (2040 ± 1075 mg). Was die Körpergewichtsänderungen betrifft, gab es deutliche Unterschiede der Körperfettreaktionen auf unterschiedliche GH-Verabreichungsmuster bei fettleibigen Ratten.

Schlußfolgerungen

Eine primäre Schlußfolgerung aus diesen Untersuchungen ist, daß die Wirkung von GH auf die Körperzusammensetzung überraschenderweise vom Muster der GH- Verabreichung abhängt. Diese Untersuchungen sagen voraus, daß beim Menschen nur das kontinuierliche Vorliegen von GH im Blut das Körperfett wirksam verringern kann, was z.B. durch häufige (zweimal tägliche oder noch häufigere) Injektionen von GH sowie durch Dauerinfusion oder andere Verfahren zur Verlängerung der Präsenz von GH im Blut, um bei einem fettleibigen Menschen einen Gewichtsverlust zu bewirken (einschließlich des Einkapselns von GH in einer Langzeitfreisetzungs-Formulierung, des Befestigens eines Polymers am GH, um Langzeitwirkung zu erzielen, oder des Verabreichens an ein Bindeprotein gebundenen GH), erreicht wird.
Die bei nicht-fettleibigen Ratten festgestellte starke Serum-IGF-1-Reaktion auf die GH- Infusion fehlte bei fettleibigen Ratten. Außerdem wurden die GHBP-Werte im Serum durch die GH-Infusion nicht gesteigert. Daher scheint bei kontinuierlicher Zufuhr von GH ein Grad an GH-Resistenz (unter Verwendung von IGF-1 und Serum-GHBP als Marker) bei fettleibigen Ratten vorhanden zu sein. Die lipolytische Reaktion auf GH zeigt jedoch, daß die GH-Resistenz nicht global ist.
Dem Wissensstand der Autoren zufolge sind diese Untersuchungen die ersten, bei denen Ratten mit erblich bedingtem GH-Mangel (GHD) mit fettreicher Kost ernährt wurden. Menschen mit GHD besitzen eine veränderte Körperzusammensetzung mit erhöhtem Körperfettanteil. Rudman, J. Amer. Geriatr. Soc., 33: 800-807 (1985). Die mit einer bestimmten Kost ernährte, fettleibige, weibliche (dw/dw)-Ratte bietet ein interessantes Modell des GH-Mangels, der in gewisser Weise dem GHD eines fettleibigen Menschen ähnelt. Man beachte, daß Menschen mit zunehmendem Lebensalter einen GH-Mangel entwickeln (siehe Rudman, [1985], weiter oben), weshalb man vernünftigerweise davon ausgehen kann, daß das hierin verwendete Nagetiermodell auch einem übergewichtigen Menschen mit GH-Mangel ähneln kann. Es ist unklar, ob die Fettleibigkeit beim Menschen mit einem relativen GH-Mangel (aufgrund reduzierter GH-Sekretion) oder einem relativen Mangel der GH-Reaktionsfähigkeit bzw. des Ansprechens auf GH (reduzierte GH-Rezeptoren oder GH-Rezeptor-Kupplung) zusammenhängt. Es wird hierin gezeigt, daß ein Tier mit einer genetisch bedingten Neigung zur Fettleibigkeit durch die richtige GH-Behandlung rasch abnehmen kann. Man kann erwarten, daß Tiere mit einer genetischen Ausstattung, die ihre Fettleibigkeit bewirkt, ebenfalls auf eine geeignete GH-Behandlung ansprechen würden, indem sie ihr Körperfett verlieren.

BEISPIEL II

Untersuchung der unterschiedlichen GH-Verabreichungsmuster bei der lipolytischen Gewichtsverringerung

Einleitung

Diese Untersuchung diente der Erforschung der Frage, ob unterschiedliche hGH- Verabreichungsmuster die Nahrungsaufnahme fettleibiger, weiblicher dw/dw-Ratten beeinflussen.

