DE69029327T2

DE69029327T2 - Neue antikörper reaktiv gegen menschliche karzinome

Info

Publication number: DE69029327T2
Application number: DE69029327T
Authority: DE
Inventors: Kim Bruce; Ingegerd Hellstrom; Kark Hellstrom; George Schreiber
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2010-06-30
Also published as: IL94872A0; PT94565B; DE69029327D1; CN1051389A; US5491088A; JPH05504330A; IE902383A1; NZ234282A; EG19493A; PT94565A; OA09527A; GR1000712B; GR900100504A; EP0479920B1; CA2020247A1; MY108519A; HU906891D0; NO915137L; IL94872A; NO915137D0

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, gegenüber menschlichen Karzinomzellen reaktive Antikörper. Insbesondere betrifft die Erfindung monoklonale Maus-Antikörper und chimäre monoklonale Antikörper, die mit einem Zellmembranantigen reagieren, das mit einer großen Vielzahl menschlicher Karzinome, einschließlich Dickdarm-, Brust-, Ovar- und Lungenkarzinomen, im Zusammenhang steht. Der monoklonale Maus-Antikörper weist hohe Spezifität gegenüber Karzinomen auf und zeigt keine bis sehr geringe Reaktivität gegenüber normalem menschlichem Gewebe oder anderen Tumortypen, wie Lymphomen und Sarkomen. Die erfindungsgemäßen Antikörper besitzen einige zusätzliche Vorteile. Erstens, werden sie in die Karzinomzellen internalisiert, an die sie binden. Daher sind die erfindungsgemäßen BR96-Antikörper brauchbar für therapeutische Anwendungen, wie z. B. als Antikörperkomponente von Antikörper-Wirkstoff- oder Antikörper- Toxin-Konjugaten, bei denen eine Internalisierung des Konjugates erwünscht ist. Zweitens, vermitteln diese Antikörper die Antikörper-abhängige Zelltoxizität ("ADCC") und die Komplementvermittelte Cytotoxizität ("CDC"). Drittens, können diese Antikörper Antigen-positive Tumorzellen in nicht-konjugierter Form töten, wenn sie in ausreichender Konzentration vorhanden sind. Die Antikörper sind auch brauchbar für Diagnoseverfahren, wie z. B. die Detektion von Karzinomen durch in vitro- oder in vivo-Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

