DE69033891T2

DE69033891T2 - NANBV-Diagnostika: Polynukleotide, geeignet für Reihenuntersuchungen auf Hepatitis C-Virus

Info

Publication number: DE69033891T2
Application number: DE69033891T
Authority: DE
Inventors: Qui-Lim Choo; Jang Han; Michael Houghton; George Kuo; Michael S. Urdea; Amy J. Weiner
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2010-05-19
Also published as: CA2017157C; NO914517D0; JPH10113176A; RO113059B1; FI105279B; JP3701754B2; AU638719B2; NO914517L; HUT59964A; EP0398748B1; EP0398748A3; JPH05500155A; BG60348B2; JP2656996B2; GEP20002164B; WO1990014436A1; ATE211772T1; DE69033891D1; HU904754D0; LV10729B

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Materialien und Verfahren für die Bekämpfung der Ausbreitung von nicht-A-, nicht-B-Hepatitisvirus (NANBV)-Infektion. Spezifischer betrifft sie ein ätiologisches Agens von nicht-A-, nicht-B-Hepatitis (NANBH), Hepatitis C-Virus (HCV) und Polynucleotide und Analoga davon, die bei Tests für den Nachweis von HCV in biologischen Proben von Nutzen sind.

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Zitierte Patente

U.S.-Patent Nr. 4,341,761
U.S.-Patent Nr. 4,399,121
U.S.-Patent Nr. 4,427,783
U.S.-Patent Nr. 4,444,887
U.S.-Patent Nr. 4,466,917
U.S.-Patent Nr. 4,472,500
U.S.-Patent Nr. 4,491,632
U.S.-Patent Nr. 4,493,890
U.S.-Patent Nr. 4,683,202
U.S.-Patent Nr. 4,458,066
U.S.-Patent Nr. 4,868,1 OS

Hintergrundwissen

Nicht-A-, nicht-B-Hepatitis (NANBH) ist eine übertragbare Krankheit oder Familie an Krankheiten, von der man annimmt, daß sie Virus-induziert sind und die von anderen Formen Virusassoziierter Leberkrankheiten unterscheidbar sind, einschließlich der von den bekannten Hepatitisviren verursachten, d. h. Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und Delta-Hepatitisvirus (HDV) ebenso wie die Hepatitis, die vom Cytomegalovinis (VMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) verursacht wird. NANBH wurde zuerst in Individuen nach einer Transfusion identifiziert. Die Übertragung vom Menschen auf den Schimpansen und die serielle Passage in Schimpansen stellte den Nachweis bereit, daß NANBH auf ein übertragbares infektiöses Mittel/übertragbare infektiöse Mittel zurückzuführen ist.
Epidemiologische Befunde legen nahe, daß es drei Arten an NANBH geben könnte:
durch Wasser übertragene, epidemische Art; die Blut- oder Nadelassoziierte Art; und die sporadisch auftretende (von der Gemeinschaft erworbene) Art. Die Anzahl der Mittel, die das verursachende Agens von NANBH sein könnten, ist jedoch unbekannt.
Es gibt eine Reihe von möglichen NANBV. Vgl. zum Beispiel die Übersichtsartikel von Prince (1983), Feinstone und Hoofnagle (1984) und Overby (1985, 1986, 1987) und den Artikel von Iwarson (1987). Es gibt jedoch keinen Beweis, daß irgendeiner dieser Kandidaten das ätiologische Agens für NANBH darstellt.
Der Bedarf an empfindlichen, spezifischen Verfahren zur Durchmusterung und Identifizierung von Trägern von NANBV und von mit NANBV kontaminiertem Blut oder von mit NANBV kontaminierten Blutprodukten ist beträchtlich. Hepatitis nach der Transfusion (PTH) tritt bei etwa 10% der Transfusionspatienten auf und NANBH ist für bis zu 90% dieser Fälle verantwortlich. Das Hauptproblem bei dieser Krankheit ist die häufige Progression zu einem chronischen Leberschaden (25-55%).
Die Patientenversorgung ebenso wie die Verhinderung der Übertragung von NANBH durch Blut und Blutprodukte oder durch engen persönlichen Kontakt erfordern zuverlässige Mittel für die Durchmusterung, Diagnose und Prognose zum Nachweis von Nucleinsäuren, Antigenen und Antikörpern, die mit NANBV in Zusammenhang stehen.
Verfahren zum Nachweis von spezifischen Polynucleotiden mittels Hybridisierungstests sind im Stand der Technik bekannt. Vgl. zum Beispiel Matthews und Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169: 1; Landegren et al., (1988) Science 242: 229; und Mittlin (1989), Clinical Chem. 35: 1819. U.S. -Patent Nr. 4,868,105, erteilt am 9. Sept. 1989 und in der E.P.A.-Offenlegungsschrift Nr. 225,807 (offengelegt am 16. Juni 1987).
Der Anmelder entdeckte ein neues Virus, das Hepatitis-C-Virus (HCV), von dem nachgewiesen wurde, daß es das wichtigste ätiologische Agens von Blut-getragener NANBH (BB-NANBH) ist. Die ursprüngliche Arbeit des Anmelders, die die partielle genomische Sequenz eines Prototyp-HCV-Isolats, CDC/HCV1 (auch HCV1 genannt), einschließt, ist beschrieben in der E.P.A.-Offenlegungsschrift Nr. 318,216 (offengelegt am 31. Mai 1989) und in der PCT Veröffentl.-Nr. WO 89/04669 (offengelegt am 1. Juni 1989). Die Offenbarungen dieser Patentanmeldungen ebenso wie die entsprechenden nationalen Patentanmeldungen werden durch Bezugnahme hier eingeschlossen. Diese Anmeldungen lehren unter anderem rekombinanten DNA-Verfahren zur Clonierung von HCV-Sequenzen, diagnostische Verfahren mit HCV-Sonden, anti-HCV-Antikörper und Verfahren zur Isolierung neuer HCV- Sequenzen.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf HCV-Sequenzen, die in der E.P.A.- Offenlegungsschrift Nr. 318,216 und in der PCT Veröffentl.-Nr. WO 89/04669 beschrieben sind, ebenso wie auf anderen HCV-Sequenzen, die hier beschrieben werden. Verfahren zur Isolierung und/oder zum Nachweis von spezifischen Polynucleotiden mittels Hybridisierung konnten zur Durchmusterung auf HCV bis zur Entdeckung von HCV durch den Anmelder nicht verwendet werden. Entsprechend ist ein Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von varianten Heaptitis-C-Virus (HCV)-Stämmen in einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt:
a) Einsetzen der Probe in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern von geeigneter Länge, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Anwesenheit eines Polymerisierungsagens zu starten, wobei wenigstens ein Primer in der Lage ist, selektiv an eine konservierte Region eines wie in Fig. 18 dargestellten HCV-Genoms oder dem Komplement davon zu hybridisieren; und
b) die Analysieren der Größe oder Sequenz jedes amplifizierten Produkts.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Polypeptid-Primer, ausgewählt aus:
5'CTC TAT GGC AAT GAG G3';
5'CGT TGG CAT AAC TGA T3';
5'CGA CAA GAA AGA CAG A3';
5'AGC TTC GAC GTC ACA T3';
5'TGA ACT ATG CAA CAG G3';
5'GGA GTG TGC AGG ATG G3';
5'AAG GTT GCA ATT GCT C3'; und
5'ACT AAC AGG ACC TTC G3'.
Fig. 1 zeigt die Sequenz der HCV-cDNA in Clon 12f und die darin enthaltenen Aminosäuren.
Fig. 2 zeigt die Sequenz der HCV-cDNA in Clon k9-1 und die darin enthaltenen Aminosäuren.
Fig. 3 zeigt die Sequenz von Clon 15e und die davon codierten Aminosäuren.
Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon 131, die darin enthaltenen Aminosäuren und die Sequenzen, die mit Clon 12f überlappen.
Fig. 5 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon 26j, die davon codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit Clon 131 überlappen.
Fig. 6 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon CA59a, die davon codierten Aminosäuren, und die Sequenzen, die mit den Clonen 26j und K9-1 überlappen.
Fig. 7 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon CA84a, die davon codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit Clon CA59a überlappen.
Fig. 8 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon CA156e, die davon codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit CA84a überlappen.
Fig. 9 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon CA167b, die davon codierten Aminosäuren und die Sequenzen, die mit CA156e überlappen.
Fig. 10 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon CA216a, die davon codierten Aminosäuren und die Überlappung mit Clon CA167b.
Fig. 11 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon CA290a, die davon codierten Aminosäuren und die Überlappung mit Clon CA216a.
Fig. 12 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon ag30a und die Überlappung mit Clon CA290a.
Fig. 13 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon CA205a und die Überlappung mit der HCV-cDNA-Sequenz in Clon CA290a.
Fig. 14 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon 18g und die Überlappung mit der HCV-cDNA-Sequenz in Clon ag30a.
Fig. 15 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon l6jh, die davon codierten Aminosäuren und die Überlappung der Nucleotide mit der HCV-cDNA-Sequenz in Clon 15e.
Fig. 16 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon 6k, die davon codierten Aminosäuren und die Überlappung der Nucleotide mit der HCV-cDNA-Sequenz in Clon 16jh.
Fig. 17 zeigt die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA in Clon p131jh, die davon codierten Aminosäuren und die Überlappung der Nucleotide mit der HCV-cDNA-Sequenz in Clon 6k.
Fig. 18 zeigt die zusammengestellte HCV-cDNA-Sequenz, die von den hier beschriebenen Clonen und von der zusammengestellten HCV-cDNA-Sequenz, die in der E.P.A.-Offenlegungsschrifi Nr. 318,216 dargestellt ist, abgeleitet ist. Die Clone, von denen die Sequenz abgeleitet ist, sind der 5'-Clon32, b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (auch k9-1 genannt), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19 g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k und p131jh. In der Figur zeigen die drei horizontalen Striche oberhalb der Sequenz die Position des mutmaßlichen Initiations-Methionincodons an. In der Figur wird auch die Aminosäuresequenz des mutmaßlichen Polyproteins gezeigt, die von der HCV-cDNA codiert wird. Heterogenitäten in clonierten DNAs von HCV1 werden durch die Aminosäuren angezeigt, die oberhalb der mutmaßlich codierten Sequenz des großen ORF angezeigt werden; die Klammern zeigen an, daß die Heterogenität am oder in der Nähe vom 5'- oder 3'-Ende der HCV-cDNA in dem Clon gefunden wurde.
Fig. 19 zeigt die Sequenzen von Einfang- und Markierungssonden zum Nachweis von HCV-RNA in biologischen Proben.
Fig. 20 zeigt die schematische Ausrichtung eines flaviviralen Polyproteins und eines mutmaßlichen HCV-Polyproteins, das von dem Haupt-ORF des HCV-Genoms codiert wird.
In der Figur sind auch die möglichen Funktionen der flaviviralen Polypeptide angezeigt, die von dem flaviviralen Polyprotein abgespalten sind. Zusätzlich werden die relativen Lagen der HCV-Polypeptide NANB&sub5;&submin;&sub1;&submin;&sub1; und C100 in Bezug auf das mutmaßliche HCV-Polyprotein angezeigt.
Fig. 22 zeigt die doppelsträngige Nucleotidsequenz der HCV-cDNA-Insertion in Clon 81 und die mutmaßliche Aminosäuresequenz des davon codierten Polypeptids.
Fig. 23 zeigt die HCV-cDNA-Sequenz in Clon 36, das Segment, das mit der NANBVcDNA von Clon 81 überlappt, und die Polypeptidsequenz, die von Clon 36 codiert wird.
Fig. 24 zeigt die HCV-cDNA-Sequenz in Clon 37b, das Segment, das mit Clon 35 überlappt, und das davon codierte Polypeptid.
Fig. 25 zeigt Autoradiogramme des HCVcPCR-Tests mit RNA, die aus Leberproben von Schimpansen mit NANBH (Fig. 25A) und von einem italienischen Patienten mit NANBH (Fig. 25B) abstammte.
Fig. 26A und 26B sind graphische Darstellungen, die den zeitlichen Zusammenhang zwischen dem Auftreten eines Leberschadens, der Anwesenheit von HCV-RNA und der Anwesenheit von anti-HCV-Antikörpern bei zwei Schimpansen mit NANBH zeigen.
Fig. 27 zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Clon CA84a, die davon codierten Aminosäure und die Sequenzen, die mit Clon CA59a überlappen.
Fig. 28 zeigt die HCV-cDNA-Sequenz in Clon 40b, das Segment, das mit Clon 37b überlappt und das davon codierte Polypeptid.
Fig. 29 ist ein Autoradiogramm, das die markierten, amplifizierten Produkte von ungefähr 300, 30 und 3 CID von HCV-Genomen zeigt.
Fig. 32 zeigt die Nucleotidsequenz von HCV-cDNA in Clon 40a.
Fig. 33 ist ein Autoradiogramm, das amplifizierte Produkte zeigt, die von Primern verlängert wurden, die von konservierten Bereichen des HCV-Genoms abgeleitet sind.
Fig. 34 zeigt die HCV-cDNA-Sequenz in Clon 35, das Segment, das mit Clon 36 überlappt, und das davon codierte Polypeptid.
Fig. 37 ist ein Diagramm, das die Verwandtschaft von Sonden und Primern zeigt, die von der 5'-Region der HCV-RNA abgeleitet sind, von denen die HCV-cDNAs in den Clonen ag30a und k9-1 abgeleitet sind.
Fig. 38 ist ein Autoradiogramm von amplifizierten Produkten, die von Primersätzen verlängert wurden, die von ag30a und k9-1 abgeleitet sind.
Fig. 39 zeigt die ausgerichteten Nucleotidsequenzen der menschlichen Isolate 23 und 27 und von HCV1. Homologe Sequenzen werden durch das Symbol (*) angezeigt. Nichthomologe Sequenzen sind in kleinen Buchstaben angegeben.
Fig. 40 zeigt die ausgerichteten Aminosäuresequenzen der menschlichen Isolate 23 und 27 und von HCV1. Homologe Sequenzen werden durch das Symbol (*) angezeigt. Nichthomologe Sequenzen sind in kleinen Buchstaben angegeben.
Fig. 41 zeigt die Halbton-Reproduktion eines Autoradiogramms eines Northern-Blots von RNA, die aus der Leber eines mit BB-NANBV infizierten Schimpansen isoliert wurde, hybridisiert mit der BB-NANBV-cDNA von Clon 81.
Fig. 43 zeigt die Halbton-Reproduktion eines Autoradiogramms von Nucleinsäuren, die aus NANBV-Partikeln extrahiert worden waren, die mit anti-NANB&sub5;&submin;&sub1;&submin;&sub1; aus infiziertem Plasma eingefangen worden waren und mit ³²P-markierter NANBV-cDNA von Clon 81 gesucht worden waren.
Fig. 44 zeigt die Reproduktion eines Autoradiogramms von Filtern, die isolierte NANBV-Nucleinsäuren enthalten, auf die mit ³²P markierten DNA-Sonden für den plus- und minus-Strang, die von der NANBV-cDNA von Clon 81 abgeleitet sind, abgesucht wurde.
Fig. 46 zeigt die Nucleotid-Consensussequenz des menschlichen Isolats 23, variante Sequenzen werden unterhalb der Sequenzlinie gezeigt. Die Aminosäuren, die von der Consensussequenz codiert werden, sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 47 zeigt die Nucleotid-Consensussequenz des menschlichen Isolats 27; variante Sequenzen werden unterhalb der Sequenzlinie gezeigt. Die Aminosäuren, die von der Consensussequenz codiert werden, sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 48 ist ein Graph, der die Beziehung der EnvL- und EnvR-Primer mit dem Modell- Flavivirus-Polyprotein und dem mutmaßlichen HCV-Polyprotein zeigt.
Fig. 49 zeigt einen Vergleich der zusammengesetzten, ausgerichteten Nucleotidsequenzen der Isolate Thorn, EC1, HCT #18 und HCV1.
Fig. 50 zeigt einen Vergleich der Nucleotidsequenzen von EC10 und einer zusammengesetzten der HCV1-Sequenz; die EC&sub1;&sub0;-Sequenz ist auf der Linie oberhalb der Punkte und die HCV1-Sequenz ist auf der Linie unterhalb der Punkte.
Fig. 51 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen 117-308 (relativ zu HCV1), die in den "EnvL"-Regionen der Consensussequenzen der menschlichen Isolate HCT # 18, JH23, JH 27, Thorne, EC 1 und von HCV 1 codiert sind.
Fig. 52 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen 330-360 (relativ zu HCV1), die in den "EnvR"-Regionen der Consensussequenzen der menschlichen Isolate HCT # 18, JH23, JH 27, Thorne, EC 1 und von HCV 1 codiert sind.
Fig. 53 zeigt die Nucleotidsequenzen der individuellen Primer im Primergemisch 5'-3.

