DE69226990T2

DE69226990T2 - Tumorantigen-spezifischer Antikörper

Info

Publication number: DE69226990T2
Application number: DE69226990T
Authority: DE
Inventors: Jan S-421 74 Vaestra Froelunda Holmgren; Peter S-752 27 Uppsala Lind; Leif S-430 41 Kullavik Lindholm
Original assignee: Pharmacia and Upjohn AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1991-07-03
Filing date: 1992-07-03
Publication date: 1999-03-25
Anticipated expiration: 2012-07-04
Also published as: JP3194020B2; NZ243435A; IE922188A1; HUT71193A; FI935970A0; EP0521842B1; DE69226990D1; HU218084B; FI935970L; FI109207B; NO934777L; CA2073124C; IL102390A0; HU9400011D0; NO315472B1; AU2292092A; EE03031B1; KR100246681B1; CA2073124A1; EP0521842A2

Description

Die Erfinderung betrifft einen neuen monoklonalen Tumor-Antigen spezifischen Antikörper, eine den Antikörper herstellende Zellinie, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den monoklonalen Antikörper umfaßt, die Verwendung des Antikörpers bei der Diagnose in vitro und die Verwendung der Zellinie zur Herstellung des Antikörpers.
Die Hybridomtechnologie zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die zuerst von Köhler und Milstein (Nature, 256, 495-497, 1975) beschrieben wurde, ist heute sehr anerkannt. Bei dieser Technologie werden Myelomzellen an Lymphozyten von Tieren gebunden, die mit einem bestimmten Antigen immunisiert worden sind. Die resultierende Hybridomzelle stellt gegen einen einzelnen antigenen Determinanten spezifische Antikörper her. Die monoklonalen Antikörper haben daher in großem Maß dazu geführt, herkömmliche Antisera in diagnostischen Standardkits für Immungssays zu ersetzen. Viel Forschung wurde außerdem durchgeführt, um die Hybridomtechnologie für therapeutische Zwecke anzupassen.
Es ist außerdem bekannt, daß die Transformation normaler Gewebezellen zu Tumorzellen mit einer Änderung der Kohlenhydratstruktur auf der Zelloberfläche verbunden ist. Viele Kohlenhydratstrukturen dienen als Antigene, und die Tumormodifizierten Strukturen stellen einen Typ sogenannter Tumorassoziierter Antigene (abgekürzt TAA) dar. Die Kohlenhydratstrukturen der Zelloberfläche sind entweder an einen Fettanteil, wobei sie in diesem Fall Glycolipide genannt werden, oder an Proteine oder Peptide, wobei sie in diesem Fall jeweils Glycoproteine oder Glycopeptide genannt werden, gebunden. Eine gemeinsame Bezeichnung dieser zwei Formen ist Glycokonjugat.
Tumor-assoziierte Glykoconjugat-Antigene sind bei menschlichen Turmorkrankheiten zuvor bekannt gewesen. Es wurde gezeigt, daß zwei Karzinomassoziierte Antigene CEA (Karzinom-embryonales Antigen) und GICA (gastrointestinales Krebsantigen) besonders bei gastrointestinalen Karzinomen das Epitop CA 19-9 aufweisen, während ein anderes drittes Epitop, CA- 50, ein allgemeines Karzinom-Antigen zu sein scheint. All diese Antigene werden von der Tumorzell-Oberfläche sekretiert und können im Blutserum nachgewiesen werden. Diese Entdeckungen haben die Suche nach monoklonalen Antikörpern, die Tumor-spezifische Antigene erkennen und bei der Immunlokalisierung und Immuntherapie verschiedener Krebskrankheiten verwendet werden können, begünstigt.
Ein monoklonaler Antikörper mit pankreatischer und kolorektaler Krebsspezifität ist in verschiedenen Veröffentlichungen und Zusammenfassungen von Konferenzen unter der Bezeichnung C242 (entsprechend dem Antigen CA- 242) erwähnt worden, siehe z. B. Larsson L. N. et al., Int. J. Cancer 42 (1988) 877-882, Lindholm L. et al., "An Immunoradiometric Assay (IRMA) for the CA-50 antigen", Tumor Marker Antigens, Ed. Jan Holmgren, Studentliteratur, 1985, Haglund C. et al., Br. J. Cancer 60 (1989) 845-51, Seil S., Human Pathology 21 : 10 (1990) 1003-19, Johansson C. et al., Int. J. Cancer 48 (1991) 757-763 und Kuusela P. et al., Br. J. Cancer 63 (1991) 636-430. Dieser C242-Antikörper ist bisher jedoch nicht spezifischer oder zu einem solchen Grad offenbart worden, daß er vom Fachmann hergestellt werden konnte, und er ist bis jetzt nicht öffentlich erhältlich gewesen.
Diese Erfindung betrifft folglich einen monoklonalen Antikörper mit der gleichen Bindungsspezifität wie der von C242 (d. h. bedeutende Spezifität für gastrointestinale, insbesondere pankreatische und kolorektale Krebszellen), ein solcher spezifischer monoklonaler Antikörper wird hiernach als C242 : II bezeichnet.
C242 : II ist ein monoklonaler muriner Antikörper der IgG Klasse, der hergestellt wird, wenn in einem geeigneten Medium eine Hybridomzellinie kultiviert wird, die durch Fusion von Milzzellen einer Maus, die mit einer humanen Kolonadenokarzinom-Zellinie immunisiert wurde, mit der murinen Myelomzellinie Sp2/0 erhalten wird, wie hiernach in Beispiel 1 in mehr Detail beschrieben wird. Eine den Antikörper C242 : II herstellende Hybridomzellinie wurde am 26.01.1990 gemäß dem Budapester Vertrag bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury Wilts., U. K. unter der Hinterlegungsnummer 90012601 hinterlegt. Auf diese Hinterlegung wurde in unserer anhängigen Internationalen Patentanmeldung PCT/SE91/00496 (WO-A-9201470) mit der Priorität vom 20.07.1990 Bezug genommen.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein neuer monoklonaler Antikörper bereitgestellt, der den monoklonalen Antikörper C242 : II oder einen Antikörper mit der gleichen Epitopspezifität, d. h. ein funktionelles Äquivalent, darstellt und hiernach als "erfindungsgemäßer Antikörper" bezeichnet wird.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Zellinie bereitgestellt, die den erfindungsgemäßen Antikörper herstellen kann, insbesondere die oben erwähnte hinterlegte Hybridomzellinie 90012601.