Monoklonale Antikörper gegen menschliche, Tumor-assoziierte Differenzierungs-Antigene sind hinsichtlich des "Targeting" verschiedener Antitumormittel, z. B. von Radioisotopen, chemotherapeutischen Wirkstoffen und Toxinen, vielversprechend [Baldwin und Byers (Hrsg.) in "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", London, Academic Press (1985)]. Zusätzlich besitzen einige monoklonale Antikörper den Vorteil, daß sie Tumorzellen mittels ADCC oder CDC in Gegenwart von menschlichen Effektorzellen oder menschlichem Serum töten [Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)], und es gibt einige wenige monoklonale Antikörper, die eine direkte Antitumor-Aktivität besitzen, die nicht von einer Wirtskomponente abhängig ist [Drebin et al., Oncogene 2:387-394 (1988)].
Es sind viele monoklonale Antikörper bekannt, die gegenüber Karzinom-assoziierten Antigenen reaktiv sind [siehe z. B. Papsidero, "Recent Progress In The Immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin. Surg. Oncol., 1 (4):171-81 (1985); Schlom et al., "Potential Clinical Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas", Important Adv. Oncol., 170-92 (1985); Allum et al., "Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions", Surg. Ann., 18:41-64 (1986); und Houghton et al., "Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Cancer", Semin. Oncol., 13(2):165-79 (1986)].
Diese bekannten monoklonalen Antikörper können an viele verschiedene Karzinom-assoziierte Antigene, einschließlich Glycoproteine, Glycolipide und Mucine, binden [siehe z. B. Fink et al., "Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Characterization Of Human Tumor Antigens", Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)]. Zu monoklonalen Antikörpern, die an Glycoprotein-Antigenen auf spezifischen Typen von Karzinomen binden, zählen diejenigen, die in den Patentschriften U.S. 4,737,579 (monoklonale Antikörper gegen nicht-kleinzellige Lungenkarzinome), U.S. 4,753,894 (monoklonale Antikörper gegen menschlichen Brustkrebs), U.S. 4,579,827 (monoklonale Antikörper gegen menschlichen Gastrointestinal-Krebs) und U.S. 4,713,352 (monoklonale Antikörper gegen menschliche Nierenkarzinome) beschrieben sind. Der monoklonale Antikörper B72.3, der einer der am meisten untersuchten Antikörper ist, erkennt ein Tumor-assoziiertes Mucin-Antigen mit einem Molekulargewicht von mehr als 1 000 kd, das auf einer Reihe verschiedener Karzinome selektiv exprimiert wird. So wurde gezeigt, daß B72.3 mit Brustkarzinomen zu 84 %, mit Kolon-Karzinomen zu 94 %, mit Ovarkarzinomen zu 100 % und mit nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen zu 96 % reagiert [siehe Johnston, "Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody B72 .3", Acta Cytol., 1(5): 537-56 (1987) und US-Patent 4,612,282 (Schlom et al.]. KC-4, ein weiterer patentierter monoklonaler Antikörper, [siehe US- Patent 4,708,930] erkennt ein etwa 400-500 kd großes Protein- Antigen, das auf einer Reihe von Karzinomen, wie z. B. Kolon-, Prostata-, Lungen- und Brustkarzinomen, exprimiert wird. Es scheint, daß weder der Antikörper B72.3 noch der Antikörper KC-4 in die Karzinomzellen, mit denen sie reagieren, internalisiert werden.
Monoklonale Antikörper, die gegenüber Tumorzell-assoziierten Glycolipid-Antigenen reaktiv sind, sind bekannt. Beispielsweise beschreiben Young et al. in "Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM&sub2;)", J. Exp. Med., 150: 1008-1019 (1979) die Herstellung zweier monoklonaler Antikörper, die spezifisch für Asialo GM&sub2;, ein Zelloberflächenglycosphingolipid-Antigen sind, das man als Marker für durch den Kirsten-Maussarkom-Virus transformierte BALB/c V3T3-Zellen identifiziert hat (siehe auch Kniep et al., "Gangliotriaosylceramide (Asialo GM&sub2;) A Glycosphingolipid Marker For Cell Lines Derived From Patients With Hodgkin's Disease", J. Immunol., 131(3): 1591-94 (1983) und US-Patent 4,507,391 (monoklonale Antikörper gegen menschliche Melanome).
Weitere monoklonale Antikörper, die mit Glycolipid-Antigenen auf Karzinomzellen reagieren, beschreiben Rosen et al. in "Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel of Rat Monoclonal Antibodies", Cancer Research, 44:2052-61 (1984) (monoklonale Antikörper gegen kleinzelligen Lungenkrebs beim Menschen), Varki et al. in "Antigens Associated With a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies", Cancer Research 44:681-87 (1984) (monoklonale Antikörper gegen menschliche Adenokarzinome in Lunge, Magen und Dickdarm und Melanome) und das US-Patent 4,579,827 (monoklonale Antikörper gegen menschliches Kolon- Adenokarzinom). Siehe auch Hellstrom et al., "Antitumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7509-63 (1986), worin der monoklonale Antikörper L6 beschrieben wird, der ein Kohlenhydrat-Antigen erkennt, welches an der Oberfläche menschlicher, nicht-kleinzeliger Lungenkarzinome, Brustkarzinome und Kolonkarzinome exprimiert wird.
Brown et al (Biosci. Rep. 3:163 (1983)) beschreiben den monoklonalen Antikörper C14/1/46/10, der gegenüber normaler Kolon-Mukosa bevorzugt an die Membranen menschlicher Kolorektal-Karzinome bindet. Dieser Antikörper erkennt ein Kohlenhydrat-Antigen, das mit der Blutgruppendeterminante H koexistiert: Rucα1 T Gal. Des weiteren zeigen Daten, daß an der antigenen Determinante Blutgruppenketten vom difucosylierten Typ 2 mit der Struktur Galβ1 T 4GlcNAc beteiligt sind.
Abe et al. (Cancer Res. 46:2639-2644 (1986)) beschreiben den monoklonalen Antikörper AH6, der mit Glycolipiden reagiert, welche die Lewis-Determinante Fucα1T2Galβ1T4[Fucα1T3]GlcNAcβ1TR aufweisen.
Kim et al. ("Expression of LeY and Extended LeY Blood Group-Related Antigens in Human Malignant, Premalignant and Nonmalignant Colonic Tissues", Cancer Res. 46:5985-5992 (1986)) beschreiben ebenfalls den monoklonalen Antikörper AH6 und lehren, daß AH6 nicht gut zwischen malignem und nicht-malignem Gewebe unterscheiden konnte. Die Publikation von Kim beschreibt außerdem die monoklonalen Antikörper CC-1, CC-2 und KH-1. Diese monoklonalen Antikörper zeigten relativ hohe Spezifität, aber geringere Sensitivität gegenüber Kolonkrebs-Gewebe.
Zusätzliche monoklonale Antikörper, die hohe spezifische Reaktivität gegenüber der Mehrheit der Zellen einer breiten Palette von Karzinomen zeigen, werden dringend benötigt. Der Grund hierfür ist die antigene Heterogenität vieler Karzinome, was bei der Diagnose oder Behandlung oft die Verwendung einer ganzen Reihe verschiedener monoklonaler Antikörper für dieselbe Tumormasse erfordert. Es besteht ein zusätzlicher Bedarf, insbesondere zur Therapie, an sogenannten "internalisierenden" Antikörpern, d.h. Antikörpern, die ohne weiteres von den Tumorzellen, an die sie binden, aufgenommen werden. Antikörper dieses Typs kommen bei therapeutischen Methoden zur Anwendung, bei welchen von Antikörper-Wirkstoff- oder Antikörper-Toxin-Konjugaten Gebrauch gemacht wird, worin ein therapeutisches Antitumormittel mit einem Antikörper zur Abgabe an den Tumor verbunden ist, wo der Antikörper an das Tumor-assoziierte Antigen, mit dem er reagiert, bindet und das Antitumormittel in das Innere der Tumorzellen "liefert" [siehe z. B. Embleton et al., "Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, S. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Antikörper gegen Tumor-assoziierte Antigene, die nicht in der Lage sind, in die Tumorzellen, an die sie binden, internalisiert zu werden, sind im allgemeinen nicht brauchbar zur Herstellung von Konjugaten mit Antituinorwirkstoffen oder Toxinen, da diese ihren Wirkungsort im Innern der Zelle nicht erreichen könnten. Es wären dann andere Methoden zur therapeutischen Verwendung dieser Antikörper erforderlich.
Es sind mehrere gegenüber Lymphocyten-Antigenen reaktive, internalisierende Antikörper bekannt. Dennoch sind solche Antikörper selten, wenn es um feste Tumoren geht. Eines der wenigen Beispiele eines internalisierenden Antikörpers, der mit Karzinomen reagiert, ist ein in Domingo et al., "Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates", Methods Enzymol. 112:238-47 (1985) offenbarter Antikörper. Dieser Antikörper reagiert mit dem auf Tumorzellen exprimierten menschlichen Transferrin-Rezeptorglycoprotein. Da der Transferrin- Rezeptor jedoch auch auf vielen normalen Gewebetypen, oft sogar in großen Mengen, exprimiert wird, kann die Verwendung eines Anti-Transferrinrezeptor-Antikörpers in einem Antikörper-Wirkstoff- oder Antikörper-Toxin-Konjugat signifikante toxische Effekte auf normale Zellen mit sich bringen. Daher ist die Brauchbarkeit dieses Antikörpers zum selektiven Abtöten oder zur selektiven Inhibierung von Tumorzellen fraglich. Ein weiterer internalisierender Antikörper ist BR64 (offenbart in den gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldungen Nr. 289,635 vom 22. Dezember 1988 und Nr. 443,696 vom 29. November 1989, auf die hiermit Bezug genommen wird), der an ein breites Spektrum menschlicher Karzinome bindet.
Die Zellfusionstechnik zur Herstellung monoklonaler Antikörper [Köhler und Milstein, Nature (London) 256:495 (1975)] hat die Entwicklung einer Reihe von monoklonalen Maus-Antikörpern ermöglicht, die mit Antigenen, einschließlich bisher unbekannten Antigenen, reagieren. Monoklonale Maus-Antikörper können jedoch vom menschlichen Immunsystem als fremde Substanzen erkannt und neutralisiert werden, so daß ihr Potential in der Humantherapie nicht zum Tragen kommt. Daher konzentrierten sich jüngste Bemühungen auf die Herstellung sogenannter "chimärer" Antikörper durch Einführung von DNA in Säugerzellen zur Expression von Immunoglobulingenen [Oi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825 (1983); Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6581 (1984); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066 (1986); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214 (1987)].
Chimäre Antikörper sind Immunoglobulin-Moleküle, die einen menschlichen und einen nicht-menschlichen Anteil umfassen. Insbesondere stammt die Antigen-Bindungsregion (variable Region) eines chimären Antikörpers aus einer nicht-menschlichen Quelle (z. B. aus einer Maus), und die konstante Region des chimären Antikörpers, die dem Immunoglobulin eine biologische Effektorfunktion verleiht, stammt aus einer menschlichen Quelle. Der chimäre Antikörper sollte die Antigen-Bindungsspezifität des nicht-menschlichen Antikörpermoleküls und die durch das menschliche Antikörpermolekül bewirkte Effektorfunktion besitzen.
Im allgemeinen umfassen die zur Herstellung chimärer Antikörper angewandten Verfahren folgende Stufen:
a) Identifizierung und Klonierung des korrekten Genseginentes zur Codierung der Antigenbindungsstelle des Antikörpermole küls; dieses Genseginent (das als VDJ, d.h. Variable, Diversity und Joining Regionen für schwere Ketten oder als VJ, d.h. Variable und Joining Regionen für leichte Ketten oder einfach als V, oder Variable Region, bekannt ist) kann entweder als cDNA oder in genomischer Form vorliegen;
b) Klonierung der Gensegmente zur Codierung der konstanten Region oder eines gewünschten Teils davon;
c) Ligation der variablen Region mit der konstanten Region, so daß der gesamte chimäre Antikörper in einer transskribierbaren und translatierbaren Form codiert ist;
d) Ligation dieses Konstruktes in einen Vektor, der einen selektierbaren Marker und Genkontrollregionen, wie z. B. Promotoren, Enhancer und Poly(A)-Additionssignale, enthält;
e) Amplifizierung dieses Konstruktes in Bakterien;
f) Einführung dieser DNA in eukaryotische Zellen (Transfektion), meist Säugetier-Lymphocyten;
g) Selektion von Zellen, die den selektierbaren Marker exprimieren;
h) Screenen auf Zellen, die den gewünschten chimären Antikörper exprimieren; und
k) Untersuchung des Antikörpers auf geeignete Bindungsspezifität und Effektorfunktionen.
Antikörper mit mehreren unterschiedlichen Antigen-Bindungsspezifitäten wurden gemäß den obigen Arbeitsanweisungen zur Herstellung chimärer Proteine [z. B. Anti-TNP: Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); und Antitumor-Antigene: Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066 (1986)] manipuliert. Ebenso erzielte man mehrere verschiedene Effektorfunktionen, indem man neue Sequenzen mit denjenigen verknüpfte, die für die Antigen-bindende Region codierten. Dazu zählen z. B. Enzyme [Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)], konstante Regionen von Immunoglobulin aus einer anderen Spezies und konstante Regionen einer anderen Immunoglobulinkette (Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Tan et al., J. Immunol. 135:3565-3567 (1985)].
Die Entdeckung der homologen Rekombination in Säugerzellen ermöglicht das Targeting neuer Sequenzen an spezifischen Orten auf Chromosomen. Die homologe Rekombination erfolgt, wenn kultivierte Säugerzellen exogene DNA an der Chromosomenstelle in chromosomale DNA integrieren, welche die zu den Plasmidsequenzen homologen Sequenzen enthält [Folger et al., Mol. Cell. Biol. 2:1372-1387 (1982); Folger et al., Symp. Quant. Biol. 49:123-138 (1984); Kucherlapati et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3153-3157 (1984); Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1391-1395 (1985); de Saint Vincent et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2002-2006 (1983); Shaul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3781-3784 (1985)]. Das Potential der homologen Rekombination innerhalb der Zellen ermöglicht die Modifikation endogener Gene in situ. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen die chromosomale Sequenz modifiziert werden kann, wobei ein Plasmid-DNA, die ein zur Target-Stelle homologes DNA-Segment und ein Seginent aus neuen Sequenzen mit der erwünschten Modifikation enthält, in die Zelle eingeführt wird [Thomas et al., Cell 44:419-428 (1986); Smithies et al., Nature 317:230- 234 (1985); Smith et al., Symp. Quant. Biol. 49:171-181 (1984)]. Durch homologe Rekombination zwischen der DNA von Säugerzellenchromosomen und der exogenen Plasmid-DNA kann es zur Integration des Plasmids oder zum Ersetzen der Chromosomen-Sequenzen durch homologe Plasmidsequenzen kommen. Dies kann dazu führen, daß eine gewunschte neue Sequenz an die endogene Target-Stelle gesetzt wird.
Das homologe Rekombinationsverfahren ist unter Verwendung von Genen, wie NEO und HPRT, die für einige Zelltypen eine dominante Selektion bieten, bewertet worden [Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6820-6824 (1987); Rubinitz und Subramani, Mol. Cell. Biol. 6:1608-1614 (1986); und Liskay, Cell 35:157-164 (1983)]. Vor kurzem sind Verfahren zur Modifizierung von Antikörpermolekülen und zur Herstellung chimärer Antikörpermoleküle unter Anwendung der homologen Rekombination zur Erzielung einer Genmodifikation beschrieben worden [Fell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8507-8511 (1989); und die gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldungen Nr. 243,873 vom 14. September 1988 und Nr. 468,035 vom 22. Januar 1990, die auf dieselbe Person übertragen wurde wie die vorliegende Anmeldung, worauf hiermit Bezug genommen wird].
Der direkteste Weg zur klinischen Anwendung monoklonaler Antitumor-Antikörper ist ihre Verabreichung in nicht-modifizierter Form, wobei monoklonale Antikörper verwendet werden, die in vitro und in Tiermodellen Antitumoraktivität zeigen. Die meisten monoklonalen Antikörper gegen Tumorantigene scheinen an sich keine Antitumor-Aktivität zu besitzen. Es sind jedoch bestimmte monoklonale Antikörper bekannt, die Komplement-abhängige Cytoxizität (CDC) vermitteln, d.h. menschliche Tumorzellen in Gegenwart von menschlichem Serum als Komplement-Quelle abtöten [siehe z. B. Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] oder Antikörper-abhängige Zelltoxizität (ADCC) zusammen mit Effektorzellen, wie z. B. menschlichen NK- Zellen oder Makrophagen, vermitteln. Zur Detektion von ADCC- und CDC-Aktivität werden monoklonale Antikörper auf die Lyse von kultivierten &sup5;¹Cr-markierten Tumor-Targetzellen über einen 4-stündigen Inkubationszeitraum untersucht.
Targetzellen werden mit &sup5;¹Cr markiert und dann 4 Stunden einer Kombination von Effektorzellen (in Form von menschlichen Lymphocyten, die unter Verwendung eines Lmyphocyten-Separationsmediums gereinigt wurden) und Antikörpern ausgesetzt, die in Konzentrationen von 0,1 µg/ml bis 10 µg/ml zugegeben wird. Die Freisetzung von &sup5;¹Cr aus den Targetzellen wird als Hinweis auf die Tumorzell-Lyse (Cytotoxizität) gemessen. Die Kontrollen umfassen die Inkubation von Targetzellen alleine bzw. jeweils mit Lymphocyten oder mit monoklonalen Antikörpern. Die Gesamtmenge an freisetzbarem &sup5;¹Cr wird bestimmt und die ADCC wird als prozentuale Abtötungsrate von Targetzellen durch monoklonale Antikörper plus Effektorzellen, im Vergleich zu alleine inkubierten Targetzellen, berechnet. Das CDC-Verfahren ist identisch mit demjenigen zur Detektion der ADCC, wobei jedoch an Stelle der Effektorzellen menschliches Serum als Komplementquelle (Verdünnung: 1:3 bis 1:6) zugegeben wird.
Monoklonale Antikörper mit ADCC- und CDC-Aktivität kommen zur therapeutischen Anwendung in Betracht, da sie oft Antitumoraktivität in vivo besitzen. Andererseits sind Antikörper, die keine ADCC- bzw. CDC-Aktivität in vitro besitzen, üblicherweise in vivo unwirksam, sofern sie nicht als Träger für Antitumormittel verwendet werden. Die Fähigkeit eines monoklonalen Antikörpers, das Komplement des Wirtes zu aktivieren, kann sich nicht nur deshalb als therapeutisch nützlich erweisen, weil Tumorzellen abgetötet werden können, sondern auch, weil sich die Blutzufuhr an die Tumoren erhöhen kann, was die Aufnahme von Wirkstoffen erleichtert [siehe Helistrom et al., "Immunobgical Approaches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, and Anti-Idiotypes, in Covalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash & Rodwell (Hrsg.), Marcel Dekker, S. 15-18 (1989)]. Unter den monoklonalen Maus-Antikörpern sind die Isotypen IgG2a und IgG3 am häufigsten mit ADCC und CDC assoziiert. Antikörper mit ADCC- und CDC-Aktivität besitzen hohe Selektivität zum alleinigen Abtöten der Tumorzellen, an die sie binden, und es wäre unwahrscheinlich, daß sie toxische Effekte bewirken, wenn sie unspezifisch in Lunge, Leber oder anderen Organen eingeschlossen wären. Dadurch können diese Antikörper gegenüber radioaktiv markierten Antikörpern oder bestimmten Typen von Immunokonjugaten im Vorteil sein.
Nur sehr wenige Antikörper können von sich aus, d.h. ohne Effektorzellen oder Komplement, wie bei ADCC oder CDC, Tumorzellen abtöten. BR96 ist ein solcher Antikörper, da er von sich aus, bei einer Antikörperkonzentration von etwa 10 µg/ml oder mehr, Zellen abtöten kann. Solche Antikörper sind von besonderem Interesse, da sie irgendein Schlüsselelement zum Überleben neoplastischer Zellen beeinflussen können.
Es ist somit ersichtlich, daß ein Antikörper, der ein hohes Maß an Selektivität gegenüber einer breiten Palette von Karzinomen zeigt, an sich Antitumoraktivität besitzt und leicht von Tumorzellen internalisiert werden kann, von großem Nutzen für die Tumortherapie sein kann.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß werden internalisierende Antikörper bereitgestellt, die hochselektiv gegenüber einer Reihe menschlicher Karzinome sind. Insbesondere handelt es sich bei den neuen, erfindungsgemäßen Antikörpern, die als BR96-Antikörper bezeichnet werden, um einen monoklonalen Maus-Antikörper und einen chimären Antikörper, die an ein auf menschlichen Karzinomzellen vorzufindendes Zellmembran-Antigen binden. Diese Antikörper sind hochreaktiv gegenüber Karzinomzellen, wie z. B. denjenigen, die von Brust-, Lungen-, Kolon- und Ovarkarzinomen stammen, wobei sie keine oder begrenzte Reaktivität gegenüber normalen menschlichen Zellen oder anderen Tumortypen, wie Lymphomen oder Sarkomen, zeigen. Darüber hinaus internalisieren die erfindungsgemäßen Antikörper in Karzinomzellen, an die sie binden und sie sind befähigt, von sich aus, d.h. in nicht-konjugierter Form und ohne Effektorzellen oder Komplement, Tumorzellen zu töten. Somit sind die BR96-Antikörper von besonderem Nutzen für therapeutische Anwendungen, z. B. zur Reaktion mit Tumorzellen, und in Konjugaten als Target-selektiver Träger verschiedener Agenzien, die Antitumoreffekte besitzen, einschließlich chemotherapeutischer Wirkstoffe, Toxine, Modifikatoren der Immunantwort, Enzymen und Radioisotopen. Diese Antikörper können somit als Komponente verschiedener Immunokonjugate, einschließlich Antikörper-Wirkstoff- und Antikörper-Toxin- Konjugate, verwendet werden, wenn eine Internalisierung des Konjugates bevorzugt ist und nach Radiomarkierung zur Abgabe von Radioisotopen an Tumoren. Die BR96-Antikörper können selbst in unmodifizierter Form von therapeutischem Nutzen sein. Des weiteren sind die Antikörper für Diagnoseverfahren zur Detektion von Karzinomen in vitro oder in vivo brauchbar.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Antikörper oder Fragment davon mit spezifischer immunologischer Reaktivität gegenüber menschlichen Karzinomzellen bereitgestellt, wobei der Antikörper eine Antigen-bindende Region des monoklonalen Maus- Antikörpers BR96 umfaßt, der von dem Hybridom mit der ATCC-Nr. HB10036 produziert wird. Bei dem erfindungsgemäßen Antikörper kann es sich um einen monoklonalen Antikörper handeln, der beispielsweise von einer Maus stammt, wie z. B. der monoklonale Maus-Antikörper BR96, der von dem mit der Nummer HB10036 bei der ATCC hinterlegten Hybridom stammt.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden monoklonale Anti-Idiotyp-Antikörper bereitgestellt, die mit einem Idiotyp auf einem Antikörper des obigen Typs reagieren.
Die Erfindung betrifft auch Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragmente der neuen Antikörper.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein rekombinantes Protein bereitgestellt, das die Antigen-bindende Region des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers umfaßt. Dieses rekombinante Protein kann ein chimärer Menschen-/Maus-Antikörper sein, wie z. B. der von dem bei der ATCC hinterlegten Hybridom HB10460 produzierte chimäre Antikörper Ch47iBR96. Die Antigenbindende Region in dem rekombinanten Protein kann mit wenigstens einem funktional aktiven Abschnitt eines zweiten Proteins verknüpft sein, das Antitumoraktivität besitzt, wie z. B. ein Enzym, Lymphokin, Oncostatin oder Toxin.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft bispezifische Antikörper mit Bindungsspezifität für zwei verschiedene Antigene, wobei eines der Antigene dasjenige ist, an das der oben erwähnte monoklonale Antikörper bindet, wie z. B. eine Variante des LeY-Antigens, die ein Fucose α1T3 enthaltendes Epitop umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können mit einem therapeutischen Agens, wie z. B. einem Antitumor-Wirkstoff, einem Toxin, einem radioaktiven Agens, einem zweiten Antikörper oder einem Enzym, zur Bildung eines Antikörperkonjugates konjugiert werden.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Kombinationen eines Immunokonjugates, welches den Antikörper vom oben definierten Typ umfaßt, der mit einem zur Umwandlung einer Prodrug in einen cytotoxischen Wirkstoff befähigten Enzym verknüpft ist, und die Prodrug umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch Hybridome zur Herstellung der neuen Antikörper, wie z. B. die bei der ATCC hinterlegten Hybridome HB10036 und HB10460.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden pharmazeutische Mittel bereitgestellt, die zur Behandlung menschlicher Karzinome brauchbar sind und eine pharmazeutisch wirksame Menge eines neuen Antikörpers, eines neuen Antikörper-Konjugates oder eines neuen rekombinanten Proteins umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung wenigstens eines der neuen Produkte zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung menschlicher Karzinome oder zur Abbildung menschlicher Karzinome, wobei das Produkt mit einer Markierung zur Erzeugung eines detektierbaren Signals markiert sein kann, die ausgewählt ist unter einer Radiomarkierung, einem Enzym, einem Chromophor und einem Fluorophor.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Bestimmung der Präsenz von Karzinomen in menschlichem Gewebe bereitgestellt, welches den Kontakt einer Probe des Gewebes mit wenigstens einem der oben beschriebenen Antikörper und die Detektion der Bindung des Antikörpers an das Gewebe umfaßt. Der Antikörper kann mit einer Markierung zur Erzeugung eines detektierbaren Signals markiert sein, die ausgewählt ist unter einer Radiomarkierung, einem Enzym, einem Chromophor und einem Fluorophor.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen diagnostischen Kit, der umfaßt:
a) einen Antikörper vom oben beschriebenen Typ und
b) ein Konjugat aus einer detektierbaren Markierung und einem spezifischen Bindungspartner des Antikörpers gemäß (a),
wobei die Markierung ausgewählt ist unter Enzymen, Radiomarkierungen, Chromophoren und Fluorophoren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidinaufnahme in die DNA von 3396-Brustkarzinomzellen, die mit einem BR96-RA-Immunotoxin in verschiedenen Konzentrationen gemäß der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 3 behandelt wurden. BR6- RA ist ein internalisierender Antikörper, der als negative Kontrolle verwendet wird, da er nicht an die 3396-Zellen bindet.
Figur 2 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidin- Aufnahme in die DNA von 2707-Lungenkarzinomzellen, die mit einem BR96-RA-Immunotoxin in verschiedenen Konzentrationen gemäß der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 3 behandelt wurden. BR6-RA ist ein internalisierender Antikörper, der auch an die 2707-Zellen bindet.
Figur 3 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidin- Aufnahme in die DNA von HCT116-Kolonkarzinomzellen, die mit einem BR96-RA-Immunotoxin in verschiedenen Konzentrationen gemäß der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 3 behandelt wurden. BR6-RA bindet nicht an HCT116-Zellen.
Figur 4 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidin- Aufnahme in die DNA von C-Kolonkarzinomzellen, die mit einem BR96-RA-Immunotoxin in verschiedenen Konzentrationen gemäß der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 3 behandelt wurden. BR6-RA bindet nicht an die C-Zellen; L6-RA bindet zwar an die C-Zellen, wird jedoch nicht internalisiert.
Figur 5 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidin Aufnahme in die DNA von 3347-Kolonkarzinomzellen, die mit einem BR96-RA-Immunotoxin in verschiedenen Konzentrationen gemäß der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 3 behandelt wurden. Im Gegensatz zu BR6 bindet BR96 nicht an diese Zellen.
Figur 6 zeigt die Ergebnisse einer FACS-Analyse der Cytotoxizität von 3396-Brustkarzinomzellen, 2987-Lungenkarzinomzellen und 3619-Kolonkarzinomzellen, die mit Propidiumiodid, wie in nachfolgendem Beispiel 4 beschrieben, gefärbt wurden.
Figur 7 zeigt die Effekte von BR96 auf die Zellproliferation verschiedener Zellinien gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 4.
Figur 8 zeigt die Wirkung von BR96 auf das Zellwachstum verschiedener Zellinien, die durch ein Färbeverfahren, wie in nachfolgendem Beispiel 4 beschrieben, bestimmt wurde.
Figur 9 zeigt die Ergebnisse von Tests zur Bestimmung der ADCC-Aktivität von BR96 gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 5.
Figur 10 zeigt die Ergebnisse von Tests zur Bestimmung der CDC-Aktivität von BR96 gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 6.
Figur 11 ist ein Balkendiagramm der Ergebnisse von Tests der Reaktivität von BR96 gegenüber Glycolipiden gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 7.
Figur 12 ist ein Balkendiagramin der Ergebnisse von Tests der Reaktivität von BR96 gegenüber Neoglycoproteinen gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 7.
Figur 13 ist eine graphische Darstellung der Bindungsaktivität von BR96 F(ab')&sub2;-Fragmenten, die durch einen ELISA unter Verwendung eines Ziege-Anti-Kappa-Leichte Kette-Detektionsreagens gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 8 mit derjenigen des ganzen monoklonalen Antikörpers BR96 verglichen wurde.
Figur 14 ist eine graphische Darstellung der Bindungsaktivität von BR96 F(ab')&sub2;-Fragmenten, die durch einen ELISA unter Verwendung eines Peroxidase-konjugierten Protein A-Detektionsreagens gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 8 mit derjenigen des ganzen monoklonalen Antikörpers BR96 verglichen wurde.
Figur 15 ist ein Diagramm des im Elektroporationsverfahren gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 9 verwendeten Vektors phgamma&sub1;HC-D.
Figur 16 ist ein Diagramm des im Elektroporationsverfahren gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 9 verwendeten Vektors pSV&sub2;gpt/Ck.