Verfahren

95 12 bis 16 Woche alte, weibliche dw/dw-Ratten (Simonsen Labs, Gilroy, CA, USA) bekamen fettreiches Futter, das aus einem Teil Crisco Pflanzenfett und 2 Teilen Purina -Nagetierfutter in Pulverform bestand. Die Ratten wurden insgesamt 11 Wochen lang bis zum Beginn dieser Untersuchung mit dieser fettreichen Kost ernährt. 54 Ratten wurden der in folgendem Beispiel III beschriebenen Untersuchung unterzogen. Von den verbleibenden Tieren wurden die 23 Ratten, deren Gewicht am meisten gestiegen war, für die vorliegende Untersuchung ausgewählt.
Am Tag -3 vor der Erstbehandlung (Tag 0) erhielten die Ratten Futter in Pulverform und wurden in NALGE-Brutkäfige gesperrt, um sie vor der Behandlung zu akklimatisieren. Magere Vergleichstiere wurden in diesem Versuch nicht verwendet. Am Tag 0 wurden die Ratten mittels Ketamin/Xylazin intraperitoneal anästhesiert (125:25 mg/kg), ein subkutaner Schnitt erfolgte dorsal, und eine Alza 2002 osmotische Minipumpe (Alza Corporation, Palo Alto, CA, USA) mit entweder hGH oder Exzipient wurde subkutan eingesetzt. Eine zweite Rattengruppe wurde entweder mit hGH oder Exzipient subkutan injiziert, auf ein Heizkissen gelegt, bis sie sich wieder bewegten, und dann in inren Stammkäfig gesperrt. Die Ratten wurden danach täglich injiziert, täglich gewogen und am Tag 14 euthanisiert.
Die Gruppen waren wie folgt:*
* Die Dosierungen sind tägliche Gesamtwerte.
Die verwendeten Reagentien waren hGH der Marke Nutroprin (5 mg-Fläschchen) und hGH-Exzipiens (der im hGH der Marke Nutroprin verwendete Puffer, äquivalent zu den 5 mg/ml).
Am Tag 15 wurden die Ratten mittels CO&sub2; euthanisiert und die Serum- und Fettspeicher zur weiteren Analyse und für die Naßgewichte gesammelt.

Ergebnisse

Körpergewicht

Alle Ratten wurden am Tag -3, als sie in Brutkäfige gesperrt wurden, auf Getreidekost umgestellt, was den Gewichtsverlust in den Vergleichstieren erklären könnte. Die Änderung des Körpergewichts (siehe Fig.8) trat einheitlich bis zu Tag 5 auf. Ab diesem Zeitpunkt begannen die mit GH injizierten Ratten zuzunehmen und die infundierten abzunehmen. Jene Tiergruppe, die GH-Infusionen erhielt, nahmen bis etwa Tag 9 ab und nahmen dann wieder zu. Am Tag 14 hatten die Vergleichsratten abgenommen (12 ± 11 g). Wiederum bewirkte die GH-Injektion eine Gewichtszunahme (18,8 ± 15 g), im Vergleich dazu nahmen die GH-infundierten Ratten ab (-5 ± 30 g, p < 0,05 gegenüber GH-Injektion).

Nahrungsaufnahme

Die Nahrungsaufnahme der Infusionsgruppe (siehe Fig.9) schien insofern mit den Körpergewichtsänderungen übereinzustimmen, als die Tiere drastisch weniger zu fressen schienen als die Injektions- und Vergleichsgruppe bis Tag 8. Am Tag 8 fraßen die Vergleichsratten 8,6 ± 3,1 g. Mit GH injizierte Ratten fraßen deutlich (p < 0,05) mehr Nahrung (9,4 ± 4,3 g) als GH-infundierte Ratten (2,6 ± 3,8 g). Ab diesem Zeitpunkt begannen die GH-infundierten Ratten zu fressen und bis zum Tag 15 fraßen sie ebenso große Mengen wie die Injektionsgruppe. Es bestand daher ein klarer Unterschied zwischen den zwei Programmen der hGH-Behandlung fettleibiger Ratten: durch Infusion zugeführtes hGH verringerte die Nahrungsaufnahme, während durch tägliche Injektion verabreichtes hGH die Nahrungsaufnahme zumeist steigerte.

Fettspeicher:

Die in Fig.10 gezeigten Fettspeichergewichte zeigen deutlich, daß der Gewichtsverlust aufgrund von GH-Infusionen wahrscheinlich auf einen Fettverlust zurückzuführen ist. Die Fettpolstergewichte der Vergleichsratten (2,9 ± 12 g) waren deutlich größer (p < 0,05) als jene der GH-infundierter Ratten (1,5 ± 1,2 g), aber nicht jene von GH- injizierten Ratten (2,6 ± 0,6).

Körperliche Erscheinung

Ratten, die hGH-Infusionen erhielten, nahmen rasch ab und zeigten einige Tage lang eine verringerte Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme, und es kam weniger oft zum Harnlassen und zu Darmentleerungen. Es schien, als ob einige Ratten stärker beeinflußt wurden als andere, doch es bestand keine offensichtliche Korrelation zwischen dem Grad der anfänglichen Fettleibigkeit bzw. des anfänglichen Körpergewichts und dem Grad der Verringerung des Appetits und des Gewichtsverlusts.