Arten der Ausführung der Erfindung

Der Ausdruck "Hepatitis-C-Virus" (HCV) wurde von den auf dem Fachgebiet Arbeitenden für ein bislang unbekanntes ätiologisches Agens für NANBH reserviert. Das Prototyp-Isolat von HCV wurde in der U.S.S.N. 122,714 identifiziert (vgl. auch E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216). Der Ausdruck HCV umfaßt auch neue Isolate derselben viralen Art. Als eine Ausweitung dieses Begriffs wird die von HCV verursachte Krankheit, früher durch Blut-übertragene NANB-Hepatitis (BB-NANBH) genannt, Hepatitis-C genannt. Die Ausdrücke NANBH und Hepatitis-C können hier austauschbar verwendet sein.
HCV ist eine virale Art, deren pathogene Stämme BB-NANBH verursachen. Davon können auch attenuierte Stämme oder defekte, interferierende Partikel abgeleitet sein. Wie nachstehend gezeigt, wird das HCV-Genom von RNA gebildet. Es ist bekannt, daß Viren, die RNA enthalten, eine relativ hohe Rate an spontaner Mutation haben, d. h., wie berichtet wurde, in der Größenordnung von 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; pro eingebautem Nucleotid (Fields & Knipe (1986)). Da daher die Heterogenität und Ungewissheit des Genotypus den RNA-Viren eigen sind, gibt es innerhalb der HCV-Art viele Stämme/Isolate, die virulent oder avirulent sein können. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren ermöglichen die Vermehrung, Identifizierung, den Nachweis und die Isolierung der verschiedenen HCV-Stämme oder - Isolate.
Mehrere verschiedene Stämme/Isolate von HCV wurden identifiziert. (Vgl. nachstehend). Ein solcher Stamm oder ein solches Isolat, der/das ein Prototyp ist, wird CDC/HCV1 genannt (auch HCV1 genannt). Information von einem Stamm oder Isolat wie eine partielle genomische Sequenz ist ausreichend, um es dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet unter Verwendung von Standardverfahren zu ermöglichen, neue Stämme/Isolate zu isolieren und zu identifizieren, ob diese neuen Stämme/Isolate HCV sind. Zum Beispiel werden mehrere verschiedene Stämme/Isolate nachstehend beschrieben. Diese Stämme, die von einer Anzahl menschlicher Seren (und von verschiedenen geographischen Gegenden) erhalten wurden, wurden unter Verwendung der Information der genomischen Sequenz von HCV1 isoliert.
Unter Verwendung der in der E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216 und nachstehend beschriebenen Verfahren wurden die genomische Struktur und die Nucleotidsequenz von genomischer RNA von HCV1 abgeleitet. Das Genom scheint eine einzelsträngige RNA zu sein, die ~10.000 Nucleotide enthält. Das Genom ist ein positiver Strang und besitzt einen kontinuierlichen, translationalen offenen Leserahmen (ORF), der ein Polyprotein von etwa 3.000 Aminosäuren codiert. In dem ORF scheinen das strukturelle Protein/die strukturellen Proteine in etwa dem ersten Viertel der N-terminalen Region codiert zu sein, wobei die Mehrheit des Polyproteins für nicht-strukturelle Proteine verantwortlich ist. Im Vergleich mit allen bekannten viralen Sequenzen werden kleine, aber signifikante co-lineare Homologien mit den nicht-strukturellen Proteine der Familie der Flaviviren und mit den Pestiviren (die jetzt auch als Teil der Familie der Flaviviren betrachtet werden) beobachtet.
Eine schematische Ausrichtung von möglichen Regionen eines flaviviralen Polyproteins (unter Verwendung vom Gelbfiebervirus als Beispiel) und von einem mutmaßlichen Polyprotein, das vom Haupt-ORF des HCV-Genoms codiert wird, ist in Fig. 20 gezeigt. In der Figur sind die möglichen Domänen des HCV-Polyproteins angezeigt. Das Flavivirus-Polyprotein enthält vom Aminoende zum Carboxyende das Nucleocapsid-Protein (C), das Matrix-Protein (M), das Hüll-Protein (E) und die nicht-strukturellen Proteine (NS) 1, 2 (a+b), 3, 4 (a+b) und 5. Basierend auf den mutmaßlichen Aminosäuren, die von der Nucleotidsequenz von HCV 1 codiert werden, scheint eine kleine Domäne am äußersten N- Terminus des HCV-Polyproteins bei der Größe und beim hohen Gehalt an basischen Resten dem Nucleocapsid-Protein (C) ähnlich zu sein, das am N-Terminus von flaviviralen Polyproteinen gefunden wird. Die nicht-strukturellen Proteine 2, 3, 4 und 5 (NS2-5) von HCV und des Gelbfiebervirus (YFV) scheinen Gegenstücke von ähnlicher Größe und Hydropathizität zu haben, obwohl die Aminosäuresequenzen divergent sind. Die Region von HCV jedoch, die den Regionen des YFV-Polyproteins entsprechen würde, die das M-, E- und NS1-Protein enthalten, unterscheidet sich nicht nur bei der Sequenz, sondern scheint auch bei der Größe und Hydropathizität ziemlich unterschiedlich zu sein. Man sollte sich merken, daß, auch wenn gewisse Domänen des HCV-Genoms hier zum Beispiel als NS1 oder NS2 bezeichnet werden, diese Bezeichnungen spekulativ sind; es können beträchtliche Unterschiede zwischen der HCV-Familie und den Flaviviren existieren, derer man sich noch bewusst werden muss.
Man erwartet, daß verschiedene Stämme, Isolate oder Subtypen von HCV im Vergleich mit HCV1 bei den Aminosäuren und Nucleinsäuren Variationen enthalten. Von vielen Isolaten wird erwartet, daß sie im Vergleich mit HCV1 eine hohe (d. h. mehr als etwa 40%) Homologie bei der gesamten Aminosäuresequenz zeigen. Es kann jedoch auch gefunden werden, daß es andere, weniger homologe HCV-Isolate gibt. Diese würden als HCV gemäß den verschiedenen Kriterien definiert werden, wie zum Beispiel einem ORF von etwa 9.000 Nucleotiden bis zu etwa 12.000 Nucleotiden, der ein Polyprotein von ähnlicher Größe wie HCV1 codiert, einem codierten Polyprotein von ähnlichem hydrophoben und/oder antigenen Charakter wie HCV 1 und der Anwesenheit von co-linearen Peptidsequenzen, die gegenüber HCV1 konserviert sind. Zusätzlich nimmt man an, daß das Genom eine positiv-strängige RNA wäre.
Alle HCV-Isolate codieren mindestens ein Epitop, das immunologisch mit einem Epitop identifizierbar ist (d. h. immunologisch kreuzreaktiv), das von den hier beschriebenen HCV-cDNAs codiert wird. Vorzugsweise ist das Epitop in einer hier beschriebenen Aminosäuresequenz enthalten und ist einzigartig für HCV im Vergleich mit zuvor bekannten Pathogenen. Die Einzigartigkeit des Epitops kann mittels seiner immunologischen Reaktivität mit anti-HCV-Antikörpern und dem Fehlen seiner immunologischen Reaktivität mit Antikörpern gegen bekannte Pathogene bestimmt werden.
HCV-Stämme und -Isolate sind evolutionär verwandt. Daher ist zu erwarten, daß die Gesamt-Homologie der Genome auf der Ebene der Nucleotide etwa 40% oder mehr sein kann, wahrscheinlich etwa 50% oder mehr sein kann, wahrscheinlich etwa 60% oder mehr, und noch wahrscheinlicher etwa 80% oder mehr; und zusätzlich, daß es entsprechende zusammenhängende Sequenzen von mindestens etwa 13 Nucleotiden gibt. Es sollte festgehalten werden, wie nachstehend gezeigt, daß es innerhalb des HCV-Genoms variable und hypervariable Regionen gibt; deshalb ist zu erwarten, daß die Homologie in diesen Bereichen beträchtlich geringer ist als im Gesamt-Genom. Die Übereinstimmung zwischen der genomischen Sequenz des mutmaßlichen HCV-Stamms und zum Beispiel der CDC/HCV1- cDNA-Sequenz kann mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden. Zum Beispiel kann sie durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation der Polynucleotide des mutmaßlichen HCV und der hier beschriebenen HCV-cDNA-Sequenz(en) bestimmt werden. Sie kann auch mittels Hybridisierungder Polynucleotide unter Bedingungen bestimmt werden, die stabile Duplexmoleküle zwischen homologen Regionen bilden (zum Beispiel solche, die vor dem S&sub1;-Verdau verwendet würden), gefolgt vom Verdau mit Einzelstrang-spezifischer Nuclease/Einzelstrang-spezifischen Nucleasen, gefolgt von einer Größenbestimmung der verdauten Fragmente.
Wegen der evolutionären Verwandtschaft der Stämme oder Isolate von HCV sind mutmaßliche HCV-Stämme oder -Isolate mittels ihrer Homologie identifizierbar. Im allgemeinen wird von HCV-Stämmen und -Isolaten erwartet, daß sie auf der Ebene der Polypeptide zu mindestens 40% homolog, wahrscheinlich zu mehr als etwa 50% homolog, wahrscheinlich zu mehr als etwa 70% homolog und noch wahrscheinlicher zu mehr als etwa 80% homolog sind, und einige können auf der Ebene der Polypeptide sogar zu mehr als etwa 90% homolog sein. Die Verfahren zur Bestimmung von Homologie bei der Aminosäuresequenz sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz direkt bestimmt und mit den hier bereitgestellten Sequenzen verglichen werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Nucleotidsequenz des genomischen Materials des mutmaßlichen HCV bestimmt werden (üblicherweise über ein cDNA- Intermediat), die davon codierte, mutmaßliche Aminosäuresequenz kann bestimmt werden, und die entsprechenden Regionen können verglichen werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein Polynucleotid, das "abgeleitet von" einer vorgegebenen Sequenz ist, auf eine Polynucleotidsequenz, die von einer Sequenz von mindestens etwa 6 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 8 Nucleotiden, mehr bevorzugt mindestens etwa 10-12 Nucleotiden und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 15- 20 Nucleotiden, die einer Region der vorgegebenen Nucleotidsequenz entsprechen, umfaßt ist. "Entsprechend" meint homolog oder komplementär zu der vorgegebenen Sequenz. Vorzugsweise ist die Sequenz der Region, von der das Polynucleotid abgeleitet ist, homolog oder komplementär zu einer Sequenz, die für ein HCV-Genom einzigartig ist. Mehr bevorzugt ist die abgeleitete Sequenz homolog oder komplementär zu einer Sequenz, die für alle oder die Mehrheit der HCV-Isolate einzigartig ist. Ob eine Sequenz für das HCV-Genom einzigartig ist oder nicht, kann mittels Verfahren bestimmt werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel kann die Sequenz mit Sequenzen in Datenbanken, z. B. Genebank, verglichen werden, um zu bestimmen, ob sie im nicht infizierten Wirt oder anderen Organismen vorhanden ist. Die Sequenz kann auch mit bekannten Sequenzen von anderen viralen Agentien einschließlich derer, von denen bekannt ist, daß sie Hepatitis induzieren, z. B. HAV, HBV und HDV, und mit den Mitgliedern der Flaviviridae verglichen werden. Die Übereinstimmung oder nicht-Übereinstimmung der abgeleiteten Sequenz mit anderen Sequenzen kann auch mittels Hybridisierung unter den geeigneten Stringenz-Bedingungen bestimmt werden. Hybridisierungsverfahren zur Bestimmung der Komplementarität von Nucleinsäuresequenzen sind im Stand der Technik bekannt und werden nachstehend diskutiert. Vergleiche zum Beispiel auch Maniatis et al. (1982). Außerdem können Fehlpaarungen von Duplex-Polynucleotiden, die mittels Hybridisierung gebildet wurden, mittels bekannter Verfahren bestimmt werden, einschließlich zum Beispiel Verdau mit einer Nuclease wie S1, die spezifisch einzelsträngige Bereiche in den Duplex-Polynucleotiden verdaut. Regionen, von denen typische DNA-Sequenzen "abgeleitet" sein können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf zum Beispiel Regionen, die spezifische Epitope codieren, ebenso wie nicht-transkribierte und/oder nicht-translatierte Regionen.
Das abgeleitete Polynucleotid ist nicht notwendigerweise physikalisch von der gezeigten Nucleotidsequenz abgeleitet, sondern kann auf jede Weise erzeugt werden, einschließlich zum Beispiel chemischer Synthese oder DNA-Replikation oder reverse Transkription oder Transkription. Zusätzlich können Kombinationen an Regionen, die der vorgegebenen Sequenz entsprechen, in einer Art modifiziert werden, von der im Stand der Technik bekannt ist, dass sie mit einer geplanten Verwendung übereinstimmt.
Der Ausdruck "rekombinantes Polynucleotid", wie hier verwendet, meint ein Polynucleotid von genomischem, cDNA, semisynthetischem oder synthetischem Ursprung, welches aufgrund seiner Herkunft oder Manipulation: (1) nicht assoziiert ist mit dem gesamten oder einem Teil eines Polynucleotids, mit dem es in der Natur assoziiert ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid als in der Natur verknüpft ist oder (3) in der Natur nicht vorkommt.
Der Ausdruck "Polynucleotid", wie hier verwendet, betrifft eine polymere Form von Nucleotiden jeder Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Ausdruck betrifft nur die Primärstruktur des Moleküls. Somit umfaßt dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA und RNA. Er umfaßt auch bekannte Arten an Modifikationen, zum Beispiel im Stand der Technik bekannte Markierungen, Methylierung, Kappenstrukturen, Substitution von einem oder von mehreren der natürlicherweise vorkommenden Nucleotide durch ein Analogon, Internucleotid-Modifikationen wie zum Beispiel diejenigen mit ungeladenen Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate usw.) und mit geladenen Verknüpfungen (z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate usw.), diejenigen, die anhängende Gruppen enthalten, wie zum Beispiel Proteine (einschließlich z. B. Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin usw.), diejenigen mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen usw.), diejenigen, die Chelatoren enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle usw.), diejenigen, die Alkylatoren enthalten, diejenigen, die modifizierte Verknüpfungen enthalten (z. B. alphaanomere Nucleinsäuren usw.), ebenso wie nicht-modifizierte Formen des Polynucleotids.
Wie hier verwendet enthält der "Sense-Strang" einer Nucleinsäure die Sequenz, die mit einer mRNA Sequenzhomologie hat. Der "Antisense-Strang" enthält eine Sequenz, die zu der des "Sense-Stranges" komplementär ist.
Wie hier verwendet ist ein "positiv-strängiges Genom" eines Virus eines, bei dem das Genom, sei es RNA oder DNA, einzelsträngig ist und ein virales Polypeptid/virale Polypeptide codiert. Beispiele für positiv-strängige RNA-Viren umfassen die Togaviridae, die Coronaviridae, die Retroviridae, die Picornaviridae und die Caliciviridae. Eingeschlossen sind auch die Flaviviridae, die früher als Togaviridae klassifiziert wurden. Vgl. Fields & Knipe (1986).
Der Ausdruck "Primer", wie hier verwendet, betrifft ein Oligomer, das in der Lage ist, als Startpunkt der Synthese eines Polynucleotidstrangs zu dienen, wenn es geeigneten Bedingungen unterworfen wird. Der Primer wird vollständig oder im wesentlichen komplementär zu einer Region des zu kopierenden Polynucleotidstrangs sein. Somit wird sich der Primer unter Bedingungen, die der Hybridisierung förderlich sind, an die komplementäre Region des Analyt-Strangs anlagern. Bei Zugabe der geeigneten Reagentien (z. B. einer Polymerase, Nucleotidtriphosphaten und dergleichen) wird der Primer durch das polymerisierende Agens verlängert, um eine Kopie des Analyt-Strangs zu bilden. Der Primer kann einzelsträngig oder alternativ teilweise oder vollständig döppelsträngig sein.
Die Ausdrücke "Analyt-Polynucleotid" und "Analyt-Strang" betreffen ein einzel- oder doppelsträngiges Nucleinsäuremolekül, von dem vermutet wird, eine Zielsequenz zu enthalten, und das in einer biologischen Probe anwesend sein kann.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Oligomer" Primer und Sonden. Der Ausdruck Oligomer deutet nicht die Größe des Moleküls an. Typische Oligomere sind jedoch nicht größer als 1000 Nucleotide, typischer sind sie nicht größer als 500 Nucleotide, noch typischer sind sie nicht größer als 250 Nucleotide; sie können in der Länge nicht größer als 100 Nucleotide sein und können nicht größer als 75 Nucleotide sein und können auch nicht größer als 50 Nucleotide sein.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Sonde" eine Struktur, die von einem Polynucleotid gebildet wird, das mit einer Zielsequenz wegen der Komplementarität von mindestens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz im Zeilbereich eine Hybridstruktur bildet. Die Polynucleotidregionen von Sonden können aus DNA und/oder RNA und/oder synthetischen Nucleotidanaloga bestehen. Bei den Sonden eingeschlossen sind "Einfangsonden" und "Markierungssonden". Vorzugsweise enthält die Sonde keine Sequenz, die komplementär zu der Sequenz/den Sequenzen ist, die verwendet werden, um die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu starten.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Zielregion" eine Region der zu amplifizierenden und/oder nachzuweisenden Nucleinsäure. Der Ausdruck "Zielsequenz" betrifft eine Sequenz, mit der eine Sonde oder ein Primer unter den gewünschten Bedingungen ein stabiles Hybrid bildet.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Zielpolynucleotidsequenz" eine Polynucleotidsequenz, die aus Nucleotiden besteht, die komplementär zu einer Zielnucleotidsequenz ist; die Sequenz ist von ausreichender Länge und Komplementarität mit der Zielsequenz, um ein Duplexmolekül zu bilden, das für den beabsichtigten Zweck eine ausreichende Stabilität hat.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Bindungspartner" ein Molekül, das in der Lage ist, ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität zu binden, wie zum Beispiel ein Antigen und ein dazu spezifischer Antikörper. Im allgemeinen muß der spezifische Bindungspartner mit ausreichender Affinität binden, um die Analyt-Kopie/des komplementären Strang- Duplexmoleküls unter den Isolierungsbedingungen zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, die zahlreichen bekannten Rezeptor-Liganden- Paare und komplementäre Polynucleotidstränge. Im Falle von komplementären Polynucleotidbindungspartnern sind die Partner normalerweise mindestens etwa 15 Basen lang und können mindestens etwa 40 Basen lang sein; zusätzlich haben sie einen Gehalt an Gs und Cs von mindestens etwa 40% und so viel wie etwa 60%. Die Polynucleotide können von DNA, RNA oder synthetischen Nucleotidanaloga gebildet werden.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "gekoppelt" die Anheftung mittels kovalenter Bindungen oder durch starke nicht-kovalente Wechselwirkungen (z. B. hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken usw.). Kovalente Bindungen können zum Beispiel Ester-, Ether-, Phosphoester-, Amid-, Peptid-, Imid-, Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen, Kohlenstoff-Phosphor-Bindungen und dergleichen sein.
Der Ausdruck "Träger" betrifft jede feste oder halbfeste Oberfläche, an der der gewünschte Bindungspartner verankert werden kann. Geeignete Träger umfassen Glas, Plastik, Metall, Polymergele und dergleichen und sie können die Form von Kügelchen, Mulden, Eintauchstäbchen, Membranen und dergleichen annehmen.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Markierung" jedes Atom oder jede Gruppe, das/die verwendet werden kann, um ein nachweisbares (vorzugsweise quantifizierbares) Signal bereitzustellen, und das/die an ein Polynucleotid oder Polypeptid gebunden werden kann.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Multimer" lineare oder verzweigte Polymere derselben, sich wiederholenden, einzelsträngigen Polynucleotideinheit oder verschiedener einzelsträngiger Polynucleotideinheiten. Mindestens eine der Einheiten hat eine Sequenz, Länge und Zusammensetzung, die es ihnen erlauben, daß sie spezifisch mit einer ersten einzelsträngigen Nucleotidsequenz von Interesse hybridisieren, typischerweise ein Analyt oder ein an einen Analyt gebundenes Oligomer. Um eine solche Spezifität und Stabilität zu erreichen, wird diese Einheit normalerweise mindestens etwa 15 Nucleotide lang sein, typischerweise nicht mehr als etwa 50 Nucleotide lang sein und vorzugsweise etwa 30 Nucleotide lang sein; darüber hinaus wird der Gehalt an Gs und Cs normalerweise mindestens etwa 40% sein und höchstens etwa 60%. Zusätzlich zu einer solchen Einheit/solchen Einheiten umfaßt das Multimer eine Vielzahl an Einheiten, die in der Lage sind, spezifisch und stabil mit einem zweiten einzelsträngigen Nucleotid von Interesse zu hybridisieren, typischerweise ein markiertes Polynucleotid oder ein anderes Multimer. Diese Einheiten sind im allgemeinen etwa von derselben Größe und Zusammensetzung wie die vorstehend diskutierten Multimere. Wenn ein Multimer so geplant wird, daß es mit einem anderen Multimer hybridisiert, sind die erste und die zweite Oligonucleotideinheit heterogen (verschieden) und hybridisieren unter den für den Test gewählten Bedingungen nicht miteinander. Somit können die Multimere Liganden sein, die die Markierung an die Sonde koppeln.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "virale RNA", der HCV-RNA umfaßt, RNA vom viralen Genom, Fragmente davon, Transkripte davon und davon abgeleitete mutante Sequenzen.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "biologische Probe" eine Probe von Gewebe oder Flüssigkeit, die von einem Individuum isoliert ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, zum Beispiel Plasma, Serum, spinale Flüssigkeit, Lymphflüssigkeit, die externen Bereiche der Haut, des Atmungs-, Verdauungs- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumore, Organe und auch Proben von Bestandteilen von in vitro-Zellkulturen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, konditioniertes Medium, das vom Wachstum von Zellen in Zellkulturmedium resultiert, mutmaßlich viral infizierte Zellen, rekombinante Zellen und Zellbestandteile).

Beschreibung der Erfindung

Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, außer anders angezeigt, herkömmliche Verfahren der Chemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA und Immunologie verwenden, die Stand der Technik sind. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur beschrieben. Vgl. z. B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, BÄNDE I UND II (D. N. Glover Hrsg. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait Hrsg. 1984); NUCLEIC ACID HYBRaISATION (B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. 1984); die Serie, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.), insbesondere Bd. 154 und Bd. 155 (Wu und Grossman, bzw. Wu, Hrsg.). Alle hier vorstehend und nachstehend erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Publikationen sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die nützlichen Materialien und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden durch Identifikation von HCV als dem ätiologischen Agens von BB-NANBV und durch die Bereitstellung einer Familie von Nucleotidsequenzen ermöglicht, die von cDNA-Bibliotheken isoliert wurden, die HCV-cDNA-Sequenzen enthalten. Diese cDNA-Bibliotheken wurden von Nucleinsäuresequenzen abgeleitet, die im Plasma eines mir HCV infizierten Schimpansen anwesend waren. Die Konstruktion von einer dieser Bibliotheken, der "c"- Bibliothek (ATCC Nr. 40394), ist in der E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen HCV-cDNA-Sequenzen ebenso wie der hier beschriebenen, können Oligomere konstruiert werden, die als Reagentien zum Nachweis von viralen Polynucleotiden in biologischen Proben von Nutzen sind. Die hier beschriebenen, neuen Oligomere ermöglichen die weitere Charakterisierung des HCV- Genoms. Von diesen Sequenzen abgeleitete Polynucleotid-Primer können verwendet werden, um Sequenzen zu amplifizieren, die in cDNA-Bibliotheken vorhanden sind, und/oder um cDNA-Bibliotheken nach zusätzlichen, überlappenden cDNA-Sequenzen zu durchmustern, die wiederum verwendet werden können, um mehr überlappende Sequenzen zu erhalten. Wie nachstehend und in der E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216 angezeigt, scheint das Genom von HCV RNA zu sein, das primär einen großen offenen Leserahmen (ORF) umfaßt, der ein großes Polyprotein codiert.
Zusätzlich zum Vorstehenden ermöglicht die nachstehend bereitgestellte Information die Identifizierung von zusätzlichen HCV-Stämmen oder -Isolaten. Die Isolierung und Charakterisierung der zusätzlichen HCV-Stämme oder -Isolate kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel durch Isolierung der Nucleinsäuren von Bestandteilen des Körpers, die virale Partikel und/oder virale RNA enthalten, durch Schaffung von cDNA-Bibliotheken unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Oligomere, zur Durchmusterung von Bibliotheken auf Clone, die die nachstehend beschriebenen HCV-cDNA-Sequenzen enthalten, und durch Vergleich der HCV-cDNAs von den neuen Isolaten mit den cDNAs, die in der E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216 und nachstehend beschrieben sind. Stämme oder Isolate, die zu den Parametern von HCV passen, wie vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben, sind leicht zu identifizieren. Andere Verfahren für die Identifizierung von HCV-Stämmen sind dem Durchschnittsfachmann geläufig, basierend auf der hier bereitgestellten Information.

Isolierung von HCV-cDNA-Sequenzen

Die Oligomere der Erfindung enthalten Regionen, die mit Zielsequenzen in HCV- Polynucleotiden hybride Duplexstrukturen bilden. Die mit den HCV-Polynucleotiden hybridisierenden Regionen der Oligomere können von der HCV-eDNA-Sequenz/den HCV- cDNA-Sequenzen bestätigt werden, die hier bereitgestellt wird/werden und die in der E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben ist/sind. Eine zusaitmengesetzte HCV-cDNA von HCV1, ein HCV-Prototyp, ist in Fig. 18 gezeigt. Die zusammengesetzte Sequenz basiert auf Sequenzinformation, die von einer Anzahl an HCV-cDNA-Clonen, die von einer Anzahl an HCV-cDNA-Bibliotheken isoliert wurden, einschließlich der "c"-Bibliothek, die in lambda gt11 (ATCC Nr. 40394) vorhanden ist, und von menschlichem Serum abgeleitet ist. Die HCV- cDNA-Clone wurden mittels Verfahren isoliert, die in der E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben sind. Kurz gesagt enthielt die Mehrzahl der isolierten Clone Sequenzen von der HCV-cDNA-"c"-Bibliothek, die unter Verwendung von vereintem Serum von einem Schimpansen mit chronischer HCV-Infektion konstruiert wurde, das einen hohen Titer des Virus enthielt, d. h. mindestens 10&sup6; Schimp.-infektiöse Dosen/ml (CID/ml). Das vereinte Serum wurde verwendet, um virale Partikel zu isolieren; die aus diesen Partikeln isolierten Nucleinsäuren wurden als Matrize bei der Konstruktion von cDNA-Bibliotheken des viralen Genoms verwendet. Der ursprüngliche Clon 5-1-1 wurde mittels Durchmusterung der "c"- Bibliothek mit Serum von infizierten Individuen erhalten. Nach der Isolierung des ursprünglichen Clons wurde der Rest der Sequenz mittels Durchmustenmg mit synthetischen Polynucleotid-Sonden erhalten, deren Sequenzen von der 5'-Region und der 3'-Region der bekannten HCV-cDNA-Sequenz(en) abgeleitet waren.
Die Beschreibung der Verfahren zur Gewinnung der cDNA-Sequenzen ist vor allem von historischem Interesse. Die resultierenden Sequenzen (und ihre komplementären) werden hier bereitgestellt, und die Sequenzen oder jeder Teil davon könnten unter Verwendung von synthetischen Verfahren oder einer Kombination von synthetischen Verfahren mit der Gewinnung von partiellen Sequenzen unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, wie in der E.P.A. Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben, hergestellt werden.

Oligomer-Primer

Unter Verwendung des HCV-Genoms als Basis (wie in Fig. 18 dargestellt) und/oder vorzugsweise von konservierten Regionen des HCV-Genoms können Oligomere von etwa 8 Nucleotiden oder mehr hergestellt werden, die mit dem positiven Strang/den positiven Strängen von HCV-RNA oder dem Komplement davon ebenso wie mit HCV-cDNAs hybridisieren. Diese Oligomere können als Primer für die Transkription und/oder Replikation von Ziel-HCV-Sequenzen dienen. Diese Oligomeren enthalten eine Ziel- Polynucleotidsequenz, die aus Nucleotiden besteht, die komplementär zu einer Ziel-HGV- Nucleotidsequenz sind; die Sequenz ist von ausreichender Länge und Komplementarität mit der HCV-Sequenz, um ein Duplexmolekül zu bilden, das für den gedachten Zweck eine ausreichende Stabilität hat. Wenn zum Beispiel der Zweck die Isolierung eines Analyten mittels Immobilisierung ist, der eine Ziel-HCV-Sequenz enthält, würden die Oligomere eine Polynucleotidregion enthalten, die von ausreichender Länge und Komplementarität mit der Ziel-HCV-Sequenz ist, um eine ausreichende Duplexstabilität zu gewährleisten, um unter den Isolierungsbedingungen den Analyten mittels seiner Bindung an die Oligomere an einer festen Oberfläche zu immobilisieren. Wenn die Oligomere zum Beispiel auch als Primer für die Transkription und/oder Replikation von Ziel-HCV-Sequenzen in einem Analyt-Polynucleotid dienen sollen, würden die Oligomere eine Polynucleotidregion enthalten, die von ausreichender Länge und Komplementarität mit der Ziel-HCV-Sequenz ist, um dem polymerisierenden Agens unter den Polymerisationsbedingungen zu gestatten, die Replikation von den Primern fortzusetzen, die in einer stabilen Duplexform mit der Zielsequenz sind. Die Oligomere können ein Minimum von etwa 4 fortlaufenden Nucleotiden enthalten, die komplementär mit der Ziel-HCV-Sequenz sind; üblicherweise werden die Oligomere ein Minimum von etwa 8 fortlaufenden Nucleotiden enthalten, die komplementär mit der Ziel- HCV-Sequenz sind, und werden vorzugsweise ein Minimum von etwa 14 fortlaufenden Nucleotiden enthalten, die komplementär mit der Ziel-HCV-Sequenz sind.
Geeignete HCV-Nucleotid-Zielsequenzen können aus Nucleotiden bestehen, die komplementäre Nucleotide sind, ausgewählt aus den folgenden HCV-cDNA-Nucleotiden, die in Fig. 18 gezeigt sind (nnx - nny bedeutet von etwa Nucleotid Nummer x bis etwa Nucleotid Nummer y):
Das Oligomer muß jedoch nicht nur aus der Sequenz bestehen, die komplementär zu der Ziel-HCV-Sequenz ist. Es kann zusätzlich Nucleotidsequenzen oder andere Gruppen enthalten, die für die Zwecke geeignet sind, für die die Oligomere verwendet werden. Wenn zum Beispiel die Oligomere als Primer für die Amplifikation von HCV-Sequenzen mittels PCR verwendet werden, können sie Sequenzen enthalten, die im Duplexmolekül Stellen für Restriktionsenzyme bilden, die die Clonierung der amplifizierten Sequenzen erleichtern.
Die Herstellung von Oligomeren erfolgt durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich zum Beispiel Verfahren, die Ausschneiden, Transkription oder chemische Synthese umfassen. Die ausgewählten Zielsequenzen und/oder -regionen des Genoms, zu denen die Ziel-Polynucleotide des Oligomers komplementär sind, hängen vom Zweck ab. Wenn zum Beispiel das Ziel ist, in biologischen Proben (z. B. Blut) auf die Anwesenheit von HCV zu prüfen, würden die bevorzugten Oligomere als Primer verwendet wereen und sie würden mit konservierten Regionen des HCV-Genoms hybridisieren. Einige der konservierten Regionen des HCV-Genoms, an die die Oligomere binden können, werden hier beschrieben, zum Beispiel die Regionen, die Nucleotidnummern von etwa dem 5'-Ende bis etwa 200, oder von etwa 4000 bis etwa 5000 oder von etwa 8000 bis etwa 9040, wie in Fig. 18 gezeigt oder vorzugsweise Nucleotide -318 bis 174, 4056 bis 4448 und 4378 bis 4902 umfassen. Andere Regionen des Genoms, die konserviert sind, sind durch Vergleich der Nucleotidsequenzen der verschiedenen Isolate von HCV leicht feststellbar, einschließlich des Prototyp-HCV, HCV 1. Verfahren zur Durchführung des Vergleichs zwischen den Genotypen zur Bestimmung von konservierten und nicht-konservierten Regionen sind im Stand der Technik bekannt, und Beispiele dieser Verfahren werden hier offenbart.
Für die Verwendung solcher Sonden als Mittel für den Nachweis der Anwesenheit von HCV-Polynucleotiden (zum Beispiel bei der Untersuchung auf kontaminiertes Blut) kann die zu analysierende biologische Probe wie Blut oder Serum nach Wunsch behandelt werden, um die darin enthaltenen Nucleinsäuren zu extrahieren. Die von der Probe resultierende Nucleinsäure kann der Gelelektrophorese oder anderen Größentrennungsverfahren unterworfen werden; alternativ kann die Nucleinsäureprobe ohne Trennung dem Dot-Blot- Verfahren unterworfen werden. Um hybride Duplex-Komplexe mit der Zielsequenz der Sonde zu bilden, muß die Zielsequenz der Analyt-Nucleinsäure in der Einzelstrangform vorliegen. Wenn die Sequenz natürlicherweise in der Einzelstrangform vorliegt, ist die Denaturierung nicht erforderlich. Wenn die Sequenz jedoch in der Doppelstrangform vorliegt, wird die Sequenz denaturiert. Die Denaturierung kann mittels verschiedener, im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt werden. Nach der Denaturierung werden die Analyt- Nucleinsäure und die Sonde unter Bedingungen inkubiert, die die Bildung stabiler Hybride der Zielsequenz in der Sonde mit der mutmaßlichen Zielsequenz im Analyten fördern, und die resultierenden Duplexmoleküle, die die Sonde(n) enthalten, werden nachgewiesen.
Der Nachweis der resultierenden Duplexmoleküle, wenn vorhanden, wird üblicherweise durch die Verwendung markierter Sonden erreicht; in einer anderen Ausführungsform kann die Sonde nicht markiert sein, kann jedoch durch spezifische Bindung mir einem Liganden, der markiert ist, direkt oder indirekt nachweisbar sein. Geeignete Markierungen und Verfahren zur Markierung von Sonden und Liganden sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel radioaktive Markierungen, die mittels bekannter Verfahren eingebaut werden können (z. B. Nick-Translation oder Kinasebehandlung), Biotin, fluoreszierende Gruppen, chemilumineszierende Gruppen (z. B. Dioxetane, insbesondere getriggerte Dioxetane), Enzyme, Antikörper und dergleichen.
Die Region der Sonden, die verwendet werden, um den Analyten zu binden, kann mit dem HCV-Genom vollständig komplementär gemacht werden. Deshalb sind üblicherweise Bedingungen hoher Stringenz wünschenswert, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Bedingungen hoher Stringenz sollten jedoch nur verwendet werden, wenn die Sonden zu Regionen des viralen Genoms komplementär sind, die nicht heterogen sind. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Anzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während der Waschverfahren bestimmt, einschließlich Temperatur, Jonenstärke, Zeitdauer und Konzentration an Formamid. Diese Faktoren werden zum Beispiel bei Maniatis, T. (1982) dargestellt.
Es können auch Variationen dieses grundlegenden Schemas, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden, einschließlich derer, die die Trennung der nachzuweisenden Duplexmoleküle von fremdem Material ermöglichen und/oder die das Signal der markierten Gruppe amplifizieren. Eine Anzahl dieser Variationen ist zum Beispiel in: Matthews und Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169: 1; Landegren et al. (1988), Science 242: 229; und Mittlin (1989), Clinical Chem. 35: 1819 zusammengestellt. Diese und die folgenden Publikationen, die Testformate beschreiben, werden durch Bezugnahme hier eingeschlossen. Geeignete Sonden zum Nachweis von HCV in diesen Tests werden von Sequenzen umfaßt, die mit Ziel-HCV-Polynucleotidsequenzen hybridisieren, um Duplexmoleküle mit dem Analyt-Strang zu bilden, wobei die Duplexmoleküle zum Nachweis in dem spezifischen Testsystem ausreichend stabil sind.