Figur 17 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse des in nachfolgendem Beispiel 9 beschriebenen kompetitiven Bindungstests zum Vergleich der Bindung des erfindungsgemäßen monoklonalen Maus-Antikörpers BR96 mit der Bindung des erfindungsgemäßen chimären Antikörpers BR96.
Figur 18 zeigt die Ergebnisse der in nachfolgendem Beispiel 10 beschriebenen FACS-Analyse der Cytotoxizität der erfindungsgemäßen Antikörper auf 3396-Brustkarzinomzellen.
Figur 19 zeigt die Ergebnisse der in nachfolgendem Beispiel 10 beschriebenen FACS-Analyse der Cytotoxizität der erfindungsgemäßen Antikörper gegenüber menschlichen 2987-Lungenadenokarzinomzellen.
Figur 20 zeigt die Ergebnisse der in nachfolgendem Beispiel 10 beschriebenen FACS-Analyse der Cytotoxizität der erfindungsgemäßen Antikörper gegenüber MCF-7-Zellen.
Figur 21 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidin- Aufnahme in die DNA von 3396-Brustkarzinomzellen, die mit einem BR96-RA-Maus-Immunotoxin und chimärem (Chi)BR96-RA in verschiedenen Konzentrationen gemäß der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 10 behandelt wurden.
Figur 22 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidin- Aufnahme in die DNA von 3630-Brustkarzinomzellen, die mit einem BR96-RA-Maus-Immunotoxin und ChiBR96-RA in verschiedenen Konzentrationen gemäß der Beschreibung im nachfolgenden Beispiel 10 behandelt wurden.
Figur 23 ist eine graphische Darstellung der Antitumoreffekte von unmodifiziertem BR96 gegenüber der Tumorzellinie H2987 gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 11.
Figur 24 ist ein Balkendiagramm, welches das Fehlen von Tumoren nach Beendigung der Behandlung bei mit BR96 gemäß der Beschreibung in nachfolgendem Beispiel 11 behandelten Tieren zeigt.
Figur 25 zeigt die Dosiseffekte des Antikörpers BR96 nach Implantation von H2707-Zellen, die gemäß der Beschreibung in Beispiel 11 anhand des Tumorvolumens bestimmt wurden.
Figur 26 zeigt, wie in nachfolgendem Beispiel 11 beschrieben, die anhand des Tumorvolumens bestimmten Effekte der Behandlung mit F(ab')&sub2;-Fragmenten und chimärem BR96 nach Implantation von 2707-Zellen.
Figur 27 zeigt das Fehlen von Tumoren nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Antikörpers BR96 im Vergleich zu den Effekten von F(ab')&sub2;-Fragmenten und chimärem BR96, wie in nachfolgendem Beispiel 11 beschrieben.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die folgende detaillierte Beschreibung dient zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antikörper, die hochspezifisch für Karzinomzellen sind. Insbesondere reagieren diese Antikörper mit einer breiten Palette von Karzinomen, wie Brust-, Lungen-, Ovar- und Kolonkarzinomen, während sie keine oder nur begrenzte Reaktivität gegenüber normalem menschlichem Gewebe oder anderen Tumortypen, wie Sarkomen und Lymphomen, zeigen.
Die BR96-Antikörper können zur Isolierung und Charakterisierung des Antigens, an das sie binden, verwendet werden. Somit können die BR96-Antikörper als Sonde zur Identifizierung und Charakterisierung des erkannten Epitops und zur zusätzlichen Definition des Zellmembran-Antigens, an das sie binden, verwendet werden [siehe z. B. Nudelman et al., "Characterization of Human Melanoma-Associated Ganglioside Antigen Defined By A Monoclonal Antibody, 4.2", J. Biol. Chem., 257 (1)12752-56 (1982) und Hakomori, "Tumor Associated Carbohydrate Antigens", Ann. Rev. Immunol., 2:103-26 (1984)].
Die Ergebnisse von vorläufigen Epitop-Screenings, die mit dem monoklonalen Antikörper BR96 durchgeführt wurden, haben gezeigt, daß das Antigen auf den Karzinomzellen, an die der Antikörper BR96 bindet, eine fucosylierte Variante des Lewis Y- Antigens ist. Das Lewis Y (Ley)-Antigen ist von Abe et al. in J. Biol. Chem. 258:8934 (1983), Lloyd et al. in Immunogenetics 17:537 (1983), Brown et al. in Biosci. Rep. 3:163 (1983) und Hellstrom et al. in Cancer Res. 46:3917 (1986) beschrieben worden. Das fucosylierte Lewis Y-Antigen ist von Abe et al. in Cancer Res. 46:2639-2644 (1986) beschrieben worden.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann unter Anwendung bewährter Hybridomtechniken hergestellt werden, wie sie zuerst von Köhler und Milstein [siehe Köhler und Milstein, "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre- Defined Specificity", Nature, 256:495-97 (1975); siehe auch Brown et al., "Structural Characterization Of Human Melanoma- Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies", J. Immunol.. 127 (2):539-46 (1981), Brown et al., "Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation With Monoclonal Antibodies", J. Biol. Chem. 255:4980-83 (1980), Yeh et al., "Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(6):297-31 (1979) und Yeh et al., "A Cell-Surface Antigen Which Is Present In The Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanomas", Int. J. Cancer. 29:269-75 (1982)] vorgestellt wurden.
Diese Techniken umfassen die Injektion eines Immunogens (z. B. Zellen oder Zellextrakte, die das Antigen oder das gereinigte Antigen aufweisen) in ein Tier (z. B. eine Maus), um in diesem Tier eine gewünschte Immunreaktion (d.h. Antikörper) zu erzeugen. Nach einem ausreichenden Zeitraum erhält man Antikörper-produzierende Lymphocyten aus der Milz, den Lymphknoten oder dem Peripherblut des Tiers. Die Lymphocyten werden vorzugsweise aus der Milz erhalten. Die Milzlymphocyten werden dann mit einer Myelomzellinie, üblicherweise in Gegenwart eines fusionierenden Agens, wie z. B. Polyethylenglykol (PEG), fusioniert. Es können eine Reihe von Myelomzellinien, wie z. B. die Myelomlinien P3-NS1/1Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O Ag14, gemäß Standardtechniken als Fusionierungspartner verwendet werden. Diese Myelomlinien sind bei der American Type Culture Collection ("ATCC") in Rockville, Maryland, erhältlich.
Die resultierenden Zellen, die die gewünschten Hybridome enthalten, werden dann in einem selektiven Medium, wie z. B. HAT-Medium, worin die nicht-fusionierten parentalen Myelomoder Lymphocytenzellen schließlich sterben, kultiviert. Nur die Hybridomzellen überleben und können unter limitierenden Bedingungen kultiviert werden, um isolierte Klone zu erhalten. Die Überstände der Hybridome werden auf die Anwesenheit von Antikörpern der gewünschten Spezifität, z. B. durch Immunoassay- Techniken unter Verwendung des Antigens, das zur Immunisierung verwendet worden war, gescreent. Es können dann positive Klone unter limitierenden Verdünnungsbedingungen subkloniert werden und der produzierte monoklonale Antikörper kann isoliert werden. Hybridome, die nach diesen Methoden hergestellt wurden, können unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Techniken in vitro oder in vivo (in Aszites-Flüssigkeit) propagiert werden [siehe allgemein Fink et al., supra, S. 123, Fig. 6-11). Zu üblicherweise verwendeten Methoden zur Reinigung monoklonaler Antikörper zählen Ammoniumsulfat-Präzipitation, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie [siehe z. B. Zola et al., "Techniques For The Production And Characterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies", in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications. Hurell (Hrsg.), S. 51-52 (CRC Press 1982)].
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wurde ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung BR96 gemäß den nachfolgend beschriebenen Hybridomtechniken unter Verwendung der Brustkrebszellinie 3396 als Immunogen hergestellt. Das auf die nachfolgend beschriebene Weise hergestellte BR96-Hybridom, das den Antikörper BR96 produziert, wurde am 22. Februar 1989 bei der ATCC hinterlegt und ist aort folgendermaßen identifiziert worden:
BR96 ATCC Hinterlegungs-Nr.: HB10036.
Der Antikörper BR96 gehört zur IgG3-Unterklasse. Dieser Antikörper zeigt hohe Spezifität für Karzinomzellen verschiedener Organtypen, wie z. B. für Tumoren in Brust, Lunge, Dickdarm und Ovarien, sowie für kultivierte Zellinien, die aus verschiedenen Brust-, Lungen und Kolonkarzinomen erhalten wurden. Des weiteren bindet der Antikörper BR96 nicht an andere Tumorzell- Typen, wie z. B. die T-Zell-Lymphomzellinien CEM und MOLT-4, die B-Zell-Lymphomzellinie P3HR-1 oder Melanomzellinien. Der Antikörper BR96 läßt sich in Antigen-positive Tumorzellen internalisieren, wirkt auf Antigen-positiven Tumorzellen toxisch, vermittelt ADCC- und CDC-Aktivität und ist überraschenderweise alleine, d.h. in unmodifizierter Form, cytotoxisch. Die BR96- Antikörper scheinen ein Ley-Antigen zu erkennen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wurden F(ab')&sub2;-Fragmente des monoklonalen BR96-Antikörpers, wie nachfolgend beschrieben, durch Pepsin-Verdau von gereinigtem BR96 hergestellt "The Antibody Molecule", Academic Press, New York (1975)]. Es wurde gezeigt, daß die Bindung der F(ab')&sub2;- Fragmente an Tumoren (3396) und MCF7-Zellen vergleichbar mit der Bindung des ganzen monoklonalen Antikörpers BR96 ist.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform wurde der erfindungsgemäße chimäre (Maus/Mensch)-Antikörper unter Anwendung eines zweistufigen homologen Rekombinationsverfahrens, wie von Fell et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8507-8511 (1989) und in den gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldungen Nr. 243,873 vom 14. September 1988 und Nr. 468,035 vom 22. Juni 1990 beschrieben, die auf dieselbe Person übertragen wurden, wie die vorliegende Anmeldung, und auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird, hergestellt. Bei diesem zweistufigen Verfahren wird ein Target-Vektor, der für eine menschliche IgGgamma1 schwere Kette kodiert, zur Transfektion einer Maushybridomzellinie verwendet, die den monoklonalen Maus-Antikörper BR96 (Hybridom ATCC Nr. HB10036) exprimiert, um ein Hybridom zu produzieren, das einen chimären BR96-Antikörper exprimiert, der menschliche IgGgamma1 schwere Kette enthält. Dieses Hybridom wird dann mit einem Target-Vektor transfiziert, der für menschliche kappa (K) leichte Kette kodierende DNA enthält, um ein Maushybridom zu produzieren, das einen chimären BR96- Antikörper exprimiert, der menschliche IgGgamma1 schwere Kette und menschliche leichte K-Kette enthält. Die zur Transfektion der Hybridome verwendeten Target-Vektoren sind der mit dem Enzym Xba1 verdaute Vektor phgamma1HC-DD&sub4; (Oncogen, Seattle, WA) und der mit HindIII verdaute Vektor pSV2gpt/Ck (Oncogen, Seattle, WA).
Das hier als ChiBR96 bezeichnete chimäre BR96-Hybridom, das wie nachfolgend beschrieben hergestellt wurde und den chimären Maus/Mensch-Antikörper BR96 produziert, wurde am 23. Mai 1990 bei der ATCC hinterlegt und ist dort folgendermaßen identifiziert worden:
ChiBR96 ATCC-Hinterlegungsnr.: HB 10460.
Sobald das Hybridom, das den chimären Antikörper exprimiert, identifiziert wurde, wird das Hybridom kultiviert und die gewünschten chimären Moleküle werden aus dem Zellkulturüberstand unter Verwendung von Techniken isoliert, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung monoklonaler Antikörper bekannt sind.
Der Begriff "Antikörper BR96" umfaßt, so wie er hier verwendet wird, intakte polyklonale und monoklonale Antikörper- Materialien, wie z. B. den monoklonalen Maus-Antikörper BR96, der vom Hybridom mit der ATCC-Nr. HB 10036 produziert wird, und chimäre Antikörpermoleküle, wie z. B. den vom Hybridom mit der ATCC-Nr. 10460 produzierten chimären Antikörper BR96. Der oben beschriebene Antikörper BR96 umfaßt auch Fragmente davon, welche die aktive Antigen-bindende Region des Antikörpers enthalten, sowie Fab-, F(ab')&sub2;- und Fv-Fragmente unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Techniken [siehe z. B. Rouseaux et al., "Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different Rat IgG Subclasses" in Methods Enzymol., 121:663-69 (Academic Press 1986)]. Der erfindungsgemäße Antikörper BR96 umfaßt auch Fusionsproteine. Darüber hinaus zeigt der erfindungsgemäße Antikörper BR96 keine immunohistologisch detektierbare Bindung an normales menschliches Gewebe aus wichtigen Organen, wie Niere, Milz, Leber, Haut, Lunge, Brust, Dickdarm, Gehirn, Schilddrüse, Herz, Lymphknoten oder Ovarien. Der Antikörper reagiert auch nicht mit Leukocyten aus Peripherblut. Der Antikörper BR96 zeigt begrenzte Bindung an einige Zellen in den Mandeln und in den Hoden und bindet an Azinuszellen in der Bauchspeicheldrüse sowie an Epithelzellen in Magen und ösophagus. Somit ist der Antikörper BR96 den meisten bekannten Antitumor-Antikörpern auf grund seines hohen Maßes an Spezifität gegenüber Tumorzellen im Vergleich zu Normalzellen überlegen [siehe z. B. Hellstrom et al., "Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotypes", in Covalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis And Therapy. Quash/Rodwell (Hrsg.), S. 1-39 (Marcell Dekker, Inc., 1989) und Bagshawe, "Tumor Markers - Where Do We Go From Here", Br. J. Cancer. 48:167-75 (1983)].
Zusätzlich umfaßt die vorliegende Erfindung Antikörper, die zur Bindung an die gleiche antigene Determinante befähigt sind, wie die BR96-Antikörper, und die mit den Antikörpern um die Bindung an dieser Stelle konkurrieren. Dazu zählen Antikörper, welche die gleiche Antigen-Spezifität besitzen wie die BR96-Antikörper, sich jedoch bezüglich Speziesherkunft, Isotyp, Bindungsaffinität oder biologischer Funktionen (z. B. Cytotoxizität) von diesen unterscheiden. Klasse, Isotyp und andere Varianten der erfindungsgemäßen Antikörper, welche die Antigen- Bindungsregion des BR96-Antikörpers besitzen, können beispielsweise unter Anwendung dem Fachmann bekannter Class-Switchingund Fusionstechniken konstruiert werden [siehe z. B. Thammana et al., "Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In A Hybridoma", Eur. J. Immunol.. 13:614 (1983); Spira et al., "The Identification Of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ELISA Assay", J. Immunol. Meth.. 74:307-15 (1984); Neuberger et al., "Recombinant Antibodies Possessing Novel Effector Functions", Nature 312:604-608 (1984); und Oi et al., "Chimeric Antibodies", Biotechniques. 4 (3):214-21 (1986)]. Somit fallen auch andere chimäre Antikörper oder andere rekombinante Antikörper (z. B. Fusionsproteine, worin der Antikörper mit einem zweiten Protein, wie z. B. einem Lymphokin oder einem Tumor-inhibierenden Wachstumsfaktor, kombiniert ist), welche dieselbe Bindungsspezifität aufweisen wie die BR96-Antikörper, unter den Schutzumfang dieser Erfindung.
Ebenso unter den Schutzumfang der Erfindung fallen Anti- Idiotyp-Antikörper gegen den erfindungsgemäßen Antikörper BR96. Diese Anti-Idiotyp-Antikörper können unter Verwendung des Antikörpers BR96 und der Fragmente davon als Immunogen hergestellt werden und sind brauchbar für diagnostische Zwecke zur Detektion humoraler Antworten auf Tumoren und für therapeutische Anwendungen, wie z. B. in einem Vakzin, um beim Patienten eine Antitumor-Reaktion zu induzieren [siehe z. B. Nepom et al., "Anti-Idiotypic Antibodies And The Induction Of Specific Tumor Immunity", Cancer And Metastasis Reviews. 6:487-501 (1987)].
Der erfindungsgemäße Antikörper BR96 ist auch für diagnostische Anwendungen, sowohl in vitro als auch in vivo, zur Detektion menschlicher Karzinome brauchbar, die das Antigen aufweisen, für das die Antikörper spezifisch sind. Zu in vitro Diagnosemethoden zählen die immunohistologische Detektion von Tumorzellen (z. B. auf menschlichem Gewebe, Zellen oder exzidierten Tumorproben) oder die serologische Detektion Tumorassoziierter Antigene (z. B. in Blutproben oder anderen biologischen Flüssigkeiten).
Immunohistochemische Techniken umfassen das Färben einer biologischen Probe, wie z. B. einer Gewebeprobe, mit dem erfindungsgemäßen Antikörper BR96 und anschließende Detektion der Anwesenheit des an sein Antigen komplexierten Antikörpers in der Probe. Die Bildung solcher Antikörper-Antigen-Komplexe in der Probe weist auf das Vorliegen von Karzinomzellen in dem Gewebe hin. Die Detektion des Antikörpers in der Probe kann unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Techniken, wie z. B. immunoenzymatischen Techniken, z. B. der Immunoperoxidase-Färbetechnik oder der Avidin-Biotin (ABC)-Technik, oder Immunofluoreszenz-Techniken, bewerkstelligt werden [siehe z. B. Ciocca et al., "Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies", Meth. Enzymol., 121:562-79 (1986); Helistrom et al., "Monoclonal Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma", Cancer Research. 46:3917-23 (1986); und Kimball (Hrsg.), Introduction To Immunology (2. Aufl.), S. 113-117 (Macmillan Pub. Co. 1986)]. So wurde z. B. die Immunoperoxidase-Färbung, wie in nachfolgendem Beispiel 2 beschrieben, verwendet, um die Reaktivität des Antikörpers BR96 mit Lungen-, Brust-, Kolon- und Ovarkarzinomen und die geringe Reaktivität dieses Antikörpers mit normalen menschlichen Gewebeproben zu demonstrieren.
Serologische Diagnosetechniken umfassen die Detektion und Quantifizierung Tumor-assoziierter Antigene, die in das Serum oder andere biologische Flüssigkeiten von Patienten sezerniert oder "ausgeschüttet" wurden, von denen angenommen wird, das sie an Karzinomen leiden. Solche Antigene können in den Körperflüssigkeiten unter Anwendung dem Fachmann bekannter Techniken, wie z. B. Radioimmunoassays (RIA) oder Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) detektiert werden, wobei der gegenüber dem "ausgeschiedenen" Antigen reaktive Antikörper zur Detektion der Anwesenheit des Antigens in einer Flüssigkeitsprobe verwendet wird [siehe z. B. Uotila et al., "Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP", J. Immunol. Methods. 42:11 (1981) und Allum et al., supra, S. 48-51]. Diese Assays unter Verwendung der hier offenbarten BR96-Antikörper kann daher zur Detektion des Glycolipid-Antigens, mit dem die BR96-Antikörper reagieren, in biologischen Flüssigkeiten und somit zur Detektion von menschlichen Karzinomen im Patienten verwendet werden. Somit ist aus dem oben Gesagten ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen BR96-Antikörper für die meisten Assays unter Beteiligung von Antigen-Antikörper-Reaktionen verwendet werden können. Zu diesen Assays zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, RIA-Standardtechniken (sowohl flüssige als auch feste Phase), sowie ELISA-Assays, Immunofluoreszenz-Techniken und andere immunocytochemische Assays [siehe z. B. Sikora et al. (Hrsg.), Monoclonal Antibodies S. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)].
Die Erfindung umfaßt auch diagnostische Kits zur Durchführung der oben beschriebenen Assays. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt der diagnostische Kit den monoklonalen Antikörper BR96, Fragmente davon, Fusionsproteine oder den erfindungsgemäßen chimären Antikörper und ein Konjugat, welches einen spezifischen Bindungspartner für den Antikörper BR96 und eine Markierung umfaßt, die zum Erzeugen eines detektierbaren Signals befähigt ist. Die Reagenzien können auch Hilfsmittel, wie Puffer und Protein-stabilisierende Agenzien (z. B. Polysaccharide), enthalten. Der diagnostische Kit kann, falls erforderlich, zusätzlich andere Komponenten des Signal-produzierenden Systems, einschließlich Agenzien zur Verringerung von Hintergrund-Interferenzen, Kontroll-Reagenzien oder eine Vorrichtung oder einen Behälter zur Durchführung des Tests, umfassen. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfaßt der diagnostische Kit ein Konjugat der erfindungsgemäßen BR96-Antikörper mit einer Markierung, die ein detektierbares Signal erzeugen kann. Es können auch Hilfsmittel der oben beschriebenen Art vorhanden sein.
Der erfindungsgemäße Antikörper BR96 ist auch für diagnostische Anwendungen zur Detektion menschlicher Karzinome in vivo brauchbar. Eine derartige Methode umfaßt die Detektion von Tumoren in vivo durch Tumor-Bildgebungstechniken. Gemäß dieser Methode wird der Antikörper BR96 mit einem geeigneten Bildgebungsreagens, das ein detektierbares Signal erzeugt, markiert. Zu Beispielen für verwendbare Bildgebungsreagenzien sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Radiomarkierungen, wie ¹³¹I, ¹¹¹In, ¹²³I, 99mTc, ³²P, ¹²&sup5;I, ³H und ¹&sup4;C, Fluorophore, wie Fluorescein und Rhodamin, und Chemilumineszenzmarkierungen, wie Luciferin. Der Antikörper kann unter Anwendung dem Fachmann bekannter Techniken mit diesen Reagenzien markiert werden. Im Hinblick auf Techniken zur radioaktiven Markierung von Antikörpern wird z. B. auf Wensel und Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Esevier, New York (1983), verwiesen [siehe auch Colcher et al., "Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice", Meth. Enzymol. 121:802-16 (1986)].
Im Falle von radioaktiv markierten Antikörpern, wird der Antikörper dem Patienten verabreicht, am Tumor lokalisiert, der das Antigen trägt, mit dem der Antikörper reagiert, und wird unter Anwendung bekannter Techniken, wie z. B. dem Radionuklid- Scanning unter Verwendung z. B. einer Gamma-Kamera oder einer Emissionstomographie, in vivo detektiert oder "abgebildet" [siehe z. B. Bradwell et al., "Developments In Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), S. 65-85 (Academic Press 1985)). Der Antikörper wird dem Patienten in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie Wasser, Saline, Ringer's Lösung, Hank's Lösung, oder nicht-wäßrigen Trägern, wie fixierten Ölen, verabreicht. Der Träger kann auch Substanzen enthalten, welche die Isotonizität und chemische Stabilität des Antikörpers verbessern, wie z. B. Puffer oder Konservierungsmittel. Die Antikörperformulierung wird, z. B. intravenös, in einer Dosis verabreicht, die ausreicht, um genug Gamma-Emission zu erzeugen, um eine Visualisierung der Tumor-Targetstelle zu ermöglichen. Man sollte genug Zeit zwischen der Verabreichung des Antikörpers und der Detektion lassen, um eine Lokalisierung an die Tumor- Targetstelle zu ermöglichen. Eine allgemeine Diskussion zur Tumorbildgebung findet sich in Allum et al., supra, S. 51-55.
Die Eigenschaften des Antikörpers BR96, nämlich: a) sehr hohe Spezifität für Tumorzellen; b) Internalisierung; c) Toxizität gegenüber Antigen-positiven Tumorzellen alleine, d.h. in unmodifizierter Form, bei Verwendung in geeigneten Konzentrationen; und d) CDC- und ADCC-Aktivität, deuten auf eine Reihe von therapeutischen Anwendungsmöglichkeiten in vivo hin. Zunächst kann der Antikörper BR96 alleine verwendet werden, um Tumorzellen in vivo zu erkennen und zu töten. Der Antikörper kann auch zusammen mit einem geeigneten therapeutischen Agens zur Behandlung menschlicher Karzinome verwendet werden. Der Antikörper kann z. B. in Kombination mit herkömmlichen oder üblichen Behandlungsmethoden, wie z. B. Chemotherapie oder Strahlentherapie, verwendet werden oder an einen therapeutischen Wirkstoff oder Toxin, sowie an ein Lymphokin oder einen Tumor-inhibierenden Wachstumsfaktor, zur Verabreichung des therapeutischen Agens an den Ort des Karzinoms konjugiert oder gebunden sein. Techniken zum Konjugieren solcher therapeutischer Agenzien sind bekannt [siehe z. B. Arnon et al., "Monodonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Hrsg.), S. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2. Aufl.), Robinson et al. (Hrsg.), S. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (Hrsg.), S. 475-506 (1985); und Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]. Der erfindungsgemäße Antikörper BR96 ist insbesondere zur Verwendung in einem therapeutischen Konjugat geeignet, da er ohne weiteres von den Karzinomzellen, an die er bindet, internalisiert wird und somit das therapeutische Agens an intrazelluläre Wirkungsorte abgeben kann.
Alternativ dazu kann der Antikörper BR96 mit Strahlung hoher Energie, z. B. einem Radioisotop, wie ¹³¹I, das bei Lokalisierung am Ort des Tumors zum Tod mehrerer Zellen führt, gekoppelt sein [siehe z. B. Order, "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), S. 303-16 (Academic Press 1985)). Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Antikörper BR96, wie von Segal im US-Patent Nr. 4,676,980 beschrieben, mit einem zweiten Antikörper zur Bildung eines Heterokonjugates zur Behandlung von Tumorzellen konjugiert sein.
Weitere therapeutische Anwendungen des erfindungsgemäßen Antikörpers BR96 umfassen eine Konjugation oder eine Verknüpfung, z. B. durch rekombinante DNA-Techniken, mit einem Enzym, das zur Umwandlung einer Prodrug in einen cytotoxischen Wirkstoff befähigt ist, und die Verwendung des Antikörper-Enzym- Konjugates in Kombination mit der Prodrug zu Umwandlung der Prodrug in ein cytotoxisches Agens am Ort des Tumors [siehe z. B. Senter et al., "Anti-Tumor Effects Of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitomycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); und Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy, FASEB J. 4:188-193 (1990)]. Eine weitere therapeutische Anwendung des Antikörpers BR96 umfaßt seine Verwendung, entweder in Gegenwart von Komplement oder als Teil eines Antikörper-Arzneimittel- oder Antikörper-Toxin-Konjugates, zur Entfernung von Tumorzellen aus dem Knochenmark von Krebspatienten. Gemäß dieser Methode kann autologes Knochenmark ex vivo durch Behandlung mit dem Antikörper gesäubert werden, wonach das Mark dann wieder dem Patienten zugeführt werden kann [siehe z. B. Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].
Des weiteren können chimäre oder andere erfindungsgemäße rekombinante BR96-Antikörper, wie oben beschrieben, therapeutisch angewandt werden. Beispielsweise kann ein Fusionsprotein, das wenigstens die Antigen-Bindungsregion des Antikörpers BR96, verknüpft mit wenigstens einem funktional aktiven Bereich eines zweiten Proteins mit Antitumor-Aktivität, z. B. einem Lymphokin oder Oncostatin, umfaßt, zur Behandlung menschlicher Karzinome in vivo verwendet werden. Des weiteren können dem Fachmann bekannte rekombinante Techniken zur Konstruktion bispezifischer Antikörper verwendet werden, worin eine der Antikörper-Bindungsspezifitäten diejenige von BR96 ist [siehe z. B. US-Patent Nr. 4,474,893].
Schließlich können auch Anti-Idiotyp-Antikörper des Antikörpers BR96 therapeutisch zur aktiven Tumorimmunisierung und Tumortherapie verwendet werden [siehe z. B. Hellstrom et al., "Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotypes", Covalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis And Therapy, supra, S. 35- 41].
Es ist daher ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung pharmazeutische Mittel, Kombinationen und Methoden zur Behandlung menschlicher Karzinome umfaßt. Beispielsweise umfaßt die vorliegende Erfindung zur Behandlung menschlicher Karzinome anwendbare pharmazeutische Mittel, die eine pharmazeutisch wirksame Menge des Antikörpers BR96 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die Mittel können den Antikörper BR96 in unmodifizierter Form, konjugiert mit einem therapeutischen Agens (z. B. einem Arzneimittel, Toxin, Enzym oder zweiten Antikörper), oder in rekombinanter Form (z. B. chimärer oder bispezifischer BR96) enthalten. Die Mittel können zusätzlich andere Antikörper oder Konjugate zur Behandlung von Karzinomen (z. B. einen Antikörper-Cocktail) enthalten.
Die erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzungen können unter Anwendung üblicher Verabreichungsmethoden, einschließlich intravenöser, intraperitonealer, oraler, intralymphatischer oder direkter Verabreichung in den Tumor, verabreicht werden, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Die intravenöse Verabreichung ist bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzungen können in verschiedenen Dosisformen, einschließlich flüssiger Lösungen oder Suspensionen, Tabletten, Pillen, Pulvern, Suppositorien, polymeren Mikrokapseln oder Mikrovesikeln, Liposomen und injizierbaren oder infundierbaren Lösungen, vorliegen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Die bevorzugte Form hängt von der Verabreichungsmethode und der therapeutischen Anwendung ab.
Die Antikörperzusammensetzungen können vorzugsweise auch herkömmliche, dem Fachmann bekannte pharmazeutisch verträgliche Träger und Ajduvantien enthalten, wie z. B. menschliches Serumalbumin, Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Lecithin, Puffersubstanzen, wie z. B. Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, und Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat.
Die wirksamste Verabreichungsmethode und das wirksamste Dosisschema sind abhängig von Schwere und Verlauf der Erkrankung, Gesundheit und Ansprechen des Patienten auf die Behandlung und vom Urteil des behandelnden Arztes. Deshalb sollte die Dosierung der Zusammensetzung individuell auf den jeweiligen Patienten zugeschnitten sein. Dennoch kann eine wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzungen im Bereich von etwa 1 bis etwa 2000 mg/m² liegen.
Die folgenden Beispiele dienen zum besseren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung. Es versteht sich jedoch, daß diese Beispiele nur zur Veranschaulichung dienen und den Schutzumfang dieser Erfindung keineswegs einschränken sollen.