Schlußfolgerungen

Die Daten über das Körpergewicht zeigen, daß das Muster der hGH-Zufuhr den Körpergewichtszuwachs, die Fettspeicher und die Nahrungsaufnahme nachhaltig beeinflußt. Tägliche hGH-Injektionen bewirkten eine Gewichtszunahme, hGH- Infusionen einen Gewichtsverlust. Eine hGH-Infusion bewirkte weiters eine Verringerung der Nahrungsaufnahme, bis das Körpergewicht und/oder die Körperfettspeicher einen neuen Wert erreichten, bei dem die Nahrungsaufnahme wieder einsetzte. Die Menge der durch die Infusionstiere aufgenommenen Nahrung war statistisch bis zum Tag 8 geringer. Ab diesem Zeitpunkt begannen die GH-infundierten Tiere zu fressen, und bis zum Tag 15 entsprach ihre Nahrungsaufnahme jener der täglichen Injektionsgruppe und unterschied sich statistisch nicht mehr von jener der Vergleichsgruppe. Die gleiche Entwicklung stellte man bei den Daten über die Gewichtszunahme fest.
Im Gegensatz zur verringerten Nahrungsaufnahme bei den Ratten, die GH-Infusionen erhielten, zeigten die mit GH injizierten Ratten keine Änderung der Nahrungsaufnahme gegenüber den mit Exzipient behandelten Vergleichsratten. Wiederum wurden die Fettspeicher durch die GH-Infusion, jedoch nicht durch die GH-Injektion verringert. Zusammenfassend gesagt bewirkten GH-Infusionen Gewichtsverlust, Anorexie und einen Verlust des Körperfetts, während (bei der gleichen GH-Dosis) tägliche GH- Injektionen das Körpergewicht steigerten und die Nahrungsaufnahme bzw. die Körperfettspeicher nicht beeinflußten.

BEISPIEL III

Verwendung von GH, IGF-1 oder GH und IGF-1 zur Behandlung fettleibiger Ratten

Einleitung

Zweck dieser Untersuchung war die Bestätigung der Wirkung unterschiedlicher GH- Verabreichungsmuster und die Untersuchung ihrer Dosisabhängigkeit. Außerdem sollte diese Untersuchung die Wirkung der Verabreichung von IGF-1 alleine oder seine Verabreichung gemeinsam mit GH auf die Zusammensetzung des Rumpfes, das Gewicht des ganzen Körpers und einzelner Organe, die Serumchemie und die Spiegel endokriner Hormone bei fettleibigen dw/dw-Ratten erforschen.

Verfahren

Dosierungslösungen

Das hierin bereits definierte PEG7-hGH wurde wie folgt hergestellt. Methoxypoly(ethylenglykol) wurde durch Titration mit Naphthal in-Natrium in den entsprechenden Ethylester umgewandelt, um das entsprechende Alkoxid zu bilden, gefolgt von der Reaktion mit Ethylbromacetat. Der Ester wurde mit Natriumhydroxid und Wasser behandelt, um die entsprechende Carbonsäure, α-Carboxymethyl-ω-carboxymethoxypoly(oxyethylen) zu ergeben. Dieses Verfahren ist ausführlich bei Bückmann et al., s.o., beschrieben.
Die Reinigung der Carbonsäure erfolgte durch Auflösung in warmem Ethanol (20 ml/g) und Kristallisation bei 4ºC. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert, dreimal mit Ether gewaschen und vakuumgetrocknet. Der Funktionalisierungsgrad wurde durch Titration einer Probe in einer wäßrigen Lösung mit 0,1 N KOH-Lösung und Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Die Dünnschicht-Chromatografie-Bedingungen waren eine Elution mit 3:17-Methanol/CH&sub2;Cl&sub2; und Visualisierung mit Ioddampf. Die Verbindung zeigt einen Streifen, Rf 0 bis 0,3.
Die Säure (15 g, 3 mMol) wurde in Ethylacetat (150 ml) durch Erwärmen aufgelöst, N- Hydroxysuccinimid (0,86 g, 7,5 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,55 g, 7,5 mMol) wurden zugegeben und die Lösung über Nacht (18 Stunden lang) bei 30ºC gerührt. Das Produkt fällt gelegentlich während der Reaktion aus, wobei in diesem Fall die dicke weiße Suspension erwärmt wird, bis nur das Flockungsmittel Dicyclohexylharnstoff nicht in Lösung geht. Das Reaktionsprodukt wurde durch Celite -Filtrationsmaterial filtriert, um den Harnstoff zu entfernen, und die Lösung bei 4ºC bis zum folgenden Morgen stehengelassen, und dann als das Produkt durch Filtration gesammelt, mit kaltem Ethylacetat dreimal gewaschen und unter Vakuum getrocknet wurde, um ω-Methoxypoly(oxyethylen)oxyethyl-N-hydroxysuccinimid (14,7 g, 98%) zu ergeben.
Das resultierende NHS-PEG wurde in einem 30-fachen molaren Überschuß bezogen auf hGH einer Lösung von 12 mg/ml hGH in 50 mM Natriumboratpuffer bei pH 8,5 zugegeben und die Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine Q Sepharose-Säule (Pharmacia) in 30 mM Tris- Puffer, pH 7,8, aufgebracht und mit einem NaCl-Gradienten eluiert. Dann wurde es auf eine Phenyl Toyopearl 650S-Säule aufgebracht, die mit 0,3 M Natriumcitratpuffer, pH 7,8, äquilibriert war. Das PEGylierte hGH wurde mit einem reversen Salzgradienten von 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,8, bis 0 M Natriumcitrat aus der Säule eluiert, und die PEGyliertes hGH der geeigneten Größe enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt. Der Puffer des Pools wurde dann mittels einer G25-Entsalzungssäule durch einen Puffer ersetzt, der 0,25 M Mannit, 0,02 M Glycin und 5 mM Natriumphosphat, pH 7,4, enthielt, um eine Konzentration von 1,75 mg/ml zu erreichen. Das PEG7-hGH wurde im Mannitpuffer weiter verdünnt, um für die Verwendung bei den Ratten der vorliegenden Untersuchung zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zu gelangen.
Das rekombinante menschliche GH war hGH der Marke Nutropin in einem 5 mg- Fläschchen. Rekombinanter, menschlicher IGF-1 [im Handel bei KabiGen AB, Stockholm erhältlich, (spezifische Aktivität > 14.000 U/mg durch Radiorezeptorassay mittels Plazentamembranen) oder für klinische Untersuchungen bei Genentech, Inc., South San Francisco erhältlich] wurde in allen in den Beispielen ausgeführten IGF-1- Experimenten verwendet. Für dieses Beispiel wurde IGF-1 mit 18 mg/ml in 10 mM Citratpuffer und 126 mM NaCl, pH 6,0, aufgelöst, während für hGH der Exzipient 5 mM Phosphatpuffer war.