Vom Ausdruck "erfindungsgemäßer Antikörper" sind außerdem Antigenbindungsfragmente des Antikörpers umfaßt. Solche Fragmente behalten die Bindungsfähigkeit und Spezifität des nicht-fragmentierten Immunglobulins bei und können zum Beispiel durch Abbau des Antikörpers durch proteolytische Enzyme, wie Pepsin, erhalten werden. Der Letztere führt zu einem F(ab')&sub2;- Molekül und kleineren Peptiden, wobei der F(ab')&sub2;-Teil ein Beispiel eines solchen Antigen-Bindungsfragments ist. Außerdem sind entsprechende durch Gentechnologie hergestellte Antikörper oder Fragmente sowie davon abgeleitete oder humanisierte Antikörperformen umfaßt. Vom Erfindungsgedanken sind außerdem Antikörper umfaßt, die von einer Maus und anderen Tieren abstammen sowie Antikörper verschiedener IG-Klassen/Unterklassen mit der gleichen Spezifität. In Bezug auf die aktiven Antikörperfragmente und rekombinant hergestellten Varianten kann die Klasse/Unterklasse eines erfindungsgemäßen Antikörpers weniger wichtig sein, da die einzigartigen spezifischen Determinanten der Klasse/Unterklasse in den Konstrukten mehr oder weniger weggelassen werden können. Folglich reicht der Erfindungsgedanke von vollständig nicht-humanen zu vollständig humanen Antikörpern und schließt unterschiedliche chimäre Formen ein. Vollständige humane Antikörper können durch Kultivieren immortalisierter humanen Antikörper herstellenden Zellen erhalten werden.
Eine bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt Antikörper, die eine Bindungsaffinität/Avidität für das CA-242 Antigen/Epitop besitzen, die bis zu 10+1 mal und in einigen Zellen bis zu 10&supmin;¹ mal der Bindungsaffinität/Avidität des von der hinterlegten Hybridomzellinie hergestellten Antikörpers beträgt. Die in Frage stehende Kreuzreaktivität wird durch Blockierungs-/Bindungsassays, die gewöhnlich auf diesem Gebiet verwendet werden, gemessen. Diese Affinitäts/Aviditäts-Bereiche sind insbesondere auf nichtfragmentierte und nicht-derivatisierte, nicht-menschliche Antikörper anzuwenden. In Bezug auf die oben erwähnte Gentechnologie wurden die cDNA der variablen Bereiche der leichten und schweren Ketten des monoklonalen Antikörpers C242 : II, der hiernach in Beispiel 4 weiter beschrieben wird, kloniert. Bevor dies detaillierter diskutiert wird, ist eine kurze allgemeine Beschreibung der strukturellen Grundimmunoglobulineinheit erwähnenswert, wobei Bezug auf die Fig. 1 der beiliegenden Abbildungen genommen wird, die die allgemeine Struktur eines Antikörpers, d. h. eines Immunglobulins, der Klasse G zeigt.
Unter Bezugnahme auf Fig. 1 besteht das Immunglobulin aus zwei identischen leichten Polypeptidketten (L), und zwei identischen schweren Polypep tidketten (II), wobei die vier Ketten über Disulphidbindungen und verschiedene nicht-kovalente Kräfte in einer symmetrischen "Y"-Konfiguration miteinander verbunden sind. Jede schwere Kette hat eine variable Domäne (VH) an jedem Ende, gefolgt von mehreren konstanten Domänen (CH), und jede leichte Kette hat eine variable Domäne (VL) an einem Ende und eine konstante Domäne (CL) an dem anderen Ende. Es gibt zwei Typen. von leichten Ketten, die jeweils kappa und lambda genannt werden. Die variable Domäne der leichten Kette ist zusammen mit der variablen Domäne der schweren Kette und die konstante Domäne der leichten Kette ist mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette ausgerichtet, wobei die variablen Domänen der leichten und schweren Kette die Antigenbindungsstelle bilden.
Die variablen Domänen der leichten und schweren Kette haben die gleiche allgemeine Struktur, wobei jede drei hypervariable Regionen umfaßt, die komplementaritätsbestimmende Regionen oder CDR genannt werden, wobei diese zwischen vier Gerüstregionen oder FR liegen. Die CDR jeder variablen Domäne liegen in enger Begrenzung zu den Gerüstregionen, und die zwei CDR-Gruppen liefern zusammen die Antikörperspezifität.
Zur Klonierung der cDNA der variablen Teile der leichten und schweren Ketten des Antikörpers C-242 : II wurde zunächst eine cDNA-Phagenbibliothek von dem Hybridom C242 : II durch an sich bekannte Verfahren hergestellt. Die Hybridisierungssonden, die jeweils die konstanten Teile der schweren Kette und der kappa leichten Kette umfassen, wurden anschließend unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und geeigneter Primer von einer Mausgenom-DNA hergestellt. Die resultierenden Sonden wurden verwendet, um die cDNA-Bibliothek auf cDNA-Klone zu screenen, die DNA-Sequenzen enthalten, die die schweren und kappa Ketten des Antikörpers C242 : II codieren. Positive hybridisierende Plaqueklone wurden vervielfältigt, und die cDNA wurde in der Form von Plasmiden ausgeschnitten. Letzteres ist durch Restriktionsenzym-Kartierung gekennzeichnet und die Plasmide, die Inserts der erwarteten Größen enthalten, wurden sequenziert. Zur Bestimmung der CDR-Regionen wurden die durch die sequenzierten Inserts codierten Aminosäuresequenzen mit solchen von zuvor bekannten Maus kappa und schweren Ketten verglichen, wobei die Grundlage der CDR-Bereiche, wie von Kabat E. A., et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Ausgabe, U. S. Department of Health and Human Services, National Institute of Health definiert, berücksichtigt wurden. Es wurde festgestellt, daß die CDR der entsprechenden Ketten die folgenden Aminosäuresequenzen (die außerdem in den Fig. 3 und 4 der beiliegenden Abbildungen gezeigt sind) aufweisen:
kappa Kette/leichte Kette
CDR1:
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr (Trp Phe)
CDR2:
Arg Met Ser Asn Leu Val Ser (Gly Val)
CDR3:
Leu Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr (Phe Gly) Schwere Kette
CDR1:
(Phe Thr) Tyr Tyr Gly Met Asn
CDR2:
(Met Gly) Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly (Arg Ile)
CDR3:
(Ala Arg) Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val (Trp Gly)