BEISPIEL 1

Herstellung des monoklonalen Antikörpers BR96

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper BR96 wurde unter Anwendung von Hybridom-Fusionstechniken produziert, die bereits von M. Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1979), sutra, und Yeh et al., Int. J. Cancer (1982), supra, beschrieben wurden. Eine drei Monate alte BALB/c-Maus wurde immunisiert, wobei als Immunogen explantierte, kultivierte Zellen eines menschlichen Brust-Adenokarzinoms mit der Bezeichnung 3396 oder H3396 (aus Adenokarzinomen der Brust eines Patienten, die bei Oncogen in Seattle, Washington kultiviert wurden) verwendet wurden. Die Maus erhielt bei fünf Gelegenheiten Injektionen: bei den ersten vier Gelegenheiten erhielt die Maus eine intraperitoneale Injektion und 1 subkutane Injektion, die auf 4 Stellen an der Maus verteilt wurde. Bei der fünften Gelegenheit gab man der Maus nur eine intraperitoneale Injektion. Die Gesamtzahl der bei jeder Gelegenheit injizierten Zellen betrug etwa 10&sup7; Zellen. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Milz entfernt, und die Milzzellen wurden in RPMI-Kulturmedium suspendiert. Die Milzzellen wurden dann in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) mit P3-x63-Ag8.653-Mausmyelomzellen fusioniert, und die Zellsuspension wurde, wie von Yeh et al., supra, beschrieben [siehe auch Köhler und Milstein, Nature, 256:495-97 (1975) und Eur. J. Immunol. 6:511-19 (1976)], in Mikrotitervertiefungen in selektivem HAT-Medium kultiviert. Das Gemisch wurde zur Bildung von Kulturen niedriger Dichte, die aus einzelnen fusionierten Zellen oder Klonen stammten, beimpft.
Die Überstände aus diesen Hybridomkulturen wurden dann unter Anwendung eines ELISA-Assays, ähnlich dem von Douillard et al., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme-Labeled Second Antibody", Meth. Enzymol., 92:168-74 (1983) beschriebenen, auf direkte Bindungsaktivität gegenüber der Brustkrebszellinie 3396 und einer aus einer Hautbiopsieprobe erhaltenen Fibroblastenzelllinie gescreent.
Bei diesem Assay wird das Antigen (mit dem der zu screenende Antikorper reaktiv ist) auf Mikrotiterplatten immobilisiert und dann mit Hybridom-Überständen inkubiert. Wenn ein Überstand den gewünschten Antikörper enthält, bindet der Antikörper an das immobilisierte Antigen und wird durch Zugabe eines Anti-Immunoglobulin-Antikörper-Enzym-Konjugates und eines Substrates für das Enzym, was zu einer meßbaren Veränderung der optischen Dichte führt, detektiert. Bei den vorliegenden Studien wurden Brustkrebszellen oder Kontrollfibroblastenzellen in eine 96er-Gewebekulturplatte (Costar Cambridge, MA) gegeben und über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtinkubator (5% CO&sub2;) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 100 µl frisch hergestelltem, 1,0 %- igem Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % pro Vertiefung fixiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend dreimal mit 1 X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Dann wurden die Zellen 30 Minuten mit 5 %-igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert und erneut dreimal mit PBS gewaschen. Die Überstände aus den Hybridomkul turen wurden dann bei 100 µl/Vertiefung zugegeben. Dann wurden die Vertiefungen 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde mit 0,1 % BSA verdünnte Ziege-Anti-Maus-Meerrettichperoxidase (Zymed, CA) bis zu einer Konzentration von 100 µl/Vertiefung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur oder 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, und die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen. o-Pehnylendiamin (OPD) wurde dann bei 100 µl/Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 5-45 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Antikörperbindungen an die Zellen wurden durch eine Farbveränderung in den Vertiefungen detektiert, die innerhalb von 10-20 Minuten erfolgte. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl/Vertiefung H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und die Extinktion mit einem Microelisa Autoreader von Dynatech (Alexandria, VA) bei 490 nm abgelesen.
Es sei darauf hingewiesen, daß dieser Assay unter Verwendung intakter Zellen oder gereinigter löslicher Antigen- oder Zellextrakte als immobilisiertem Antigen durchgeführt werden kann. Bei Verwendung löslicher Antigen- oder Zellextrakte als Antigen wurde das Antigen zunächst bei 50 µl/Vertiefung in PBS auspiattiert und die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, bevor man mit dem Assay begann. Wenn intakte Zellen als Antigen verwendet werden, können diese frisch oder nach Fixierung verwendet werden. In beiden Fällen wurden anfangs 10&sup4; Zellen in Kulturmedium bei 100 µl/Vertiefung ausplattiert und über Nacht bei 37ºC in einem Inkubator (5 % CO&sub2;) inkubiert.
Hybridome, welche Antikörper produzierten, die an die Brustkrebszellinie und nicht an die menschlichen Fibroblastenzellen banden, wurden so ausgewählt und in einem FACS-Zellsortiergerät auf Peripherblutleukocyten (PBLs), wie in nachfolgendem Beispiel 2 beschrieben, getestet. Hybridome, die bezüglich PBLs negativ waren, wurden kloniert, in vitro expandiert und weiter auf Antikörperspezifität getestet. Diejenigen Hybridome, die gegenüber menschlichem Brustkrebs reaktive Antikörper produzierten, wurden erneut kloniert, expandiert und in 3 Monate alte, mit Pristan geprimte BALB/c-Mäuse injiziert, wo sie als Aszites-Tumoren wuchsen.
Gemäß dieser Prozedur wurde die Hybridomzellinie BR96 erhalten, kloniert und in Mäuse injiziert, um sich als Aszites- Tumor zu entwickeln. Wie oben erwähnt, wurde das Hybridom BR96 bei der ATCC hinterlegt. Der monoklonale Antikörper BR96 aus Aszitesflüssigkeit wurde durch Aff initätschromatographie an immobilisiertem rekombinantem Protein A (Repligen, Cambridge, MA) gereinigt. Die geklärte Aszitesflüssigkeit wurde mit einem äquivalenten Volumen Bindungspuffer (1 M Kaliumphosphat, pH 8) verdünnt und auf eine zuvor mit Bindungspuffer äquilibrierte Protein A-Säule gegeben. Die Säule wurde gründlich mit Bindungspuffer gewaschen und dann wurde der Antikörper mit 50 mM Phosphorsäure, pH 3, eluiert. Die gereinigte Antikörperfraktion wurde mit 1 M Tris, pH 9, neutralisiert und dann gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert. Das gereinigte BR96 wurde schließlich sterilfiltriert und gekühlt oder gefroren gelagert.

BEISPIEL 2

Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers BR96

Isotypenbestimmung

Zur Bestimmung der von dem Hybridom BR96 produzierten Immunoglobulin-Klasse wurde von folgenden Techniken Gebrauch gemacht:

(a) Ouchterlony-Immunodiffusion

Ein Aliquot des Überstandes der Hybridomzellen wurde in die Mittelvertiefung einer 25 % Agar-Platte gegeben. Monospezifische Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Isotyp-Antikörper (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) wurden in die Randvertiefungen gegeben, und die Platte wurde 24-28 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Präzipitinlinien gelesen.

(b) ELISA-Isotypisierung

Dynatech Immunolon 96er-Platten wurden mit Ziege-Anti- Maus-Ig-Antikörpern in einer Konzentration von 1 µg/ml, 50 µl/Vertiefung in PBS, beschichtet und über Nacht bei 4ºC bedeckt stehen gelassen. Die Platten wurden mit PBS/Tween 20, 0,05 %, gewaschen und mit Medium bei 100 µl/Vertiefung 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Nach dem Waschen der Platten wurden Überstände des Hybridoms BR96 zugegeben und bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS, die 2 % Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, wurden die Platten 30 Minuten bei 37ºC mit an Peroxidase gebundenen, monospezifischen Kaninchen-Anti- Maus-Ig-Isotyp-Antikörpern (Zymed, South San Francisco, CA) inkubiert. Nach weiterem Waschen wurden die Platten mit 1 mg/ml OPD und 0,03 % H&sub2;O&sub2; in 0,1 M Citratpuffer, pH 4,5, inkubiert. Die optische Dichte bei 630 nm wurde mit einem Dynatec ELISA- Plattenlesegerät bestimmt.
Auf der Basis dieser Prozeduren wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikörper BR96 dem IgG3-Isotyp angehört.

Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers BR96

Der Antikörper BR96 zeigt ein hohes Maß an Reaktivität gegenüber einer breiten Palette von Karzinomen und nur begrenzte Reaktivität gegenüber normalen Zellen. Dies wurde durch Experimente unter Beteiligung immunohistologischer Studien an Gefriergewebeschnitten sowie durch Bindungsstudien unter Verwendung intakter kultivierter Zellen gezeigt.