Nachweis von HCV-RNA und davon abgeleiteten Polynucleotiden unter Verwendun2 eines HCV/cPCR-Verfahrens

Ein besonders nützliches Verfahren zum Nachweis von HCV-RNA oder von von HCV-RNA abgeleiteten Polynucleotiden ist das HCV/cPCR-Verfahren, das ein Teil der vorliegenden Anmeldung ist und das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR) benutzt, das von Saiki et al. (1986), von Mullis im U.S.-Patent Nr. 4,683,195 und von Mullis et al. im U.S.- Patent Nr. 4,683,202 beschrieben wird. Das HCV/cPCR-Verfahren verwendet Primer und Sonden, die von Information abgeleitet sind, die hier bereitgestellt wird und die die Natur des HCV-Genoms betrifft.
Im allgemeinen werden beim PCR-Verfahren kurze Oligonucleotidprimer hergestellt, die zu entgegengesetzten Enden gewünschter Sequenzen passen. Die Sequenz zwischen den Primern muß nicht bekannt sein. Eine Probe eines Polynucleotids wird extrahiert und denaturiert, vorzugsweise durch Hitze, und mit Oligonucleotidprimern hybridisiert, die in molarem Überschuß vorhanden sind. Die Polymerisation wird durch eine Matrizen- und Primer-abhängige Polymerase in der Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten oder Nucleotidanaloga (dNTPs) katalysiert. Dies resultiert in zwei "langen Produkten", die die jeweiligen Primer an ihren 5'-Enden enthalten, kovalent verknüpft mit den neu synthetisierten Komplementen der ursprünglichen Stränge. Die replizierte DNA wird erneut denaturiert, mit den Oligonucleotidprimern hybridisiert, Polymerisationsbedingungen erneut unterworfen, und es wird ein zweiter Zyklus der Replikation initiiert. Der zweite Zyklus stellt die beiden ursprünglichen Stränge, die zwei langen Produkte von Zyklus 1 und zwei "kurze Produkte" bereit, die von den langen Produkten repliziert wurden. Die kurzen Produkte enthalten Sequenzen (Sense oder Antisense), die von der Zielsequenz abgeleitet sind und die an den 5'- und 3'-Enden von Primersequenzen flankiert werden. Bei jedem zusätzlichen Zyklus wird die Zahl an kurzen Produkten exponentiell repliziert. Somit verursacht das Verfahren die Amplifikation einer spezifischen Zielsequenz.
Bei dem Verfahren wird eine Probe bereitgestellt, von der man annimmt, daß sie HCV- RNA oder ein Fragment davon enthält. Die Probe wird üblicherweise von einem Individuum entnommen, von dem man vermutet, daß es NANBH hat; andere Quellen für die Probe werden jedoch umfaßt, z. B. konditioniertes Medium oder Zellen von in vitro-Systemen, in denen das Virus sich repliziert hat. Die Probe muß jedoch die Zielnucleinsäuresequenz(n) enthalten.
Die Probe wird dann Bedingungen unterworfen, die die reverse Transkription der HCV-RNA in HCV-cDNA erlauben. Die Bedingungen für die reverse Transkription von RNA sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel in Maniatis et al. (1982) und in Methods in Enzymology beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren für die reverse Transkription verwendet reverse Transkriptase von einer Vielzahl an Quellen einschließlich rekombinanter Moleküle und Isolate von zum Beispiel einem Retrovirus, vorzugsweise vom Myeloblastose-Virus des Affen (AMV) und geeignete Bedingungen für die Transkription. Das HCV-cDNA-Produkt der reversen Transkription ist ein RNA : DNA- Hybrid, das von der ersten Runde der reversen Transkription resultiert; danach resultieren DNA : DNA-Hybride von zwei oder mehr Runden an Transkription.
Die HCV-cDNA, die von der reversen Transkription resultiert, wird dann der PCR unterworfen, um die Zielsequenz zu amplifizieren. Um dies zu erreichen, wird die HCV- cDNA denaturiert und die getrennten Stränge werden mit Primern hybridisiert, die die Zielsequenz flankieren.
Die Strangtrennung kann mittels jedes geeigneten, denaturierenden Verfahrens erreicht werden, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet geläufig sind. Ein bevorzugtes, physikalisches Verfahren umfaßt das Erhitzen der Nucleinsäure bis sie vollständig (> 99%) denaturiert ist. Die typische Hitzedenaturierung umfaßt Temperaturen, die von etwa 80ºC bis etwa 105ºC reichen, für Zeiträume, die etwa 1 bis 10 Minuten betragen.
Nach der Hybridisierung der HCV-cDNA mit den Primern werden die Ziel-HCV- Sequenzen mit einem polymerisierenden Mittel repliziert, welches ein Primer-Oligonucleotid für die Initiierung der Synthese der Replikakette verwendet. Die Primer werden so ausgesucht, daß sie komplementär zu Sequenzen des HCV-Genoms sind. Oligomere Primer, die komplementär zu Regionen der Sense- und Antisense-Stränge von HCV-cDNA sind, können von den HCV-cDNA-Sequenzen von den zusammengestellten cDNA-Sequenzen geplant werden, die in Fig. 18 bereitgestellt werden.
Die Primer werden so ausgesucht, daß ihre relative Positionen entlang der Duplexsequenz so sind, daß ein Verlängerungsprodukt, das von einem Primer synthetisiert wurde, wenn es von seiner Matrize (Komplement) getrennt wird, als Matrize für die Verlängerung des anderen Primers dient, um eine Replikakette definierter Länge zu ergeben.
Der Primer ist vorzugsweise für eine maximale Effizienz bei der Amplifikation einzelsträngig, kann aber auch alternativ doppelsträngig sein. Wenn der Primer doppelsträngig ist, wird zunächst behandelt, um seine Stränge zu trennen, bevor er zur Herstellung von Verlängerungsprodukten verwendet wird. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muß ausreichend lang sein, um in der Gegenwart des polymerisierenden Mittels die Synthese von Verlängerungsprodukten zu initiieren. Die exakte Länge der Primer wird von vielen Faktoren abhängen, einschließlich der Temperatur und Quelle der Primer und dem verwendetem Verfahren. Zum Beispiel enthält der Oligonucleotidprimer in Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz typischerweise etwa 15-45 Nucleotide, obwohl er mehr oder weniger Nucleotide enthalten kann. Kurze Primermoleküle benötigen im allgemeinen kühlere Temperaturen, um mit der Matrize ausreichend stabile Hybridkomplexe zu bilden.
Die hier verwendeten Primer werden so ausgewählt, daß sie "im Wesentlichen" zu den verschiedenen Strängen von jeder zu amplifizierenden, spezifischen Sequenz komplementär sind. Deshalb müssen die Primer nicht die exakte Sequenz der Matrize widerspiegeln, müssen aber ausreichend komplementär sein, um mit ihren jeweiligen Strängen selektiv zu hybridisieren. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment mit dem 5'- Ende des Primers verknüpft sein, während der Rest der Primersequenz mit dem Strang komplementär ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingestreut sein, unter der Voraussetzung, daß der Primer ausreichende Komplementarität mit der Sequenz von einem der zu amplifizierenden Stränge hat, um damit zu hybridisieren und dabei eine Duplexstruktur zu bilden, die mit den polymerisierenden Mitteln verlängert werden kann. Die nicht-komplementären Nucleotidsequenzen der Primer können Stellen für Restriktionsenzyme umfassen. Die Anheftung einer Stelle für ein Restriktionsenzym an das Ende/die Enden der Zielsequenz wäre insbesondere hilfreich bei der Clonierung der Zielsequenz.
Es sollte verstanden werden, daß "Primer", wie hier verwendet, mehr als einen Primer bedeuten kann, insbesondere in dem Fall, in dem es eine gewisse Zweideutigkeit hinsichtlich der Information über die Endsequenz(en) der zu amplifizierenden Zielregion gibt. Somit umfaßt ein "Primer" eine Kollektion von Primeroligonucleotiden, die Sequenzen enthalten, die die möglichen Variationen in der Sequenz darstellen, oder er umfaßt Nucleotide, die eine typische Basenpaarung zulassen. Eines der Primeroligonucleotide in dieser Kollektion wird homolog mit dem Ende der Zielsequenz sein. Ein spezieller Fall wird in den Beispielen gezeigt, wo Oligomer-Sets von 44-meren und 45-meren verwendet wurden, um die Amplifikation einer potentiell varianten Region des HCV-Genoms zu initiieren.
Es wird erwartet, daß es eine Vielzahl an Stämmen oder Isolaten von HCV mit Sequenzen gibt, die von HCV1 abweichen, dem Prototyp-Stamm. Um deshalb variante Stämme nachzuweisen, ist es vorzuziehen, Primer zu konstruieren, die mit konservierten Regionen des HCV-Genoms hybridisieren. Die konservierten Regionen können durch Vergleich der Nucleotid- oder Aminosäuresequenz von mehreren HCV-Stämmen/Isolaten bestimmt werden. Es scheint mindestens drei Regionen an konservierten Aminosäuren im HCV-Genom zu geben, die vorstehend beschrieben sind, von denen die Primer abgeleitet werden können. Diese Regionen sind vermutlich. Die nachstehend in den Beispielen beschriebenen Primer sind von Regionen abgeleitet, von denen man annimmt, daß sie konservierte Regionen von HCV sind, basierend auf der Sequenzhomologie mit den Flaviviren.
Die Oligonucleotidprimer können mittels jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden von spezifischer Sequenz sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel die Clonierung und Restriktion geeigneter Sequenzen und die direkte chemische Synthese. Chemische Syntheseverfahren können zum Beispiel das von Narang et al (1979) beschriebene Phosphotriesterverfahren, das von Brown et al. (1979) offenbarte Phosphodiesterverfahren, das von Beaucage et al. (1981) offenbarte Diethylphosphoramidatverfahren und das Verfahren am festen Träger in U.S.- Patent Nr. 4,458,066 umfassen.
Die Primer können, wenn gewünscht, durch Einbau von Mitteln markiert sein, die mittels spektroskopischer, photochemischer, biochemischer, immunchemischer oder chemischer Mittel nachweisbar sind.
Die Matrizen-abhängige Verlängerung des Oligonucleotidprimers/der Oligonucleotidprimer wird durch ein polymerisierendes Mittel in der Gegenwart ausreichender Mengen der vier Desoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) oder Analogen in einem Reaktionsmedium durchgeführt, das aus den geeigneten Salzen, Metallkationen und pH-Puffersystemen zusammengesetzt ist. Geeignete polymerisierende Mittel sind Enzyme, von denen bekannt ist, daß sie die Primer- und Matrizen-abhängige DNA-Synthese katalysieren. Bekannte DNA-Polymerasen umfassen zum Beispiel E. coli DNA-Polymerase I oder ihr Klenow-Fragment, T&sub4; DNA-Polymerase und Taq DNA- Polymerase. Die Reaktionsbedingungen für die Katalyse der DNA-Synthese mit diesen DNA- Polymerasen sind im Stand der Technik bekannt.
Die Produkte der Synthese sind Duplexmoleküle, die aus Matrizensträngen und den Primerverlängerungssträngen bestehen, die die Zielsequenz umfassen. Diese Produkte wiederum dienen als Matrize für eine andere Runde an Replikation. In der zweiten Runde an Replikation wird der Primerverlängerungsstrang des ersten Zyklus an seinen komplementären Primer angelagert; die Synthese ergibt ein "kurzes" Produkt, das am 5'- und 3'-Ende von Primersequenzen oder ihren Komplementen begrenzt ist. Wiederholte Zyklen der Denaturierung, Primeranlagerung und Verlängerung resultiert in exponentieller Anhäufung der Zielregion, die durch die Primer bestimmt wird. Es werden ausreichend Zyklen durchlaufen, um die gewünschte Menge an Polynucleotid zu erhalten, die die Zielregion der Nucleinsäure enthält. Die gewünschte Menge kann variieren und wird durch die Funktion bestimmt, der das produzierte Polynucleotid dienen soll.
Das PCR-Verfahren kann in einer Anzahl von zeitlichen Sequenzen durchgeführt werden. Es kann zum Beispiel schrittweise durchgeführt werden, wobei nach jedem Schritt neue Reagentien zugegeben werden, oder auf eine Weise, wobei alle Reagentien simultan zugegeben werden, oder partiell schrittweise, wobei nach einer vorgegebenen Anzahl an Schritten frische Reagentien zugegeben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die PCR-Reaktion als automatisiertes Verfahren durchgeführt, das ein thermostabiles Enzym verwendet. Bei diesem Verfahren wird das Reaktionsgemisch zyklisch durch einen Denaturierungsbereich, einen Primeranlagerungsbereich und einen Reaktionsbereich bewegt. Es kann eine Maschine verwendet werden, die spezifisch an die Verwendung eines thermostabilen Enzyms angepaßt ist und die die Temperaturcylisierung ohne ein flüssiges Handhabungssystem verwendet, da das Enzym nicht nach jedem Zyklus zugegeben werden muß. Diese Art von Maschine ist von der Perkin Elmer Cetus Corp. kommerziell erhältlich.
Nach der Amplifikation mittels PCR werden die Zielpolynucleotide durch Hybridisierung mit einem Sondenpolynucleotid nachgewiesen, das unter stringenten bis mäßig stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz bildet. Wenn zu erwarten ist, daß eine Sonde mit der Zielsequenz vollständig komplemetär ist (d. h. etwa 99% oder mehr), werden stringente Bedingungen verwendet. Wenn eine gewisse Fehlpaarung erwartet wird, wenn zum Beispiel variante Stämme mit dem Ergebnis erwartet werden, daß die Sonde nicht vollständig komplemetär ist, kann die Stringenz der Hybridisierung erniedrigt werden. Es werden jedoch Bedingungen gewählt, die unspezifische/zufällige Bindung ausschließen. Bedingungen, die die Hybridisierung beeinflussen, und die unspezifische Bindung ausschließen, sind im Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel bei Maniatis et al. (1982) beschrieben. Im allgemeinen erhöhen niedrige Salzkonzentration und höhere Temperatur die Stringenz der Bindung. Es wird zum Beispiel üblicherweise angenommen, daß stringente Bedingungen eine Inkubation in Lösungen, die etwa 0,1 X SSC, 0,1% SDS enthalten, bei etwa 65ºC Inkubations/Waschtemperatur bedeuten und mäßig stringente Bedingungen eine Inkubation in Lösungen, die etwa 1-2 X SSC enthalten, 0,1% SDS bei etwa 50º-65ºC Inkubations/Waschtemperatur bedeuten. Bedingungen niedriger Stringenz sind 2 X SSC und etwa 30º-50ºC.
Sonden für HCV-Zielsequenzen können von der HCV-cDNA-Sequenz abgeleitet werden, die in Fig. 18 gezeigt wird, oder von neuen HCV-Isolaten. Die HCV-Sonden können von jeder geeigneten Länge sein, die die Zielregion überspannen, die aber die Primer ausschließen und die die spezifische Hybridisierung mit der Zielregion zulassen. Wenn vollständige Komplementarität sein soll, d. h. wenn der Stamm eine Sequenz enthält, die identisch zu der der Sonde ist, können die Sonden kurz sein, d. h. im Bereich von etwa 10-30 Basenpaaren, da das Duplexmolekül dann selbst unter stringenten Bedingungen relativ stabil ist. Wenn ein gewisses Ausmaß an Fehlpaarung mit der Sonde erwartet wird, d. h. wenn vermutet wird, daß die Sonde mit einer varianten Region hybridisiert, kann die Sonde von größerer Länge sein, da die Länge etwas der Wirkung der Fehlpaarung(en) auszugleichen scheint. Ein Beispiel dafür wird in den Beispielen gefunden, wo die Sonde geplant wurde, um an potentielle Varianten von HCV1 zu binden. In diesem Fall wurden die Primer geplant, um an HCV-cDNA zu binden, die von einer hypothetisch konservierten Region des HCV-Genoms abgeleitet war, und die Zielregion war eine, die potentiell Variationen enthielt (basierend auf dem Flavivirus-Modell). Die Sonde, die verwendet wurde, um die HCV-Zielsequenz nachzuweisen, enthielt etwa 268 Basenpaare.
Die Sondennucleinsäure, die eine Sequenz hat, die komplementär ist zu der Zielsequenz, kann unter Verwendung ähnlicher Verfahren, wie vorstehend für die Synthese der Primersequenzen beschrieben, synthetisiert werden. Wenn erwünscht, kann die Sonde markiert werden. Geeignete Markierungen sind vorstehend beschrieben.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Länge des von der Sonde nachgewiesenen PCR-Produkts zu bestimmen. Dies kann insbesondere dann wahr sein, wenn vermutet wird, daß die varianten HCV-Stämme innerhalb der Zielregion Deletionen enthalten oder wenn man die Länge des PCR-Produkts bestätigen möchte. In solchen Fällen ist es vorzuziehen, die Produkte sowohl der Größenanalyse als auch der Hybridisierung mit der Sonde zu unterwerfen. Verfahren zur Größenbestimmung von Nucleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel die Gelelektrophorese, die Gradientensedimentation und die Gelausschlußchromatographie.
Die Anwesenheit der Zielsequenz in einer biologischen Probe wird durch die Bestimmung nachgewiesen, ob sich ein Hybrid zwischen der HCV-Polynucleotidsonde und der Nucleinsäure gebildet hat, die dem PCR-Amplifikationsverfahren unterworfen wurde. Verfahren zum Nachweis von Hybriden, die zwischen einer Sonde und einer Nucleinsäuresequenz gebildet werden, sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel kann der Einfachheit halber eine nicht markierte Probe auf eine feste Matrix übertragen werden, an die sie bindet, und die gebundene Probe Bedingungen unterworfen werden, die die spezifische Hybridisierung mit der markierten Sonde ermöglichen; die feste Matrix wird dann auf die Anwesenheit der markierten Sonde untersucht werden. Wenn die Probe markiert ist, kann alternativ die nicht markierte Sonde an die Matrix gebunden werden und nach Einwirken der geeigneten Hybridisierungsbedingungen wird die Matrix auf die Anwesenheit der Markierung untersucht. Andere geeignete Hybridisierungstests werden vorstehend beschrieben.

Bestimmung von varianten HCV-Sequenzen unter Verwendung der PCR

Um variante HCV-Stämme zu identifizieren und dabei Sonden für diese Varianten zu planen, wird das vorstehend beschriebene HCV/cPCR-Verfahren verwendet, um variante Regionen des HCV-Genoms zu amplifizieren, so daß die Nucleotidsequenzen dieser varianten Zielregionen bestimmt werden können. Im allgemeinen könnte man erwarten, daß variante Typen von HCV in anderen geographischen Gebieten vorkommen als in denen, in denen der HCV1-Stamm dominierend ist, zum Beispiel Japan, Afrika usw.; oder in andern Wirbeltierarten, die auch von dem Virus infiziert werden. Variantes HCV kann auch während der Passagen in Gewebekultursystemen oder als Resultat von spontanen oder induzierten Mutationen auftreten.
Um die variante Zielregion zu amplifizieren, werden Primer geplant, die die in Verdacht stehende Region flankieren und vorzugsweise komplementär zu konservierten Regionen sind. Primer zu zwei Regionen von HCV, die wahrscheinlich konserviert sind, basierend auf dem Flavivirus-Modell, sind in den Beispielen beschrieben. Diese Primer und Sonden könne unter Verwendung der Sequenzinformation geplant werden, die für den HCV1- Stamm in Fig. 18 bereitgestellt wird.
Die Analyse der Nucleotidsequenz der Zielregion(en) kann durch direkte Analyse der mittels PCR amplifizierten Produkte erfolgen. Ein Verfahren für die direkte Sequenzanalyse von mittels PCR amplifizierten Produkten ist bei Saiki et al. (1988) beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform kann die amplifizierte Zielsequenz/können die amplifizierten Zielsequenzen vor der Sequenzanalyse cloniert werden. Ein Verfahren für die direkte Clonierung und Sequenzanalyse von enzymatisch amplifizierten genomischen Segmenten wurde von Scharf (1986) beschrieben. Bei diesem Verfahren werden die beim PCR-Verfahren verwendeten Primer in der Nähe des 5'-Endes modifiziert, um passende Restriktionsstellen für die direkte Clonierung in zum Beispiel einen M13 Sequenzierungsvektor zu produzieren. Nach der Amplifikation werden die PCR-Produkte mit den geeigneten Restriktionsenzymen gespalten. Die Restriktionsfragmente werden in den M13-Vektor ligiert und zum Beispiel in den JM 103-Wirt transformiert, ausplattiert, und die resultierenden Plaques werden mittels Hybridisierung mit einer markierten Oligonucleotidsonde durchmustert. Andere Verfahren für die Clonierung und Sequenzanalyse sind im Stand der Technik bekannt.