Tiere

95 12 bis 16 Wochen alte, weibliche dw/dw-Ratten (Simonsen Labs, Gilroy, CA, USA) wurden mit fettreicher Kost gefüttert, die aus einem Teil Crisco -Pflanzenfett und 2 Teilen -Nagetierfutter in Pulverform bestand. Zehn altersmäßig übereinstimmende Ratten wurden auf der fettarmen Nagetierfutter-Kost belassen, um als magere Vergleichstiere zu dienen. Alle Ratten erhielten während der gesamten Versuchsdauer ihre jeweilige Kost. Die Tiere wurden wöchentlich gewogen. Nach 8 Wochen wurden 54 Tiere ausgewählt, die am meisten zugenommen hatten. Versuchsanordnung:*
mager 10
* Die verabreichten Dosen sind in µg/Tag.
Am Tag -1 wurden die Ratten wahllos in 9 Sechsergruppen aufgeteilt. Am Tag 0 wurden die fettleibigen Ratten mittels Ketamin/Xylazin intraperitoneal anästhesiert (125: 25 mg/kg). Der dorsal-skapulare Bereich wurde geklammert und mittels eines 70% Isopropylalkohol-Tupfers auf den chirurgischen Eingriff vorbereitet. Ein kleiner subkutaner Einschnitt erfolgte dorsal, und zwei osmotische Alza 2002-Minipumpen, die entweder hGH, IGF-1 oder Exzipient enthielten, wurden subkutan eingesetzt. Die Wunde wurde mittels 9 mm-Wundklemmen geschlossen.
Die Tiere wurden subkutan entweder mit hGH oder Exzipient injiziert, auf ein Heizkissen gelegt, bis sie sich wieder bewegten, und dann in ihrem Stammkäfig eingesperrt. Die Ratten wurden täglich injiziert und gewogen und am Tag 14 euthanisiert. Die mageren Vergleichsratten wurden anästhesiert und Scheinoperationen durchgeführt, jedoch keine Minipumpen eingesetzt oder Injektionen verabreicht.
Am Tag 14 wurden alle Ratten mittels CO&sub2; euthanisiert und Serum, Milz, Niere, Leber, Herz, die Eierstock-Fettpölster und die retroperitonealen Fettpölster und die Schienbeine entnommen. Serum, Leber, Eierstock-Fettpölster, Haut und Rumpf wurden aufgehoben und eingefroren. Herz und Schienbein wurden für die Histologie in Formalin eingelegt. Die Serumchemie wurde mittels eines klinischen Chemieanalysators von Monarch gemessen. Seruminsulin wurde durch einen Radioimmunassay gemessen. Die IGF-1- Gesamtmenge im Serum wurde ebenfalls durch Radioimmunassay gemessen, nachdem die Proben mittels Säure/Ethanol extrahiert wurden.