Immunohistologie

Für die immunohistologischen Studien wurde die in Immunochemistry, S. 104-69 (John Wiley & Sons, New York, 1979) beschriebene und von H.J. Garrigues et al. in "Detection Of A Human Melanoma-Associated Antigen, p97, In Histological Sections Of Primary Human Melanomas", Int. J. Cancer, 29:511-15 (1982) modifizierte Peroxidase-Antiperoxidase (PAP)-Technik von L.A. Sternberger verwendet. Die Targetgewebe für diese Tests wurden bei Operationen erhalten und innerhalb 4 Stunden nach Entnahme unter Verwendung von in flüssigem Stickstoff vorgekühltem Isopentan eingefroren. Die Gewebe wurden dann bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff oder bei -70ºC aufbewahrt. Es wurden Gefrierschnitte hergestellt, luftgetrocknet, mit Aceton behandelt und erneut getrocknet Lsiehe Garrigues et al., supra]. Die zur histologischen Auswertung zu verwendenden Schnitte wurden mit Hämatoxylin gefärbt. Zur Verringerung unspezifischen Hintergrundes wurden die Schnitte mit normalem menschlichem Serum, das mit PBS 1/5 verdünnt war, vorinkubiert [siehe Garrigues et al., supra]. Maus-Antikörper, Kaninchen- Anti-Maus-IgG und Maus-PAP wurden mit einer Lösung von 10 % normalem menschlichem Serum und 3 % Kaninchenserum verdünnt. Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde in einer Verdünnung von 1/50 verwendet. Maus-PAP-Komplexe (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.), die 2 mg/ml spezifisch gereinigter PAP enthielten, wurden in einer Verdünnung von 1/80 verwendet.
Das Färbeverfahren bestand darin, daß man aufeinanderfolgende Schnitte 2,5 h mit einem spezifischen Antikörper, d.h. BR96, oder einem Kontrollantikörper behandelte, die Schnitte 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Verdünnung 1/50) inkubierte und die Schnitte dann 30 Minuten bei Raumtemperatur Maus-PAP-Komplexen (Verdünnung 1/80) aussetzte. Nach jeder Behandlung mit Antikörper wurden die Slides zweimal mit PBS gewaschen.
Die immunohistologische Reaktion wurde durch Zugabe von frisch hergestelltem, 015 %-igem 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 0,01 %-igem H&sub2;O&sub2; in 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6, 8 Minuten entwickelt [siehe Hellstrom et al., J. Immunol., 127:157-60 (1981)]. Durch eine weitere 20-minütige Behandlung mit einer 1 %-igen OsO&sub4;-Lösung in destilliertem Wasser wurde die Färbung intensiviert. Die Schnitte wurden mit Wasser gespült, mit Alkohol dehydratisiert, mit Xylol gereinigt und auf Slides befestigt. Parallele Schnitte wurden mit Hämatoxylin gefärbt.
Die Slides wurden jeweils unter Kodierung bewertet und die kodierten Proben wurden von einem unabhängigen Beobachter un tersucht. Typische Slides wurden unter Verwendung von Differentialinterferenzkontrastoptik (Zeiss-Nomarski) fotografiert. Der Grad der Antikörperfärbung wurde mit 0 (keine Reaktivität) + (einige wenige, schwach positive Zellen), ++ (wenigstens ein Drittel der Zellen positiv), +++ (die meisten Zellen positiv) ++++ (nahezu alle Zellen stark positiv) bewertet. Da die Unterschiede zwischen + und 0 weniger deutlich abgegrenzt waren als zwischen + und ++ Färbung, wurde eine als ++ oder höher eingestufte Färbung für "positiv" erachtet. Es wurden sowohl neoplastische als auch Stromazellen in den Tumorproben beobachtet. Es wurde nur die Färbung der Tumorzellen registriert, da sich die Stromazellen überhaupt nicht oder deutlich schwächer verfärbten als die Tumorzellen.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die immunohistologische Färbung verschiedener Tumor- und Normalgewebeproben unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers BR96. Wie die Tabelle deutlich zeigt, reagiert der Antikörper BR96 mit einer breiten Palette menschlicher Karzinomproben, nicht jedoch mit Sarkomen, und zeigt nur sporadische Reaktivität gegenüber Melanomen. Darüber hinaus zeigt er nur begrenzte Reaktivität gegenüber einer großen Anzahl menschlicher Normalgewebeproben. Reaktivität gegenüber Normalzellen wurde nur in Form einer Bindung an eine kleine Subpopulation von Zellen in den Mandeln und in den Hoden sowie an Azinuszellen im Pankreas und an Epithelzellen in Magen und Ösophagus detektiert. TABELLE 1 Immunoperoxidase-Färbung menschlicher Tumoren und Normalgewebeproben mit dem monoklonalen Antikörper BR96 TABELLE 1 (Fortsetzung) Immunoperoxidase-Färbung menschlicher Tumoren und Normalgewebeproben mit dem monoklonalen Antikörper BR96
Es wurde auch die Bindung des Antikörpers BR96 an verschiedene kultivierte Zellinien bewertet. Die Antikörperbindung an die Zelloberfläche intakter kultivierter Zellen wurde entweder durch einen Direktbindungs-Assay mit ¹²&sup5;I-markierten Antikörpern, wie von Brown et al. in "Quantitative Analysis Of Melanoma-Associated Antigen p97 In Normal And Neoplastic Tissues", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:539-43 (1981) beschrieben, oder durch direkte Immunofluoreszenz unter Verwendung eines Coulter Epics C Flourescence Activated Cell Sorter (FACS) II [Hellstrom et al., Cancer Res. 46:3917-3923 (1986)] identifiziert.
Für die Bindungsanalysen unter Verwendung eines FACS-Zellsortiergerätes wurden Aliquots von 2 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup6; kultivierten Zellen in 15 % fötalem Rinderserum (FBS) in IMDM-Medium (Gibco, NY) bis zu einem Gesamtvolumen von 500 µl/Röhrchen hergestellt. Die Zellen wurden 1,5 Minuten auf einem Serofuge- Gerät zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. In jedes Röhrchen wurden 100 µl des monoklonalen Antikörpers BR96 bei 10 µl/ml gegeben, deren Inhalt vermischt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde durch 1,5-minütiges Zentrifugieren auf dem Serofuge-Gerät dreimal mit 500 µl 15 % FBS/IMDM gewaschen (die Röhrchen wurden nach dem dritten Waschen geblottet). Dann wurden in jedes Röhrchen 50 µl optimierte FITC-konjugierte-Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Tago, Burlingame, CA) gegeben, die mit 15 % FBS/IMDM verdünnt waren (Verdünnung: 1:25), und das Reaktionsgemisch wurde gemischt und 30 Minuten inkubiert. Die Waschstufe wurde dann wiederholt und nach dem Blotten der Röhrchen wurde jedes Pellet in 200-500 µl PBS resuspendiert. Jede Probe wurde mit einem Coulter Epics C FACS untersucht und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde bestimmt. Anhand die MFI wurde das lineare Fluoreszenzäquivalent (LFE) bestimmt. Das LFE jeder Versuchsprobe, geteilt durch das LFE einer negativen Kontrolle, ergab ein Verhältnis zwischen der Helligkeit der mit spezifischen Antikörpern gefärbten Zellen gegenüber den mit Kontrollantikörpern gefärbten Zellen. Die Bindungsdaten sind in nachfolgender Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 FACS-Analyse der Bindung von BR96 an verschiedene Typen suspendierter Zellen TABELLE 2 (Fortsetzung) FACS-Analyse der Bindung von BR96 an verschiedene Typen suspendierter Zellen
Wie Tabelle 2 zeigt, reagierte der monoklonale Antikörper BR96 zwar mit Brust-, Lungen- und Kolonkarzinom-Zellinien, jedoch nicht mit Melanomlinien oder mit T- oder B-Lymphomlinien noch mit normalen Peripherblut-Leukocyten. Eine Scatchard- Analyse unter Verwendung radioaktiv markierter Antikörper zeigte, daß als ungefähre Assoziationskonstante (Ka) von BR96 für die Linie 3396, an die BR96 bindet, 3,6 x 10&sup6; Antigenstellen/Zelle errechnet wurden.
Diese Daten zeigen, daß der monoklonale Antikörper BR96 Zelloberflächenantigene erkennt, die auf den meisten menschlichen Karzinomen in großer Zahl (bis zu 106 Moleküle/Zelle) exprimiert werden.

BEISPIEL 3

Internalisierung des monoklonalen Antikörpers BR96 in Karzinomzellen

Es wurden Studien zur Bestimmung der Internalisierung des monoklonalen Antikörpers BR96 in Antigen-positive Karzinomzellen durchgeführt. Bei einem Verfahren wurde BR96 an das Ricin A-Kette-Toxin zur Bildung eines Immunotoxins, nämlich BR96-RA, konjugiert, dessen Internalisierung in Karzinomzellen dann bestimmt wurde. Die Aufnahme des Konjugates in die Karzinomzellen schätzte man ab, indem man feststellte, in welchem Ausmaß die Tumorzellen durch die Ricin A-Kette getötet wurden.
Die Konjugation des Antikzrpers an das Toxin wurde folgendermaßen durchgeführt: Deglycosylierte Ricin A-Kette (Inland Labs, Austin, TX) [siehe auch Blakey et al., Cancer Res., 47:947-952 (1987)] wurde, vor der Gelfutration auf G-25 Sephadex unter Verwendung von PBS, pH 7,2, als Elutionsinittel, mit Dithiothreitol (5 mM) behandelt. Dies gab man in einem Molverhältnis von 2:1 zu dem Antikörper in PBS, wobei der Antikörper zuvor mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) (Pierce, Rockford, IL) gemäß dem Verfahren von Lambert et al., J. Biol. Chem., 260:12035-12041 (1985) modifiziert worden war. Man ließ die Reaktion 12-24 h bei Raumtemperatur fortschreiten und verdünnte die Lösung dann mit 1 Volumen H&sub2;O. Unkonjugierte Antikörper wurden unter Verwendung von Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Schweden) abgetrennt [siehe Knowles et al., Anal. Biochem., 160:440-443 (1987)].
Das Konjugat und überschüssige Ricin A-Kette wurden mit hoher Salzkonzentration (10 x PBS) eluiert und einer weiteren Reinigung auf Sephacryl-300 (Pharmacia) unter Verwendung von PBS als Elutionsinittel unterworfen. Das resultierende Konjugat war frei von ungebundenem monoklonalem Antikörper oder ungebundener Ricin A-Kette und bestand hauptsächlich aus 1:1 Addukten.
Die Internalisierung von BR96-RA in verschiedene Karzinomzellinien wurde dann unter Anwendung eines Assays zur Inhibierung der Thymidinaufnahme bestimmt. Die Inhibierung des 3H-Thymidin-Einbaus in die DNA der Karzinomzellen (d.h. die Inhibierung der Zellproliferation) dient bei diesem Assay als Meßwert für den cytotoxischen Effekt von BR96-RA gegenüber den Zellen und somit als Meßwert für die Internalisierung des Immunotoxins in die Zelle.
Für den Assay wurden Karzinomzellen auf einer 96er- Mikrotiterplatte in einer Menge von 1 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung in 100 µl IMDM-Medium mit 15 %-igem fötalem Kälberserum (FCS) ausplattiert. Die Platten wurden 12-18 h bei 37ºC inkubiert, um die Zellen haften zu lassen. Dann wurde das Medium entfernt. Die Platten wurden auf Eis gestellt. Dann wurde BR96-RA-Immunotoxin (100 µl) in log 10 Reihenverdünnungen, von anfangs 10 µg/ml bis zu einer Endkonzentration von 0,01 µg/ml, zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h auf Eis inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 200 µl/ml Medium wurden zugegeben. Dann wurde weitere 18 h bei 37ºC inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden 50 µl ³H-Thymidin (1 µCi/Vertiefung) zugegeben und die Platten wurden 6 h bei 37ºC in einem 5 % CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Die Assay-Platten wurden dann bei -70ºC wenigstens 1 h eingefroren und 15 Minuten in einem Geitrockner aufgetaut. Die Zellen wurden auf Glasfaserfiltern (Filter Strips, Nr. 240-1, Cambridge Technology) in Szintillationsfläschchen aus Kunststoff unter Verwendung eines PHD Cell Harvester geerntet. Man gab 3 ml Szintillationszählflüssigkeit in die Fläschchen und zählte die Fläschchen auf einem Beckman LS3891 beta-Szintillationszähler (1 Minute/Probe) aus.
Es wurden für jede getestete Zellinie Kurven der prozentualen Inhibierung der Thymidin-Aufnahme gegen die Immunotoxinkonzentration geplottetl die in den Figuren 1-5 dargestellt sind. Bei jedem Assay gab es eine Kontrolle. Die Ergebnisse des Assays sind als prozentuale ³H-Thymidin-Aufnahme in unbehandelte Kontrollzellen angegeben.
Figur 1 zeigt die durch Internalisierung von BR96-RA verursachte prozentuale Inhibierung der Thymidin-Aufnahme in Zellen aus der Brustkarzinomzelllinie 3396. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Lungenkarzinomzellinie 2707 (Figur 2) und mit der Kolonkarzinomzellinie C (siehe Figur 4) erhalten. BR96-RA wurde nicht in die Zellinie HCT116, einer menschlichen Kolonkarzinomzellinie, die BR96 nicht bindet, internalisiert (siehe Figur 3). Figur 5 zeigt keine Internalisierung von BR96-RA in 3347, einer Kolonkarzinomzellinie, an die BR96 nicht bindet; andererseits wird BR6-RA, der an die 3347-Zellen bindet, internalisiert. Daher zeigt diese Studie nicht nur die Internalisierung des Antikörpers BR96, sondern auch die Selektivität der Internalisierung des Antikörpers BR96 gegenüber Antigen-positiven Karzinomzellen.

BEISPIEL 4

Cytotoxizität des unmodifizierten monoklonalen Antikörders BR96

Im Anschluß an die überraschende Entdeckung, daß der monoklonale Antikörper BR96 von sich aus (d.h. in unmodifiziertem Zustand) in einem FACS-Assay cytotoxisch zu sein schien, wurden drei Arten von Versuchen durchgeführt. Um eine Komplementwirkung in Serum zu vermeiden, wurden alle verwendeten Seren (30 Minuten bei 56ºC) hitzeinaktiviert. Zusätzlich wurden einige der Experimente mit FACS-Analyse (wie nachfolgend beschrieben) an Zellen durchgeführt, die in Serum-freiem Medium kultiviert und ohne Serum getestet wurden.
Im ersten Versuch wurden lebende, suspendierte Zellen aus verschiedenen Antigen-positiven Karzinomlinien (3396, 2987, 3619) mit dem monoklonalen Antikörper BR96 behandelt. Die Zellen (5 x 10&sup5;) wurden 30 Minuten mit 100 µl BR96 oder monoklonalem Kontrollantikörper in einer Konzentration von 60, 30, 15, 7,5 und 3,8 µg/ml in Kulturmedium (IMDM, 15 % FBS) auf Eis inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit Kulturmedium wurden diese in 500 µl Medium suspendiert und durch Zugabe des Farbstoffs Propidiumiodid, der tote Zellen färbt, gefärbt [Krishan, Cell Biol. 66:188 (1975); und Yeh, J. Immunol. Methods, 43:269 (1981)]. Aus einer 1 mg/ml Basislösung (in 70 %-igem Alkohol) wurden 5 µl Farbstoff zu den Zellproben gegeben, 15 Minuten auf Eis inkubiert, einmal gewaschen und schließlich in 500 µl Medium suspendiert. Die Zellen wurden mit einem Coulter Epics C FACS ausgewertet, wobei tote Zellen anhand ihrer roten Fluoreszenz identifiziert wurden. Die Analyse erfolgte mit einem Zweiparameter-Display mit dem Logarithmus der Vorwärtslichtstreuung im horizontalen und dem Logarithmus der roten Fluoreszenz im vertikalen Display. Die Zellgröße im Vergleich mit der Zell-Lebensfähigkeit wurde unter Anwendung des Coulter Epics C-Programms Quadstat errechnet. Tumorzellen, die BR96 binden konnten sowie Tumorzellen, die BR96 nicht binden, wurden parallel untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 6 angegeben. Figur 6 zeigt, daß die Zellen der drei Antigen-positiven Karzinome jeweils durch Inkubation mit BR96 rasch getötet wurden. Unbehandelte oder Antigen-negative Zellen wurden nicht getötet.
Im zweiten Versuch wurden Tumorzellen (3396, 3630, 2987, 3619 und HCT116) 18 h bei 37ºC auf einer 96er-MikrotiterpLatte in einer Menge von 3 x 10³ Zellen/Vertiefung in 150 µl IMDM- Medium, das FBS für 66 Stunden enthielt, mit BR96 (oder dem monoklonalen Kontrollantikörper) behandelt. Anschließend wurden 50 µl ³H-Thymidin (1 µCi/Vertiefung) zugegeben und die Platte wurde weitere 6 h bei 37ºC inkubiert. Danach wurde sie wenigstens 1 h bei -70ºC eingefroren und dann 15 Minuten in einem Geltrockner aufgetaut, und die Zellen wurden auf Glasfaserfilter geerntet. Dann wurde der tritiierte Thymidin-Assay, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch die Zellen und Antikörper bei 37ºC inkubiert wurden. Figur 7 zeigt die Ergebnisse. BR96 bewirkte eine Inhibierung der [³H]- Thymidin-Aufnahme in Antigen-positive Zellinien, wobei diese Wirkung dosisabhängig war. Die Antigen-negative Zellinie HCT116 wurde durch BR96 in keiner Konzentration beeinträchtigt.
Im dritten Versuch wurde ein Assay zur Wachstumsinhibierung unter Anwendung einer abgewandelten Form des von Linsley et al. [Linsley, et al., "Identification and characterization of cellular receptors for growth regulator, Oncostatin M", J. Biol. Chem. 264:4282-4289 (1989)] beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Man impfte Zellen (3 x 10³) aus vier verschiedenen Zellinien (HCT116, 2987, 3396 und 3630) in IMDM (Volumen: 0,1 ml) mit 15 %-igem fötalem Rinderserum (FBS) in 96er-Mikrotiterpiatten und ließ sie 3 h bei 37ºC binden. Dann wurden verschiedene Konzentrationen von ganzen monoklonalen BR96-Antikörpern in einem Volumen von 0,1 ml zugegeben, und anschließend wurde die Inkubation 72 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Danach wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden mit Kristallviolett (0,1 % in 20 % Methanol) 30 Minuten gefärbt und dreimal mit PBS gewaschen. Der gebundene Farbstoff wurde durch Zugabe von 0,1 ml einer Lösung von 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,2, in 50 % Ethanol eluiert. Die Proben wurden jeweils dreifach mit einem ELISA-Lesegerät untersucht, wobei die Extinktion in Gegenwart von BR96 und die Extinktion in unbehandelten Proben bestimmt wurde. Die Ergebnisse dieses Verfahrens sind als prozentuale Inhibierung des Zellwachstums angegeben. Figur 8 zeigt die Ergebnisse. Die Ergebnisse dieses Versuchs stimmen mit den oben für den Versuch zur Thymidinaufnahme angegeben Ergebnissen (Figur 7) überein.