Die terminalen Dipeptidreste in den Klammern sind optionale Abweichungen der CDR-Sequenzen. Die kappa Kette in Fig. 3 enthält einen cys-Rest, was bedeutet, daß die aminoterminalen Grenzen ihrer CDR gut definiert sind.
Die die obigen CDR codierenden Sequenzen sind in Fig. 4 veranschaulicht. Mit der Kenntnis dieser CDR-Aminosäure- und/oder DNA-Sequenzen kann der Fachmann die CDR-Bereiche des Antikörpers C242 : II in die klonierten variablen Teile eines anderen Antikörpers oder Antikörperfragmentes mittels seitengerichteter Mutagenase, die als solche im Stand der Technik bekannt ist, einführen. Ein solches Verfahren, das allgemein als "CDR- Transplantation" bekannt ist, umfaßt auf dem DNA-Niveau die Substitution der CDR-codierten Sequenzen des Antikörpers C242 : II in die CDR codierenden Sequenzen des Empfängerantikörpers oder Fragmentes, und führt zu einem Antikörper oder Antikörperfragment mit einer entsprechenden Spezifität des monoklonalen Antikörpers C242 : II. Erfindungsgemäß ist daher selbstverständlich jeder Antikörper oder jedes Antikörperfragment umfaßt, daß die oben definierten CDR oder alternativen CDR umfaßt, wobei die gleiche Epitopspezifität beibehalten wird.
Der erfindungsgemäße Antikörper ist gegen ein Tumorassoziiertes Antigen gerichtet, das hiernach als CA-242 bezeichnet wird, und das ein sialyliertes Kohlenhydrat-Antigen zu sein scheint, das auf dem gleichen Makromolekül wie das obengenannte Antigen CA-50 exprimiert wird. Strukturell unterscheidet sich dieses Antigen von dem Epitop CA-50 dadurch, daß der er findungsgemäße Antikörper sowohl nicht mit einer sialylierten Lewis-a- Substanz als auch mit Sialosyllacto-N-tetraose reagiert. Ein monoklonaler Antikörper gegen CA-50 kann jedoch die Bindung des erfindungsgemäßen Antikörpers an CA-50 inhibieren, was auf eine stukturelle Beziehung zwischen CA-50 und dem Antigen, der von dem erfindungsgemäßen Antikörper erkannt wird, schließen läßt. Das Tumor-assoziierte Antigen CA-242 wird in einem Großteil von kolorektalen Tumoren exprimiert und wird nur schwach oder gar nicht in normalem Kolongewebe exprimiert.
Nach der Bindung des zellgebundenen Antigens an den erfindungsgemäßen Antikörper kann der so gebildete Antigen-Antikörper-Komplex endozytosiert oder in die Zellen aufgenommen werden. Dies ist eine hervorragende Eigenschaft des hinterlegten Antikörpers C242 : II. Obwohl das von dem erfindungsgemäßen Antikörper erkannte Antigen sehr schwach in normalem pankreatischem und Kolongewebe exprimiert wird, wird er stark in pankreatischen Carzinom- und Koloadenokarzinom-Zellen exprimiert. Der erfindungsgemäße Antikörper findet daher bei der Verwendung der Immunlokalisierung von humanem pancreatischem Krebs und humanem Kolonkarzinom Anwendung.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird folglich die Verwendung des neuen erfindungsgemäßen Antikörpers in einem Immungssay bereitgestellt.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den neuen erfindungsgemäßen Antikörper umfaßt, bereitgestellt.
Ein Immungssay zur in vitro-Untersuchung, das auf dem neuen erfindungsgemäßen Antikörper basiert, kann gemäß herkömmlicher immunologischer Techniken des Standes der Technik entworfen werden, wobei der erfindungsgemäße Antikörper in einer markierten oder nicht-markierten Form verwendet wird und die Komplexbildung des Antikörpers mit den spezifischen Antigen- Arten in der zu untersuchenden Probe bestimmt wird. In dem ersten Fall kann der Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung, wie einer radioaktiven, chemilumineszierenden, fluoreszierenden oder einer Enzym-Markierung, markiert werden, während in dem letzteren Fall der Antikörper über einen mit einer markierten Substanz gebildeten Komplex oder durch kein Markierungsverfahren, wie dem Biosensorverfahren, das z. B. auf der Oberflächenplasmoresonnanz basiert, nachgewiesen wird. Die Probe kann, z. B. in Form einer Körperflüssigkeit, wie Serum, oder einer Gewebepräparation (histochemisches Assay) sein.
Für diagnostische Zwecke in vivo wird der erfindungsgemäße Antikörper mit einer geeigneten außen nachweisbaren Markierung, wie einer radioaktiven Markierung oder einem Schwermetallatom, bereitgestellt und wird an einen Patienten verabreicht, wonach die mögliche lokalisierte Antikörperanhäufung im Körper bestimmt wird.
Bei der therapeutischen Anwendung kann der neue erfindungsgemäße Antikörper in einer Vielzahl pharmazeutischer Zusammensetzungen und Präparationen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, wie Wasser, formuliert sein und auf verschiedene herkömmliche Wege, wie intravenös, subkutan, intramuskulär oder intraperitonal, verabreicht werden.
In den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen wird die Herstellung eines den erfindungsgemäßen neuen Antikörper herstellenden Hybridoms, dessen Verwendung bei der immunhistologischen Untersuchung, dessen Endozytose und die Klonierung der die schweren und leichten Ketten des monoklonalen Antikörpers C242 : II codierenden cDNA unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen beschrieben, worin:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der allgemeinen Immunglobulin-G Struktur ist;
Fig. 2 ein Diagramm, das die Endozytose der C242 : II Zellen zeigt, ist;
Fig. 3 eine Darstellung der detaillierten cDNA-Sequenz ist, die die variable Domäne der kappa Kette des monoklonalen Antikörpers C242 : II zeigt, zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz; und
Fig. 4 eine Darstellung der detaillierten cDNA-Sequenz ist, die die variable Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers C242 : II codiert, zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz, beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung der Hybridomzellinie und Herstellung von C242 : II