Ergebnisse

Körpergewicht:

Die fettreich ernährten Ratten nahmen während der ersten 4 Wochen der fettreichen Ernährung rasch zu, doch dann erreichte der Gewichtszuwachs zumeist einen Plateauwert. Nach 8 Wochen feureicher Kost nahmen die dw/dw-Ratten erheblich zu, sodaß 54 Tiere ausgewählt werden konnten, die 42-83% mehr als ihr Anfangsgewicht (durchschnittliche 59%) aufwiesen - im Vergleich zu 18-32% (durchschnittlich 23%) bei den mit getreidereicher Kost gefütterten Ratten.
Fig.11 zeigt die mittleren Gewichtszuwächse der 10 Rattengruppen am Tag 14. Die mit Exzipienten behandelten Ratten behielten ihren fettleibigen Zustand bei, wobei man weder einen Gewichtszuwachs noch eine Gewichtsabnahme feststellen konnte (1,5 ± 9,0 g). Nach 14-tägiger Behandlung zeigte die Kombination aus hGH-Infusion und IGF-1 durchwegs eine starke katabolische Wirkung, wobei der durchschnittliche Gewichtsverlust im Verlauf von 14 Tagen 30,2 ± 10,0 g betrug, ein Wert, der deutlich größer als (p < 0,05) bzw. mehr als zweimal so hoch war wie in der Gruppe, die nur die 300 µghGH-Infusion allein erhielt (-23,8 ± 31,1 g). IGF-1 übte keinen großen Einfluß auf die Gewichtszunahme aus, obwohl nach 14 Tagen eine Gewichtszunahme (10,0 ± 4,5 g) und keine Gewichtsabnahme festzustellen war. Wiederum ergaben Infusionen der geringen hGH-Dosis von 100 µg/Tag eine Gewichtszunahme, die sich nicht wesentlich von den Vergleichstieren unterschied, jedoch klein (13,2 ± 16,1 g) im Vergleich zur großen Gewichtszunahme aufgrund der 100 µg/Tag an durch Injektion verabreichtem hGH (30,1 ± 18,1 g) war. Die zwei Dosen des injizierten hGH unterschieden sich nicht voneinander, zeigten aber eine anabolische Wirkung, die sich statistisch von den Vergleichstieren unterschied (p < 0,05). Am Tag 14 war die Gewichtszunahme der Ratten, die tägliche Injektionen mit 100 µg/Tag PEG7-hGH erhielten (2,6 ± 20 g), deutlich weniger (p < 0,05) als jener der täglich mit hGH injizierten Ratten.
Fig.12 zeigt die Gewichtszunahmen im Verlauf der Zeit für einige der Gruppen. Diese Figur zeigt die drastischen Unterschiede zwischen den zwei hGH-Programmen und zwischen der Wirkung von GH alleine und der GH-IGF-1-Kombination.