BEISPIEL 5

ADCC-Aktivität des Antikörpers BR96

Die Bestimmung der ADCC-Aktivität des monoklonalen Antikörpers BR96 erfolgte gemäß der Beschreibung von Hellstrom et al., Proc. Natt. Acad. Sci. (USA) 82:1499-1502 (1985). Man führte dabei einen Versuch zur kurzzeitigen Freisetzung von &sup5;¹Cr gemäß der Beschreibung von Cerrotini et al., Adv. Immunol. 18:67-132 (1974) durch, mit welchem sich die Freisetzung von &sup5;¹Cr bestimmen läßt, um einen Hinweis auf die Tumorzell-Lyse (Cytotoxizität) zu erhalten. Peripherblut-Lymphocyten von gesunden menschlichen Individuen wurden auf Ficoll-Hypaque getrennt [Hellstrom et al., Int. J. Cancer 27:281-285 (1981)], um Effektorzellen entsprechend einer natürlichen Killerzellenreaktivität von 5 % gegen SK-MEL-28-Zellen zu erhalten; (10&sup6;) Zellen wurden durch zweistündige Inkubation mit 100 µCi (1 Ci 37 Gbq) &sup5;¹Cr bei 37ºC markiert, anschließend dreimal gewaschen und in Medium resuspendiert. Die markierten Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit V-förmigen Böden (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) geimpft (2 x 10&sup4; Zellen pro Vertiefung in 20 µl). Dann wurden zunächst gereinigte BR96-Antikörper (10 µg/ml, 1 µg/ml und 0,1 µg/ml) und anschließend 2 x 10&sup5; Lymphocyten pro Vertiefung in 100 µl zugegeben. Die Gemische wurden 2 bis 4 h inkubiert und anschließend wurden die Platten bei 400 x g zentrifugiert. Man entfernte die Überstände und bestimmte die Radioaktivität in 100 µl-Proben mit einem Gammazähler. Es gab zwei Replikate pro Gruppe; die Abweichung zwischen den Replikaten betrug weniger als 10 %. Es wurden einige "Criss-Cross"-Experimente durchgeführt, wobei Lungen- (oder Kolon-) Karzinom- und Melanom-Targets parallel mit dem monoklonalen Antikörper BR96 und mit dem monoklonalen Antimelanom-Antikörper MG-22 getestet wurden [Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1499-1502 (1985)], die an die meisten Karzinomzellen nicht binden. Zur Kontrolle wurden Targetzellen alleine oder separat mit Lymphocyten oder monoklonalen Antikörpern inkubiert.
Die spontane Freisetzung wurde als Counts pro Minute (cpm) der Freisetzung aus Targetzellen, die weder Antikörpern noch Lymphocyten ausgesetzt worden waren, in das Medium und die gesamte Freisetzung wurde als Anzahl der Counts der Freisetzung aus Targetzellen, die am Ende des Assays osmotisch lysiert wurden, definiert. Die prozentuale Cytotoxizitätsrate wurde berechnet als:
x 100 Freisetzung in der Versuchsgruppe - spontane Freisetzung/gesamte Freisetzung - spontane Freisetzung
Die Effektorzellen wurden durch Bestimmung ihrer Sensitivität gegenüber Inkubation mit Anti-Serum gegen den Leu-11b- Oberflächenmarker und gegen Meerschweinchen-Komplement unter Anwendung der von Hellstrom et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Hrsg. Reisfeld & Sell, Liss, New York, Bd. 27, S. 149-164 (1985) (worauf hiermit Bezug genommen wird) beschriebenen Verfahren charakterisiert. Dadurch bestimmte man die Expression des Leu-11b-Markers, der natürliche Killer (NK)- Zellen charakterisiert und von Lymphocyten exprimiert wird, die ADCC gegenüber menschlichen Melanomzellen in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers BR96 vermitteln. Die Cytotoxizität von Effektorzellen alleine ("natürlicher Killereffekt") wurde von den in Figur 9 angegebenen Daten subtrahiert.
Die in Figur 9 für eine Antikörperkonzentration von µg/ml angegebenen Ergebnisse zeigen, daß BR96 ADCC-Aktivität vermittelt, sofern er in ausreichenden Konzentrationen vorhanden ist und die Targetzellen das Epitop in ausreichenden Konzentrationen exprimieren. Die ADCC-Aktivität ist bei Antikörperkonzentrationen zu beobachten, die niedriger sind als diejenigen, bei denen der Antikörper an sich cytotoxisch ist (üblicherweise etwa 20 µg/ml). Bei alleiniger Verwendung des Antikörpers BR96 als Kontrolle ergaben sich bei den getesteten Konzentrationen und unter Anwendung des &sup5;¹Cr-Assays 0 % Tötung. ADCC-Aktivität wurde nur bei Zellinien festgestellt, die den Antikörper BR96 binden. Somit wurden die Zellen von fünf verschiedenen Karzinomlinien, die alle BR96 banden, mittels ADCC bei Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers von bis zu lediglich 0,1 µg/ml getötet, während die Zellen einer sechsten Linie, nämlich 2964, die BR96 nicht banden, nicht getötet wurden. Das Erfordernis der Antikörperbindung zur Erzielung von ADCC wurde auch dadurch demonstriert, daß die beiden Karzinome, die einen anderen Antikörper, nämlich L6 (Linien 3619 und 2987), binden konnten, von L6 mittels ADCC getötet wurden und die anderen nicht. Unter den Bedingungen des Assays bewirkte BR96 alleine, selbst bei einer Versuchskonzentration von 10 µg/ml, die Freisetzung von lediglich 1 % des Markers.

BEISPIEL 6

Fähigkeit von BR96 zur Vermittlung Komplementvermittelter Cytotoxizität (CDC)

Es wurden Versuche zur Bewertung der Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers BR96, Tumorzellen in Gegenwart von menschlichem Serum als Komplementquelle (Komplement-vermittelte Cytotoxizität) (CDC) zu töten, ähnlich den in obigem Beispiel 5 beschriebenen ADCC-Tests durchgeführt, wobei jedoch anstelle einer Suspension von Effektorzellen 100 µl menschliches Serum aus normalen menschlichen Individuen pro Mikrotest-Vertiefung als Komplementquelle (Verdünnung 1:3 bis 1:6) zugegeben wurden.
Wie in Figur 10 dargestellt, wurde eine CDC gegenüber Zellen, die BR96 banden, bei einer Antikörper-Konzentration von 0,1-5,0 µg/ml beobachtet, während jedoch keine CDC gegenüber den BR96-Antigen-negativen Zellinien HCT116 und 3347 vorhanden war. Die 3347-Zellen konnten jedoch bei Verwendung des monoklonalen Antikörpers L6, der an diese Zellen bindet, getötet werden. Es wurden stets auch Kontrollen durchgeführt, bei denen BR96 in Abwesenheit von Komplement getestet wurde. Für BR96 alleine wurde durch den Assay zur Freisetzung von &sup5;¹Cr keine Tötung festgestellt. Diese Daten zeigen, daß BR96 in Gegenwart von menschlichem Serum in Konzentrationen, bei denen er an sich nicht cytotoxisch ist, cytotoxische Wirkung besaß (der Kontroll-Antikörper bewirkte keine CDC).

BEISPIEL 7

Bestimmung der Reaktivität von BR96 gegenüber Glycolipiden und Glycoproteinen

Man testete die Reaktivität des Antikörpers BR96 gegenüber einer Reihe immobilisierter Glycolipid-Antigene mit bekannter Kohlenhydrat-Struktur und synthetischer Glycoproteine (sogenannte "Neoglycoproteine") unter Anwendung eines ELISA-Assays, wobei gereinigte Glycolipide und Glycoproteine und Antikörper im Überschuß verwendet wurden (Dr. John Magnani, Biocarb, Gaithersburgl MD; Lloyd et al., Immunogenetics 17:537-541 (1983)). Die Glycolipide wurden aus Methanol in einer Menge von 100 ng/Vertiefung in Mikrotitervertiefungen getrocknet. Die Oberfläche der Vertiefungen wurde durch Inkubation des auf 200 ng verdünnten Glycoproteins in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4/Vertiefung, mit synthetischen Glycoproteinen beschichtet. Gereinigte BR96-Antikörper wurden in einer Konzentration von 10 µg/ml in 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 1 % BSA, und Antikörper aus Aszitesflüssigkeit in einer Verdünnung von 1:100 in dem gleichen Puffer getestet. Bei derart hohen Konzentrationen sind die meisten Bindungswechselwirkungen leicht zu detektieren. Die Extinktionswerte wurden als Mittelwert zweier Vertiefungen berechnet. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in den Figuren 11 und 12 zusammengefaßt und zeigen, daß BR96 mit Ley-Antigenen reagierte.
Diese Feststellungen zeigen, daß BR96 an eine Variantenform des Lewis Y (Fuc α1-2Galβ1-4(Fucα2-3)GlcNAc.-Antigens binden kann und daß an GlcNAc gebundene Fucose α1-3 einen Bereich des Ley-verwandten Epitops bildet, das von BR96 erkannt wird. Die hohe Tumorspezifität von BR96 und die (bisher für gegenüber Ley-Antigenen reaktive monoklonale Antikörper noch nicht beschriebene) Fähigkeit zur Internalisierung weisen darauf hin, daß der Antikörper ein komplexes Epitop erkennt, das in einem Bereich das Ley-Antigen umfaßt.

BEISPIEL 8

Herstellung und Charakterisierung von BR96 F(ab')&sub2;-Fragmenten)

Maus-BR96 (IgG3) aus Maus-Aszitesflüssigkeit wurde durch Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt. Dabei wurde entfettete Aszitesflüssigkeit über eine Säule geschickt, die eine zuvor mit 1 M Kaliumphosphat, pH 8,0, äquilibrierte Matrix aus immobilisiertem Protein A (RepliGen Corp., Cambridge, MA) enthielt. Nach dein Passieren der Aszitesflüssigkeit wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis kein Protein mehr spektrophotometrisch detektiert wurde. Dann wurden gebundene BR96-Antikörper unter Verwendung von 0,1 M Citratpuffer, pH 3,0, von der Säule eluiert. Unmittelbar nach der Elution wurde das Eluat mit 1,0 M Tris-Puffer, pH 9,0, neutralisiert, bis der pH etwa 7,0 betrug. Der monoklonale Antikörper wurde dann in PBS dialysiert und vor Lagerung oder Verwendung eingeengt.
Dann wurden F(ab')&sub2;-Fragmente durch Verdauung gereinigter monoklonaler BR96-Antikörper mit Pepsin nach Lamoy, "Preparation of F(ab')&sub2; Fragments from Mouse IgG of Various Subclasses", Meth. Enzymol. 121:652-663 (1986) hergestellt. Verbleibende ganze Antikörper und Fc-Fragmente wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Passage über eine Protein A-Affinitätssäule adsorbiert. Die resultierenden F(ab')&sub2;-Fragment-Präparate wurden ausgiebig gegen PBS dialysiert und sterilfiltriert.
Die BR96-F(ab')&sub2;-Fragment-Präparate wurden durch Gelpermeations-HPLC, SDS-PAGE und ELISA an der menschlichen Brusttumorlinie 3396 (Oncogen, Seattle, WA) charakterisiert. Die Gelpermeations-HPLC wurde durchgeführt, um die Molekülgröße der Proteine zu bestimmen, welche das F(ab')&sub2;-Präparat umfaßten. Reproduzierbare Chromatogramme verschiedener Präparate zeigten, daß das Protein zu 75-80 % F(ab')&sub2; war. An den Positionen, die für Material mit höherem Molekulargewicht, wie z. B. ganze BR96-Antikörper oder Proteinaggregate, stehen, wurde kein Protein detektiert. Die verbleibenden 20-25 % des Proteins eluierten an Positionen, die inaktiviertem Pepsin und anderen kleineren, nicht an Protein A bindenden Verdauungsprodukten entsprachen.
Durch nichtreduzierende und reduzierende SDS-PAGE unter suchte man die denaturierten Molekülgrößen und die strukturelle Anordnung der Proteine in den F(ab')&sub2;-Präparaten. Typischerweise wurde eine einzige größere Bande an der F(ab')&sub2;-Position (etwa 100 kdal), ohne sichtbare, kontaminierende Bande ganzer monoklonaler Antikörper (160 kdal), beobachtet. Die Banden niedrigeren Molekulargewichtes (d.h. von weniger als 100 kdal), die für inaktiviertes Pepsin und kleine Verdauungsprodukte standen, waren minimal. Unter reduzierenden Bedingungen wurden die erwarteten Ergebnisse mit den einzigen größeren Banden erhalten, die in Form von Doppellinien bei etwa 25 kdal, entspre chend der leichten Kette und dem verbleibenden, fragmentierten Teil der schweren Kette, auftraten. Es wurde keine Bande einer ganzen schweren Kette beobachtet.
Die funktionelle (Bindungs-) Aktivität des F(ab')&sub2;-Fragmentes von BR96 wurde mit derjenigen von ganzem BR96 in einem ELISA verglichen, wobei das Antigen von 3396-Zellen stammte. Die Bindung von ganzen BR96-Antikörpern oder von F(ab')&sub2;-Fragmenten an die Zellen wurde mit einem HRP-konjugierten Ziege- Anti-Maus-K-Leichte Kette-Reagens, wie in Figur 13 dargestellt, detektiert. Auf einer Doppelplatte wurde die Bindung von ganzem BR96 unter Verwendung von HRP-konjugiertem Protein A, das an den ganzen Antikörper und nicht and die F(ab')&sub2;-Fragmente bindet, von der Bindung der F(ab')&sub2;-Fragmente unterschieden (Figur 14).
Diese Ergebnisse zeigen, daß BR96 F(ab')&sub2; (Posten R0201- 1663-03, Posten 2) eine Spur des ganzen Antikörpers BR96 enthielt. Die Menge kontaminierender ganzer Antikörper ist schätzungsweise etwa 8 dreifache Verdünnungen von der vorhandenen Menge an F(ab')&sub2; entfernt oder beträgt etwa 0,01 %. Das andere F(ab')&sub2;-Präparat (Posten R9011-1481-48, Posten 1) zeigte keine detektierbare Menge kontaminierender ganzer BR96-Antikörper, was darauf hinweist, daß sich jeglicher Effekt von BR96 durch die Bindung der Fab-Region, und nicht der Fc-Region, erklären läßt.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die BR96 F(ab')&sub2;-Präparate nach HPLC und SDS-PAGE völlig frei von kontaminierendem ganzem BR96-IgG zu sein scheinen. Man fand nur in einem Fall, als ein sehr empfindliches ELISA-Verfahren angewandt wurde, detektierbare Mengen an kontaminierenden ganzen BR96-Antikörpern, die nur etwa 0,01 Gew.-%, bezogen auf die Menge an vorhandenen F(ab')&sub2;-Fragmenten ausmachten.

BEISPIEL 9

Herstellung und Charakterisierung chimärer BR96- Antikörper (ChiBR96)

Der erfindungsgemäße chimäre Maus/Mensch-Äntikrper BR96 ("ChiBR96") wurde unter Anwendung eines zweistufigen homologen Rekombinationsverfahrens hergestellt, wie es von Fell et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8507-8511 (1989) und in den gleichzeitig anhängigen Patentanmeldungen von Fell und Folger- Bruce, nämlich USSN 243,873 vom 14. September 1988 und SN 468,035 vom 22. Januar 1990 beschrieben wurde, die beide auf dieselbe Person übertragen worden sind, wie die vorliegende Anmeldung. Auf die Offenbarung all dieser Dokumente wird hiermit in vollem Umfang Bezug genommen.

Transfektion menschlicher Schwere Kette-DNA

Die Maus-Hybridomzellinie BR96, ATCC-Nr. HB10036, die wie oben beschrieben erhalten wurde, transfizierte man (8 x 10&sup6; Zellen) mit hgamma1/HC-D (bei der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, unter der NRRL-Nr. B 18599 hinterlegt) (Figur 15) durch Elektroporation (Gene Pulser; Biorad Laboratories, Richmond, CA) bei 250 V, Kapazitätseinstellung 960 µFd, in isotonischer, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 30 µg/ml des gereinigten Xba1-restringierten Fragmentes (6,2 kb) des Vektors hgamma1HC-D. Nach 48 Stunden wurden die Zellen in 96er-Platten in einer Menge von 10&sup4; Zellen/Vertiefung geimpft. Die Selektion von NeoR wurde in IMDM-Medium (GIBCO, Grand Island, NY), das 10 %-iges (V/V) fötales Kälberserum (FBS) und das Antibiotikum Aminoglycosid G418 (GIBCO) in einer Menge von 2,0 mg/ml enthielt, durchgeführt.