Universelle Primer für Flaviviren und für HCV

Untersuchungen zur Natur des Genoms von HCV unter Verwendung von Sonden, die von der HCV-cDNA abgeleitet sind, ebenso wie Sequenzinformation, die in der HCV-cDNA enthalten ist, legen nahe, daß HCV ein Flavi-ähnliches Virus ist. Diese Untersuchungen werden in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben, die dem hier genannten Rechtsnachfolger gehört und die vollständig hier umfaßt wird. Ein Vergleich der HCV-cDNA- Sequenz, die von den HCV-cDNA-Clonen abgeleitet ist, mit bekannten Sequenzen einer Reihe von Flaviviren zeigt, daß HCV Sequenzen enthält, die homolog sind zu konservierten Sequenzen in den Flaviviren. Diese konservierten Sequenzen können die Schaffung von Primern ermöglichen, die universell in ihrer Anwendung bei der Amplifikation von Zielregionen von Flaviviren und für HCV sind. Diese Sequenzen sind das 16-mer oder kleinere Sequenzen von den 3'-Enden der in den Beispielen beschriebenen Primer. Die Identifizierung der Art wird dann unter Verwendung einer Sonde, die für die Art spezifisch ist, durchgeführt. Die Genome einer Reihe von Flaviviren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel das japanische Enzephalitis-Virus (Sumiyoshi et al. (1987)), Gelbfiebervirus (Rice et al. (1985)), Dengue Typ 2-Virus (Hahn et al. (1988)), Dengue Typ 4-. Virus (Mackow (1987)) und West Nile Virus (Castle et al. (1986)). Die Identifizierung von HCV-RNA wird unter Verwendung einer Sonde erreicht, die spezifisch für HCV ist, dessen Sequenz mittels der HCV-cDNA-Sequenzen bestimmt werden kann, die hier bereitgestellt werden.
In einer anderen Ausführungsform erlaubt die Verwendung eines Satzes an Sonden, die so geplant sind, daß sie der Degenerierung des Codons Rechnung tragen und deshalb für die Flaviviren und für HCV gemeinsame Sequenzen enthalten, bestimmt durch Vergleich der HCV-Aminosäursequenzen mit den bekannten Sequenzen der Flaviviren, ein allgemeines Nachweissystem für diese Viren.

Herstellung von gewünschten DNA-Sequenzen

Synthetische Oligonucleotide können unter Verwendung eines automatischen Oligonucleotid-Synthesegeräts, wie von Warner (1984) beschrieben, hergestellt werden. Wenn gewünscht, können die synthetischen Stränge durch Behandlung mit ³²P mit Polynucleotid- Kinase in der Gegenwart von ³²P-ATP unter Standardbedingungen für die Reaktion markiert werden.
DNA-Sequenzen, einschließlich der aus cDNA-Bibliotheken isolierten, können mittels bekannter Verfahren modifiziert werden, einschließlich zum Beispiel der ortsgerichteten Mutagenese, wie von Zoller (1982) beschrieben. Kurz gesagt wird die zu modifizierende DNA als einzelsträngige Sequenz in Phagen verpackt und mittels DNA-Polymerase in doppelsträngige DNA überführt unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids als Primer, das komplementär zu dem zu modifizierenden Teil der DNA ist und das in seiner eigenen Sequenz die Modifikation einschließt. Die resultierende doppelsträngige DNA wird in ein Wirtsbakterium transformiert, das Phagen trägt. Kulturen der transformierten Bakterien, die Replikationen von jedem Strang des Phagen enthalten, werden in Agar ausplattiert, um Plaques zu erhalten. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques Phagen, die die mutierte Sequenz haben, und die restlichen 50% haben die ursprüngliche Sequenz. Replikate der Plaques werden mit markierten, synthetischen Sonden bei Temperaturen und Bedingungen hybridisiert, die die Hybridisierung mit dem korrekten Strang ermöglichen, aber nicht mit der nicht modifizierten Sequenz. Die mittels Hybridisierung identifizierten Sequenzen werden gewonnen und cloniert.

Kits für die Durchmusterung auf von HCV abgeleitete Polynucleotide

Oligomere, die Primer für die Amplifikation von Proben für HCV sind, können in Kits verpackt werden. Kits für die Amplifikation von HCV-Sequenzen können die oligomeren Primer enthalten, die bei der Amplifikation verwendet wurden. Die Kits enthalten die Primer üblicherweise in einer vorgemessenen oder vorbestimmten Menge, ebenso wie andere geeignete verpackte Reagentien und Materialien, in getrennten, geeigneten Behältern, die für das (die) spezielle(n) Amplifikationsprotokoll(e) erforderlich sind. Zum Beispiel kann der Kit Standards, Puffer, Träger, Enzyme, Substrate, Markierungssonden, Bindungspartner und/oder Anweisungen zur Durchführung des Tests enthalten.

Beispiele

Nachstehend werden Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben, die nur zu Illustrationzwecken bereitgestellt werden und nicht zur Begrenzung des Umfangs der vorliegenden Erfindung.

Isolierung und Sequenz der überlappenden HCV-cDNA-Clone 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e und CA167b

Die Clone 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e und CA167b wurden von der lambdagtl 1-Bibliothek isoliert, die HCV-cDNA enthält (ATCC Nr. 40394), deren Herstellung in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 (offengelegt am 31. Mai 1989) und der WO 89/04669 (offengelegt am 1. Juni 1989) beschrieben ist. Die Durchmusterung der Bibliothek wurde mit den Sonden, die nachstehend beschrieben werden, unter Verwendung des in Huynh (1985) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Die Häufigkeit, mit der positive Clone erschienen, war mit den entsprechenden Sonden etwa 1 in 50.000.
Die Isolierung von Clon 13i wurde unter Verwendung einer synthetischen Sonde erreicht, die von der Sequenz von Clon 12f abgeleitet war, Die Sequenz der Sonde war:
5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'.
Die Isolierung von Clon 26j wurde unter Verwendung einer Sonde erreicht, die von der 5'-Region von Clon K9-1 abgeleitet war, Die Sequenz der Sonde war:
5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'.
Das Isolierungsverfahren für Clon 12f und für Clon k9-1 (auch K9-1 genannt) wird in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben, und ihre Sequenzen werden in den Fig. 1 bzw. 2 gezeigt. Die HCV-cDNA-Sequenzen der Clone 13i und 26j werden in den Figs. 4 und 5 gezeigt. Auch die davon codierten Aminosäuresequenzen werden gezeigt, ebenso wie die Überlappung von Clon 13i mit Clon 12f und die Überlappung von Clon 26j mit Clon 13i. Die Sequenzen dieser Clone bestätigten die Sequenz von Clon K9-1. Clon K9-1 wurde von einer anderen HCV-cDNA-Bibliothek isoliert (vgl. E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 218,316).
Der Clon CA59a wurde unter Verwendung einer Sonde isoliert, die auf der Sequenz der 5'-Region von Clon 26j basierte. Die Sequenz dieser Sonde war:
5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'.
Eine Sonde, die von der Sequenz von Clon CA59a abgeleitet war, wurde verwendet, um den Clon CA84a zu isolieren. Die Sequenz der für diese Isolierung verwendeten Sonde war:
5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.
Der Clon CA156e wurde unter Verwendung einer Sonde isoliert, die von der Sequenz von Clon CA84a abgeleitet war. Die Sequenz der Sonde war:
5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.
Der Clon CA167b wurde unter Verwendung einer Sonde isoliert, die von der Sequenz von Clon CA 156e abgeleitet war. Die Sequenz der Sonde war:
5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.
Die Nucleotidsequenzen der HCV-cDNAs in den Clonen CA59a, CA84a, CA156e und CA167b werden in den Figs. 6, 7, 8 bzw. 9 gezeigt. Die davon codierten Aminosäuren ebenso wie die Überlappung mit den Sequenzen der relevanten Clone werden ebenfalls in den Figuren gezeigt.

Herstellung der "pi"-HCV-cDNA-Bibliothek

Eine Bibliothek von HCV-cDNA, die "pi"-Bibliothek, wurde von demselben Ansatz von infektiösem Schimpansenplasma konstruiert, der verwendet wurde, um die lambda gt11 HCV-cDNA-Bibliothek (ATCC Nr. 40394) zu konstruieren, die in der E.P.A.-Offenlegungs- Nr. 318,216 beschrieben ist, und unter Verwendung der im Wesentlichen gleichen Verfahren. Die Konstruktion der pi-Bibliothek verwendete jedoch ein Primerverlängerungsverfahren, bei dem der Primer für die reverse Transkriptase auf der Sequenz von Clon CA59a basierte. Die Sequenz des Primers war:
5' GGT GAC GTG GGT TTC 3'.

Die Isolierung und Sequenz von Clon pi14a

Die Durchmusterung der "pi" HCV-cDNA-Bibliothek, die vorstehend beschrieben ist, mit der Sonde, die verwendet wurde, um den Clon CA167b zu isolieren (vgl. vorstehend) ergab den Clon pi14a. Der Clon enthält etwa 800 Basenpaare an cDNA, die mit den Clonen CA167b, CA156e, CA84a und CA59a überlappen, die von der lambda gt11 HCV-cDNA- Bibliothek (ATCC Nr. 40394) isoliert worden waren. Zusätzlich enthält pi14a auch etwa 250 Basenpaare an DNA, die stromaufwärts der HCV-cDNA in Clon CA167b liegen.

Isolierung und Sequenz der Clone CA216a, CA290a und ag30a

Basierend auf der Sequenz von Clon CA167b wurde eine synthetische Sonde hergestellt, die die folgende Sequenz hat:
5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'
Die vorstehende Sonde wurde verwendet, um die zu durchmustern, was Clon CA216a ergab, dessen HCV-Sequenzen in Fig. 10 gezeigt werden.
Eine andere Sonde wurde hergestellt, basierend auf der Sequenz von Clon CA216a, die die folgende Sequenz hat:
5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'
Die Durchmusterung der lambda gtl 1-Bibliothek (ATCC Nr. 40394) mit dieser Sonde ergab Clon CA290a, wobei die darin enthaltenen HCV-Sequenzen in Fig. 11 gezeigt sind.
In einem parallelen Ansatz wurde unter Verwendung von Nucleinsäure, die von demselben infektiösen Plasma isoliert worden waren, das in der ursprünglichen, vorstehend beschriebenen lambda gt11-cDNA-Bibliothek verwendet worden war, eine Primerverlängerungs-cDNA-Bibliothek hergestellt. Der verwendete Primer basierte auf der Sequenz der Clone CA216a und CA290a:
5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'
Die cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von Verfahren gemacht, die denen ähnlich sind, die vorstehend für Bibliotheken beschrieben wurden, die bei der Isolierung der Clone pi14a und k9-1 verwendet wurden. Die für die Durchmusterung dieser Bibliothek verwendete Sonde basierte auf der Sequenz von Clon CA290a:
5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'
Der Clon ag30a wurde mit obiger Sonde von der neuen Bibliothek isoliert, und er enthielt etwa 670 Basenpaare an HCV-Sequenz. Vgl. Fig. 12. Ein Teil dieser Sequenz überlappt mit der HCV-Sequenz der Clone CA216a und CA290a. Etwa 300 Basenpaare der ag30a-Sequenz liegen jedoch stromaufwärts der Sequenz von Clon CA290a. Die nicht-überlappende Sequenz zeigt ein Start-Codon (*) und Stop-Codons, die den Start des ORF von HCV anzeigen könnten. Ebenfalls in Fig. 12 gezeigt sind mutmaßliche, kleine, codierte Peptide (#), die bei der Regulierung der Translation eine Rolle spielen können, ebenso wie die mutmaßliche, erste Aminosäure des mutmaßlichen Polypeptids (/) und davon codierte, stomabwärts gelegene Aminosäuren.

Die Isolierung und Sequenz von Clon CA205a

Der Clon CA205a wurde von der ursprünglichen lambda gtl 1-Bibliothek (ATCC Nr. 40394) unter Verwendung einer synthetischen Sonde isoliert, die von der HCV-Sequenz in Clon CA290a abgeleitet war (Fig. 11). Die Sequenz der Sonde war:
5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'.
Die Sequenz der in Fig. 13 gezeigten HCV-cDNA in CA205a überlappt mit den cDNA- Sequenzen in den beiden Clonen ag30a und CA290a. Die Überlappung der Sequenz mit der von CA290a wird durch die gepunktete Linie oberhalb der Sequenz gezeigt (die Figur zeigt auch die mutmaßlichen Aminosäuren, die in diesem Fragment codiert werden.
Wie bei den HCV-cDNA-Sequenzen in den Clonen CA205a und ag30a beobachtet, scheint das mutmaßliche HCV-Polyprotein am ATG-Startcodon zu beginnen; die HCV- Sequenzen in beiden Clonen enthalten im Rahmen ein zusammenhängendes Doppel-Stop- Codon (TGATAG), 42 Nucleotide stromauf von diesem ATG. Der HCV-ORF scheint nach diesen Stop-Codons zu beginnen und sich über mindestens 8907 Nucleotide zu erstrecken (vgl. die zusammengesetzte HCV-cDNA, die in Fig. 18 gezeigt wird).

Isolierung und Sequenz von Clon 18g

Basierend auf der Sequenz von Clon ag30a (vgl. Fig. 12) und eines überlappenden Clons von der ursprünglichen lambda gt11-Bibliothek (ATCC Nr. 40394), CA230a, wurde eine synthetische Sonde hergestellt, die die folgende Sequenz hatte:
5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.
Die Durchmusterung der ursprünglichen lambda gtl 1-HCV-cDNA-Bibliothek mit der Sonde ergab Clon 18g, dessen HCV-cDNA-Sequenz in Fig. 14 gezeigt wird. In dieser Figur werden auch die Überlappung mit dem Clon ag30a und mutmaßliche Polypeptide gezeigt, die innerhalb der HCV-cDNA codiert werden.
Die cDNA in Clon 18g (C 18g oder 18g) überlappt mit der in den vorstehend beschriebenen Clonen ag30a und CA205a. Die Sequenz von ClBg enthält auch die Doppel- Stop-Codon-Region, die in Clon ag30a beobachtet wird. Die Polynucleotidregion stromaufwärts von diesen Stop-Codons stellt vermutlich einen Teil der 5'-Region des HCV- Genoms dar, der kurze ORFs enthalten kann, was durch direkte Sequenzierung des gereinigten HCV-Genoms bestätigt werden kann. Diese mutmaßlichen, kleinen, codierten Peptide können eine regulatorische Rolle bei der Translation spielen. Die Region des HCV-Genoms stromaufwärts von der, die durch C18g repräsentiert wird, kann unter Verwendung von im Wesentlichen dem Verfahren für die Sequenzanalyse isoliert werden, das in der E.P.A.- Offenlegungs-Nr. 318,216 für die Isolierung von cDNA-Sequenzen stromaufwärts der HCV- cDNA-Sequenz in Clon 12f beschrieben ist. Im Wesentlichen werden kleine synthetische Oligonucleotidprimer von reverser Transkriptase synthetisiert, die auf der Sequenz von C18g basieren, und verwendet, um an die entsprechenden Sequenzen in genomischer RNA von HCV zu binden. Die Primersequenzen befinden sich proximal zu dem bekannten 5'-Ende von C18g, aber ausreichend stromabwärts, um die Planung von Sondensequenzen stromaufwärts der Primersequenzen zuzulassen. Bekannte Standardverfahren für das Primen und die Clonierung werden verwendet. Die resultierenden cDNA-Bibliotheken werden mit Sequenzen durchmustert, die stromaufwärts der Primerstellen liegen (abgeleitet von der aufgeklärten Sequenz von C18g). Die genomische RNA von HCV wird entweder aus Plasma oder Leberproben von Individuen mit NANBH erhalten. Da HCV ein Flavi-ähnliches Virus zu sein scheint, kann das 5'-Ende des Genom Kappen-Struktur am 5'-Ende enthalten (Gelbfieber- Virus, Rice et al. (1988); Dengue-Virus, Hahn et al. (1988); Japanischer Enzephalitis-Virus (1987)).

Isolierung und Seciuenz von Clonen von der beta-HCV-cDNA-Bibliothek

Clone, die cDNA enthalten, die repräsentativ ist für die Region am 3'-Ende des HCV- Genoms, wurden von einer cDNA-Bibliothek isoliert, die von dem ursprünglichen Pool an infektiösem Schimpansenplasma konstruiert wurde, das für die Herstellung der HCV-cDNAlambda-gt11-Bibliothek (ATCC Nr. 40394) verwendet wurde, die in der E.P.A.-Offenlegungs- Nr. 318,216 beschrieben ist. Um die DNA-Bibliothek zu erzeugen, wurde aus dem Plasma extrahierte RNA unter Verwendung von Poly (rA)-Polymerase "ein Schwanz" aus Poly (rA) "angefügt", und unter Verwendung von Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer für die reverse Transkriptase wurde cDNA synthetisiert. Das resultierende RNA:cDNA-Hybrid wurde mit RNAase H verdaut und in doppelsträngige HCV-cDNA umgewandelt. Die resultierende HCV-cDNA wurde unter Verwendung von im Wesentlichen dem von Huynh (1985) beschriebenen Verfahren in lambda-gt10 cloniert, was die beta (oder b)-HCV-cDNA-Bibliothek ergab. Die verwendeten Verfahren waren wie folgt.
Eine Teilmenge des Plasmas (12 ml) wurde mit Proteinase K behandelt und mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert, das 0,05 M Tris-Cl, pH 7,5, 0,05% (Vol./Vol.) beta- Mercaptoethanol, 0,1% (Gew./Vol.) Hydroxychinolin, 1 mM EDTA gesättigt war. Die resultierende wäßrige Phase wurde mit dem Phenol-Gemisch erneut extrahiert, gefolgt von 3 Extraktionen mit einem 1 : 1 Gemisch von Phenol und Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1), gefolgt von 2 Extraktionen mit einem Gemisch aus Chloroform und Isoamylalkohol (1 : 1). Nachdem die wäßrige Phase bezüglich NaCl auf 200 mM eingestellt worden war, wurden die Nucleinsäuren in der wäßrigen Phase über Nacht bei -20ºC mit 2,5 Volumina an kaltem, absolutem Ethanol ausgefüllt. Die Niederschläge wurden mittels einer 40 minütigen Zentrifugation bei 10.000 UpM gesammelt, mit 70% Ethanol, das 20 mlvi NaCl enthielt, und mit 100% kaltem Ethanol gewaschen, 5 min in einem Exsikkator getrocknet und in Wasser gelöst.
An die isolierten Nucleinsäuren von dem Pool an infektiösem Schimpansenplasma wurde unter Verwendung von Poly-A-Polymerase in der Gegenwart von menschlichem Ribonuclease-Inhibitor aus Placenta (HPRI) (bei Amersham Corp. gekauft) und von MS2 RNA als Träger ein Schwanz aus Poly(rA) angefügt. Die isolierten Nucleinsäuren, die denjenigen in 2 ml Plasma entsprachen, wurden in einer Lösung inkubiert, die TMN (50 mM Tris HCl, pH 7,9, 10 mM MgCl&sub2;, 250 mM NaCl, 2,5 mM MnCl&sub2;, 2 mlvi Dithiothreit (DTT), 40 Mikromol alpha-[³²P] ATP, 20 Einheiten HPRI (Amersham Corp.) und etwa 9 bis 10 Einheiten an RNase-freier Poly-A-Polymerase (BRL) enthielt. Die Inkubation betrug 10 min bei 37ºC, und die Reaktion wurde mit EDTA (Endkonzentration etwa 250 mM) gestoppt. Die Lösung wurde mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform und mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, und die Nucleinsäuren wurden über Nacht bei -20ºC mit 2,5 Volumina Ethanol in der Gegenwart von 200 mlvi NaCl ausgefällt.

Isolierung von Clon b5a

Die beta-HCV-cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung einer synthetischen Sonde, die eine Sequenz hatte, die auf der HCV-cDNA-Sequenz von Clon 15e basierte, mittels Hybridisierung durchmustert. Die Isolierung von Clon 15e wird in der E.P.A.-Offenlegungs- Nr. 318,216 beschrieben, und seine Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt. Die Sequenz der synthetischen Sonde war:
5' ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'.
Die Durchmusterung der Bibliothek ergab Clon beta-5a (b5a), der eine HCV-cDNA- Region von etwa 1000 Basenpaaren enthält. Die 5'-Region dieser cDNA überlappt mit den Clonen 35f, 19g, 26g und 15e (diese Cione sind vorstehend beschrieben). Die Region zwischen der Poly-A-Sequenz am 3'-Ende und der 3'-Sequenz, die mit Clon 15e überlappt, enthält etwa 200 Basenpaare. Dieser Clon ermöglicht die Identifikation einer Region der Sequenz am 3'-Ende des HCV-Genoms.
Die Sequenz von b5a ist innerhalb der Sequenz der HCV-cDNA in Clon 16jh (nachstehend beschrieben) enthalten. Darüber hinaus ist die Sequenz auch in CC34a enthalten, isoliert aus der ursprünglichen lambda gtl 1-Bibliothek (ATCC Nr. 40394). (Die ursprüngliche lambda gtl 1-Bibliothek wird hier als "C"-Bibliothek bezeichnet).

Isolierung und Sequenz von Clonen, die mittels PCR-Amplifikation der 3'-Region des HCV-Genoms erzeugt wurden

Mehrere cDNA-Clone wurden erzeugt, die Nucleotidsequenzen enthalten, die von der 3'-Region des HCV-Genoms abgeleitet sind. Dies wurde durch Amplifikation einer Zielregion des Genoms mittels eines Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens erreicht, das in Saiki et,al. (1986) und in Saiki et al. (1988) beschrieben ist und das, wie nachstehend beschrieben, modifiziert wurde. Die HCV-RNA, die amplifiziert wurde, Wurde von dem ursprünglichen Pool an infektiösem Schimpansenplasma erhalten, das für die Herstellung der HCV-cDNAlambda-gt11-Bibliothek (ATCC Nr. 40394) verwendet wurde, die in der E.P.A.-Offenlegungs- Nr. 318,216 beschrieben ist. Die Isolierung der HCV-RNA war, wi vorstehend beschrieben. An die isolierte RNA wurde mittels E. coli-PolyA-Polymerase am 3'-Ende mittels ATP ein Schwanz angehängt, wie von Sippel (1973) beschrieben, außer daß die Nucleinsäure-Substrate durch die Nucleinsäuren ersetzt wurden, die aus dem Schimpansenserum isoliert worden waren. Die RNA mit Schwanz wurde dann durch reverse Transkriptase einer reversen Transkription in cDNA, unter Verwendung eines Oligo dT-Primer-Adaptors, unterworfen im Wesentlichen wie von Han (1987) beschrieben, außer daß die Komponenten und die Sequenz des Primer-Adaptors waren:
Die resultierende cDNA wurde dann mittels PCR unter Verwendung von zwei Primern einer Amplifikation unterworfen:

Primer Sequenz

JH32 (30mer) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC
JH11 (20mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
Der JH32-Primer enthielt 20 Nucleotidsequenzen, die mit dem 5'-Ende der Zielregion in der cDNA mit einem geschätzten TM von 66ºC hybridisierbar waren. JH11 wurde von einem Teil des Oligo dT-Primer-Adaptors abgeleitet; somit ist er spezifisch für das 3'-Ende der cDNA mit einem TM von 64ºC. Beide Primer wurden so geplant, daß sie für die Verwendung bei der folgenden Clonierung der amplifizierten HCV-cDNA am 5'-Ende eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Not I aufwiesen.
Die PCR-Reaktion wurde durch Suspension der cDNA und der Primer in 100 Mikroliter an Reaktionsgemisch durchgeführt, das die vier Desoxynucleosidtriphosphate, Puffersalze und Metallionen und eine thermostabile, von Ihermus aquaticus isolierte DNA- Polymerase (Taq Polymerase) enthielt, die in einem Perkin Elmer Cetus-PCR-Kit (N801-0043 oder N801-0055) vorliegen. Die PCR-Reaktion wurde für 35 Zyklen in einem Perkin Elmer Cetus-DNA-Thermalcycler durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungschrift von 1,5 min bei 94ºC, einem Anlagerungsschritt von 2 min bei 60ºC, einem Primer-Verlängerungsschritt von 3 min bei 72ºC. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung einer Sonde mit 30 Nucleotiden, JH34, deren Sequenz auf der der Region am 3'- Ende von Clon 15e basiert, der Southern Blot-Analyse unterworfen, Die Sequenz von JH34 ist:
5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'.
Die durch die HCV-cDNA-Sonde nachgewiesenen PCR-Produkte bewegten sich in der Größe zwischen etwa 50 bis zu etwa 400 Basenpaaren.
Um die amplifizierte HCV-cDNA zu clonieren, wurden die PCR-Produkte mit NotI gespalten und mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Größe nach geordnet. DNA, die größer war als 300 Basenpaare, wurde in die NotI-Stelle von pUC18S cloniert. Der Vektor pUC18S wird durch Einbau eines NotI-Polylinkers konstruiert, der zwischen die EcoRI- und SalI-Stellen von pUC 18 cloniert ist. Die Clone wurden unter Verwendung der JH34-Sonde auf HCV-cDNA durchmustert. Es wurde eine Anzahl an positiven Clonen erhalten und sequenziert. Die Nucleotidsequenz der HCV-cDNA-Insertion in einem dieser Clone, 16jh, und die davon codierten Aminosäuren sind in Fig. 15 gezeigt. Eine Nucleotid-Heterogenität, die in der Sequenz der HCV-cDNA in Clon 16jh im Vergleich mit einem anderen Clon dieser Region nachgewiesen wurde, ist in der Figur angezeigt.