Organgewichte

A. Herzgewicht: Es bestand kein signifikanter Unterschied unter den Gruppen bezüglich des absoluten Herzgewichts oder des als Prozentsatz des Körpergewichts ausgedrückten Herzgewichts (d.h. des relativen Gewichts).
B. Nierengewicht: Hochdosierte hGH-Infusionen sorgten zumeist für eine Zunahme des absoluten Nierengewichts und für eine drastische Erhöhung des relativen Nierengewichts im Vergleich zu den Vergleichstieren oder den durch GH-Injektion behandelten Tieren. Mit IGF-1 behandelte Ratten besaßen wesentlich größere Nieren als die fettleibigen Vergleichstiere, doch statistisch unterschieden sie sich nicht von den mageren Vergleichstieren. In den hGH-Infusionsgruppen bestand eine dosisabhängige Wirkung auf die relative Nierengröße. PEG7-hGH übte keinen wesentlichen Einfluß auf die Nierengröße aus.
C. Lebergewicht: Ratten, die 300 µg-Infusionen hGH erhielten, besaßen eine beträchtlich größere Leber relativ zum Körpergewicht als die Vergleichstiere. IGF-1 hatte keinen statistischen Effekt im Vergleich zu den Vergleichstieren und keine additive Wirkung in Kombination mit hGH im Vergleich zur hochdosierten hGH- Infusionsgruppe. Die hGH-Injektion übte auf die relative Lebergröße keinen signifikanten Einfluß aus.
D. Milzgewicht: Die Milzgewichte der Ratten, die nur IGF-1 erhielten, waren deutlich größe als bei jenen, die IGF-1 in Kombination mit hGH-Infusionen erhielten. Dies legt nahe, daß die Milzwachstumsreaktion auf IGF-1 durch hGH-Infusion blockiert wurde.
Diese Daten waren unerwartet, da man vorher noch nie beobachten konnte, wie auffällig die Wirkung von IGF-1 durch hGH-Infusionen blockiert wird.
E. Fettpölstergewicht: Das absolute Gewicht der retroperitonealen Fettpölster (Fig.13) und das relative Gewicht (Fig.14) sowie das absolute Gewicht der Gonaden-Fettpölster (Fig.15) sind dargestellt. Jene Ratten, die 300 µg hGH mittels Infusion erhielten, nahmen sehr stark ab und hatten signifikant (p < 0,01) kleinere Fettspeicher als die Vergleichstiere. Die Wirkung der 100 µg hGH-Infusion auf die Fettmasse war geringer, und die Fettpölster wogen deutlich mehr (p < 0,01) als die Fettpölster der hochdosierten Infusionsgruppe. Im Gegensatz dazu wiesen Ratten, die hGH-Injektionen in einer Dosis von entweder 100 oder 300 µg/Tag erhielten, keine Änderung des absoluten Gewichts der retroperitonealen oder Gonaden-Speicher auf. IGF-1 alleine und PEG7-hGH übten keinen wesentlichen Einfluß auf die Fettpolstermasse aus.
Bei Tieren mit IGF-1-Infusion in Kombination mit hGH-Injektionen war ein deutlich (p < 0,05) größerer Verlust an Fettpolstermasse festzustellen als bei den Vergleichstieren, wobei die stärkste Wirkung auf die Körperzusammensetzung jene der kombinierten GH- und IGF-1-Infusionen war. Bei dieser letzteren Gruppe war die Fettmasse drastisch auf die der mit Getreidekost gefütterten Ratten verringert und im Vergleich zur Gruppe, die nur GH-Infusionen erhielt, ebenfalls geringer (p < 0,05).

F. Serumchemie:

1. Ratten-Insulin: Durch ANOVA zeigte sich, daß die Insulin-Spiegel im allgemein nicht statistisch unterschiedlich waren. Siehe Fig.16. Man beachte aber, daß bei der Gruppe der Kombinationsbehandlung aus hGH-Infusion und IGF-1 die meisten Tiere Insulin- Konzentrationen von ≤ 0,2 ng/ml aufwiesen, der niedrigste nachweisbare Wert für diesen Assay. Es schien daher, daß IGF-1 die Insulin-Spiegel verringerte und daß GH- Infusionen plus IGF-1-Infusionen die Insulin-Spiegel noch weiter verringerten.
2. Serum-IGF-1: Die IGF-1-Konzentrationen im Serum fettleibiger Ratten wurden durch GH-Infusionen nicht beeinflußt (dies bestätigte die Taten in Tabelle IV). Siehe Fig.17. Erwartungsgemäß erhöhten IGF-1-Infusionen die IGF-1-Konzentrationen im Serum. Diese Konzentrationen wurden jedoch durch gemeinsame GH-Verabreichung verringert.
3. Glukose: Die Glukose-Spiegel waren in der hGH/IGF-1-Infusionsgruppe drastisch niedriger (59,6 mg/dl ± 6,3) als in der hochdosierten hGH-Infusionsgruppe (98,2 mg/dl ± 48,9). Siehe Fig.18. Auf der Grundlage der Daten aus Beispiel II erreichte die Nahrungsaufnahme in der hGH-Infusiongruppe bis zum Tag 14 wieder einen Normalwert, doch die Glukose-Spiegel waren niedrig. PEG7-hGH übte keinen Einfluß auf Serum-Glukose aus.
4. Triglyzeride: Die Serum-Triglyzeride waren deutlich niedriger, wenn hGH und IGF-1 in Kombination infundiert wurden. Infusionen von IGF-1 oder hGH alleine übten keinen signifikanten Einfluß auf die Serum-Triglyzeride aus. Tägliche hGH-Injektionen sorgten für eine beträchtliche Erhöhung der Serum-Triglyzeride; wenn jedoch IGF-1 in Kombination mit hGH-Injektionen infundiert wurde, war kein statistischer Unterschied zwischen den Serum-Triglyzeriden von jenen der Vergleichstiere feststellbar. Siehe Fig. 18. PEG7-hGH übte keinen Einfluß auf Serum-Triglyzeride aus.
5. Cholesterin: Es bestanden keine signifikanten Unterschiede unter den Gruppen. Siehe Fig.18.
6. Harnstoff-Stickstoff: Die fettleibigen Ratten weisen niedrigere Harnstoff-Stickstoff (BUN) Blutwerte auf. Siehe Fig.19. Diese Ratten erhielten fettreiches Futter - die dünnen Ratten fraßen relativ mehr Protein als Kalorien. Die IGF-1 erhaltenden Gruppen besitzen geringere mittlere BUN-Werte als die Gruppen, die hGH alleine erhalten.
7. Kalzium: Kalzium-Werte wurden durch hGH-Infusion und durch PEG7-hGH erhöht, sanken aber, wenn IGF-1 alleine oder in Kombination mit hGH verabreicht wurde. Siehe Fig.19.
8. Phosphor: Die Phosphor-Werte waren in allen fettleibigen Ratten hoch. Die mageren Vergleichstiere wiesen deutlich geringere Werte auf. Siehe Fig.19.