Detektion sezernierter Human-IgG (Hu gamma1)-Antikörper durch ELISA

Die Kulturüberstände wurden unter Anwendung eines Sandwich-ELISA-Assays 2 Wochen nach Transfektion gescreent. Ziege-Anti-Human-IgG, Fc-spezifisch (CALTAG, San Francisco, CA), wurde als Einfang-Antikörper verwendet und Ziege-αHuman- IgG, Fc-spezifisch und an Meerrettichperoxidase HRPO konjugiert (CALTAG), war der Antikörper, der zur Detektion von gebundenern Human-IgG verwendet wurde. Zellen aus den HuIgG-positiven Vertiefungen wurden durch Verdünnung subkloniert und die Verdünnungs-Klone wurden durch ELISA zur Detektion von Human-IgGgamma1 nach dem zuvor beschriebenen Verfahren gescreent. Die Human-IgGgamma1 enthaltenden Klone wurden auch zur Detektion von Maus-IgG3-Schwere Kette durch ELISA gescreent. Ziege-Anti-Maus- IgG3 (Southern Biotechnology Assoc., Inc., Birmingham, AL) wurde als Einfang-Antikörper verwendet und Ziege-Anti-Maus, konjugiert mit HRPO (Southern Biotechnology Assoc., Inc.), war der Antikörper, der zur Detektion von Maus-IgG3 verwendet wurde.
Einer der Human-IgGgamma1-positiven, Maus-IgG3-negativen (Hugamma1&spplus;, MuG3&supmin;) Klone wurde ausgewählt und als ChiHBR96 bezeichnet. Diese schwerkettige chimäre Hybridomzellinie, ChiHBR96, wurde bezüglich Antigenspezifität gegenüber MCF-7- Zellen und durch einen quantitativen ELISA bezüglich der Expressionsraten der Human-IgG-Expression auf MCF7-Zellen charakterisiert. Die Zellinie ChiHBR96 exprimierte etwa 20 µg/ml Antigen-spezifische Human-IgG-Antikörper.

Leichte Kette-DNA-Transfektion

Das Hybridom ChiHBR96 (8 x 10&sup6; Zellen) wurde, wie oben beschrieben, durch Elektroporation transfiziert, wobei jedoch µg/ml menschlicher Leichte Kette-Rekombinationsvektor psV&sub2;gpt/CK (NRRL Nr. B 18507), enthaltend die in Figur 16 gezeigte Leichte Kette-K-Immunoglobulinsequenz, linearisiert mit HindIII, verwendet wurde. Nach 48 Stunden wurden die Zellen in 96er-Platten in einer Menge von 10&sup4; Zellen/Vertiefung geimpft. Die Selektion auf gpt wurde in IMDM-Medium durchgeführt, das %-iges (V/V)FBS, 15 µg/ml Hypoxanthin, 250 µg/ml Xanthin und 2,25 µg/ml Mycophenolsäure (MA) enthielt.

Detektion von sezerniertem Human-Kappa (Hu K)-Antikörper durch ELISA

Die Kulturüberstände wurden unter Anwendung eines Sandwich-ELISA-Assays, wie oben beschrieben, 2: Wochen nach Transfektion gescreent. Ziege-α-Human-K (CALTAG) war der Einfang-Antikörper und Ziege-Anti-Human-K-HRPO (CALTAG) war der Antikörper, der zur Detektion von gebundenem Human-K verwendet wurde. Die Vertiefungen, die Human-K-Antikrper enthielten, wurden durch Verdünnung subkloniert und die Klone wurden durch ELISA zur Detektion von Human-K- oder Maus-K-Kette gescreent. Ziege-Anti-Maus-K (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) wurde als Einfang-Antikörper verwendet und Ziege-Anti-Maus-K, konjugiert an HRPO (Fisher Scientific), war der Antikörper, der zur Detektion des Vorhandenseins der Maus-K-Kette verwendet wurde. Einer der Human-K-positiven, Maus-K-negativen Klone (HuK&spplus;, MuK&supmin;) wurde ausgewählt, um die Antigenspezifität gegenüber MCF-7-Zellen zu analysieren, und bezüglich der Expressionsraten durch einen quantitativen ELISA für Human-IgG-Expression auf MCF7-Zellen analysiert. Eine Zellinie, die Antigen-spezifisch gegenüber MCF-7-Zellen und HuIgG&spplus;, MuIgG3&supmin;, HuK&spplus;, MuK&supmin; war, wurde ausgewählt und als chimäres BR96 (Chi-BR96) bezeichnet.
Die ursprüngliche Expression des Schwere und Leichte Kette-Antigen-spezifischen, chimären Antikörpers BR96 (Chi-BR96) betrug etwa 25 µg/ml. Durch vier aufeinanderfolgende Klonierungsdurchgänge der Linie in Weichagarose mit einem Kaninchen-α-HuIgG-Antikörper-Overlay zur Detektion der Zellen, welche die höchste Menge an chimären Antikörpern sezernieren [Coffino et al., J. Cell. Physiol. 79:429-440 (1972)] wurde eine Hybridomzellinie (ChiBR96) erhalten, die etwa 130 µg/ml chimäre Antikörper sezernierte. Das Hybridom ChiBR96 wurde am 23. Mai 1990 bei der ATCC hinterlegt und erhielt dort die Hinterlegungsnummer ATCC Nr. HB 10460.

Bindung von ChiBR96

Die relative Affinität des erfindungsgemäßen Antikörpers ChiBR96 und des erfindungsgemäßen Maus-Antikörpers BR96 gegenüber dein Tumor-assoziierten Antigen auf MCF-7-Zellen wurde durch einen ELISA-Kompetitionsbindungs-Assay bestimmt [Hellstrom et al., Cancer Res. 50:2449-2454 (1990)]. Die adhärente, Antigen-aufweisende Zellinie MCF-7 wurde auf einer 96er- Mikrotiterplatte in einer Menge von 3 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung ausplattiert und etwa 3-4 Tage bis zur Konfluenz kultiviert. Das Kulturmedium wurde verworfen und die Zellen wurden mit 0,5 % Glutaraldehyd in PBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in einer Menge von 100 µl/mg 30 Minuten fixiert. Das Glutaraldehyd wurde verworfen und die Platte dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen. Die Platte wurde dann mit Bindungspuffer (0,1 % BSA in DMEM) 200 µl/Vertiefung 1 Stunde blockiert oder bei -20ºC unbegrenzt gelagert. Der Bindungspuffer wurde verworfen und es wurden Proben und Standards in die Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden bedeckt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Proben und Standards wurden verworfen und die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen. HRP-Konjugat, verdünnt mit 1 % Pferdeserum in PBS, wurde in die Vertiefungen gegeben (100 µl/Vertiefung) und 1 h bei 37ºC inkubiert. Der ELISA wurde mit 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin (TMB)-Chromagen (Genetic Systems, Seattle, WA) in einem Citratpuffer entwickelt. Die Farbentwicklung wurde mit 3N H&sub2;SO&sub4; unterbrochen und die Platte wurde mit einem Titertek Microplate-Lesegerät bei 450 nm gelesen. Durch diesen Assay wurde bestimmt, wie gut 0,3 Mg/ml biotinylierter Antikörper ChiBR96 mit nicht-markiertem ChiBR96 oder nicht-markiertem monoklonalern Maus-Antikörper BR96 um das Antigen konkurriert. Die gebundenen biotinylierten ChiBR96-Antikörper wurden mit Avidin- HRPO detektiert und mit ELISA-Standardreagenzien entwickelt.
Wie aus Figur 17 ersichtlich, zeigt die überlappung der beiden Bindungskurven, daß die zwei Antikörper dieselbe Spezifität und relative Affinität gegenüber dem Tumorantigen besitzen.

BEISPIEL 10

Charakterisierung des Antikörpers BR96 und der BR96 F(ab')&sub2;-Fragmente

Cytotoxizität unmodifizierter ChiBR96- und BR96 F(ab')&sub2;- Fragmente

Lebende suspendierte Zellen der BR96-Antigen-positiven Karzinomlinien 3396, 2987 und MCF-7 wurden mit ChiBR96- und BR96 F(ab')&sub2;-Fragmenten, die gemäß der Beschreibung in den obigen Beispielen 8 und 9 hergestellt worden waren, behandelt, um die Cytotoxizität dieser Antikörper im Vergleich zu den erfindungsgemäßen monoklonalen BR96-Antikörpern zu bestimmen. Die Cytotoxizitäts-Tests wurden durch FACS-Assay, wie in obigem Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den Figuren 18-20 als prozentuale Rate toter Zellen gegen die Antikörperkonzentration in µg/ml aufgetragen.
Figur 18 und 20 zeigen, daß der chimäre Antikörper BR96 und die F(ab')&sub2;-Fragmente von BR96 IgG3 dem monoklonalen Antikörper BR96 bezüglich Cytotoxizität gegenüber 3396- und MCF-7- Zellen ähnlich sind. Figur 19 zeigt, daß die cytotoxische Wirkung gegenüber 2987-Zellen wesentlich geringer ist als gegenüber anderen Brustkarzinomzellen (Figuren 18 und 20). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß ein höheres Bindungsverhält nis (Tabelle 2) für die Tötung durch diese Antikörper von Bedeutung ist und/oder daß verschiedene Tumorzellen unterschiedliche Sensitivität gegenüber der tödlichen Wirkung dieser Antikörper besitzen. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Antikörper ChiBR96 und die F(ab')&sub2;-Fragmente von sich aus, d.h. in unkonjugierter Form, cytotoxisch sind, und sie zeigen auch, daß die Cytotoxizität der BR96-Antikörper nicht von der FC-Region abhängt.

Internalisierung von ChiBR96

Die Internalisierung des Antikörpers ChiBR96 in Karzinomzellen wurde im Vergleich zur Internalisierung des monoklonalen Antikörpers BR96 bewertet. Die Antikörper waren mit Ricin A- Kette-Toxin zur Bildung der Immunotoxine ChiBR96-RA (1-4 Ricin A-Ketten pro Antikörpermolekül) und BR96-RA (1-2 Ricin A-Ketten pro Antikörpermolekül) konjugiert, und die Internalisierung in die Karzinomzellinien 3396 und 3630 wurde unter Anwendung eines Assays zur Inhibierung der Thymidinaufnahme, wie in obigem Beispiel 3 beschrieben, bestimmt.
Die Kurven der prozentualen Inhibierung der Thymidinaufnahme gegen die Immunotoxinkonzentration jeder getesteten Zellinie sind in den Figuren 21 und 22 aufgetragen. Figur 21 zeigt die prozentuale Inhibierung der Thymidinaufnahme in Zellen aus der Brustkarzinomzellinie 3396, die durch die Internalisierung von ChiBR96-RA und BR96-RA verursacht wird. Aus der Kurve ist ersichtlich, daß ChiBR96 ähnlich wie BR96 internalisiert wird und, was das Töten von Tumorzellen betrifft, wenigstens so wirksam zu sein scheint wie BR96. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Brustkarzinomzellinie 3630 (Figur 22) erhalten.

ADCC-Aktivität des Antikörpers ChiBR96

Die Bestimmung der ADCC-Aktivität von ChiBR96 erfolgte, wie in obigem Beispiel 5 beschrieben, unter Verwendung folgender Zellinien: Brustkrebslinien 3396, 3630 und 3680 (Oncogen, Seattle, WA) und MCF-7 (ATCC-Nr. HTB22); Ovarkrebslinie 3633-3 (Oncogen, Seattle, WA); und Lungenkrebsimien 2987, 3655-3 und 2981 (Oncogen, Seattle, WA). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 für verschiedene Antikörper-Konzentrationen angegeben. TABELLE 3 ADCC-Aktivität von ChiBR96
Die in Tabelle 3 für verschiedene Antikörperkonzentrationen angegebenen Ergebnisse zeigen, daß ChiBR96 ein ähnliches Maß an ADCC-Aktivität vermittelt wie BR96. Die ADCC-Aktivität ist bei niedrigeren Antikörperkonzentrationen als denjenigen, bei denen der Antikörper ChiBR96 von sich aus cytotoxisch ist, zu beobachten. Bei Verwendung des Antikörpers BR96 alleine als Kontrolle wurden bei den getesteten Konzentrationen 0 % Tötung erzielt. ADCC-Aktivität wurde nur bei denjenigen Zellinien festgestellt, die den Antikörper BR96 binden.

Fähigkeit von ChiBR96 zur Vermittlung der Komplement-vermittelten Cytotoxizität

Die Bestimmung der Fähigkeit von ChiBR96,; Tumorzellen in Gegenwart von menschlichem Serum als Komplementguelle zu töten (CDC), wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, unter Verwendung der Brustzellinien 3396, MCF-7, 3630 und 3680; der Ovarkrebszellinie 3633-3; und der Lungenkrebszellinien 3655-3, 2987 und 2981 durchgeführt. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse. TABELLE 4 CDC-Aktivität von ChiBR96
Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, daß ChiBR96 in Gegenwart von menschlichem Serum, das Komplement enthielt, eine ähnliche cytotoxische Wirkung (CDC) wie BR96 zeigte. BR96 und ChiBR96 waren in keiner Konzentration cytotoxisch. Das menschliche Serum war auch nicht cytotoxisch.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß der erfindungsgemäße, ganze Antikörper BR96 und chimäre Antikörper BR96 in die Karzinomzellen, an die sie binden, internalisiert werden, alleine, in unmodifizierter Form, cytotoxisch sind und sowohl ADCC- als auch CDC-Aktivität gegenüber Zellen besitzen, die eine größere Menge an Epitopen exprimieren.

BEISPIEL 11

Bewertung der BR96-Antikörper in vivo

Das therapeutische Potential des unmodifizierten erfindungsgemäßen Antikörpers BR96 zur Behandlung von Tumoren wurde in einer Reihe von Experimenten unter Verwendung von in nackte Mäuse verpflanzten, menschlichen Tumorgewebes untersucht. Zusätzlich wurden einige Parameter untersucht, die einen Einfluß auf diie Wirksamkeit von BR96 als Antitumor-Agens haben könnten. Zu diesen Parametern zählen das Ausmaß der Antigen-Expression auf der Target-Tumorlinie, der Zeitraum von der Tumorimplantation bis zur Initiierung der Therapie und Dosiseffekte.
In allen in vivo-Experimenten wurden der benötigten Anzahl an Balb/c nu/nu-Mäusen (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) die menschliche Lungenadenokarzinom-Zellinie H2987 oder die Tumorlinie H2707 implantiert. Zellen aus diesen Tumorlinien wurden in vitro kultiviert, geerntet, gewaschen und in PBS resuspendiert, bevor jeder Maus 10 Millionen Zellen subkutan (s.c.) in die hintere Flanke implantiert wurden. Diese Gruppen von Mäusen wurden dann randomisiert und in kleinere, gleiche Gruppen zu je 8 oder 10 Mäusen aufgeteilt.
Zur Erhöhung der Chance, Antitumoreffekte von BR96 zu beobachten, wobei der Antikörper immer noch zur eigentlichen Lokalisierung der Tumorimplantationsstelle erforderlich war, damit überhaupt eine Wirkung erfolgen konnte, wurde die Therapie 24 Stunden nach Tumorimplantation an Tag 2 eingeleitet. Sowohl die BR96- als auch die Kontroll-Mabs wurden in der gleichen Dosis und nach dem gleichen Schema verabreicht, obwohl die Einleitung der Therapie in einigen Fällen variierte. Die Behandlungsdosis wurde in 0,2 ml PBS intravenös (i.v.) durch die Schwanzvene der Mäuse verabreicht. Normalerweise waren nach dem Schema 5 Injektionen, einmal alle drei Tage, (Q3DX5) vorgesehen. Es gab jedoch zwei zusätzliche Injektionen an den Tagen 19 und 21 nach Implantation des Tumors H2987 im Anfangsexperiment.

Antitumoreffekte des Antikörpers BR96 gegenüber den Tumoren 2987 und 2707

Bei jedem Tier wurde wöchentlich das Tumorvolumen bestimmt, wobei die Messung üblicherweise am achten Tag nach der Implantation begann. Das Tumorvolumen wurde aus den Meßwerten der Tumorlänge und der senkrechten Breite unter Anwendung folgender Formel berechnet:
Tumorvolumen = größte Länge x (senkrechte Breite im Quadrat/2)
Dann wurden die Gruppendurchschnittswerte berechnet und gegen die Zeit nach der Tumorimplantation aufgetragen.
Im Anfangsexperiment, das in Figur 23 dargestellt ist, führte die Behandlung mit BR96 zu äußerst signifikanten Antitumoreffekten gegenüber der Zellinie H2987. BR64, der auch an diese Zellen bindet und in diese internalisiert wird, wurde als negative Kontrolle verwendet und zeigte, wenn überhaupt, nur geringe Wirkung im Vergleich zu den PBS-behandelten Kontrollen.
In Tabelle 5 sind die Effekte gegenüber einzelnen Tumoren am Ende der Behandlung in diesem ersten Experiment zusammengefaßt. TABELLE 5 Effekte der zu unterschiedlichen Zeipunkten nach Implantation von H2987 initiierten Behandlung mit unmodifiziertem BR96
Nur die Behandlung mit dem Antikörper BR96 führte zur vollständigen Beseitigung des Tumors. Zwei Tiere in dieser Gruppe waren tumorfrei und bei 3 weiteren Tieren zeigte sich eine Unterbrechung des Wachstums ihrer Tumoren nach Behandlung mit dem Antikörper BR96. Die zwei Mäuse, bei denen keine Anzeichen eines Tumors festzustellen waren, blieben während des gesamten Verlaufs des Experimentes tumorfrei.