Isolierung und Sequenz von Clon 6k

Basierend auf der Sequenz von Clon 16jh und Clon b5a (vgl. vorstehend), wurde eine synthetische Sonde mit der folgenden Sequenz gemacht:
5' TCT TCA ACT GGG CAG TAA GAA CAA AGC TCA 3'.
Die Durchmusterung der ursprünglichen lambda gt11-HCV-cDNA-Bibliothek (beschrieben in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216) mit der Sonde ergab Clone mit einer Häufigkeit von etwa 1 in 10&sup6;; einer von ihnen wurde als Clon 6k bezeichnet (auch C6k genannt), dessen HCV-cDNA-Sequenz in Fig. 16 gezeigt ist. Ebenfalls in dieser Figur sind die Überlappung mit dem Clon 16jh und mutmaßliche Polypeptide, die von der HCV-cDNA codiert werden, gezeigt. Die Sequenzinformation von der HCV-cDNA in Clon 6k wurde von nur einem Strang erhalten. Die Information über die Hinterlegung diese Clons wird nachstehend bereitgestellt, wobei dieser Clon als Lambda gt11 C6k aufgelistet ist. Die Bestätigung, daß die C6K-Sequenz ein Teil eines ORF ist, der das HCV1-Polypeptid codiert, wurde durch die Sequenzierung von anderen, überlappenden Clonen erhalten.

Isolierung und Sequenz von Clon p131jh

Ein Clon, der eine Sequenz von der 3'-Region des HCV-Genoms enthält und der im Leserahmen ein Stopp-Codon enthält, wurde, im Wesentlichen wie vorstehend für die Isolierung von mittels PCR-Amplifikation der 3'-Region des Genoms erzeugten Clonen beschrieben, isoliert, außer daß die HCV1-RNA unter Verwendung des Oligonucleotids
5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA GAA T&sub1;&sub5; 3'
in cDNA umgewandelt worden war. Die cDNA wurde dann unter Verwendung der Primer:
5' TTC GCG GCC GCT ACA GCG GGG GAG ACA T 3-'
und
5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GA 3'
mittels der PCR-Reaktion amplifiziert.
Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte mit Spermin ausgefällt, mit NotI verdaut und mit Phenol extrahiert. Die gereinigten Produkte wurden in die NotI-Stelle von pUC18S cloniert und unter Verwendung des Oligonucleotids:
5' CGA TGA AGG TTG GGG TAA ACA CTC CGG CCT 3' wurden HCV-positive Clone selektiert. Die HCV-cDNA in einem Clon, als p131jh bezeichnet, ist in Fig. 17 gezeigt. Dieser Clon enthält ein Stopp-Codon für den großen ORF, der im HCV- Genom enthalten ist, im Leserahmen.

Isolierung und Sequenz von Clon 5'-Clon32

Ein Clon, der eine Sequenz von der 5'-Region des HCV-Genoms stromaufwärts der Sequenz in Clon b114a enthält, wurde isoliert und die Nucleotidsequenz mittels einer Modifikation des Verfahrens für die Isolierung und Sequenz von Clonen bestimmt, die durch die PCR- Amplifikation der 3'-Region des Genoms erzeugt worden sind, beschrieben in der U.S.S.N. 456,637, die durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Im allgemeinen wurde die Zielsequenz des Genoms mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert, das in Saiki et al. (1986) und in Saiki et al. (1988) beschrieben ist. Die HCV-RNA, die amplifiziert wurde, wurde durch Extraktion von menschlichem Serum (klinisches U.S.-Isolat, HCV27) unter Verwendung eines kalten Guanidiniumthiocyanat-Verfahrens erhalten, welches von Han et al. (1987) beschrieben ist. Die extrahierte RNA wurde mit reverser Transkriptase in einzelsträngige cDNA unter Verwendung eines Primers, JH94, umgewandelt, der komplementär zu den Nucleotiden -250 bis -223 des HCV-Genoms (vgl. Fig. 18) ist. Die Sequenz von JH94 ist:
5' CCT GCG GCC GCA CGA CAC TCA TAC TAA 3'.
Die Umwandlung von einzelsträngiger zu doppelsträngiger HCV-cDNA wurde durch Verlängerung der DNA mit etwa 20 bis 50 dA-Resten unter Verwendung der terminalen Desoxynucleotididyl-Transferase (Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING) und Replikation des verlängerten Moleküls unter Verwendung des folgenden Oligo-dT-Primer- Adaptors erreicht, der eine NotI-Stelle und einen sp6-Promotor enthält:
Die resultierende cDNA wurde der Amplifikation mittels PCR unter Verwendung von zwei Primern unterworfen, JH94 (vorstehend beschrieben) und JH11, der die folgende Sequenz hat.

Primer Sequenz

JH11 (20mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
Die PCR-Reaktion wurde durch Suspension der cDNA und der Primer in 100 Mikroliter Reaktionsgemisch durchgeführt, welches die vier Desoxynucleosidtriphosphate, Puffersalze und Metallionen und eine thermostabile, von Thermus aquaticus isolierte DNA- Polymerase (Taq Polymerase) enthielt, die in einem Perkin Elmer Cetus-PCR-Kit (N801-0043 oder N801-0055) vorliegen. Die PCR-Reaktion wurde für 35 Zyklen in einem Perkin Elmer Cetus-DNA-Thermalcycler durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungschritt von 1,5 min bei 94ºC, einem Anlagerungsschritt von 2 min bei 60ºC und einem Primer-Verlängerungsschritt von 3 min bei 72ºC.
Die PCR-Produkte wurden mit NotI verdaut und in pUC18S cloniert. Die Clone, die HCV-Nucleotidsequenzen enthielten, wurden mittels Durchmusterung mit einer Sonde, Alex90, erhalten, die von den Nucleotiden -312 bis -283 des HCV1-Genoms abgeleitet ist und die die Sequenz:
5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'
hat. Die HCV-cDNAs in den isolierten Clonen wurden mittels des Didesoxy- Kettenterminationsverfahrens (Sanger et al. (1977)) sequenziert. Die Sequenz von HCV- cDNA in einem der isolierten Clone, 5'-Clon32, überspannt die Region der Nucleotide -224 bis -341 in Fig. 18.
Eine Analyse der Nucleotidsequenz von HCV-cDNA zeigte, daß das Replikat des HCV-RNA-Strangs eine GC-reiche Strecke enthält, die in der Lage sein kann, eine stabile Haarnadelstruktur zu bilden:
In der Struktur zeigen die gestrichelten Linien mögliche Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Nucleotiden an.
Eine Recherche in der Computer-Datenbank Genebank ergab, daß bei bekannten viralen Sequenzen homologe Sequenzen nicht vorkommen. Somit kann diese Sequenz einzigartig für das 5'-Ende des HCV-Genoms sein.
Eine Haarnadelstruktur kann als ein Erkennungssignal für eine Transkriptase dienen und/oder sie kann zur Stabilität der RNA am 5'-Ende beitragen.

Zusammengesetzte HCV-cDNA-Sequenzen

Eine HCV-cDNA-Sequenz wurde von einer Serie von überlappenden Clonen zusammengesetzt, die von den verschiedenen, hier und in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschriebenen HCV-cDNA-Bibliotheken abgeleitet sind. Die Clone, von denen Fig. 18 abgeleitet wurde, sind Clon 5'-32, b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, - CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (auch k9-1 genannt) 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19 g, 26g, 15e, b5a, 16jh, C6k und pl131jh. Die Verfahren zur Isolierung dieser Clone ebenso wie ihre Sequenzen werden hier und in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 diskutiert, die hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird. In der Fig. 18 zeigen die drei Striche oberhalb der Sequenz die Lage des mutmaßlichen Initiator-Methionin-Codes an.
Der Clon b114a überlappt mit den Clonen 18g, ag30a und CA205a, außer daß der Clon b114a zwei zusätzliche Nucleotide stromaufwärts der Sequenz in Clon 18g enthält (d. h. 5'- CA). Diese zwei zusätzlichen Nucleotide wurden in die genomische Sequenz von HCV eingeschlossen, die in Fig. 18 gezeigt wird.
Es sollte festgehalten werden, daß, obwohl mehrere der vorstehend beschriebenen Clone von anderen Bibliotheken als der ursprünglichen HCV-cDNAlambda-gt11C- Bibliothek (ATCC Nr. 40394) erhalten wurden, diese Clone HCV-cDNA-Sequenzen enthalten, die mit den HCV-cDNA-Sequenzen in der ursprünglichen Bibliothek überlappen. Somit ist im Wesentlichen die gesamte HCV-Sequenz von der ursprünglichen lambda gt11C- Bibliothek (ATCC Nr. 40394) ableitbar, die verwendet wurde, um den ersten HCV-cDNA- Clon (5-1-1) zu isolieren. Die Isolierung von Clon 5-1-1 wird in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
Die mutmaßliche Sequenz des hauptsächlichen HCV-Polyproteins, die von der zusammengesetzten HCV1-cDNA codiert wird, ist auch gezeigt. Die erste Aminosäure in der Sequenz ist das mutmaßliche Initiator-Methionin des großen ORF. Die varianten Aminosäuren, die auf clonalen Heterogenitäten beruhen, werden oberhalb der Sequenz gezeigt. Da die lambda-gt-11-Bibliothek aus Serum gewonnen wurde, das von einem einzigen Individuum (vgl. E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216) erhalten worden war, legen die Ergebnisse nahe, daß variante virale Sequenzen (Nucleotid und Aminosäure) in diesen Individuum vorhanden sind.
Eine Untersuchung der zusammengesetzten HCV-cDNA-Sequenz zeigt, daß es neben dem großen ORF eine Reihe von ORFs gibt, die stromaufwärts von dem liegen, der das Polyprotein codiert, und daß es innerhalb der Sequenz, die das Polyprotein codiert, eine Reihe von kleinen ORFs in den anderen beiden translationalen Rahmen gibt. Die ORFs stromaufwärts des HCV-Polyproteins werden in der Tabelle direkt darunter gezeigt.

Tabelle

ORFs stromaufwärts von dem, der das aroße HCV-Polyprotein codiert
Der Leserahmen, die Position und die Größe der ORFs stromabwärts der Sequenz, die das mutmaßliche Initiator-MET des Polyproteins codiert, werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Das hauptsächliche Polyprotein ist das vom Leserahmen 2 translatierte.

Tabelle

ORFs stromabwärts von der Sequenz, die das mutmaßliche Initiator-MET codiert
Zusätzlich zu dem Vorstehenden enthält auch die Sequenz, die zum genomischen Strang von HCV-RNA komplementär ist, bei Überprüfung mehrere kleine ORFs. Einer dieser ORFs, der komplementär zu den Nucleotiden -341 bis +837 in der HCV-RNA-Sequenz ist, codiert ein Polypeptid von 385 Aminosäuren.

Vergleich der Sequenz von 5'-Regionen, die von HCV-Isolaten von verschiedenen geographischen Gebieten erhalten wurde

Die Nucleotidsequenzen von 5'-Regionen von HCV-Isolaten aus den U.S.A. (HCV18, HCV27), aus Italien (HCVI1, HCVI24) und von Korea (HCVKI) wurden verglichen.
Die Isolierung der HCV-cDNA-Sequenzen war, im Wesentlichen wie vorstehend für die Isolierung von 5'-Clon32 beschrieben, außer folgendem. Die extrahierte RNA wurde unter Verwendung entweder des Primers JH51 oder r16, die zu den HCV-Nucleotiden -90 bis -73 oder 366 bis 383 komplementär sind, einer reversen Transkription unterzogen. Die Sequenz dieser Primer ist wie folgt:

Primer Sequenz

JH51 5' CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3'
r16 5' CAC GTA AGG GTA TCG ATG 3'
Die Amplifikation der HCVdsDNA wurde mittels des PCR-Verfahrens unter Verwendung von JH93 und JH52 als 5'- bzw. 3'-Primer durchgeführt. Die HCV-Sequenz in JH93 ist abgeleitet von den HCV-Nucleotiden -317 bis -296, die in JH52 ist von den HCV- Nucleotiden -93 bis -117; die Nucleotidzahlen werden unterhalb der Sequenz in Klammern angezeigt. In JH52 wurde das unterstrichene Dinucleotid mutiert, um eine NotI-Stelle zu schaffen. Die Sequenzen dieser Primer sind wie folgt.
Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte mit NotI gespalten und in pUC18S cloniert. Die HCV-cDNAs wurden entweder mittels direkter Sequenzierung nach Amplifikation mit PCR sequenziert, oder in einer anderen Ausführungsform wurden die clonierten HCV-cDNAs mittels Primerverlängerung und dem Didesoxyverfahren sequenziert. Die Primerverlängerung und das Didesoxyverfahren der Sequenzierung wurden, wie vorstehend für die Sequenz des 5'-Clons32 beschrieben, durchgeführt.
Das PCR-Verfahren für die direkte Sequenzierung verwendete Alex90 (vgl. vorstehend für die Sequenz) als den 5'-Primer und r25 als den 3'-Primer. Alex90 ist von den HCV- Nucleotiden -312 bis -283 abgeleitet und r25 ist von den Nucleotiden 365 bis 342 abgeleitet (vgl. Fig. 18). Die Sequenz von r25 ist:
5' ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3'.
Ein Vergleich der Sequenzen der 5'-Region von HCV27, HCVK1, HCVI1, HCVI24 und HCV18 mit der Sequenz des Prototyp-HCV, HCV1, zeigte das folgende. Die untersuchte 5'-Region ist innerhalb der 5 HCV-Isolate hoch konserviert. Die Sequenzen scheinen identisch zu sein bis auf ein Nucleotid, das in HCVI24 an Position -171 deletiert war und bis auf die Zweideutigkeit bei vier Nucleotiden an den Positionen -222 bis -219 im Isolat HCVK1.
Das hohe Ausmaß an Sequenzkonservierung in diesem Bereich kann die Rolle dieses Bereiches bei der viralen Replikation und/oder Transkription und/oder Translation wiederspiegeln.

Sequenzvariationen in HCV-Isolaten von verschiedenen Individuen

Isolate von HCV, die Sequenzen enthalten, die von CDC/HCV 1 abweichen, wurden in menschlichen Individuen identifiziert, von denen einige serologisch positiv auf anti-C100-3- Antikörper waren (EC10 war Antikörpernegativ). Die Identifizierung dieser neuen Isolate wurde durch Clonierung und Sequenzierung von Segmenten des HCV-Genoms erreicht, die unter Verwendung von CDC/HC1-Sequenzen mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert worden waren. Die Amplifikation wurde im Wesentlichen auf der Grundlage eines HCV/cPCR- Verfahrens erreicht. Das Verfahren verwendet Primer und Sonden auf der Grundlage von HCV-cDNA-Sequenzen, die hier beschrieben sind. Der erste Schritt bei dem Verfahren ist die Synthese einer cDNA für entweder das HCV-Genom oder sein replikatives Intermediat unter Verwendung von reverser Transkriptase. Nach der Synthese der HCV-cDNA und vor der Amplifikation wird die RNA in der Probe mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren abgebaut. Ein bestimmtes Segment der HCV-cDNA wird dann unter Verwendung der geeigneten Primer amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden cloniert, und Clone, die die amplifizierten Sequenzen enthalten, werden mittels einer Sonde nachgewiesen, die komplementär zu der Sequenz ist, die zwischen den Primern liegt, die aber nicht mit den Primern überlappt.

HCV-Isolate, die von Menschen in den U.S.A. isoliert sind

Blutproben, die als Quelle für HCV-Virionen verwendet wurden, wurden vom American Red Cross in Charlotte, North Carolina, und vom Community Blood Center of Kansas, Kansas City, Missouri, erhalten. Die Proben wurden unter Verwendung eines ELISA- Tests, wie er in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben ist, auf Antikörper gegen das HCV-C100-3-Antigen durchmustert und unter Verwendung eines polyclonalen Ziege-anti- Mensch HRP einer ergänzenden Western-Blot-Analyse unterzogen, um anti-HCV-Antikörper zu messen. Es wurde mittels dieser Tests bestimmt, daß zwei Proben, #23 und #27, vom American Red Cross bzw. vom Community Blood Center of Kansas HCV-positiv waren.
Virale Partikel, die im Serum dieser Proben vorhanden waren, wurden mittels Ultrazentrifugation unter den Bedingungen isoliert, die von Bradley et al. (1985) beschrieben sind. Von diesen Partikeln wurde mittels Verdau mit Proteinase K und SDS mit einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm/ml Proteinase K und 0,1% SDS RNA extrahiert; der Verdau war 1 Stunde bei 37ºC. Die virale RNA wurde durch Extraktion mit Chloroform- Phenol weiter gereinigt, wie in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben.
HCV-RNA in der Präparation von RNA wurde einer reversen Transkription in cDNA unterzogen, im Wesentlichen wie beschrieben in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216, außer daß das Oligonucleotid JHC7, welches der cDNA-Sequenz 1958-1939 entspricht und das die folgende Sequenz hat, als Primer für die reverse Transkriptasereaktion verwendet wurde.
JHC 7: CCA GCG GTG GCC TGG TAT TG.
Nachdem die beiden Stränge der cDNA synthetisiert waren, wurde die resultierende cDNA dann mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert, im Wesentlichen wie vorstehend für die Isolierung von Clonen beschrieben, die durch die PCR-Ampliükation erzeugt worden waren, außer daß die verwendeten Oligonucleotidprimer, d. h. JHC 6 und ALX 80, so geplant waren, daß sie ein Segment von 1080 Nucleotiden des HCV-Genoms von den CDC/HCV1- Nucleotiden 673 bis 1751 amplifizierten. Die Primer waren außerdem so geplant, daß sie eine Not I-Restriktionsstelle am 3'-Ende des PCR-Produkts und ein glattes Ende am 5'-Ende umfaßten. Die Sequenz der Primer ist:
ALX 80: TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG;
und
JHC 6: ATA TGC GGC CGC CTT CCG TTG GCA TAA.
ALX 80 entspricht den Nucleotiden 673-702 der CDC/HCV1-Sequenz; JHC 6 entspricht den Nucleotiden 1752-1738 von HCV1 (außerdem gibt es 12 zusätzliche Nucleotide, die eine NotI-Stelle codieren). Die Bezeichnung der Nucleotide mit JHC 6, d. h. in abnehmenden Zahlen, zeigt die Lage im Antisense-Strang an.
Nach der PCR-Amplifikation mit den vorstehend beschriebenen Primern, wurde das glatte Ende wie folgt in eine Not I-Stelle verwandelt. Ein Homopolymerschwanz von 15 dGs wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotid-Transferase an das PCR-Produkt angefügt und die Produkte wurden unter Verwendung der Primer JHC 6 und JHC 13 erneut einer Amplifikation durch PCR unterworfen. Der letztere Primer, JHC 13, dessen Sequenz folgt, ist so geplant, daß er eine Not I-Stelle zusätzlich zu einem SP6-Phagenpromotor enthält. (Der SP6-Promotor ist in GENETIC ENGINEERING, J. Setlow Hrsg. (1988) beschrieben.)
Um die amplifizierte HCV-cDNA zu clonieren, wurden die PCR-Produkte mit NotI gespalten, mit Spermin ausgefällt, um freie Oligonucleotide zu entfernen (Hoopes et al. (1981)) und in die NotI-Stelle von pUC18S cloniert (vgl. Abschbitt IV. A.34.). Die HCV- cDNAs in drei Clonen, die von jedem HCV-Isolat abgeleitet waren, wurden der Sequenzanalyse unterzogen. Die Analyse war im Wesentlicherigemäß dem Verfahren, das in Chen und Seeburg (1985) beschrieben ist.
Consensussequenzen von den Clonen, die von HCV in den Proben 23 und 27 abgeleitet sind, sind in Fig. 46 bzw. Fig. 47 gezeigt. Die variablen Sequenzen sind ebenfalls in diesen Figuren gezeigt, ebenso wie die Aminosäuren, die von den Consensussequenzen codiert werden.
Fig. 39 und Fig. 40 zeigen Vergleiche der ausgerichteten Nucleotidsequenzen vom - positiven Strang (Fig. 39) und die mutmaßlichen Aminosäuresequenzen (Fig. 40) der Proben 23, 27 und von HCV1. Die Aminosäuresequenz von HCV1 in Fig. 39 stellt die Aminosäuren Nummer 129-467 des HCV-Polyproteins dar, das von dem großen ORF in der genomischen HCV-RNA codiert wird. Eine Überprüfung von Fig. 46 und Fig. 47 zeigt, daß es Variationen in den Sequenzen der drei isolierten Clone gibt. Die Sequenzvariationen auf der Ebene der Nucleotide und der Aminosäuren sind in der Tabelle unmittelbar nachstehend zusammengestellt. In der Tabelle stellen die Polypeptide, die als S und NS1 bezeichnet werden, die Aminosäuren-Nummer 130 bis 380 bzw. 380 bis 470 dar. Die Numerierung geht von dem mutmaßlichen Initiator-Methionin aus. Die Terminologie S und NS 1 beruht auf der Positionierung der Sequenzen, die Polypeptide codieren, unter Verwendung des Flavivirus-Modells. Wie jedoch vorstehend diskutiert, legen kürzliche Befunde nahe, daß es mit Hinblick auf die viralen Polypeptiddomänen keine völlige Korrelation zwischen HCV und den Flaviviren gibt, insbesondere bei den mutmaßlichen E/NS1-Domänen. In der Tat können HCV-Polypeptide und ihre codierenden Domänen substantielle Abweichungen vom Flavivirus-Modell aufweisen. Tabelle Sequenzhomologie
Obwohl es bei den neu isolierten HCV-Sequenzen Variationen gibt, enthält jede der clonierten Sequenzen von den Proben 23 und 27 (HCV23 und HCV27 genannt) 1019 Nucleotide, was das Fehlen von Deletions- oder Additionsmutanten in diesem Bereich in den ausgewählten Clonen anzeigt. Die Sequenzen in den Figs. 39 und 40 zeigen auch, daß die isolierten Sequenzen in dieser Region sich nicht umgelagert haben.
Ein Vergleich der Consensussequenzen für HCV1 und für die anderen Isolate von HCV ist in der vorstehenden Tabelle zusammengestellt. Die Sequenzvariationen zwischen - dem Schimpansen-Isolat HCV1 und der HCVs, die von Menschen isoliert wurden, sind etwa dieselben, wie sie zwischen den HCVs von menschlichem Ursprung gesehen werden.
Es ist von Interesse, daß die Sequenzvariationen in zwei der mutmaßlichen Domänen nicht einheitlich sind. Die Sequenz in einer mutmaßlichen S-Region scheint relativ konstant zu sein, wobei eine zufällige Streuungt über die Region vorliegt. Im Gegensatz dazu hat eine mutmaßliche NS1-Region ein höheres Maß an Variabilität als die Gesamtsequenz und die Variation scheint in einer hypervariablen Tasche von etwa 28 Aminosäuren zu sein, die etwa 70 Aminosäuren stromabwärts des mutmaßlichen N-Endes des mutmaßlichen Polyproteins gelegen ist.
Obwohl man argumentieren könnte, daß die gefundenen Variationen während des Amplifikationsverfahrens eingeführt wurden, ist es unwahrscheinlich, daß alle diese Variationen sich daraus ergeben. Es wurde geschätzt, daß die Taq-Polymerase in einer Sequenz Fehler von etwa einer Base pro 10 Kilobasen Matrizen-DNA pro Zyklus eingeführt (Saiki et al. (1988)). Basierend auf dieser Schätzung könnten bis zu sieben Fehler während der PCR-Amplifikation des 1019 bp-DNA-Fragments eingeführt worden sein. Die drei Subclone von HCV-23 und HCV-27 ergaben jedoch 29 bzw. 14 Basenvariationen. Das folgende legt nahe, daß diese Variationen natürlicherweise auftreten. Etwa 60% dieser Basenaustäusche sind stille Mutationen, die die Aminosäuresequenz nicht ändern. Es wäre zu erwarten, daß Variationen, die durch die Taq-Polymerase während der PCR-Amplifikation eingeführt werden, zufällig auftreten; die Ergebnisse zeigen jedoch, daß die varianten Sequenzen in mindestens einer spezifischen Region gehäuft auftreten. Darüber hinaus wurde eine Consensussequenz durch Sequenzierung von mehreren verschiedenen Clonen abgeleitet, die von den durch PCR amplifizierten Produkten abgeleitet waren.