Schlußfolgerungen

Die Ergebnisse aus diesen Untersuchungen bestätigen die Untersuchungen der Beispiele I und II insofern, als die kontinuierliche hGH-Verabreichung an eine bestimmte Kost fressende fettleibige Tiere lipolytisch wirkt und einen drastischen Verlust an Körpergewicht hervorruft. Die gleiche GH-Dosis hingegen, die durch tägliche Injektionen verabreicht wird, erhöht das Körpergewicht und besitzt keine lipolytische Netto-Aktivität. Diese Untersuchung zeigt, daß der Effekt dosisabhängig ist.
Weiters wurde IGF-1 in Kombination mit hGH verwendet, um zu bestimmen, ob IGF-1 die lipolytische Wirkung der hGH-Infusionen antagonisiert. Überraschenderweise stellte man fest, daß die Kombination als lipolytische Behandlung sogar noch wirksamer war als GH alleine, besonders im Fall von GH-Infusionen.
Bei nicht-fettleibigen Tieren haben IGF-1-Infusionen und GH-Injektionen eine additive anabolische Wirkung, doch IGF-1 kombiniert mit GH-Infusionen übt keine additive anabolische Wirkung aus. Siehe obige US-A-5.126.324. Man konnte daher nicht erwarten, daß die Kombination von IGF-1 und GH (IGF-1-Infusionen und GH-Infusionen oder GH-Injektionen) eine lipolytische Wirkung bei fettleibigen Säugetieren hervorruft Besonders überraschend war der drastische Synergismus der GH-Infusion und der IGF-1- Infusion bezüglich Gewichtsabnahme und Fettgewebemasse bei fettleibigen Ratten.
Beispiel I zeigte, daß fettleibige dw/dw-Ratten insulin-resistent wurden. GH gilt als "diabetogen", d.h. es verursacht Insulin-Resistenz. Daher steht die Verabreichung von GH (insbesondere mit IGF-1) an ein fettleibiges Tier, worin Glukose-Blutwerte sowie Insulin-Werte sinken (und nicht steigen), im Gegensatz zum vorhergesagten Ergebnis.
Anhand dieser überraschenden Ergebnisse könnte man annehmen, daß die Verringerung des Körperfetts auf nahezu die Werte vor der Fettleibigkeit die Insulin-Empfindlichkeit wiederherstellt, sodaß es bei fettleibigen Menschen, die einer Insulin-Behandlung unterzogen werden, die geeignete, hierin beschriebene Verabreichung von GH und IGF-1 ermöglichen würde, die Insulin-Verabreichung zu reduzieren oder abzubrechen. Man kann daher erwarten, daß eine Therapie mit GH und IGF-1 der Diabetes vom Typ II bei fettleibigen menschlichen Patienten vorbeugt oder deren Fortschreiten verhindert.
Man kann davon ausgehen, daß die hierin angeführten Ratten-Daten auf Pferde, Kühe und andere Säugetiere extrapoliert werden können, wobei das Körpergewicht des Säugetiers in Einklang mit etablierten veterinärmedizinischen und klinischen Verfahren entsprechend berücksichtigt wird. Unter Verwendung von Standard-Arbeitsvorschriften und -verfahren ist der Veterinärmediziner oder Kliniker in der Lage, die Dosierungen, den Zeitplan und die Verabreichungsart von IGF-1 und GH und ihrer Varianten so einzustellen, daß sie maximale Effekte beim gerade behandelten Säugetier erzielen. Man nimmt an, daß auch Menschen auf diese Weise ansprechen und sie tun das auch, wobei ihre Reaktionen im nachstehenden Beispiel IV beschrieben sind.