Herstellung von Milzzellen

Eine humane kolorektale Karzinomzellinie, COLO 205, die kommerziell von der American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD., USA unter der Hinterlegungsnummer CCL 222 erhältlich ist, wurde auf übliche Weise in Iscove's MEM, das mit 10%-igem fetalem Rinderserum (FCS) ergänzt ist, kultiviert. Die Zellen wurden vor der Konfluenz gewöhnlich nach 2 bis 3 Tagen nach der Subkultivierung geerntet und zur Immunisierung dreimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
BALB/c Mäuse, die 4 bis 6 Wochen alt waren, wurden intraperitoneal mit einer Startdosis von in 0,1 ml PBS suspendierten 3 · 10&sup7; COLO 205 Zellen immunisiert. Die Tiere wurden anschließend mit einer Auffrischung mit einer weiteren 0,1 ml Suspension der 3 · 10&sup7; COLO 205 Zellen immunisiert und 4 Tage später geopfert, und die Milze wurden entfernt. Die Milze wurden anschließend in einer einzelnen Zellsuspension dissoziiert.

Hybridomherstellung

1,2 · 10&sup8; Milzzellen der oben beschriebenen Zellsuspension wurden auf zwei Röhrchen verteilt. Zu jedem Röhrchen wurden zusätzlich 108 Myelomzellen von der Mausmyelom-Zellinie Sp2/0 (erhältlich aus der Sammlung der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, U. S. A. unter der Hinterlegungsnummer CRL 1581) gegeben. Die beiden Röhrchen wurden zentrifugiert, und die gesamte Flüssigkeit wurde abgegossen. Zu jedem Röhrchen wurden anschließend langsam über 1 Minute unter konstantem Rühren 2 ml 37ºC PEG-Lösung (10 g PEG MW4000, 1 ml DMSO und 10 ml monoclonale Kochsalzlösung) gegeben. Die Röhrchen wurden 90 Sekunden unter sanftem Rühren in ein Wasserbad bei 37ºC übertragen. Die Fusion wurde durch Zugabe zu jedem Reagensglas einer physiologischen Pufferlösung gemäß dem folgenden Schemata unterbrochen: 2 ml während der ersten 30 Sekunden, 6 ml während der folgenden 30 Sekunden und weitere 32 ml über 1 Minute. Nach dem Waschen der Zellsuspension in einem Kulturmedium wurde sie insgesamt in 100 ml mit Kulturmedium ergänztem Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin (HAT) suspendiert. Das Kulturmedium war mit 10% FCS, L-Asparagin (36 mg/l), L-Arginin-HCl (116 mg/l), Folinsäure (10 mg/l), L-Glutamin (292,3 mg/l), Natriumpyruvat (110,1 mg/l) und Mercaptoethanol (3,49 ul/l) ergänztes Iscove's MEM. 50 ul Aliquote wurden auf die Wells einer 96-Well Gewebekulturplatte verteilt. Die Wells sind mit 250 ul Macrophagensuspension von BALB/c Mäusen (2 · 104 Zellen/ml) in HAT-ergänztem Kulturmedium beschichtet worden. Das Medium wurde 6 Tage nach der Fusion gewechselt.

Screenen der Antikörper sekretierenden Hybridome

Das am Tag 6 erhaltene Medium wurde auf COLO 205 positive Antikörper untersucht, wie von Kennett R. H., "Enzyme-linked antibody assay with cells attached to polyvinyl chloride plates", Monoclonal Antibodies, Hybridomas, A new dimension in bilogical analyses. Eds. H. R. Kennett, T. J. McKevin, K. B. Bechtol, Plenum Press, New York 1980, beschrieben. Kurz zusammengefaßt wurden die Wells des Nung-Immunplattentyps IIF mit 2 · 10&sup5; Zellen/Well COLO 205 Zellen (1 mg/100 ml PBS) beschichtet, Beschichtungsvolumen 50 ul. Das oben erwähnte am Tag 6 erhaltene Kulturmedium wurde anschließend zu den beschichteten Wells, 50 ul/Well, gegeben. Nach der Inkubierung über Nacht bei Raumtemperatur wurde Peroxidase-konjugiertes Antimaus-Ig (Dakopatts P260, Dakopatts A/S. Kopenhagen, Dänemark), das in 1% BSA-PBS (1/500) verdünnt ist, auf 100 ug/Well zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das Substrat in der Form von 4 OPD-Tabletten Dako 52000, das in 12 ml Zitronensäurepuffer, pH 5,0 und 5 ul 30%- Wasserstoffperoxid verdünnt worden war, wurde anschließend zu 100 ul/Well gegeben, und die Absorption wurde nach der Inkubierung bei 450 nm gemessen.
Ungefähr 600 Hybridomklone wurden untersucht. Zunächst wurden 190 von ihnen mit COLO 205 Zellen reagiert. Von diesen reagierten 177 außerdem mit normalen humanen Lymphozyten, die auf Lymphoprep von Nyegaard A/S. Norwegen hergestellt wurden, und wurden verworfen. Ein Klon, der von einem der restlichen Klone erhalten wurde, wurde Hybridom C242 genannt und der Isotyp- Klasse IgGl zugeordnet. Mit dem Hybridom C242 wurden anschließend eine Vielzahl von Subklonierungsschritten durchgeführt, um schließlich einen stabilen monoklonalen Antikörper herzustellen, der den C242 : II genannten Klon herstellt.
Das Hybridom C242 wurde also zunächst kloniert und führt zu einem C242 : V genannten Klon. Dieser Klon wurde dann unter Bildung des Klons C242 : V : II kloniert. Bei beiden dieser Klonierungen wurde die Hybridomsuspension in Hypoxanthin/Thymidin (HT)-ergänztem Kulturmedium auf eine Dichte von 4 Zellen/Ml verdünnt. 50 ul (0,2 Zellen) wurden in jeden Well in einer 96-Well-Kulturplatte, die zuvor mit 250 ul Macrophagensuspension von Balb/c Mäusen (5 · 10³ Macrophagen/Well) in HT-ergänztem Medium beschichtet worden waren, verteilt. Nach 2 bis 5 Tagen wurden einzelne Zellklone durch visuelle Inspektion in einem Mikroskop untersucht. Am sechsten Tag wurde das Medium gewechselt und Aliquote der erhaltenen Media auf die Quantität der Antikörperbindung an COLO 205 Zellen, aber nicht an normale humane Zellen wie oben beschrieben durch ELISA untersucht. Die besten Klone in Bezug auf eine positive Reaktion in dem ELISA von COLO 205 und eine beibehaltene negative Reaktion in dem ELISA von normalen Zellen wurden ausgewählt und in Fläschchen in flüssigem Stickstoff zur weiteren Entwicklung gefroren.
Zur Durchführung einer dritten Klonierung wurden die Zellen aufgetaut und in DMEM (Dulbecco's Modifiziertes Eagle's Medium, 5% FCS) kultiviert. Die Zellen wurden anschließend in die Wells einer 96-well Gewebekulturplatte bei einer Durchschnittsdichte von 3 Zellen pro Well ausgesät. Die Klonierung wurde in DMEM mit 5% FCS durchgeführt und Makrophagen wurden als Speisezellen verwendet. Auf dieser Platte befanden sich 30 Klone, von denen 16 auf die IgG-Herstellung durch Nephelometrie und die Spezifität der Antikörper durch ELISA wie oben beschrieben untersucht wurden. Bei 12 dieser Klone wurde festgestellt, daß sie IgG herstellen. 10 Klone wurden anschlie ßend auf einer 96-Well Gewebekulturplatte ausgebreitet, von denen das erhaltene Medium auf IgG-Herstellung und Spezifität untersucht wurde. Diese Auswahl führte zu dem Erhalt von 4 Klonen mit verhältnismäßig hoher Produktivität. Ein Endproduktivitätstest dieser vier Klone wurde in Gewebekulturgefäßen durchgeführt. Der Klon mit der höchsten Produktivität wurde ausgewählt und C242/CL S10 A1 genannt. Er wurde in flüssigem Stickstoff für die weitere Verwendung gefroren.
Eine erste Klonierung des Klons C242/CL 510 A1 ließ erkennen, daß ein Drittel der Zellen kein IgG herstellen, wie durch die Absorption von weniger als 0,1 bei einer Verdünnung von 1 : 1000 in einem allgemeinen Maus IgG ELISA untersucht. Fünf positive Subklone wurden zusammengeführt, um einen als C242 : I bezeichneten Klon zu erzeugen. Die Produktivität dieses Klons wurde durch ein allgemeines HPLC-basierendes Assay quantifiziert und betrug 150 ug Maus IgG pro ml.
Der Klon C242 : I wurde anschließend unter Erhalt von 33 Klonen, die alle positiv für die Maus IgG-Herstellung waren, in einer 96-Well Platte kloniert. Fünf von ihnen, die alle 150 ug/ml ergaben, wurden zusammengeführt, um einen als C242 : II bezeichneten Endklon mit einer stabilen IgG- Produktivität zu erzeugen. Das HPLC-Assay zeigte, daß die Produktivität von C242 : II 196 ug Maus IgG pro ml ist. Die Zellen wurden gefroren und in Gefäßen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Eine Probe von dem hergestellten Hybridom C242 : II wurde unter der Hinterlegungsnummer 90012601, wie oben angegeben, bei der ECACC hinterlegt.