HCV-Isolate von Menschen in Italien und den USA

Segmente von HCV-RNA, die in verschiedenen Isoläten vorhanden waren, wurden mittels des HCVcPCR-Verfahrens amplifiziert. Diese Segmente überspannen eine Region von ~0,6 Kb bis ~1,6 Kb stromabwärts von dem Methionin codierenden Startcodon des mutmaßlichen HCV-Polyproteins. Die Isolate sind von biologischen Proben, die von HCV- infizierten Individuen erhalten worden waren. Spezifischer ist das Isolat HCT # 18 von menschlichem Plasma eines Individuums in den USA, EC1 und EC10 sind von einer Leberbiopsie eines italienischen Patienten und Th ist von der Mononucleocyten-Fraktion aus peripherem Blut eines amerikanischen Patienten. Vergleichbare Segmente von HCV-RNA wurden von einem Schimpansen isoliert.
RNA wurde von den menschlichen Plasmaproben unter Verwendung einer Extraktion mit Phenol : CHCl&sub3; : Isoamylalkohol extrahiert. 0,1 ml oder 0,01 ml an Plasma wurden mit einer TENB/Proteinase KISDS-Lösung (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml Proteinase K und 0,5% SDS), die 10 bis 40 Mikrogramm/ml Polyadenylsäure enthielt, auf ein Endvolumen von 1,0 ml gebracht und bei 37ºC 60 Minuten inkubiert. Nach diesem Proteinase K-Verdau wurden die resultierenden Plasmafraktionen durch Extraktion mit mit TE (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gesättigtem Phenol, pH 6,5, von Proteinen befreit. Die Phenolphase wurde durch Zentrifugation abgetrennt und erneut mit TENB extrahiert, das 0,1% SDS enthielt. Die resultierenden wäßrigen Phasen von jeder Extraktion wurden vereint und zweimal mit einem gleichen Volumen an Phenol/Ghloroform/Isoamylalkohol [1 : 1(99 : 1)] und dann zweimal mit einem gleichen Volumen eines 99 : 1-Gemischs von Chlorofornillsoamylalkohol extrahiert. Nach Phasentrennung mittels Zentrifugation wurde die wäßrige Phase auf eine Endkonzentration von 0,2 M Na-Acetat gebracht, und die Nucleinsäuren wurden durch Zugabe von zwei Volumina Ethanol ausgefällt. Die ausgefällten Nucleinsäuren wurden durch 60 Minuten Ultrazentrifugation in einem SW 41-Rotor bei 38 K und 4ºC oder 10 Minuten in einer Microfuge bei 10K und 4ºC gewonnen.
Die von der Leberbiopsie extrahierte RNA wurde von Dr.F. Bonino, Ospedale Maggiore di S. Giovanni Battista, Torino, Italien, zur Verfügung gestellt.
Die Mononucleocyten-Fraktion wurde mittels Sedimentation einer Teilmenge an Blut des Individuums durch Ficoll-Paque ® (Pharmacia Corp.) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers erhalten. Aus der Fraktion wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung des Guanidiniumthiocyanat-Verfahrens extrahiert, das in der E.P.A.- Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben ist (vgl. auch Choo et al. (1989)).
Die Synthese der HCV-cDNA von den Proben wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase und Primern erreicht, die von Clon 156e und Clön K91 abgeleitet waren. Diese Primer, die in Relation zu der genomischen RNA Antisense-Primer sind, haben die folgenden Sequenzen.
156e16B: 5' CGA CAA GAA AGA CAG A 3',
und
K91/16B 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'.
Nach der Ethanolpräzipitation wurde die präzipitierte RNA- oder Nucleinsäurefraktion getrocknet und in mit DEPC behandeltem, destilliertem Wasser resuspendiert. Sekundärstrukturen bei den Nucleinsäuren wurden durch 10 Minuten Erhitzen auf 65ºC zerstört, und die Proben wurden unmittelbar auf Eis gekühlt. Die cDNA wurde unter Verwendung von 1 bis 3 Mikrogramm Gesamt-RNA aus Leber oder von Nucleinsäuren (oder RNA), die aus 10 bis 100 Mikrolitern Plasma extrahiert worden waren, synthetisiert. Die Synthese verwendete reverse Transkriptase und fand in einer 25 Mikroliter-Reaktion statt unter Verwendung des Protokolls, das der Hersteller BRL festgelegt hatte. Alle Reaktionsgemische für die cDNA-Synthese enthielten 23 Einheiten des RNAase-Inhibitors RNASINTM (Fisher/Promega). Nach der cDNA-Synthese wurden die Reaktionsgemische mit Wasser verdünnt, 10 Minuten gekocht und schnell auf Eis abgekühlt.
Jeder Satz an Proben wurde zwei Runden PCR-Amplifikation unterworfen. Die Primer für die Reaktion wurden so ausgewählt, daß sie Regionen amplifizierten, die als "EnvL" und "EnvR" bezeichnet werden. Die "EnvL"-Region umfaßt die Nucleotide 669-1243 und die mutmaßlichen Aminosäuren 117-308; die "EnvR"-Region umfaßt die Nucleotide 1215-1629 und codiert die mutmaßlichen Aminosäuren 300-408 (die mutmaßlichen Aminosäuren sind ausgehend vom mutmaßlichen Methionin-Initiationscodon numeriert). Die Verwandtschaft dieser Regionen im Verhältnis zu dem mutmaßlichen Polyprotein, das von HCV-cDNA codiert wird, und zu den Polypeptiden, die vom Flavivirus-Modell codiert werden, ist in Fig. 48 gezeigt.
Die Primer für die erste Runde an PCR-Reaktionen wurden von den HCV-cDNA- Sequenzen in Clon ag30a, Clon 156e oder Clon k9-1 abgeleitet. Die Primer, die für die Amplifikation der EnvL-Region verwendet wurden, waren 156e16B (vorstehend gezeigt) und ag30a16A für den Sense-Strang; die Amplifikation der EnvR-Region verwendete die Primer K91/16B (vorstehend gezeigt) und 156e16a für den Sense-Sträng. Die Sequenzen der Sense- Strang-Primer sind wie folgt.
Für EnvL, ag30a16A: 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3',
und
Für EnvR, 156e16A: 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3'.
Die PCR-Reaktionen wurden im Wesentlichen gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt (Cetus-Perkin-Elmer), außer der Zugabe von 1 Mikrogramm an RNase A. Die Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 100 Mikroliter durchgeführt. Die PCR wurde für 30 Zyklen durchgeführt unter Verwendung eines Schemas von 94ºC (1 min), 37ºC (2 min) und 72ºC (3 min) mit einer Verlängerung von 7 Minuten bei 72ºC beim letzten Zyklus. Die Proben wurden dann mit Phenol : CHCl&sub3; extrahiert, zweimal mit Ethanol präzipitiert, in 10 mM Tris HCl, pH 8,0, resuspendiert und unter Verwendung einer Centricon-30 (Amicon)-Filtration konzentriert. Dieses Verfahren entfernt effektiv Oligonucleotide, die in der Größe kleiner als 30 Nucleotide sind; dadurch werden die Primer von der ersten PCR-Amplifikationsrunde entfernt.
Die mittels Centricon-30 konzentrierten Proben wurden dann unter Verwendung von Sonden, die von den Clonen 202a und 156e für die EnvL-Region und von 156e und 59a für die EnvR-Region geplant waren, einer zweiten Runde an PCR-Amplifikation unterworfen. Die Primer für die Amplifikation der EnvL-Region haben die folgenden Sequenzen.
202aEnv41a: 5' CTT GAA TTC GCA ATT TGG GTA AGG TCA TCG ATA CCC TTA CG 3'
und
156e38B': 5' CTT GAA TTC GAT AGA GCA ATT GCA ACC TTG CGT CGT CC 3'.
Die Primer für die Amplifikation der EnvR-Region in RNAs, die von Menschen abgeleitet sind, haben die folgenden Sequenzen.
156e38A': 5' CTT GAA TTC GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA TC 3'
und
59aEnv39C: 5' CTT GAA TTC CAG CCG GTG TTG AGG CTA TCA TTG CAG TTC 3'.
Die Amplifikation mittels PCR wurde für 30 Zyklen durchgeführt unter Verwendung eines Schemas von 94ºC (1 min), 60ºC (1 min) und 72ºC (2 min) mit einer Verlängerung von 7 Minuten bei 72ºC beim letzten Zyklus. Die Proben wurden dann mit Phenol : CHCl&sub3; extrahiert, zweimal ausgefällt und mit EcoRI verdaut. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden mittels Trennung der Produkte durch Elektrophorese auf 6%-igen Polyacrylamidgelen analysiert. DNA von ungefähr der geschätzten Größe des erwarteten PCR-Produkts wurde aus den Gelen elehtroeluiert und entweder in einen pGEM-4-Plasmidvektor oder in lambda gt11 subcloniert. Die erwarteten Produktgrößen für EnvL und EnvR nach der ersten Amplifikationsrunde sind 615 bp bzw. 683 bp; nach der zweiten Amplifikationsrunde sind die erwarteten Produktgrößen für EnvL und EnvR 414 bp bzw. 575 bp. Die Plasmide, die die amplifizierten Produkte enthielten, wurden verwendet, um Wirtszellen zu transformieren; das pGEM-4-Plasmid wurde verwendet, um DH5-alpha zu transformieren, und lambda gt11 wurde verwendet, um C600 delta-HFL zu transformieren. Clone der transformierten Zellen, die entweder mit den geeigneten HCV-Sonden hybridisierten (nachstehend beschrieben), oder diejenigen, die Insertionen der korrekten Größe hatten, wurden ausgewählt. Die Insertionen wurden dann in M13 cloniert und sequenziert.
Die Sonden für alle HCV/cPCR-Produkte bestanden aus mit ³²P markierten Sektionen von HCV-cDNA, die durch PCR-Amplifikation einer Region von Clon 216 (unter Verwendung von CA215a16A und 216a16B als Primer) und von Clon 84 (unter Verwendung von CA84a16A und CA84a16B oder CA84a16C als Primer) hergestellt wurden; ³²P wurde mittels Nick-Translation in die PCR-Produkte eingeführt. Die Sonden für die erste und zweite Runde der EnvL-Amplifikation waren von Clon 216. Diejenigen für die erste Runde der EnvR-Amplifikation waren von 84 (d. h. CA84a16A und CA84a16B), für die zweite Runde der EnvL-Amplifikation waren CA84a16A und CA84a16C. Diese Sonden überlappten nicht mit den Primern, die bei den HCV/cPCR-Reaktionen verwendet wurden. Die Sequenz der Primer für die PCR-Amplifikation der Sonden ist in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle
Die Sequenzinformation über Varianten in der EnvL-Region wurde von drei Clonen von HCT #18, 2 Clonen von TH, 3 Clonen von EC1 und von den HCV1-Clonen erhalten, die in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 und vorstehend beschrieben sind. Ein Vergleich der zusammengesetzten Nucleotidsequenz von jedem Isolat, die von diesen Clonen abgeleitet ist, ist in Fig. 49 gezeigt. In dieser Figur ist jede Sequenz 5' nach 3' für den Sense-Strang für die EnvL-Region gezeigt, und die Sequenzen wurden ausgerichtet. Die vertikalen Linien und großen Buchstaben zeigen Sequenzhomologie an, die Abwesenheit einer Linie und kleine Buchstaben zeigen das Fehlen einer Homologie an. Die in den Linien gezeigten Sequenzen sind wie folgt: Linie 1, Thorn; Linie 2, EC1; Linie 3, HCT # 18; Linie 4, HCV 1.
Die Sequenzinformation über Varianten in der EnvR-Region wurde von zwei Clonen von EC10 und von den HCV1-Clonen erhalten, die in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 und vorstehend beschrieben sind. Die beiden EC10-Clon unterschieden sich nur in einem.
Nucleotid. Ein Vergleich der Nucleotidsequenz von EC10 (Clon 2) und einer Zusammensetzung der HCV1-Sequenzen ist in Fig. 50 gezeigt; jede Sequenz ist 5' nach 3' für den Sense-Strang der EnvR-Region gezeigt, und die Sequenzen wurden ausgerichtet. Die Doppelpunkte zwischen den Sequenzen zeigen Sequenzhomologie an.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen, die von der BnvL (Aminosäuren # 117-308)- und von der EnvR (Aminosäuren #300-438)-Region für jedes der Isolate codiert werden, ist in Fig. 51 bzw. Fig. 52 gezeigt. In den Figuren eingeschlossen sind Sequenzen für die vorstehend beschriebenen Isolate JH23 und JH27. Ebenfalls gezeigt sind Sequenzen von einem japanischen Isolat; diese Sequenzen wurden von Dr. T. Miyamura, Japan zur Verfügung gestellt. In den Figuren wird die Aminosäuresequenz für die Region für HCV1 in ihrer Gesamtheit gegeben und die nicht-homologen Aminosäuren in den verschiedenen Isolaten sind angezeigt.
Wie in Fig. 51 zu sehen, liegt in der EnvL-Region insgesamt eine etwa 93% Homologie zwischen HCV1 und den anderen Isolaten. HCT18, Th und EC1 haben etwa 97% Homologie mit HCV1; JH23 und JH27 haben etwa 96% bzw. etwa 95% Homologie mit HCV1. Fig. 52 zeigt, daß die Homologien in der EnvR-Region signifikant weniger sind als in der EnvL-Region; darüber hinaus scheint eine Subregion hypervariabel zu sein (d. h. von Aminosäure 383-405). Diese Daten sind in der unmittelbar nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Tabelle Homologie der EnvR-Region

Nachweis von Positivstrang- und Negativstrang-5'-HCV-RNA in Serum

Die RNA in HCV27, aus Serum isoliert, wurde unter Verwendung des PCR- Verfahrens auf die Anwesenheit von positiven und negativen Strängen analysiert. Das PCR- Verfahren wurde, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, außer folgendem. Die extrahierte HCV27-RNA wurde unter Verwendung von Alex90 oder JH52 (vgl. vorstehend für die Sequenzen) als Primer einer reversen Transkription in einzelsträngige cDNA unterworfen. Die Sequenz von Alex90 stimmt mit der der Nucleotide -312 bis -283 des positiven Strangs von HCV-RNA überein, während JH52 mit der der Nucleotide -117 bis -93 des negativen Strangs übereinstimmt. Die resultierenden einzelsträngigen HCV-cDNAs wurden jede separat mittels PCR unter Verwendung von Alex90 und JH52 amplifiziert. Der Nachweis der amplifizierten Produkte wurde mittels des Southern-Blot-Verfahrens unter Verwendung von Alex89 als Sonde erreicht. Alex89 stimmt mit den Nucleotiden Nummer - - 203 bis -175 von HCV-RNA überein. Die Sequenz von Alex89 ist:
5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.
Die Analyse zeigte, daß mit diesem Verfahren die Signale der amplifizierten Produkte von beiden RNA-Strängen von gleicher Intensität waren. Diese Ergebnisse legen auch nahe, daß die HCV-RNA in der 5'-Region als doppelsträngige RNA existieren könnte.

Nachweis von HCV-Polynucleotidsequenzen unter Verwendung der PCR- Amplifikation

Im verallgemeinerten Verfahren für die Amplifikation von HCV-RNA mittels cPCR wird davon ausgegangen, daß der RNA-Strang ein Virion oder ein mRNA-Strang ist, der ein "Sense"-Strang ist. Es ist jedoch auch möglich, daß die replikative, intermediäre Form auch nachgewiesen werden kann, die "antisense" wäre; in diesem Fall wäre der Primer ein "Sense"- Primer. Ein RNA-Sense-Strang, der die Zielregion enthält, wird mit einem Antisense-Primer hybridisiert, der die Synthese des Replikat-Strangs initiiert, der das Ziel enthält. Mit einer Primer- und Matrizen-abhängigen reversen Transkriptase wird cDNA zu der RNA-Matrize synthetisiert. Die cDNA in dem resultierenden RNA : cDNA-Hybrid wird mittels Denaturierung und Behandlung mit RNAse freigesetzt. An die cDNA werden Primer angelagert und mit einer Primer- und Matrizen-abhängigen DNA-Polymerase verlängert. Die Produkte werden denaturiert, wieder an die Primer angelagert, und es wird eine zweite Runde an Synthese durchgeführt. Eine Reihe an Zyklen werden durchgeführt, bis das amplifizierte Produkt, das die Zielregion enthält, in der gewünschten Menge vorliegt, was mindestens ein nachweisbarer Spiegel ist.

Nachweis von amplifizierten HCV-Nucleinsäuresequenzen, die von HCV- Nucleinsäuresequenzen in Leber- und in Plasmaproben von Schimpansen mit NANBH abgeleitet sind

HCV-Nucleinsäuren, die in Leber und Plasma von Schimpansen mit NANBH anwesend sind und nicht in Kontrollschimpansen, wurden unter Verwendung von im Wesentlichen des Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens (PCR) amplifiziert, das von Saiki et al. (1986) beschrieben wurde. Die Primer-Oligonucleotide wurden von den HCV-cDNA- Sequenzen in Clon 81 (Fig. 22) oder in den Clonen 36 (Fig. 23) und 37b (Fig. 24) abgeleitet. Die amplifizierten Sequenzen wurden mittels Gelelektrophorese und einem modifizierten Southern-Blot-Verfahren unter Verwendung des geeigneten cDNA-Oligomers oder der geeigneten Nick-translatierten eDNA-Sequenz mit einer Sequenz der Region zwischen den beiden Primern, aber diese nicht einschließend, als Sonden nachgewiesen.
Proben an RNA, die mittels des Amplifikationssystems zu untersuchende HCV- Sequenzen enthielten, wurden von Leberbiopsien von drei Schimpansen mit NANBH und von zwei Kontroll-Schimpansen isoliert. Die Isolierung der Poly (A&spplus;)-RNA-Fraktion wurde mittels des Guanidiniumthiocyanat-Verfahrens durchgeführt, beschrieben in Maniatis et al. (1982).
Proben an RNA, die mittels des Amplifikationssystems untersucht werden sollten, wurden auch vom Plasma von zwei Schimpansen mit NANBH und von einem Kontroll- Schimpansen isoliert, ebenso wie von einem Pool an Plasma von Kontroll-Schimpansen. Ein infizierter Schimpanse hatte einen Titer gleich oder größer als 10&sup6; CID/ml, und der andere infizierte Schimpanse hatte einen Titer gleich oder größer als 10&sup5; CID/ml.
Die Nucleinsäuren wurden wie folgt von dem Plasma extrahiert. Entweder 0,1 ml oder 0,01 ml Plasma wurden mit einer TENB/Proteinase K/SDS-Lösung (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml Proteinase K und 0,5% SDS), die 10 Mikrogramm/ml Polyadenylsäure enthielt, auf ein Endvolumen von 1,0 ml gebracht und bei 37ºC 60 Minuten inkubiert. Nach diesem Proteinase K-Verdau wurden die resultierenden Plasmafraktionen durch Extraktion mit mit TE (10,0 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gesättigtem Phenol von Proteinen befreit. Die Phenolphase wurde durch Zentrifugation abgetrennt und erneut mit TENB extrahiert, das 0,1% SDS enthielt. Die resultierenden wäßrigen Phasen von jeder Extraktion wurden vereint und zweimal mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol [1 : 1(99 : 1)] und dann zweimal mit einem gleichen Volumen eines 99 : 1-Gemischs von Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Nach Phasentrennung mittels Zentrifugation wurde die wäßrige Phase auf eine Endkonzentration von 0,2 M Na-Acetat gebracht, und die Nucleinsäuren wurden durch Zugabe von zwei Volumina Ethanol ausgefällt. Die ausgefällten Nucleinsäuren wurden durch 60 Minuten Ultrazentrifugation in einem SW 41-Rotor bei 38 K und 4ºC gewonnen.
Zusätzlich zu vorstehendem wurden das Schimpansenplasma hohen Titers und das vereinte Kontrollplasma alternativ mit 50 Mikrogramm an Poly A-Träger gemäß dem Verfahren von Chomcyzski und Sacchi (1987) extrahiert. Dieses Verfahren verwendet eine saure Guanidiniumthiocyanat-Extraktion. Die RNA wurde durch 10 Minuten Zentrifugation bei 10.000 UpM und 4ºC in einer Eppendorf-Microfuge gewonnen.
Bei zwei Gelegenheiten wurden die mittels des Proteinase K/SDS/Phenol-Verfahrens aus Plasma extrahierten Nucleinsäuren vor der Synthese von cDNA in der PCR-Reaktion durch Bindung an und Elution von S- und S Elutip-R-Säulen weiter gereinigt. Das verwendete Verfahren war gemäß den Vorschriften des Herstellers.
Die als Matrize für die PCR-Reaktion verwendete cDNA wurde von den Nucleinsäuren (entweder Gesamt-Nucleinsäuren oder RNA) abgeleitet, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt worden waren. Nach der Ethanol-Präzipitation wurden die präzipitierten Nucleinsäuren getrocknet und in mit DEPC behandeltem, destilliertem Wasser resuspendiert. Sekundärstrukturen bei den Nucleinsäuren wurden durch 10 Minuten Erhitzen bei 65ºC zerstört, und die Proben wurden unmittelbar auf Eis gekühlt. Die cDNA wurde unter Verwendung von 1 bis 3 Mikrogramm Gesamt-RNA aus Schimpansenleber oder von Nucleinsäuren (oder RNA), die aus 10 bis 100 Mikrolitern Plasma extrahiert worden waren, synthetisiert. Die Synthese verwendete reverse Transkriptase und fand in einer 25 Mikroliter- Reaktion statt, unter Verwendung des Protokolls, das der Hersteller BRL festgelegt hatte. Die Primer für die cDNA-Synthese waren diejenigen, die auch bei der nachstehend beschriebenen PCR-Reaktion verwendet worden waren. Alle Reaktionsgemische für die cDNA-Synthese enthielten 23 Einheiten des RNAase-Inhibitors RNASINTM (Fisher/Promega). Nach der cDNA-Synthese wurden die Reaktionsgemische mit Wasser verdünnt, 10 Minuten gekocht und schnell auf Eis abgekühlt.
Die PCR-Reaktionen wurden im Wesentlichen gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt (Cetus-Perkin-Elmer), außer der Zugabe von 1 Mikrogramm an RNase A. Die Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 100 Mikroliter durchgeführt. Die PCR wurde für 35 Zyklen unter Verwendung eines Schemas von 37ºC (2 min), 72ºC (3 min) und 94ºC (1 min) durchgeführt.
Die Primer für die cDNA-Synthese und für die PCR-Reaktionen waren von den HCV- cDNA-Sequenzen in Clon 81, Clon 36 oder Clon 37b abgeleitet. (Die HCV-cDNA-Sequenzen der Clone 81, 36 und 37b sind in den Figs. 22, 23 bzw. 24 gezeigt). Die Sequenzen der zwei 16-mer Primer, die von Clon 81 abgeleitet sind, waren:
5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3'
und
5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3'.
Die Sequenz des Primers von Clon 36 war:
5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'.
Die Sequenz des Primers von Clon 37b war:
5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.
Bei den PCR-Reaktionen bestanden die Primerpaare entweder aus den beiden, von Clon 81 abgeleiteten 16-meren oder dem 16-mer von Clon 36 und dem 16-mer von Clon 37b.
Die PCR-Reaktionsprodukte wurden mittels Auftrennung der Produkte mittels alkalischer Gelelektrophorese analysiert, gefolgt von Southern-Blot-Verfahren und Nachweis der amplifizierten HCV-cDNA-Sequenzen mit einer mit ³²P markierten internen Oligonucleotidsonde, die von einer Region der HCV-cDNA abgeleitet war, die nicht mit den Primern überlappt. Die PCR-Reaktionsgemische wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und die Nucleinsäuren mit Salz und Ethanol aus der wäßrigen Phase präzipitiert. Die präzipitierten Nucleinsäuren wurden mittels Zentrifugation gesammelt und in destilliertem Wasser gelöst. Teilmengen der Proben wurden einer Elektrophorese auf 1,8%-igem alkalischen Agarosegel unterworfen. Einzelsträngige DNA von 60, 108 und 161 Nucleotiden Länge wurde als Molekulargewichtsmarker auf den Gelen gleichzeitig einer Elektrophorese unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die DNAs in dem Gel auf Biorad Zeta Probe TM-Papier übertragen. Die Prähybridisierungs-, Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren die vom Hersteller (Biorad) angebenen.
Die Sonden, die zum Nachweis mittels Hybridisierung von amplifizierten HCV- cDNA-Sequenzen verwendet wurden, waren die folgenden. Wenn das Paar an PCR-Primern von Clon 81 abgeleitet war, war die Sonde ein 108-mer mit einer Sequenz, die der entsprach, die in der Region zwischen den Sequenzen der beiden Primer lokalisiert war. Wenn das Paar an PCR-Primern von den Clonen 36 und 37b abgeleitet war, war die Sonde die Nicktranslatierte HCV-cDNA-Insertion, die von Clon 35 abgeleitet war, dessen Nucleotidsequenz in Fig. 34 gezeigt ist. Die Primer sind von den Nucleotiden 155-170 der Insertion in Clon 37b und 206-268 der Insertion in Clon 36 abgeleitet. Das 3'-Ende der HCV-cDNA-Insertion in - Clon 35 überlappt die Nucleotide 1-186 der Insertion in Clon 36; und das 5'-Ende der Insertion in Clon 35 überlappt die Nucleotide 207-269 der Insertion in Clon 37b (vgl. Figs. 23, 34 und 24). Somit überspannt die cDNA-Insertion in Clon 35 einen Teil der Region zwischen den Sequenzen der von Clon 36 und 37b abgeleiteten Primer und ist als Sonde für die amplifizierten Sequenzen, die diese Primer umfassen, von Nutzen.
Die Analyse der RNA von den Leberproben war gemäß dem vorstehenden Verfahren unter Verwendung der beiden Sätze an Primern und Sonden. Die RNA von der Leber der drei Schimpansen mit NANBH ergab positive Hybridisierungsergebnisse für die Amplifikationssequenzen der erwarteten Größe (161 und 586 Nucleotide für 81, 36 bzw. 37b), während die Kontrollschimpansen negative Hybridisierungsergebnisse ergaben. Bei dreimaliger Wiederholung der Experimentewurden dieselben Ergebnisse erzielt.
Die Analyse der Nucleinsäuren und RNA von Plasma war auch gemäß dem vorstehenden Verfahren unter Verwendung der Primer und der Sonde von Clon 81. Das Plasma war von zwei Schimpansen mit NANBH, von einem Kontrollschimpansen und von gepooltem Plasma von Kontrollschimpansen. Beide NANBH-Plasmen enthielten Nucleinsäuren/RNA, die in dem PCR-Amplifikationstest positive Ergebnisse ergaben, während die beiden Kontrollplasmen negative Ergebnisse ergaben. Diese Ergebnisse wurden mehrfach wiederholt erhalten.
Es ist bekannt, daß bei RNA-Viren defekte Viren auftreten. Unter Verwendung des PCR-Verfahrens ist es möglich, Primer zur Amplifikation von Sequenzen des HCV-Genoms zu planen. Es wird erwartet, daß es durch Analyse der amplifizierten Produkte möglich ist, sowohl defekte Versionen des viralen Genoms zu identifizieren als auch virale Spezies vom Wildtyp. Unter Verwendung von zwei Primern auf der Basis bekannter HCV-Sequenzen kann man demgemäß genau die erwartete Größe des PCR-Produkts voraussagen. Jede größere Spezies, die bei der Analyse mittels Gelelektrophorese und Hybridisierung beobachtet wird, könnte potentiell variante Genome darstellen. Alternativ könnte jede auf diese Weise beobachtete kleinere Spezies defekte Agentien darstellen. Die Analyse dieser Typen wäre von Nutzen bei der Bestätigung der genauen Quelle der bekannten HCV-Sequenz, ob sie in der Tat eine virale Sequenz vom Wildtyp ist oder ein defektes Genom. Techniken und Verfahren für diese Analysen sind im Stand der Technik bekannt und wurden früher beschrieben. Diese Methodik wird den Durchschnittsfachmann in die Lage versetzen, verwandte (Wildtyp oder defekte) Formen des viralen Genoms zu erhalten.