Antitumoreffekte des Antikörpers BR96 gegenüber etablierten Tumoren

Eines der wichtigsten Ziele der Tumortherapie ist die wirksame Behandlung etablierter und wachsender Tumoren. Um zu untersuchen, ob BR96 einen Antitumoreffekt gegenüber etablierten Tumoren haben könnte, wurden die Lungenadenokarzinom-Tumorlinien H2987 bzw. H2707 als Fremdtransplantate in nackten Mäusen verwendet. Da diese Tumorlinien beide acht Tage nach Verabreichung von 10 Millionen Zellen s.c. tastbare Tumoren bilden, stellte die Verzögerung des Behandlungsbeginns eine Methode zur Untersuchung der Antitumoreffekte gegenüber etablierten Tumoren zur Verfügung.
Daher wurden zur weiteren Untersuchung der Wirksamkeit von unmodifiziertem BR96 einige Experimente durchgeführt, bei denen die Behandlung bis zu 5 oder 8 Tage nach der Tumorimplantation s.c. zurückgehalten wurde. Die Verzögerung des Behandlungsbe ginn ermöglichte es den Tumorzellen, etablierte Tumoren zu bilden. Dies führt zu einem Tiermodell, dessen Behandlung schwieriger ist, das jedoch der klinischen Situation in realistischerer Weise ähnelt.
Das Behandlungsprotokoll ist in Tabelle 6 zusammengefaßt. Drei Gruppen zu je 10 Mäusen wurden einer Behändlung mit dem Antikörper BR96 unterzogen, die, wie in nachfolgender Tabelle beschrieben, zu unterschiedlichen Zeitpunkten initiiert wurde. Kontrollinäuse erhielten ab Tag 2 FA6 oder PBS. FA6 ist ein Maus-IgG&sub3;, das gegen ein bakterielles Antigen gerichtet ist, welches nicht in Säugetieren vorgefunden wird, und fungierte als Isotyp-angepaßter, nichtbindender, monoklonaler Antikörper als negative Kontrolle. TABELLE 6 Effekte der Behandlung mit unmodifiziertem BR96, initiiert zu verschiedenen Zeitpunkten nach Implantation von H2987 oder H2707
Die Ergebnisse dieses Behandlungsprotokolls für die beiden Tumorzellinien H2987 und H2707 sind in Figur 24 angegeben, worin die Anzahl der Tiere ohne Tumore gegen den Zeitpunkt des Behandlungsbeginns nach Tumorimplantation geplottet ist. Das Fehlen eines Tumors, definiert als das Fehlen eines tastbaren Tumors, wurde am Ende der Behandlung jeder Gruppe bestimmt. Die Bestimmung des Fehlens von Tumoren erfolgte an unterschiedlichen Tagen, da die Behandlung zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Tumorimplantation initiiert wurde. Eine frühe Initiierung der Behandlung war deutlich wirksamer, und die Wirksamkeit der Behandlung verringert sich mit zunehmender Verzögerung des Behandlungsbeginns nach dem Zeitpunkt der Tumorimplantation. Da eine Verzögerung des Behandlungsbeginns dem Tumor in zunehmendem Maße das Wachstum und eine Etablierung ermöglicht, spiegelt die verringerte Wirksamkeit der Behandlung zu späteren Initiierungszeitpunkten die zunehmende Schwierigkeit wider, größere und etabliertere Tumoren zu behandeln.
Diese Ergebnisse zeigen, daß BR96 Antitumoreffekte gegenüber zwei verschiedenen Tumorzellinien besitzt. Antitumoreffekte wurden nur in den drei Gruppen beobachtet, die mit dem Antikörper BR96 behandelt worden waren, während bei den mit der Kontrolle, d.h. mit FA6 oder PBS, behandelten Tieren keine Antitumoreffekte zu beobachten waren.
Es ist signifikant, daß die Unterschiede in der Wirksam keit bei etablierteren Tumoren für die Tumorlinie H2707, die mehr Antigene exprimiert, größer sind. Die Beobachtung, daß H2707 in größerem Maße auf die Behandlung mit BR96 anspricht als H2987, steht im Einklang mit der Annahme, daß die Menge an Antigen, die von einer Tumorzelle exprimiert wird, die Wirksamkeit der Behandlung mit BR96 beeinflussen kann. Aus den obigen Daten ist ersichtlich, daß BR96 Antitumoreffekte gegenüber fortgeschrittenen Tumoren besitzt.

Dosiseffekte des Antikörpers BR96

Bei einem anderen Experiment wurden die Dosiseffekte von BR96 gegenüber der Tumorlinie H2707 untersucht. Bei diesem Experiment wurde BR96 in halblogarithmischen Mengen von 1 mg/Dosis bis zu 0,032 mg/Dosis verabreicht. Die mittleren Tumorvolumina der Gruppen sind in Figur 25 gegen den Zeitpunkt nach der Tumorimplantation aufgetragen Die mit Kontrolle behandelten Tiere erhielten nur die höchste Dosis des monoklonalen Antikörpers, d.h. 1 mg/Dosis FA6. Bei diesen Kontrolltieren waren keine Antitumoreffekte zu beobachten, während bei Verabreichung des Antikörpers BR96 innerhalb des gewählten Dosisbereichs eine dosisabhängige Antwort erfolgte.

Antitumoreffekte von F(ab')&sub2;-Fragment und chimärem BR96)

Zusätzlich wurden die Antitumoreffekte des F(ab')&sub2;-Fragmentes von BR96 untersucht, um festzustellen, ob die in vivo beobachteten Antitumoreffekte auf den Fc-Bereich zurückzuführen waren oder ob schon die Bindung an den Tumor mit der anschließenden Internalisierung für den Zelltod ausreichte, wie die in vitro-Assays nahelegten. Die Dosis an F(ab')&sub2;-Fragment betrug 0,66 mg/Dosis, wobei dasselbe Schema angewandt wurde wie für ganzen BR96. Diese Dosis entspricht einem ungefähren Moläquivalent an Bindungsregionen im Vergleich zu den 1,0 mg/Dosis ganzes IgG3 BR96. Die mittleren Werte des Tumorvoluinens dieser mit dein Antikörperfragment behandelten Gruppe sind in Figur 26 gegen den Zeitpunkt nach der Tumorimplantation aufgetragen. Es gab eindeutig einige Antitumoreffekte, obwohl die Effekte nicht so stark waren wie mit dem ganzen Antikörper. Diese Effekte waren zu den früheren Zeitpunkten, d.h. während oder unmittelbar nach der Behandlung, am ausgeprägtesten.
In diesem Experiment wurden auch die Antitumoreffekte von chimärem BR96 untersucht. Für den chimären MAb wurde eine mittlere Dosis von 0,32 g/Dosis gewählt. Die mittleren Werte für das Tumorvolumen dieser Gruppe von Mäusen sind ebenfalls in Figur 26 angegeben. Die Behandlung mit dem chimären Antikörper BR96 war wirksamer als eine vergleichbare Dosis Maus-BR96-IgG&sub3;. Dies wird zusätzlich durch Figur 27 verdeutlicht, aus der ersichtlich ist, daß 6 der 8 mit chimärem BR96 behandelten Mäuse am Ende der Behandlung frei von tastbaren Tumoren waren.
Die in Figur 27 dargestellt Untersuchung der einzelnen Tumoren ergab, daß nach Abschluß der Behandlung, anhand der Anzahl Tiere ohne Tumore nach Behandlung mit abnehmenden Mengen an IgG3-BR96-Antikörpern von 1,0 bis auf 0,1 mg/Dosis, ein klarer Dosiseffekt deutlich wurde. Überraschenderweise führte die Behandlung mit 0,032 mg/Dosis zu einem ähnlichen Antitumor effekt wie 0,32 mg/Dosis. Dies kann ein Hinweis darauf sein, daß die Menge an durch die Behandlung getöteten Zellen des Tumors sehr nahe an der erforderlichen Mindestmenge für ein weiteres Wachstum des Tumors lag.
Drei der acht mit dem F(ab')&sub2;-Fragment behandelten Tiere waren nach der Behandlung frei von tastbaren Tumoren. Daher ist der Fc-Bereich nicht unbedingt für Antitumoreffekte des Antikörpers in vivo erforderlich, obwohl er die tumorzidalen Eigenschaften von BR96, insbesondere in immunokompetenten Lebewesen, verstärken dürfte.
Die obigen Ausführungen zeigen, daß unmodifizierte BR96- Antikörper wirksame Antitumor-Agenzien gegen Tumorlinien in vivo sind. Des weiteren zeigen die BR96-Antikörper eine Wirkung gegenüber fortgeschrittenen oder etablierten, wachsenden Tumoren. Es gibt Anzeichen dafür, daß eine höhere Antigendichte auf der Tumorlinie die Fähigkeit von BR96, diese Zellen zu töten, vermindern kann. Es wurde gezeigt, daß dieser monoklonale Antikörper in all seinen Formen, d.h. in chimärer Form, als ganzes Maus-IgG3 oder in Form von F(ab')&sub2;-Fragmenten, als Antitumor- Agens wirksam ist. Frühere Behandlung und höhere Dosen sind bevorzugt.

BEISPIEL 12

Lokalisierung und Biodistribution der BR96-Antikörper

Radioiodierte monoklonale BR96-Antikörper, die in den Dosen verabreicht wurden, wie sie in den in obigem Beispiel 11 beschriebenen Therapie-Experimenten verwendet wurden, wurden zur Bestimmung der Biodistributionseigenschaften verwendet. Insbesondere wurden ganzes IgG3, BR96, chimäre oder F(ab')&sub2;- Fragmente zusammen mit der geeigneten Kontrolle (ganzer monoklonaler Antikörper FA6, chimäres 96,5 bzw. 96,5 F(ab')&sub2;) zur Lokalisierung im Tumor und in verschiedenen anderen Organen verwendet.
Vor den Lokalisierungsexperimenten wurden den Tieren, wie in obigem Beispiel 11 beschrieben, Tumorzellen für die Therapiestudien injiziert. Man ließ die Tumoren in den Tieren jedoch etwa 2 Wochen wachsen. Zu diesem Zeitpunkt wurden 100 µg des BR96-Antikörpers oder -Fragmentes gemäß den Anweisungen des Herstellers mit ¹²&sup5;I unter Verwendung von 10 µg Iodogen 10 Minuten bei Raumtemperatur radioaktiv markiert. Kontrollantikörper oder Fragmente davon wurden unter Anwendung derselben Methode mit ¹³¹I markiert. Diese radioiodierten Antikörper wurden mit den geeigneten, nicht-markierten Antikörpern verdünnt, bis die für die Therapieexperimente zu verwendenden Dösen erreicht waren. Sowohl die spezifischen als auch die unspezifischen Antikörper wurden dann vermischt und zusammen i.v., durch die Schwanzvene der Maus, verabreicht. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Mäuse willkürlich aus der Gruppe genommen, anästhesiert, durch den Orbital-Plexus ausgeblutet und getötet. Es wurden verschiedene Gewebeproben entnommen, gewogen und mit einem Gaminazähler gezählt, der zwischen den zwei Iod-Radioisotopen unterscheiden konnte. Anhand dieser Daten wurden die prozentuale Injektionsdosis und die prozentuale Injektionsdosis pro Gramm berechnet.
Die gesammelten Daten der Lokalisierungsexperimente zum Zeitpunkt 24 nach Verabreichung sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. TABELLE 7 Zusammenfassung der Biodistributionsexperimente
Das einzige Gewebe, daß signifikante Unterschiede zwischen spezifischen und unspezifischen Antikörpern zeigt, ist der Tumor. Alle anderen untersuchten Gewebe zeigen etwa die gleiche Aufnahme an spezifischen und unspezifischen Antikörpern. Eine mögliche Ausnahme sind die niedrigeren Blutspiegel an unspezifischern Antikörper FA6. Dies weist auf eine beschleunigte Clearance dieses Antikörpers aus dem Blut hin. Der Unterschied zwischen dein spezifischen und dem unspezifischen Antikörper im Tumor ist jedoch größer als der Unterschied der Blutspiegel an FA6- und BR96-Antikörpern.
Die Daten in Tabelle 7 zeigen auch, daß der prozentuale Anteil der in einem bestimmten Organ vorhandenen Dosis, unabhängig von der verabreichten Dosis, konstant ist. Dies weist darauf hin, daß quantitativ mehr Antikörper am Ort des Tumors vorhanden ist, wenn höhere Dosen verabreicht werden. Darüber hinaus gibt es keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den beiden Tumorlinien, was die spezifische gegenüber der unspezifischen Aufnahme betrifft.
Tabelle 7 zeigt auch, daß das F(ab')&sub2; mit deutlich höherer Geschwindigkeit aus dem Tier eliminiert wurde, als IgG3 oder chimäres BR96. Dies könnte die verminderte Wirksamkeit des Fragmentes im Vergleich zu den Therapie-Experimenten mit ganzen Antikörpern erklären. Jegliche Antitumoreffekte des Fragmentes müssen daher rasch und noch während der kurzen Zeitspanne vor der Eliminierung erfolgen.
ChiBR96 wurde in einem vergleichbaren Ausmaß wie IgG3BR96 lokalisiert. Höhere Mengen waren im Vergleich mit dem chimären Kontrollantikörper nur im Tumor vorhanden. Dies deutet darauf hin, daß jegliche Erhöhung der Wirksamkeit des chimären Antikörpers im Vergleich zu Maus-BR96 IgG3 auf Substitution der konstanten Region beim Menschen beruht. Ebenso wichtig ist, daß die Substitution der konstanten Region beim Menschen die Fähigkeit des chimären Antikörpers zur Lokalisierung am Tumor nicht zu beeinträchtigen bzw. seine Biodistribution nicht negativ zu beeinflussen scheint.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß IgG&sub3; und chimäre Formen von BR96 in der Lage sind, spezifisch am Ort des Tumors lokalisiert zu werden. Darüber hinaus sind durch diese vorläufigen Experimente sowohl die Lokalisierung als auch die therapeutischen Effekte bei vergleichbaren Dosen gezeigt worden. Indirekte Hinweise auf die Lokalisierung der F(ab')&sub2;-Fragmente ergeben sich aus der Antitumoraktivität der Fragmente in den Therapie-Experimenten. Diese Aktivität muß vor Ablauf von 24 Stunden erfolgen.
Obwohl hier besondere erfindungsgemäße Ausführungsformen gezeigt worden sind, ist ersichtlich, daß Änderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind. Es versteht sich daher, daß der Schutzumfang eher durch die nachfolgenden Patentansprüche, als durch die spezifischen Ausführungsformen definiert ist, die hier nur als Beispiele dienten.

Claims

1. Antikörper oder Fragment davon mit spezifischer immunologischer Reaktivität gegenüber menschlichen Karzinomzellenl wobei der Antikörper eine Antigen-bindende Region des monoklonalen Maus-Antikörpers BR96, produziert vom Hybridom mit der ATCC Nr. HB10036, umfaßt.

2. Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Antikörper nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein monoklonaler Maus-Antikörper ist.

4. Antikörper nach Anspruch 3, nämlich der monoklonale Maus- Antikörper BR96, produziert vom Hybridom HB 10036, hinterlegt bei der ATCC.

5. Monoklonaler Anti-Idiotyp-Antikörper, der mit einem Idiotyp auf dem Antikörper gemäß Anspruch 4 reagiert.

6. Ein Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment des Antikörpers gemäß Anspruch 1 bis 5.

7. Rekombinantes Protein, umfassend die Antigen-bindende Region des monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

8. Rekombinantes Protein nach Anspruch 7, worin das Protein ein chimärer Mensch/Maus-Antikörper ist.

9. Chimärer Antikörper nach Anspruch 8, nämlich der chimäre Antikörper ChiBR96, produziert vom Hybridom HB 10460, hinterlegt bei der ATCC.

10. Rekombinantes Protein nach Anspruch 7, worin die Antigenbindende Region an einen wenigstens funktionell aktiven Abschnitt eines zweiten Proteins mit Antitumor-Aktivität angefügt ist.

11. Rekombinantes Protein nach Anspruch 10, worin das zweite Protein ein Enzym, ein Lymphokin, ein Oncostatin oder ein Toxin ist.

12. Bispezifischer Antikörper mit Bindungsspezifität für zwei verschiedene Antigenel wobei eines der Antigene dasjenige ist, an welches der monoklonale Antikörper gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 bindet.

13. Bispezifischer Antikörper nach Anspruch 12, worin eines der Antigene eine Variante des Ley-Antigens ist und ein Epitop enthält, das Fucose α1T3 aufweist.

14. Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüchel worin der Antikörper an ein therapeutisches Agens unter Bildung eines Antikörperkonjugates konjugiert ist.

15. Antikörper nach Anspruch 14, worin das therapeutische Agens ein Antitumor-Wirkstoff, ein Toxin, ein radioaktives Agens, ein zweiter Antikörper oder ein Enzym ist.

16. Kombination aus einem Iminunokonjugat, umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9, verknüpft mit einem Enzym, das zur Umwandlung einer Prodrug in einen cytotoxischen Wirkstoff befähigt ist, und der Prodrug.

17. Hybridom HB 10036, hinterlegt bei der ATCC.

18. Hybridom HB 10460, hinterlegt bei der ATCC.

19. Pharmazeutisches Mittel, brauchbar zur Behandlung menschlicher Karzinome, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 12 oder 13.

20. Pharmazeutisches Mittel, brauchbar zur Behandlung menschlicher Karzinome, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Antikörperkonjugates gemäß Anspruch 14 oder 15.

21. Pharmazeutisches Mittel, brauchbar zur Behandlung menschlicher Karzinome, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines rekombinanten Proteins nach einem der Ansprüche 10 oder 11.

22. Verwendung wenigstens eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung menschlicher Karzinome.

23. Verfahren zur Bestimmung der Präsenz von Karzinomen in menschlichem Gewebe, umfassend den Kontakt einer Probe des Gewebes mit dein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und die Detektion der Bindung des Antikörpers an das Gewebe.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin der Antikörper mit einer Markierung, ausgewählt unter einer Radiomarkierung, einem Enzym, einem Chromophor und einem Fluorophor, markiert ist, um ein detektierbares Signal zu erzeugen.

25. Verwendung wenigstens eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Abbildung menschlicher Karzinome.

26. Verwendung nach Anspruch 25, worin der Antikörper mit einer Markierung, ausgewählt unter einer Radiomarkierung, einem Enzym, einem Chromophor und einem Fluorophor, markiert ist, um ein detektierbares Signal zu erzeugen.

27. Diagnostischer Kit, umfassend:

a) den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9; und

b) ein Konjugat aus einer detektierbaren Markierung und einem spezifischen Bindungspartner des Antikörpers gemäß (a).

28. Diagnostischer Kit nach Anspruch 27, worin die Markierung ausgewählt ist unter Enzymen, Radiomarkierungen, Chromophoren und Fluorophoren.