Herstellung von monoklonalem Antikörper C242 : II.

Eine Anfangszellsuspension von dem oben hergestellten Hybridom wurde von einem gefrorenen Gefäß erhalten. Die Zellen wurden in Gewebekulturkammern mit einer Gesamtfläche von 6000 cm² von Nung A/S bei einer Dichte von 2 · 10&sup4; Zellen/ml (Hybridom C242 : II) ausgesät. Die Zellen wurden anschließend in DMEM kultiviert, das gemäß Iscove (Iscove N. N., und Melchers F. J. Exp. Med. Bd. 147, S. 923 (1979) und mit 1%-igem Gentamycin, 1% Aminosäureergänzung und 5% fetalem Rinderserum ergänzt worden war. Die Zellen wurden anschließend 4 oder 5 Tage bei 37ºC unter 8% CO&sub2;-enthaltender feuchter Atmosphäre inkubiert. Am Ende der Inkubierung wurden die Zellen gezählt, und die Probe wurden zur Bestimmung der monoklonalen Antikörperkonzentration entnommen. Der Überstand der Zellkultur wurde dekantiert und durch einen Zellulosefilter filtriert, um die suspendierten Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend 20 bis 30mal durch Ultrafiltration in einer Millipore Pellican Ultrafiltrationszelle unter Verwendung einer Membran mit einem 30000 Molekulargewicht Rückhaltevermögen konzentriert. Eine Probe des Konzentrats wurde zur Untersuchung der Konzentration des monoklonalen Antikörpers C242 : II und der Antigenreaktivität entnommen, woraufhin das monoklonale Antikörperkonzentrat bei -70ºC bis zur Reinigung aufbewahrt wurde.

Reinigung von monoklonalem Antikörper C242 : II

Eine Protein-A-Sepharose® 4B (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) wurde gemäß der Anweisungen des Herstellers betreffend das Anschwellen und Waschen des Gels hergestellt, woraufhin das oben hergestellte Antikörperkonzentrat C242 : II unter Verwendung von 1,5 M Glycin-NaOH, 3 M NaCl, pH 8,9, als Bindungspuffer daran gebunden wurde. Nach dem anfänglichen Waschen unter Verwendung des gleichen Puffers wurde die Affinitätssäule mit 0,1 M Zitronensäure NaOH, pH 5,0 eluiert und der monoklonale Antikörper C242 : II wurde in Tuben, die 1 Mol/l Tris-HCl, pH 8,0 enthalten, gesammelt. Der erhaltene Antikörper wurde anschließend gegen 0,02 M Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,0, 0,2 g/l NaN&sub3; dialysiert. Der dialysierte Antikörper C242 : II wurde anschließend durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einem 30000 Molekulargewicht Rückhaltevermögen konzentriert. Nach der Entnahme von Proben für die Konzentrations- und Qualitätskontrolluntersuchung wurde der monoklonale Antikörper C242 : II bei -20ºC aufbewahrt.

Beispiel 2

Immunhistochemische Untersuchung von C242 : II in kolorektalem Krebs und normalen Geweben

Proben von kolorektalem Primärkarzinom und von verschiedenen normalen Geweben von Patienten, bei denen eine operative Resektion durchgeführt wurde, wurden erhalten. Die Gewebe wurden auf Eis aufbewahrt und innerhalb einer Stunde nach der Resektion in mit flüssigem Stickstoff vorgekühltem Isopentan gefroren. Die Gewebe wurden bei -70ºC bis zur Zerkleinerung aufbewahrt. Die gefrorenen Biopsien wurden in 5 um Abschnitte geschnitten und in 50% Aceton 30 Sekunden bei +4ºC und anschließend in 100% Aceton bei +4ºC fixiert. Die Abschnitte wurden luftgetrocknet und in PBS 10 Minuten gespült. Alle Abschnitte wurden anschließend in 0,3% Wasserstoffperoxid in PBS 5 Minuten inkubiert, um die endogene Peroxidase zu blockieren und mit PBS zweimal gespült. Danach wurden die Abschnitte mit normalem Schweineserum behandelt und 1 : 10 in PBS-4% BSA 5 Minuten bei +4ºC verdünnt, um nichtspezifische Bindungen der Antikörper zu blockieren.
Alle Inkubierungen mit den Antikörpern wurden in feuchter Atmosphäre 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Abschnitte wurden zunächst mit monoklonalem Antikörper C242 : II, der in obigem Beispiel 1 erhalten wur de, in PBS-4% BSA und danach mit biotinyliertem anti-Maus IgG vom Pferd (VectastainTM, Vector Laboratories, Burlingame, CA, U. S. A.), das 1 : 400 in PBS-4% BSA mit 2% anti-Kaninchen-Immunglobulin vom Schwein verdünnt worden war, und anschließend mit Avidin DH/biotinyliertem Meerrettich-Peroxidase H Komplex (Dakopatts A/S. Kopenhagen, Dänemark) inkubiert. Nach jeder Inkubierung wurden die Scheiben in PBS 15 Minuten gespült. Die Abschnitte wurden anschließend 15 Minuten mit Substrat behandelt, in PBS gesp"ult, mit Haematoxylin gefärbt und mit Glycerin-Gelatine (Merck, Darmstadt, Deutschland) fixiert. Als Substrat wurden 10 mg 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma, St. Louis, Mo., U. S. A.), die in 6 ml Dimethylsulfoxid gelöst und mit 50 ml 0,02 M Natriumacetat, pH 5, 5, enthaltend 4 ul 30% H&sub2;O&sub2;, verdünnt wurden, verwendet. Die Substratlösung wurde vor der Verwendung filtriert. Die Abschnitte wurden anschließend untersucht, und die Ergebnisse sind nachfolgend in der Tabelle I dargestellt:

Tabelle I

Färbung der kolorektalen Tumore und verschiedenen normalen Geweben mit C242 : II

Gewebe Färbung/Gesamt
kolorektales Karzinom 26/41
normaler Darm 8/16
Säugerdrüse 2/3
Ohrspeicheldrüse 2/2
Haut 0/1 leichte Färbung der Schweißdrüsen
Leber 0/2 schwache Färbung der Galle
Kanäle
Nieren 0/1
Pankreas 2/2 Kanäle
Magen 0/1
Dünndarm 0/1
Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, zeigten 63% der untersuchten Biopsien von kolorektalen Tumoren eine positive Färbung mit monoklonalem C242 : II. Es wurde festgestellt, daß die Expression des Antigens CA-242 in normalem Kolongewebe im allgemeinen schwächer ist als im Tumorgewebe, wobei die Färbung vollständig im Säulenepithelium und Becherzellen lokalisiert ist. Normales nicht-Kolongewebe zeigte fast keine Reaktivität mit monoklonalem C242 : II, wohingegen eine positive Reaktion in normalen Brustkanälen, pankreatischen Kanälen, Gallenkanälen und Schweißdrüsen festgestellt wurde, wobei die Intensität der Färbung schwach war.

Beispiel 3

Endozytose von C242 : II, das an COLO 205 humanen Kolonkarzinom bindet

Ein Endozytose-Assay wurde wie folgt durchgeführt: Einzelne Zellsuspensionen wurden von den COLO 205 Zellen hergestellt (siehe Beispiel 1), die als Monoschichtkultur wachsen gelassen wurden. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, gründlich gewaschen und in Kulturmedium wieder suspendiert. Jod-markierter Antikörper C242 : II aus Beispiel 1 (200000 cmp entsprechend 50 ng monoklonalem Antikörper) wurde zu einer einzelnen Zellsuspension von COLO 205 Zellen (10&sup6; Zellen) in 5 ml Reagensgläsern gegeben. Das Endvolumen betrug 200 ul/Glas.
Die Zellen wurden in der Gegenwart von ¹²&sup5;I-C-242 1 Stunde auf Eis (0ºC) inkubiert. Die Suspension wurde anschließend zentrifugiert, und die Zellen wurden von nicht-gebundenem monoklonalem Antikörper befreit. Die prä-inkubierten Zellen wurden weiter bei 37ºC in 10-minütigen Zeitabständen über 1 Stunde inkubiert, wobei die Zellen jedesmal wieder gekühlt und pelletisiert wurden. Die in das Kulturmedium abgegebene radioaktive Markierung würde im Überstand gemessen (LKB gamma-Zähler, Pharmacia AB, Uppsala, Schweden). Der Überstand wurde außerdem einer TCA-Ausfällung unterworfen, und die Radioaktivität des Niederschlags wurde gemessen. Das an die Oberfläche gebundene ¹²&sup5;I-C242 wurde durch saures Waschen mit 0,2 M Glycin-HCl- Puffer, pH 1,5, enthaltend 2,5 mg/ml Papain, gewaschen, und die Radioaktivität, die internalisiert wurde, wurde gezählt. Die Menge des Oberflächengebundenen Antikörpers nach jedem bei 37ºC inkubierten Zeitabschnitts wurde durch Subtrahieren des abgegebenen und internalisierten monoklonalen Antikörpers von dem gesamten Oberflächengebundenen monoklonalen Antikörper berechnet. Der Abbau von abgegebenem Antikörper wurde durch TCA-Ausfällung des Überstandes des Mediums gemessen.
Die Ergebnisse sind in der beiliegenden Abbildung Fig. 1 dargestellt, die die Endozytose von ¹²&sup5;IC242 : II in die COLO 205 Zellen zeigt, wobei die Radioaktivität auf der Zelloberfläche ("Sur"), die internalisierte Radioaktivität ("Int"), die abgegebene Radioaktivität ("Res") und die abgebaute abgegebene Radioaktivität ("Deg. Re") als Prozentzahl der gesamten anfänglichen Radioaktivität auf der Zelloberfläche ausgedrückt wird. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß eine mehr als 20%-ige C242 : II Internalisierung innerhalb 1 Stunde erreicht wurde, wenn die prä-inkubierten Zellen bei 37ºC inkubiert wurden. Es traten kleine Mengen säurelöslicher Radioaktivität auf, wenn der Überstand des Mediums durch TCA ausgefällt wurde, was auf eine geringe Fragmentierung der abgegebenen Radioaktivität nach einer 1-stündigen Inkubierung hinweist.

Beispiel 4

Molekulare cDNA-Klonierung, die Teile der leichten und schweren Ketten des monoklonalen Antikörper C242 : II codieren

A. Gesamt-RNA Herstellung

Die Gesamt-RNA der 108 Zellen wurde im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Chirgwin, J. M. et al. (1979; Biochemistry 18, 5294-5299), das von Chomezynksi, P. und Sacchi, N. (1987; Anal. Biochem. 162, 156-159), modifiziert wurde, hergestellt. Kurz zusammengefaßt wurde das Zellpellet in 15 ml kalter denaturierter Lösung, die aus 4 M Guanidiniumthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 7, 0,5% N-Lauroylsarcosin, 0,1 M 2-Mercaptoethanol besteht, gelöst. Nach der Auflösung des Zellmaterials wurden 1,2 ml 2 M Natriumacetat (pH 4,0) zugegeben, und die Mischung wurde mit Phenol- Chloroformisoamylalkohol (250 : 49 : 1) extrahiert. Nach der Zentrifugierung wurde die RNA von der wässrigen Phase durch Zugabe eines gleichen Isopropanolvolumens ausgefällt und bei -20ºC über Nacht inkubiert, um die gesamte RNA auszufällen. Nach der Zentrifugierung und Suspension der RNA wurde die Ausfällung wiederholt und nach einer zusätzlichen Zentrifugierung und Ausfällung betrug die gesamte RNA-Ausbeute 960 ug, gemäß Messungen der Absorption.