Nachweis von Sequenzen in festgehaltenen Partikeln, die nach Amplifikation mittels PCR an HCV-cDNA hybridisieren, die von Clon 81 abgeleitet ist

Die RNA in festgehaltenen Partikeln wurde, wie nachstehend beschrieben, erhalten. Die Analyse auf Sequenzen, die an HCV-cDNA hybridisieren, die von Clon 81 abgeleitet ist, wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen. PCR-Amplifikationsverfahrens durchgeführt, außer daß die Hybridisierungssonde ein Kinase-behandeltes Oligonucleotid war, das von der cDNA-Sequenz von Clon 81 abgeleitet war. Die Ergebnisse zeigten, daß die amplifizierten Sequenzen mit der HCV-cDNA-Sonde hybridisierten.
Die Partikel wurden aus dem Plasma von HCV nfizierten Schimpansen unter Verwendung von Polystyrol-Kügelchen festgehalten, die mit einem immungereinigten Antikörper beschichtet waren, der gegen das von Clon 5-1-1 codierte Polypeptid gerichtet war. Das Verfahren zur Herstellung der immungereinigten Antikörper-Präparation ist in der E.P.A.- Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben, die ebenfalls im hier genannten Rechtsnachfolgers des Eigentümers hier ist und die durch Bezugnahme mit eingeschlossen wird. Kurz gesagt wurde das von Clon 5-1-1 codierte Polypeptid als ein Fusionspolypeptid mit Superoxid-Dismutase (SOD) exprimiert. Dies wurde durch Subclonierung der cDNA-Insertion in Clon 5-1-1 in den Expressionsvektor pSODcfl (Steimer et al. (1986)) erreicht. Die von pSODcfl isolierte DNA wurde mit BamHI und EcoRI behandelt, und der folgende Linker wurde in die lineare DNA ligiert, die durch die Restriktionsenzyme gebildet wurde:
5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT AA 3' Nach der Clonierung wurde das Plasmid, das die Insertion enthielt, isoliert. Das Plasmid, das die Insertion enthielt, wurde mit EcoRI behandelt. Die HCV-cDNA-Insertion in Clon 5-1-1 wurde mit EcoRI ausgeschnitten und in diese mit EcoRI linearisierte Plasmid-DNA ligiert. Das DNA-Gemisch wurde verwendet, um den E. coli-Stamm D1210 (Sadler et al. (1980)) zu transformieren. Rekombinante mit der 5-1-1-cDNA in der korrekten Orientierung für die Expression des ORF wurden durch Restriktionskartierung und Nucleotidsequenzierung identifiziert. Die rekombinanten Bakterien von einem Clon wurden durch Züchtung der Bakterien in der Gegenwart von IPTG zur Expression des SOD-NANB&sub5;&submin;&sub1;&submin;&sub1;-Polypeptids induziert. Das Fusionspolypeptid wurde von dem rekombinanten E. coli durch differentielle Extraktion des Zellextrakts mit Harnstoff, gefolgt von Chromatographie auf Anionen- und Kationenaustauschersäulen gereinigt. Das gereinigte SOD-NANB&sub5;&submin;&sub1;&submin;&sub1;-Polypeptid wurde an eine Nitrocellulosemembran gebunden. Antikörper in Proben von HCV-infiziertem Serum wurden an an Matrix-gebundene Polypeptide adsorbiert. Nach Waschen zur Entfernung von unspezifisch gebundenem Material und nicht gebundenem Material wurde der gebundene Antikörper von dem gebundenen Polypeptid freigesetzt.

cPCR-Verfahren zum Nachweis von HCV-RNA in der Leber und im Serum von Individuen mit NANBH.

Die Zuverlässigkeit und der Nutzen einer modifizierten Form des PCR-Tests, d. h. eines cPCR-Tests, zum Nachweis einer HCV-Infektion wurde mittels Durchführung des Tests mit Gesamt-RNA von Leber und mit Serum von infizierten Individuen bestimmt. In dem cPCR- Test wird mutmaßliche, virale RNA in der Probe einer reversen Transkription in cDNA mit reverser Transkriptase unterworfen; ein Segment der resultierenden cDNA wird dann unter Verwendung einer modifizierten Version des von Saiki et al. (1986) beschriebenen PCR- Verfahrens amplifiziert. Die Primer für das cPCR-Verfahren werden von HCV-RNA abgeleitet, die durch die Familie der hier bereitgestellten HCV-cDNAs identifiziert werden kann. Ein amplifiziertes Produkt, das HCV-RNA entspricht, wird unter Verwendung einer Sonde nachgewiesen, die von der Familie der hier bereitgestellten HCV-cDNAs abgeleitet ist.
Die cPCR/HCV-Tests, die bei diesen Studien verwendet wurden, wurden unter Verwendung der folgenden Verfahren für die Gewinnung der RNA, der reversen Transkription von RNA in cDNA, der Amplifikation von spezifischen Segmenten der cDNA mit PCR und der Analyse der PCR-Produkte durchgeführt.
Die RNA wurde aus Leber unter Verwendung des Guanidiniumisothiocyanat- Verfahrens zur Gewinnung von Gesamt-RNA extrahiert, das bei Maniatis et al. (1982) beschrieben ist.
Um Gesamt-RNA aus Plasma zu isolieren, wurde das Plasma mit TENB (0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) fünf bis zehnfach verdünnt und 60 bis 90 Minuten bei 37ºC in einer Proteinase K/SDS-Lösung (0,05% SDS, 1 mg/ml Proteinase K, 20 Mikrogramm/ml poly(A)-Träger) inkubiert. Die Proben wurden einmal mit Phenol (pH 6,5) extrahiert, die resultierende organische Phase wurde erneut einmal mit TENB, das 0,1% SDS enthielt, extrahiert, und die wäßrigen Phasen von beiden Extraktionen wurden vereint und zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol/CHCl&sub3;/Isoamylalkohol [1 : 1(99 : 1)] extrahiert. Die resultierenden wäßrigen Phasen wurden mit einem gleichen Volumen - CHCl&sub3;/Isoamylalkohol (99 : 1) zweimal extrahiert und mit Ethanol unter Verwendung von 0,2 M Natriumacetat, pH 6,5, und 2,5 Volumina 100%-igem Ethanol ausgefällt; die Präzipitation fand über Nacht bei 20ºC statt.
Die als Matrize für die PCR-Reaktion verwendete cDNA wurde unter Verwendung der vorbestimmten Proben für die Herstellung der entsprechenden cDNAs hergestellt. Jede RNA- Probe (die entweder 2 Mikrogramm Hitze-denaturierter Gesamt-RNA von Schimpansenleber, RNA von 2 Mikroliter Plasma oder 10% der RNA enthielt, die aus zylindrischen menschlichen Leberbiopsien von 10 mm · 4 mm extrahiert worden war) wurde in einer 25 Mikroliter-Reaktion inkubiert, die 1 mikromolar für jeden Primer, 1 millimolar für jedes Desoxyribonucleotidtriphosphat (dNTP), 50 millimolar an Tris-HCl, pH 8,3, 5 millimolar an MgCl&sub2;, 5 millimolar an Dithiothreit (DTT), 73 millimolar an KCl und 40 Einheiten RNase- Inhibitor (RNASIN) und 5 Einheiten reverse Transkriptase von AMV enthielt. Die Inkubation war 60 Minuten bei 37ºC. Nach der cDNA-Synthese wurden die Reaktionen mit 50 Mikroliter entionisiertem Wasser (DIW) verdünnt, 10 Minuten gekocht und auf Eis gekühlt.
Die Amplifikation eines Segments der HCV-cDNA wurde unter Verwendung der zwei synthetischen oligomeren 16-mer Primer durchgeführt, deren Sequenzen von den HCV- cDNA-Clonen 36 (Antisense) und 37b (Sense) abgeleitet waren. Die Sequenz des Primers von Clon 36 war:
5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'.
Die Sequenz des Primers von Clon 37b war:
5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.
Die Primer wurden jeder mit einer Endkonzentration von 1 mikromolar verwendet. Um das Segment an HCV-cDNA zu amplifizieren, das durch die Primer flankiert wird, wurden die cDNA-Proben mit 0,1 Mikrogramm RNAse A und den PCR-Reagentien des Perkin Elmer Cetus-PCR-Kits (N801-0043 oder N801-OOSSgemäß den Angaben des Herstellers) inkubiert. Die PCR-Reaktion wurde 30 Zyklen oder 60 Zyklen in einem Perkin Elmer Cetus Thermalcycler durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungsschritt von einer Minute bei 94ºC, einem Anlagerungsschritt von 2 Minuten bei 37ºC und einem Verlängerungsschritt von 3 Minuten bei 72ºC. Der Verlängerungsschritt beim letzten Zyklus (30 oder 60) war jedoch 7 Minuten statt 3 Minuten. Nach der Amplifikation wurden die Proben mit einem gleichen Volumen Phenol : Chloroform (1 : 1) extrahiert, gefolgt bei einer Extraktion mit einem gleichen Volumen Chloroform, und die Proben wurden mit Ethanol ausgefällt, das 0,2 M Natriumacetat enthielt.
Die cPCR-Produkte wurden wie folgt analysiert. Die Produkte wurden einer Elektrophorese auf alkalischen 1,8%-igen alkalinen Agarosegelen gemäß Murakawa et al. (1988) unterworfen und durch ein Blot-Verfahren der Gele über Nacht in 0,4 M NaOH auf ZetaTM-Probe-Papier (BioRad Corp.) übertragen. Die Blots wurden in 2 X SSC (1 X SSC enthält 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) neutralisiert und in 0,3 M NaCl, 15 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 15 mM EDTA, 1,0% SDS, 0,5% fettfreier Milch (Carnation Co.) und 0,5 mg/ml Ultraschall-bestrahlter, denaturierter Lachssamen-DNA prä-hybridisiert. Die auf HCV-cDNA-Fragmente zu analysierenden Blots wurden mit einer ³²P markierten Sonde hybridisiert, die durch Nick-Translation der HCV-cDNA-Insertionssequenz in Clon 35 gebildet wurde, beschrieben in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216. Nach der Hybridisierung wurden die Blots bei 65ºC in 0,1 X SSC gewaschen (1 X SSC enthält 0,15 M NaCl, 0,01 M Na-Citrat), getrocknet und autoradiographiert. Die erwartete Produktgröße ist in der Länge 586 Nucleotide; Produkte, die mit der Sonde hybridisierten und in den Gelen in dieser Größenordnung wanderten, wurden als positiv auf virale RNA eingestuft.
Als eine Kontrolle wurde cPCR mit Primer durchgeführt, die geplant waren, um alpha- 1-anti-Trypsin-mRNA zu amplifizieren, um die Anwesenheit von RNA in jeder analysierten Probe zu verifizieren. Die codierende Region des alpha-1-anti-Trypsin-Gens ist in Rosenberg et al. (1984) beschrieben. Synthetische, oligomere 16-mer Primer, die geplant sind, um ein Fragment von 365 Nucleotiden der codierende Region des alpha-1-anti-Trypsin-Gens zu amplifizieren, wurden von den Nucleotiden 22-37 (Sense) und den Nucleotiden 372-387 (Antisense) abgeleitet. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung einer Nick-translatierten Sonde mit ³²P nachgewiesen, die zwischen den cDNA/PCR-Primersequenzen liegt, diese aber nicht einschließt.
Wegen der extremen Empfindlichkeit der PCR-Reaktion wurden alle Proben mindestens dreimal laufen gelassen. Alle falsch positiven Signale wurden bei Einhaltung der folgenden Vorkehrungen eliminiert: 1) Eliminierung von Aerosolen durch Verwendung von Röhrchen mit Schraubverschluß mit Gummidichtring; 2) Pipettierung mit positiven Ranin MicromanTM-Verdrängungspipetten mit Wegwerfkolben/-kapillaren; und 3) Auswahl der Oligonucleotidsequenzen für die cDNA- und PCR-Primer von zwei nicht benachbarten cDNA-Clonen.

Nachweis von HCV-RNA in Leberproben mittels eines cPCR-Verfahrens

Der cPCR-Test wurde mit Gesamt-RNA durchgeführt, die aus der Leber von drei Schimpansen, die experimentell mit einem NANBH-Agens infiziert worden waren, und von Leberbiopsien von italienischen Patienten mit der Diagnose von chronischer NANBH isoliert worden war.
Fig. 25A zeigt die Ergebnisse des cPCR-Tests unter Verwendung von 1 Mikrogramm von jeder Präparation von Gesamt-RNA von Leber. Die RNA wurde von Leberproben eines Schimpansen in der chronischen Phase von NANBH (910) (Spur 1) und von zwei Schimpansen in der akuten Phase der Infektion (1028 und 508) (Spuren 2 bzw. 3) isoliert. Die PCR wurde mit den Proben in den Spuren 1-3 für 30 Zyklen durchgeführt, und das Autoradiogramm des Blots, der diese Spuren enthielt, wurde 5 Stunden exponiert cDNA von 1 Mikrogramm an Gesamt-RNA von dem akut infizierten Tier 1028 (Spur 4) und von drei nicht infizierten Schimpansen (Spuren 5-7) wurden für 60 Zyklen amplifiziert, und die Autoradiogramme, die diese Spuren enthielten, wurde 7 Tage exponiert. Mit ³²P markierte und mit MspI verdaute pBR322-DNA diente als Marker bei allen Autoradiogrammen. Aus den Ergebnissen kann gesehen werden, daß cDNA, die HCV-RNA entsprach, nur in den Proben von Schimpansen mit NANBH, entweder chronisch oder akut, gesehen wurde (Spuren 1, 3 und 4). Die cPCR-Produkte in diesen Spuren wanderten zwischen den Markerfragmenten von 527 und 622 Nucleotiden (nicht gezeigt).
Fig. 25B zeigt die Ergebnisse des cPCR-Tests unter Verwendung von 10% der RNA, die aus 10 mm X 4 mm Zylindern von Leberbiopsien von 15 Patienten mit chronischer NANBH (Spuren 1-15), einem Patienten mit cryptogener Leberkrankheit (Spur 16) und einer Kontrollprobe von einem Patienten mit chronischer Hepatitis-B (Spur 17) extrahiert worden war. Die Amplifikation mittels PCR betrug 30 Zyklen, und die Autoradiogramme für die Blots wurden 4 Tage exponiert, außer daß Spur 1 für 15 Stunden exponiert wurde. Wie man von den Resultaten sieht, waren 9/15 (60%) der menschlichen Proben positiv für HCV-RNA (Spuren 1, 2, 4, 6, 7, 10-13). Ein Patient mit der Diagnose der cryptogene Leberkrankheit (Spur 16) und ein Patient mit chronischer HBV-Infektion (Spur 17) waren im cPCR-Test wiederholt negativ.

Vergleich des HCV/cPCR-Tests bei menschlichen Leberbiopsien und von RIA von Serum unter Verwendung von HCV-C100-3-Polyneptid

SOD/HCV-C100-3-Polypeptid (auch C100 genannt) ist ein rekombinantes Fusionspolypeptid, das 363 virale Aminosäuren enthält. Das Polypeptid ist von Nutzen beim Nachweis von Antikörpern gegen HCV (vgl. Kuo et al. (1989)). Das Verfahren zur Herstellung von C100 ist in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben.
Ein Radioimmuntest unter Verwendung von C100 wurde mit den Seren durchgeführt, die von den selben 17 menschlichen Patienten gewonnen worden waren, deren Leberproben dem vorstehend beschriebenen HCV/cPCR-Test unterworfen worden waren. Die Seren wurden am selben Tag wie die Leberbiopsien entnommen. Der Test wurde im Wesentlichen wie in der E.P.A.-Offenlegungs-Nr. 318,216 beschrieben, durchgeführt, die im gemeinsamen Eigentum ist und durch Bezugnahme hier eingeschlossen wird. Kurz gesagt wurden Mikrotiterplatten (Immulon 2, Removeawell strips) mit 0,1 Mikrogramm gereinigtem C100 beschichtet. Die beschichteten Platten wurden 1 Stunde bei 37ºC mit den Serumproben (100 Mikroliter einer 1 : 100-Verdünnung) oder geeigneten Kontrollen inkubiert. Nach der Inkubation wurde das nicht gebundene Material entfernt, die Platten wurden gewaschen und die Komplexe von menschlichem Antikörper-C100 wurden durch Inkubation mit ¹²&sup5;I- markiertem Schaf-anti-Mensch-Immunglobulin nachgewiesen. Nicht gebundener, markierter Antikörper wurde durch Absaugen entfernt und die Platten wurden gewaschen. Die Radioaktivität in den einzelnen Mulden wurde bestimmt.
Die Ergebnisse des RIA zeigten, daß 67 Prozent dieser Proben positiv für anti-C100- Antikörper waren. Seren von dem Patienten mit der Diagnose der cryptogenen Leberkrankheit waren positiv für anti-C100-Antikörper, obwohl Spiegel an viraler RNA in der Leber des Patienten in dieser Probe nicht nachweisbar waren. Das Maß an Korrelation zwischen der Anwesenheit an anti-C100-Antikörpern und HCV-RNA war 70%; zwei Patienten, die beim RIA negativ auf Antikörper waren, hatten signifikante Spiegel an HCV-RNA in ihrer Leber (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die Ergebnisse zeigen an, daß das Virus häufig in der Leber von Patienten mit zirkulierenden anti-C100-Antikörpern vorhanden ist und bestätigt den Anspruch, daß die Anwesenheit von anti-C100-Antikörpern genau den Befall mit HCV widerspiegelt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse außerdem, daß HCV dieser Art für NANBH in mindestens 75% der Patienten in dieser Studie verantwortlich ist und daß der dominierende Stamm von HCV in Italien mit dem in den Vereinigten Staaten vorherrschenden Stamm eng verwandt zu sein scheint.

HCV/cPCR-Test von Seren: Nachweis von viraler RNA bei der Infektion in der akuten Phase in Schimpansen

Die zeitliche Relation zwischen dem Erscheinen eines Leberschadens, der Anwesenheit von HCV-RNA und der Anwesenheit von anti-HCV-Antikörpern wurde im Serum von zwei experimentell infizierten Schimpansen mit NANBH (Nr. 771 und 910) verfolgt. Der Leberschaden wurde über die Alaninaminotransferase (ALT)-Spiegel bestimmt; die Anwesenheit von HCV-RNA wurde mittels des vorstehend beschriebenen HCV-cPCR- Tests bestimmt; anti-HCV-Antikörper wurden unter Verwendung des C100-RIA nachgewiesen.
Die HCV/cPCR-Analyse wurde mit RNA durchgeführt, die aus 1 Mikroliter Schimpansenplasma extrahiert worden war. Von dem Schimpansen 771 wurde an den Tagen 25, 32, 70 und 88 nach der Infektion Serum entnommen; die cPCR wurde für 30 Zyklen durchgeführt und das Autoradiogramm 18 Tage exponiert. Von dem Schimpansen 910 wurde an den Tagen 11, 28 und 67 nach der Infektion Serum entnommen; die cPCR wurde für 60 Zyklen durchgeführt und das Autoradiogramm 5 Tage exponiert.
Die Ergebnisse der Tests werden für den Schimpansen 771 in Fig. 26A und für den Schimpansen 910 in Fig. 26B gezeigt. Von einem Vergleich der Figs. 26A und 26B scheint es, daß ein früher, gut definierter Peak an ALT-Werten während der akuten Hepatitis mit der Anwesenheit von viraler RNA in dem infizierten Individuum korreliert.
Die Daten zeigen auch an, daß die Anwesenheit von HCV-RNA, die ein Indiz für einen Virämiezustand ist, der Anwesenheit von anti-HCV-Antikörpern vorangeht. Der Schimpanse 771 (Fig. 26A) zeigte nach 28 Tagen eine klar definierte akute Episode von NANBH nach der Transfusion, charakterisiert durch einen anfänglichen Peak an ALT-Spiegeln. HCV-RNA wurde im Serum nachgewiesen, das am Tag 25 und am Tag 32 gesammelt wurde. Während dieser akuten Phase waren anti-HCV-Antikörper jedoch nicht vorhanden. Im Gegensatz dazu war am Tag 70 HCV-RNA unterhalb der experimentellen Nachweisgrenze und anti-HCV- Antikörper stiegen an. Am Tag 88 blieb HCV-RNA nicht nachweisbar, während anti-HCV- Antikörper signifikant höher als am Tag 70 waren.
Die Resultate, die mit den Seren von dem Schimpansen 910 erhalten wurden, waren im Muster etwa ähnlich, obwohl die Zeit der Induktion von HCV-Antikörpern durch die Infektion während der akuten Phase der Krankheit nicht nachgewiesen wurde, die sich mindestens bis zum Tag 67 erstreckte; die anti-HCV-Antikörper, die mittels RIA am Tag 11 nachgewiesen wurden, waren auf passive Immunisierung von Tier 910 mit Antikörpern von dem Plasma zurückzuführen, das verwendet wurde, um das Tier zu inokulieren. Anti-HCV-Antikörper wurden im Serum des Schimpansen 910 während der späteren, chronischen Phase der Infektion gefunden (Daten nicht gezeigt).
Es sollte festgehalten werden, daß niedrige ALT-Werte im Plasma von Individuen mit chronischer NANBH nicht notwendigerweise mit schwacher Virusproduktion korrelieren. Ein Pool von 17 verschiedenen Plasmaproben, dem Schimpansen 910 über einen Zeitraum von zwei bis dreieinhalb Jahren nach der Inokulation entnommen, wurden auf ALT-Spiegel und HCV-RNA überprüft. Die ALT-Werte der Proben überstiegen nicht 45 mU/ml; trotzdem zeigten Titrationsuntersuchungen hohe Titer an HCV an (3 · 106 CID/ml). Eine cPCR wurde für 30 Zyklen durchgeführt, und die Autoradiogramme wurden 15 Stunden exponiert; die cPCR-Analyse zeigte klar die Anwesenheit von viraler RNA (Daten nicht gezeigt).