BEISPIEL IV

Verwendung von GH. IGF-1 oder GH und IGF-1 zur Behandlung menschlicher Patienten

Klinische Daten wurden von männlichen AIDS-Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 39 Jahren erhalten und Vergleiche zwischen Kontrollgruppe, IGF-1 alleine, GH alleine und GH und IGF-1 gemeinsam angestellt. In diesen Untersuchungen wurde IGF-1 (hergestellt und formuliert wie in Beispiel III) bei einer Dosis von 5 mg zweimal täglich (etwa 80 µg/kg zweimal täglich unter Annahme eines durchschnittlichen Körpergewichts von 60 kg) subkutan verabreicht. GH (hergestellt und formuliert wie in Beispiel 1) wurde bei einer Dosis von 1,4 mg/Tag (etwa 23 µg/kg/Tag unter Annahme eines durchschnittlichen Körpergewichts von 60 kg) subkutan an die AIDS-Patienten verabreicht. Die Patienten wurden gemäß dieser Arbeitsvorschrift 6 oder 12 Wochen lang behandelt.
Nach der Behandlung wurde die Änderung der Fettmasse (kg) vom Ausgangswert bei jedem Patienten mittels Dualenergie-Röntgenstrahlen-Absorptiometrie (DEXA), eines bewährten Verfahrens zur Messung der Körperzusammensetzung des Menschen, ermittelt. Anfangs gab es 15 Patienten pro Gruppe, doch die Anzahl der Patienten, die nach 12 Wochen noch behandelt wurden, sank auf 9 (Vergleichsgruppe), 6 (GH- Gruppe), 4 (IGF-1-Gruppe) und 6 (GH- und IGF-1-Gruppe).
Diese Untersuchung zeigte, daß nach 12-wöchiger Behandlung die Kombination von IGF-1 und GH eine durchschnittliche Zunahme der mageren Körpermasse von etwa 77 Pfund und einen damit einhergehenden Fettverlust erzielte. Im extremsten Fall nahm der Patient 3 kg an magerer Körpermasse zu, doch verlor 1 kg Fett. IGF-1 zeigte keine Veränderung gegenüber Plazebo, während GH alleine eine geringe Zunahme der mageren Körpermasse ohne Fettverlust verursachte. Die durch die Balkengraphen in Fig.20 und durch die Rohdaten der Tabelle V dargestellten Ergebnisse zeigen, daß jene die die Kombinationsbehandlung erhielten, den bei weitem größten Verlust an Fettmasse aufwiesen, wobei dies ein Hinweis auf einen synergistischen Einfluß auf den Fettverlust ist, wenn hGH und IGF-1 gemeinsam 12 Wochen lang verabreicht werden. Eine ähnliche Wirkung konnte man nach 6-wöchiger medikamentöser Therapie beobachten. TABELLE V Fettmasse na;ch 12-wöchiger Hormonbehandlung
* SD bedeutet Standarabweichung

Claims

1. Verwendung von IGF-1 und Wachstumshormon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Fettleibigkeit.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Verabreichung an einen Menschen.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Mensch Diabetes vom Typ II hat und der Bedarf des Menschen an Insulin nach der Verabreichung von Wachstumshormon und IGF-1 verringert ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, worin das Wachstumshormon menschliches, reifes Nativsequenz-Wachstumshormon ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 2, 3 und 4, worin der IGF-1 menschlicher, reifer Nativsequenz-IGF-1 ist.

6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verabreichung von IGF-1 durch Dauerinfusion erfolgt.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der IGF-1 in einer Formulierung mit Langzeitfreisetzung vorliegt.

8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verabreichung von Wachstumshormon durch Injektion erfolgt.

9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Wachstumshormon solcherart verabreicht wird, daß seine therapeutisch wirksame Konzentration im Blut des Säugetiers während der gesamten Verabreichungsdauer kontinuierlich aufrechterhalten wird.

10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Wachstumshormon über bis zu zehn Aminosäurereste kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer, ausgewählt aus Polyethylenglykolhomopolymeren und Polyoxyethylenpolyolen, konjugiert ist.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Wachstumshormon über 2 bis 8 Lysinreste auf dem Wachstumshormon kovalent mit Polyethylenglykol konjugiert ist.

12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Wachstumshormon mit einem Wachstumshormon-Bindeprotein verabreicht wird.

13. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament eine wirksame Menge an Wachstumshormon von zumindest 0,01 mg/kg/Tag bietet.

14. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament eine wirksame Menge an IGF-1 von zumindest 0,01 mg/kg/Tag bietet.

15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Wachstumshormon und IGF-1 getrennt verabreicht werden.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das Wachstumshormon und IGF-1 als eine einzelne Formulierung verabreicht werden.

17. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der IGF-1 mit einem IGF-1-Bindeprotein verabreicht wird.