8. mRNA-Isolierung

Zur Isolierung der polyadenylierten mRNA aus der obigen Gesamt-RNA- Präparation wurde das PolyATractTMmRNA Isolierungssystem von Promega Corporation, Madison, WisCOnsin, U. S. A. gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet (c. f.: Promega Technical Bulletin, Nr. 090 : 1990). Kurz zusammengefaßt wurden 960 ug der Gesamt-RNA in Wasser gelöst und mit einer biotinylierten Oligo(dT)-Sonde (50 pMol) in 0,4 · SSC (1 · SSC = 8,77 g NaCl, 4,41 g Natriumcitrat pro Liter Wasser bei pH 7,0) wieder verbunden. Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen (Streptavidin MagnesphereTM) wurden zugegeben, und nach einer 1-minütigen Inkubierung wurden die magnetischen Teilchen entfernt und mehrmals mit 0,1 · SSC gewaschen. Die polyadenylierte mRNA wurde von den Kügelchen durch Inkubierung in Wasser unter Erhalt von 5 ug mRNA eluiert.

C. Herstellung der cDNA-Phagezibibliothek in E. coli

Die cDNA wurde von der polyadenylierten mRNA des vorherigen Schrittes im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Gubler U., und Hoffmann. B. J. (1983; Gene 25, 263-269), das für den Vektor Uni-ZAPTM (Stratagene Inc. La Jolla, Kalifornien) modifiziert wurde, um die Klonierung in einer Richtung der doppelsträngigen cDNA zu erlauben, hergestellt. Kurz zusammengefaßt wurden 5 ug polyadenylierte mRNA durch Primieren mit dem Uni-ZAPTM-Linker Primer (56 ng/ml) unter Zugabe von dATP, dGTP, dTTP und 5-Methyl-dCTP auf 0,6 mM und 45 E Moloncy muriner Leukämievirus Reverse Transkriptase umgewandelt. Die Mischung wurde bei 37ºC 1 Stunde inkubiert. DieSynthese des zweiten cDNA-Stranges wurde durch Zugabe von dATP, dGTP, dTTP und dCTP auf eine Endkonzentration von 0,15 mM, 3,2 E RNase H und 6.5 E DNA Polymerase 1 und durch 2,5-stündige Inkubierung bei 16ºC durchgeführt. Die Mischung wurde mit Phenol-Chloroform (1 : 1) extrahiert, und eine Ethanolausfällung wurde durchgeführt. Die Enden der cDNA wurden durch 30-minütige Inkubierung mit 0,16 mM dNTP und 10 E T4 DNA Polymerase bei 37ºC in glatte Enden umgewandelt. Nach der Phenol-Chloroform-Extraktion und der Ethanolausfällung wurde die resultierende cDNA mit den glatten Enden durch Zugabe von 3 Weiss E T4 DNA Ligase, 1 mM ATP und Inkubierung über Nacht bei 8ºC an EcoRI Adaptoren ligiert. Nach der Ligierung wurden die kohäsiven EcoRI-Enden durch Zugabe von 10 E T4 Polynucleotidkinase in der Gegenwart von 1 mM ATP und 30- minütiger Inkubierung bei 37ºC der Kinasereaktion unterworfen. Die resultierende cDNA mit phosphorylierten kohäsiven EcoRI-Enden wurde mit 90 E Xhol verdaut, um ein kohäsives Xhol-Ende der durch den Uni-ZAPTM Linker Primer codierenden Sequenz zu bilden. Die resultierende cDNA wurde anschließend an 1 ug Uni-ZAPW XR EcoRI und Xhol hergestellte Arme in der Gegenwart von 2 Weiss E T4 DNA Ligase, 1 mM ATP und Inkubierung über Nacht bei 12ºC ligiert. Die Ligierungsmischung wurde in Phagenpartikel unter Verwendung des Gigapack 11 Gold® Pack-Extraktes gemäß den Anweisungen des Herstellers in vitro gepackt, und die resultierenden Phagen wurden verwendet, um E. coli PLK-F' zu infizieren. Die resultierende cDNA-Bibliothek 8,5 · 10&sup4; unabhängiger Klone wurde unter Erhalt eines Phagentiters von 7,5 · 10&sup8; pfu/ml einmal amplifiziert. Die resultierende cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von E-coli XL 1-Blau als Wirtsstamm gescreent (c.f. Bullock, W. (1978) Biotechniques 5, 4), wie hiernach beschrieben wird.

D. Herstellung von Hybridisierungssonden

Zur Bestimmung der cDNA-Klone, die die IgGl schwere Kette und kappa Kette des Antikörpers C242 : II codieren, wurden Hybridisierungssonden von der Mausgenom-DNA durch die Polymerasekettenreaktion gemäß Saiki R. H., et al (1988; Science 239, 487-491) hergestellt, die die erste konstante Domäne der schweren Kette, CH1, und die konstante Domäne der kappa Kette, CK, umfassen. Kurz zusammengefaßt wurden die Oligonucleotid-Primerpaare, die mit den 5'- und 3'-Regionen der Exone, die die obigen Immunglobulindomänen codieren, hybridisieren zur Amplifizierung der Mausgenom-DNA verwendet. Nach der Reinigung durch Agarosegelelektrophorese wurden die resultierenden DNA- Sondenfragmente mit 32P durch das wahlweise Primer-Verlängerungsverfahren gemäß Feinberg A. P. und Vogelstein B. (1983; Anal. Biochem 132,6) markiert.

E. Screenen nach den Sequenzen, die die schweren und leichten Ketten von IgG1 codieren und die Einführung in Plasmide

Die cDNA-Bibliothek aus dem obigen Abschnitt C wurde in zwei getrennten Runden jeweils unter Verwendung des Immunglobulins IgG1 und der kappa Sonden aus Abschnitt D. gemäß den von Sambrook J. et al (1989, Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschriebenen Verfahren gescreent. Positivhybridisierende Phagenklone der zwei getrennten Hybridisierungen wurden weiter durch Screenen unter Verwendung der gleichen Sonden, wie in dem anfänglichen Screenen, gereinigt. Positivhybridisierende Phagenklone wurden in E. Coli XL 1-Blau-Kulturen ausgebreitet, und die resultierenden Phagen-Stocks wurden verwendet, um cDNA enthaltende pBluescript SK(-)Plasmide durch Aufschneiden des Phagen herzustellen und im wesentlichen gemäß Short, J. M. et al. (1988; Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600) vervielfältigt.