HCV/cPCR-Test an Seren: Nachweis von viraler RNA bei der Infektion in der akuten Phase im Menschen

Plasma von einem menschlichen, chirurgischen Patienten, das während der frühen, akuten NANBH entnommen wurde, wurde unter Verwendung des HCV/cPCR-Test und des C100-RIA auf HCV-RNA bzw. anti-HCV-Antikörper untersucht. Der HCV/cPCR-Test wurde unter Verwendung eines Mikroliters Plasma von dem Patienten und von vier menschlichen Kontrollen mit bekannter Abstammung durchgeführt; cPCR wurde für 30 Zyklen durchgeführt, und nach Hybridisierung und Waschen wurde das Autoradiogramm acht Stunden exponiert.
Die Resultate zeigten, daß das von dem chirurgischen Patienten während der akuten Phase der Infektion entnommene Serum einen hohen Spiegel an viraler RNA enthielt und daß die anti-HCV-Antikörper mit dem C100-RIA nicht nachweisbar waren (Daten nicht gezeigt). (Von dem Plasma der akuten Phase von dem chirurgischen Patienten war bekannt, daß es einen hohen Titer an infektiösem NANBH-Agens [106,5 CID/ml, wie von Feinstone et al. (1981); Feinstone et al. (1983) bestimmt]) enthielt. Es sollte jedoch festgehalten werden, daß dieser Patient ungefähr 9 Monate nach der Infektion eine mittels C100-RIA festgestellte Serokonversion zu anti-HCV-Antikörpern durchgemacht hatte. Das Serum von den menschlichen Kontrollplasmen bekannter Abstammung war sowohl bei dem HCV/cPCR-Test- als auch bei dem C100-RIA negativ.

Empfindlichkeit des HCV/cPCR-Tests

Die Empfindlichkeit des HCV/cPCR-Tests wurde durch Analyse von zehnfachen seriellen Verdünnungen eines Plasmapools bekannten Titers bestimmt. Das Schimpansenplasma hatte einen Titer von ~3 · 10&sup5; CID/ml und die RNA wurde aus zehnfachen Verdünnungen von einem Mikroliter des Plasmas extrahiert. cPCR wurde für dreißig Zyklen durchgeführt, und nach Hybridisierung und Waschen wurde das Autoradiogramm 15 Stunden exponiert. Die von der Amplifikation von ~300, ~30 und ~3 CID an HCV-Genomen resultierenden cPCR-Produkte sind in den Spuren 1-3 in Fig. 29 gezeigt. Die Proben in den Spuren 1 und 2 waren auf den Autoradiogrammen nachweisbar, die 2 Stunden exponiert waren.
Da man annimmt, daß der mittlere Titer an HCV in infizierten Individuen zwischen etwa 100 bis 10.000 CID/ml Plasma ist, legen diese Daten nahe, daß der HCV/cPCR-Test klinisch von Nutzen sein kann.

HCV/cPCR-Test für variante HCV-Stämme

Primer, die aus einem Satz an oligomeren 44-meren und einem Satz an oligomeren 45- meren bestanden, wurden geplant, um Stämme von HCV zu amplifizieren, die ähnlich oder identisch zu den HCV-Isolaten sind, von denen die cDNA-Sequenz in Fig. 18 abgeleitet ist. Die Voraussetzung, der die Planung dieser Primer unterliegt, ist unsere Entdeckung, daß HCV ein Flavi-ähnliches Virus ist. Mitglieder der Familie der Flaviviridae haben im Vergleich mit HCV zwei konservierte Sätze an Aminosäuresequenzen, TATPPG und QRRGR, in der mutmaßlichen NS3-Region dieser Viren. Mehrere andere, kleinere Sätze können gesehen werden, zum Beispiel GDD in der mutmaßlichen NS5-Region. Andere Sätze können durch Vergleich der bekannten Aminosäuresequenzen mit der von HCV ermittelt werden. Diese Information wurde von den Sequenzen von mehreren Mitgliedern der Familie der Flaviviridae abgeleitet, die beschrieben wurden, einschließlich des japanischen Encephalitis-Virus (Sumiyoshi et al. (1987)), Gelbfiebervirus (Rice et al. (1985)), Dengue Typ 2-Virus (Hahn et al. (1988)), Dengue Typ 4-Virus (Mackow et al. (1987)) und West-Nil-Virus (Castle et al. (1986)). Die konservierten Aminosäuresequenzen und die Verwendung von Codons sind in der unmittelbar folgenden Tabelle dargestellt. Konservierte Aminosäure (As.)-Sequenzen zwischen Flaviviren und HCV
Bemerkung: die Primersequenz wurde so ausgewählt, um die Zahl an Nucleotiddegenerationen am 3'-Ende der Primersequenz zu minimieren und um die Zahl an Nucleotiden am 3'-Ende von jedem Primer zu maximieren, die genau zu jeder der möglichen Nucleotidsequenzen oder dem Komplement davon passen, die die vorstehend angezeigten konservierten Aminosäuren codieren.
Die 44-mer- und 45-mer-Oligomerprimer wurden so geplant, daß die Sequenzen, die diese Aminosäuren codierten, in den Primern enthalten waren. Darüber hinaus enthalten sie Degenerationen am 3'-Ende von jedem Primer und sind von zwei verschiedenen Regionen des HCV-Genoms abgeleitet, die in Clon 40b (vgl. Fig. 28)-anwesend sind und die von der Region abgeleitet sind, die die mutmaßliche NS3-Region von HCV codiert. Die Formeln für die Oligonucleotidprimer in den Sätzen sind:
5' GAC TGC GGG GGC GAG ACT GGT TGT GCT CGC ACC GCC ACC CCX CC 3'
worin X A, T, G oder C ist; und
5' TCT GTA GAT GCC TGG CTT CCC CCT GCC AGT CCT GCC CCG ACT YTG 3'
worin Y T oder C ist.
Der HCV/cPCR-Test wurde unter Verwendung dieser Primer zur Amplifikation von HCV-RNA im Plasma des Schimpansen 910 durchgeführt. Das Testverfahren war, im Wesentlichen wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben, außer daß die 44-mer- und 45-mer- Sätze an oligomeren Primern für die Primer eingesetzt wurden, die von Clon 36 und Clon 37b abgeleitet waren. Außerdem war der Nachweis von amplifizierter HCV-cDNA mittels Hybridisierung mit einer Sonde, die von Clon 40a abgeleitet war, dessen Sequenz in Fig. 32 gezeigt ist.
Die Sonde wurde durch Amplifikation eines Segements von Clon 40a unter Verwendung des vorstehend beschriebenen PCR-Verfahrens tnd 18-mer-Primern hergestellt, die die folgenden Sequenzen haben:
5' GAG ACA TCT CAT CTT CTG 3'
und
5' GAG CGT GAT TGT CTC AAT 3'.
Nach der Amplifikation wurden die hergestellten Sonden mittels Nick-Translation mit ³²P markiert.
Fig. 33 zeigt ein Autoradiogramm der Southern-Blots, hybridisiert mit der Sequenz, die von Clon 40a abgeleitet ist. Mit ³²P markierte und mit MspI verdaute pBR322-DNA- Fragmente dienten als Marker (Spur 1). Die vorhergesagte Größe des PCR-Produkts, das von einer Amplifikation unter Verwendung dieser Primer resultiert, ist 490 Nucleotide (nt). Wiederholungsreaktionen sind in den Spuren 2 und 3 gezeigt.

Analyse auf Varianten der 5'-Realen von HCV

Basierend auf dem Flavivirus-Modell codiert die 5'-Region von HCV-cDNA, die flankiert wird von den Regionen, die in den Clonen ag30a und k9-1 repräsentiert sind, ein Segment eines mutmaßlichen Hüll- und/oder Matrixproteins/mutmaßlicher Hüll- und/oder Matrixproteine (E/M). Serum, das von dem Schimpansen erhalten worden war, von dem die HCV-cDNA-"c"-Bibliothek konstruiert worden war, wurde mittels HCV/cPCR analysiert, um zu bestimmen, ob innerhalb der Zielregion Varianten vorkommen.
Der HCV/cPCR-Test wurde, im Wesentlichen wie vorstehend für die Isolierung von Clon 5'-32 beschrieben, durchgeführt, abgesehen von den verwendeten Primern und Sonden. Fig. 37 zeigt die Beziehung der Primer und Sonden (und der Clone, von denen sie abgeleitet sind) zu der Zielregion der HCV-cDNA. Ein Satz an PCR-Primem, ag30a16A und K91Env16B, wurde von den Clonen ag30a und k9-1 abgeleitet, die stromaufwärts bzw. stromabwärts von der Zielsequenz sind. Die erwartete Größe des cPCR-Produkts, das von ag30a16A und K91Env16B gestartet wird, ist 1,145 kb, basierend auf der bestätigten Sequenz von HCV-cDNA. Zwei andere Sätze an PCR-Primem, die die amplifizierte Region unter Verwendung von ag30a16A und K91Env16B abdecken und die sich gegenseitig überlappen, wurden ebenfalls für die Amplifikation von HCV-RNA im Serum verwendet. Somit wurden in diesem Fall die PCR-Reaktionen unter Verwendung von ag30a16A und CA156e16B als einem Satz an Primern und von CA156e16A und K91Env16B als zweitem Satz an Primern durchgeführt. Die erwarteten Größen für das PCR-Produkt für diese Paare waren 615 Nucleotide (NT) bzw. 683 NT. Die unmittelbar fogende Tabelle führt den Primer, den Clon, von dem er abgeleitet ist, und die Primersequenz auf Tabelle
Die Sonden für alle HCV-cPCR-Produkte bestanden aus ³²P-markierten Abschnitten von HCV-cDNA, die mittels PCR-Amplifikation einer Region von Clon 216 (unter Verwendung von CA216a16A und 216a16B als Primer) und von Clon 84 (unter Verwendung von CA84a16A und CA84a16B als Primer) hergestellt worden waren; ³²P wurde mittels Nick- Translation in die PCR-Produkte eingeführt. Diese Sonden überlappten die in der HCV/cPCR- Reaktion verwendeten Primer nicht.
Fig. 38 zeigt ein Autoradiogramm eines Southern-Blots, bei dem die HCV/cPCR- Produkte mit den ³²P-markierten Sonden hybridisiert worden waren. Das HCV/cPCR-Produkt, das von den Primern ag30a16A und K91Env16B verlängert worden war (Spur 1) war etwa 1,1 Kb; nach 15 Stunden Exposition wurden keine anderen PCR-Produkte beobachtet. Die HCV- Produkte, die von den Primersätzen ag30a15A/CA156e16B (Spur 2) und CA156e16A/K91Env16B (Spur 3) verlängert worden waren, waren etwa 625 NT bzw. etwa 700 NT. Die Größe der PCR-Produkte wurde durch Vergleich mit der relativen Wanderung von Fragmenten bestimmt die aus dem Verdau von pBR322 mit MspI und von PhiX 174 mit HaeIII resultierten (Spur 5).
Die vorstehende Untersuchung wird Insertionen oder Deletionen, die so klein sind wie 20 NT bis 50 NT, und DNA-Umlagerungen nachweisen, die die Größe der Ziel-DNA verändern. Die Resultate in Fig. 38 bestätigen, daß es nur eine Hauptspezies an cDNA gibt, die von der E/M-Region von HCV in dem Schimpansenserum abgeleitet ist.

Amplifikation für die Clonierung von HCV-cDNA-Sequenzen unter Verwendung von PCR und Primern, die von konservierten Reajonen von genomischen Sequenzen vom Flavivirus abgeleitet sind

Unsere Entdeckung, daß HCV ein Flavi-ähnliches Virus ist, erlaubt eine Strategie zur Clonierung nicht charakterisierter HCV-cDNA-Sequenzen unter Verwendung des PCR- Verfahrens und von Primern, die von Regionen abgeleitet sind, die konservierte Aminosäuresequenzen in Flaviviren codieren. Im allgemeinen ist einer der Primer von einer definierten genomischen HCV-Sequenz abgeleitet, und der andere Primer, der eine Region von nicht sequenzierten HCV-Polynucleotiden flankiert, ist von einer konservierten Region des Flavivirus-Genoms abgeleitet. Von den Flavivirus-Genomen ist bekannt, daß sie konservierte Sequenzen innerhalb von NS1 und der E-Polypeptide enthalten, die in der 5'- Region des Flavivirus-Genoms codiert werden. Um daher cDNA-Sequenzen zu isolieren, die von mutmaßlich vergleichbaren Regionen des HCV-Genoms abgeleitet sind, werden stromaufwärts liegende Primer geplant, die von konservierten Sequenzen innerhalb dieser Flavivirus-Polypeptide abgeleitet sind. Die stromabwärts liegenden Primer sind von einem stromaufwärts liegenden Ende des bekannten Bereichs der HCV-cDNA abgeleitet.
Wegen der Degeneration des Codes ist es wahrscheinlich, daß es Fehlpaarungen zwischen den Flavivirus-Sonden und den entsprechenden genomischen HCV-Sequenzen gibt. Deshalb wird eine Strategie verwendet, die der von Lee (1988) beschriebenen ähnlich ist. Das Lee-Verfahren verwendet gemischte Oligonucleotidprimer, die komplementär zu den reversen Translationsprodukten einer Aminosäuresequenz sind; die Sequenzen in den gemischten Primern berücksichtigen jede Codondegenerierung für die konservierte Aminosäuresequenz.
Drei Sätze an Primergemischen werden erzeugt, basierend auf den Aminosäurehomologien, die in mehreren Flaviviren gefunden wurden, einschließlich Dengue- 2,4 (D-2,4), Japanischer Encephalitis-Virus (JEV), Gelbfieber (YF), und West-Nil-Virus (WN). Das Primergemisch, das von der am meisten stromaufwärts gelegenen, konservierten Sequenz (5'-1) abgeleitet ist, basiert auf der Aminosäuresequenz Gly-Trp-Gly, die ein Teil der konservierten Sequenz Asp-Arg-Gly-Trp-Gly-AspN ist, die im E-Protein von D-2, JEV, YF und WN gefunden wird. Das nächste Primergemisch (5'-2) basiert auf einer stromabwärts gelegenen, konservierten Sequenz im E-Protein, Phe-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Ile-Phe-Gly-Asp- Ser-Tyr-Ile, und ist von Phe-Gly-Asp abgeleitet; die konservierte Sequenz ist in D-2, JEV, YF und WN vorhanden. Das dritte Primergemisch (5'-3) basiert auf der Aminosäuresequenz Arg- Ser-Cys, die ein Teil der konservierten Sequenz Cys-Cys-Arg-Ser-Cys im NS1-Protein von D- 2, D-4, JEV, YF und WN ist. Die individuellen Primer, die das Gemisch bei 5'-3 bilden, sind in Fig. 53 gezeigt. Zusätzlich zu den variierten Sequenzen, die von der konservierten Region abgeleitet sind, enthält jeder Primer in jedem Gemisch auch eine konstante Region am 5'- Ende, der eine Sequenz enthält, die Stellen für die Restriktionsenzyme Hindlil, MboI und EcoRI codiert.
Der stromabwärts gelegene Primer ssc5h20A ist von einer Nucleotidsequenz in Clon 5h abgeleitet, die HCV-cDNA-Sequenzen enthält, die mit denen in den Clonen 14i und 11b überlappen. Die Sequenz von ssc5h20A ist
5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3'.
Ein alternativer Primer ssc5h34A kann auch verwendet werden. Dieser Primer ist von einer Sequenz in Clon 5h abgeleitet und enthält außerdem am 5'-Ende Nucleotide, die eine Stelle für ein Restriktionsenzym bilden, womit das Clonieren erleichtert wird. Die Sequenz von ssc5h34A ist
5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3'.
Die PCR-Reaktion, die ursprünglich von Saiki et al. (1986) beschrieben wurde, wird, im Wesentlichen wie von Lee et al. (1988) beschrieben, durchgeführt, außer daß die Matrize für die cDNA eine RNA ist, die von der Leber von mit HCV infizierten Schimpansen oder von viralen Partikeln isoliert wurde, die vom Serum von mit HCV infizierten Schimpansen isoliert wurden. Außerdem sind bei der ersten Runde der Amplifikation die Anlagerungsbedingungen weniger stringent (0,6 M NaCl und 25ºC), weil der Teil des Primers, der an die HCV-Sequenz anlagert, nur 9 Nucleotide ist und Fehlpaarungen aufireten könnten. Wenn darüber hinaus ssc5h34A verwendet wird, tendieren die zusätzlichen Sequenzen, die nicht vom HCV-Genom abgeleitet sind, dazu, das Hybrid Primer-Matrize zu destabilisieren. Nach der ersten Runde an Amplifikation können die Anlagerungsbedingungen stringenter sein (0,066 M NaCl und 32ºC- 37ºC), da die amplifizierten Sequenzen nun Regionen enthalten, die komplementär zu den Primern oder Duplikate von ihnen sind. Außerdem werden die ersten 10 Zyklen der Amplifikation mit Klenow-Enzym I bei geeigneten PCR-Bedingungen für dieses Enzym durchgeführt. Nach der Beendigung dieser Zyklen werden die Proben extrahiert und mit Taq- Polymerase laufen gelassen, gemäß den Kit-Vorschriften, die von Cetus/Perkin-Elmer bereitgestellt werden.
Nach der Amplifikation werden die amplifizierten HCV-cDNA-Sequenzen mittels Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die von Clon 5h abgeleitet ist, nachgewiesen. Die Sonde ist von Sequenzen abgeleitet, die stromaufwärts zu denen sind, die zur Ableitung der Primer verwendet wurden, und sie überlappt nicht mit den Sequenzen der von Clon Sh abgeleiteten Primer. Die Sequenz der Sonde ist
5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CUU GTT GAT GGC GC 3'.

Industrielle Anwendbarkeit

Die hier beschriebenen Verfahren ebenso wie die Oligomerprimer, die von HCV- cDNA abgeleitet sind, und die Kits, die sie enthalten, sind von Nutzen für die genaue, relativ einfache und ökonomische Bestimmung der Anwesenheit von HCV in biologischen Proben, insbesondere in Blut, das bei Transfusionen verwendet werden soll, und bei Individuen, bei denen eine HCV-Infektion vermutet wird. Darüber hinaus können diese Verfahren und Oligomere beim Nachweis eines früheren Stadiums einer HCV-Infektion von Nutzen sein, als es immunologische Tests können, die auf der Verwendung von rekombinanten HCV- Polypeptiden basieren. Ein Hybridisierungstest mit amplifizierten Polynucleotiden weist HCV-RNA auch in Gelegenheitsproben nach, die negativ auf anti-HCV-Antikörper sind.
Somit können die hier beschriebenen Sonden und Primer in amplifizierten Hybridisierungstests verwendet werden, in Verbindung mit einem Immuntest, der auf HCV- Polypeptiden beruht, um Infektionen, die auf HCV beruhen, und mit HCV infizierte biologische Proben, einschließlich Blut, vollständiger zu identifizieren.
Die hier bereitgestellte Information erlaubt die Planung von Primern, die von konservierten Regionen des HCV-Genoms abgeleitet sind. Die Bereitstellung dieser Primer stellt ein allgemeines Verfahren bereit, das variante HCV-Stämme nachweisen kann und das bei der Durchmusterung von Blut und Blutprodukten verwendet werden kann.
Wenn die bei diesem Verfahren verwendeten Primer von konservierten Regionen des HCV-Genoms abgeleitet sind, sollte das Verfahren beim Nachweis und/oder der Identifikation varianter Stämme von HCV helfen. Dies wiederum sollte zu der Entwicklung von zusätzlichen - immunologischen Reagentien für den Nachweis und die Diagnose von HCV führen, ebenso wie zu der Entwicklung von zusätzlichen Polynucleotidreagentien für den Nachweis und/oder die Behandlung von HCV.
Außerdem ermöglichen Sätze an Primern und Sonden, die von den konservierten Aminosäuresequenz von Flaviviren und HCV geplant werden, ein universelles Nachweisverfahren für diese infektiösen Agentien.
Die im folgenden aufgelisteten Materialien sind eine Hinterlegung unter den Regeln des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATTC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, und sie haben die folgenden Hinterlegungsnummern erhalten.
Außerdem wurden am 11. Mai 1989 die folgenden Hinterlegungen gemacht.
Die folgenden Derivate von Stamm D1210 wurden am 3. Mai 1989 hinterlegt. Stammderivat ATCC-Nr.
Die folgenden Stämme wurden am 12. Mai 1989 hinterlegt.

Stamm ATTC-Nr.

Lambda gt11 (C35) 40603
Lambda gt10 (beta-Sa) 40602
D 1210 (C40b) 67980
D1210 (M16) 76981
Die folgenden biologischen Materialien wurden am 23. März 1990 hinterlegt.

Material ATTC-Nr.

5'-Clon32 (in pUC18S) 68276

Claims

1. Verfahren für die Detektion von verschiedenen Hepatitis C Virus (HCV) Stämmen in einer Probe, das Verfahren umfassend:

(a) Einsetzen der Probe in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern von geeigneter Länge um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Anwesenheit eines Polymerisierungsagens zu starten wobei wenigstens ein Primer in der Lage ist selektiv an eine konservierte Region eines HCV Genoms, dargestellt in Fig. 18 oder dem Komplement davon zu hybridisieren; und

(b) Analysieren der Größe oder Sequenz von einem amplifizierten Produkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die konservierte(n) Region(en) des HCV Genoms NS3 oder NS5 ist (sind).

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die konservierte Region des HCV Genoms zwischen Nukleotid -318 bis 174 ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei wenigstens ein Primer in der Lage ist, an eine konservierte Region eines Flavivirusgenoms zu hybridisieren.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die konservierte Region des Flavivirusgenoms sich innerhalb der Sequenz befindet, welche für NS1 oder E Polypeptide codiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 wobei wenigstens ein Primer (i) eine Nukleotidsequenz umfasst welche die Polypeptidsequenz TATPPG oder QRRGR codiert, oder (ii) den Komplementärstrang der. Nukleotidsequenz aus (i).

7. Verfahren nach Anspruch 6 wobei der Primer die Sequenz

5' ACC GCC ACC CCX CC3' umfasst, wobei X irgendein Nukleotid ist;

oder

5' CCT GCC CCG ACGXTG3' umfasst, wobei X ein T oder C ist.

8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei wenigstens ein Primer (i) eine Nukleotidsequenz umfasst, welche die Polypeptidsequenz GWG, FGD oder RSC codiert oder (ii) den Komplementärstrang der Nukleotidsequenz von (i).

9. Verfahren nach Anspruch 8 wobei der Primer eine Oligonukleotidprimer- Mischung ist, umfassend die einzelnen Sequenzen dargestellt in Fig. 53.

10. Verfahren nach Anspruch 1 wobei wenigstens ein Primer ausgewählt ist von

5' CTC TAT GGC AAT GAG G3';

5'CGT TGG CAT AAC TGA T3';

5' CGA CAA GAA AGA CAG A3';

5' AGC TTC GAC GTC ACA T3';

5' TGA ACT ATG CAA CAG G3';

5' GGA GTG TGC AGG ATG G3';

5' AAG GTT GCA ATT GCT C3';

5' ACT AAC AGG ACC TTC G3'

5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA3' und

5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A3'.

11. Ein Primer ausgewählt von

5' CTC TAT GGC AAT GAG G3';

5' CGT TGG CAT AAC TGA T3';

5' CGA CAA GAA AGA CAG A3';

5' AGC TTC GAC GTC ACA T3';

5' TGA ACT ATG CAA CAG G3';

5' GGA GTG TGC AGG ATG G3';

5' AAG GTT GCA ATT GCT C3'; und

5' ACT AAC AGG ACC TTC G3'.