F. Charakterisierung der Plasmid cDNA der hybridisierenden Kolonien

Die resultierenden cDNA-enthaltenden Plasmide wurden durch Restriktionsenzym-Kartierung gekennzeichnet, und die Inserts-enthaltenden Plasmide der erwarteten Größe wurden der Didesoxy-DNA-Sequenzierung gemäß Sanger F. et al (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) unterworfen. Ein mit der Ig kappa Sonde hybridisierendes Plasmid, das pKGE761 genannt wird, enthielt ein cDNA-Insert, dessen Sequenz einen offenen Leserahmen codiert, der mit den zuvor bekannten Maus kappa-Leichtkettensequenzen sehr homolog ist (c.f. Kabat, E. A. et al (1987) Sequences of Protein of Immunological Interest, 4. Ausgabe, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health). Eine Teil cDNA-Sequenz, die den variablen Bereich der kappa leichten Kette, VK, codiert, und deren translatierte Proteinsequenz sind in Fig. 3 dargestellt. Die drei als CDR1 bis CDR3 bezeichneten CDR-Sequenzen sind durch Unterstreichung angezeigt. Ein Signalpeptid, das dem aminoterminalen Ende des VK-Segmentes vorangestellt ist, ist durch S gekennzeichnet. CK zeigt den konstanten Bereich, der dem carboxyterminalen Ende der VK-Sequenz folgt.
Ein mit der IgGl-Sonde hybridisierendes Plasmid, das pKGE762 bezeichnet wird, enthielt ein cDNA-Insert, dessen Sequenz einen offenen Leserahmen codiert, der mit den zuvor bekannten Maus IgGI-Schwerkettensequenzen sehr homolog ist (c. f. Kabat, E. A., et al. vide supra). Eine Teil cDNA-Sequenz, die den variablen Bereich der IgGI schweren Kette codiert, VH, und deren translatierte Proteinsequenz ist in Fig. 4 dargestellt. Die als CDR1 bis CDR3 bezeichneten CDR-Sequenzen sind durch Unterstreichung gekennzeichnet. Ein Signalpeptid, das dem aminoterminalen Ende des VH-Segmentes vorangestellt ist, ist durch S gekennzeichnet. CH1 zeigt den konstanten Bereich, der dem carboxyterminalen Ende der VH-Sequenz folgt.
SEQUENZLISTE
SEQ ID NO: 1
SEQUENCE TYPE: Protein amino terminal end of C242 antibody kappa chain (light chain) variable region and corresponding cDNA nucleotide sequence.
SEQUENCE LENGTH: 141 amino acid residues 464 base pairs
MOLECULAR TYPE: Amino terminal end of C242 antibody kappa chain (light chain) variable region
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 2
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined by SEQ fD NO 1
SEQUENCE LENGTH: 16 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR1 region of the hypervariable region of the C242 kappa chain (light chain)
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 3
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined by SEQ ID NO 1
SEQUENCE LENGTH: 18 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR1 region of the hypervariable region of the C242 kappa chain.(light cham)
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CElL LINE: C242 HYBRIDOM. EGAGC 90012601
SEQ ID NO: 4
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined by SEQ ID NO 1
SEQUENCE LENGTH: 7 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR2 region of the hypervariable region of the C242 kappa chain (light chain)
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 5
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined by SEQ ID NO 1
SEQUENCE LENGTH: 9 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR2 region of the hypervariable region of the C242 kappa chain (light chain)
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 6
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined by SEQ ID NO 1
SEQUENCE LENGTH: 9 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR3 region of the hypervariable region of the C242
STRANDEONESS: sin (light chain)
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE : C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 7
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined by SEQ ID NO 1
SEQUENCE LENGTH: 11 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR3 region of the hypervariable region of the C242 kappa chain (light chain)
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 8
SEQUENCE TYPE: Protein and corresponding cDNA nucieotide sequence
SEQUENCE LENGTH: 148 amino acid residues and 480 base pairs
MOLECULAR TYPE: Aminoterminal end of C242 IgG1 antibody heavy chain variable region
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID No: 9
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 5 amino acid residues and 480 base pairs
MOLECULAR TYPE: CDR1 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRiDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 10.
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 7 amino acid residues
VIOLECULAR TYPE: CDR1 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 11
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 17 amino acid residues
VIOLECULAR TYPE: CDR2 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
MMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 12
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 19 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR2 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEONESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 13
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 19 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR2 region of the hypervariable region of the 0242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 14
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 21 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR2 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 15
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 16 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR3 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELl LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 16
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 18 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR3 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 17
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 18 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR3 regionofthe hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601
SEQ ID NO: 18
SEQUENCE TYPE: Part of polypeptide defined in SEQ ID NO 8
SEQUENCE LENGTH: 20 amino acid residues
MOLECULAR TYPE: CDR3 region of the hypervariable region of the C242 antibody heavy chain
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE. NAME OF CELL LINE: C242 HYBRIDOM. ECACC 90012601

Claims

1. Antikörper, hergestellt durch die Hybridom-Zelllinie C242 : II mit der ECACC Erkennungsnummer 90012601 oder ein Antikörper, der die gleiche Epitop-Spezifität besitzt.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 zur diagnostischen Verwendung in vivo.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 zur therapeutischen Verwendung.

4. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in fragmentierter Form.

5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der spezifisch an das gleiche Epitop bindet wie ein Antikörper, der in seinen CDR:

Kappa-Kette:

CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr

CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer

CDR3: LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr

Schwere Kette:

CDR1: TyrTyrGlyMetAsn

CDR2: TrplleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly

CDR3: ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal

hat.

6. Verfahren zur Diagnose in vitro, umfassend die Schritte: Kontaktieren einer Probe mit einem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes, enthaltend den monoklonalen Antikörper, der an sein Antigen gebunden ist, ermöglicht und anschließendes Bestimmen des gebildeten Komplexes, wobei die Menge davon mit der Menge des in der Probe vorhandenen Antigens korreliert.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, umfassend eine wässrige Lösung des monoklonalen Antikörpers.

9. Zelllinie, die die Herstellung des Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragmentes davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ermöglicht.

10. Zelllinie nach Anspruch 9, die die Hybridom-Zelllinie C242 : II mit der ECACC Erkennungsnummer 90012601 oder eine künstliche oder spontane Variante davon ist.