AT400577B - Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikörpers und verfahren zum nachweisen von malignen zellen - Google Patents

Description

AT 400 577 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers, der sich an eine Determinantstelle an einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzi-nomzellen, von Human-Brust-Karzinomzellen und/oder von Human-Dickdarm-Karzinomzeilen bindet.

Weiters betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen von malignen Zellen in einer Probe, bei der Verdacht auf das Vorliegen solcher Zellen besteht.

Genauer gesagt ist der erfindungsgemäß hergestellte monoklonale Antikörper immunspezifisch für und/oder immunreaktiv mit einem Proteinantigen, das mit Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom (NSCLC) und bestimmten anderen Humankarzinomen, einschließlich einigen Karzinomen der Brust, des Dickdarms usw., assoziiert ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des neuen monoklonalen Antikörpers ist gekennzeichnet durch a) Vermehren eines Hybridoms, das die identifizierenden Charakteristika von A.T.C.C. Nr. HB 8913 hat und erhalten wurde durch Fusion von (i) einer Antikörper erzeugenden Zelle, die von der Milz eines 'Tieres stammt, das mit in Kulturen gezüchteten Pleuraleffusionszellen immunisiert worden ist, oder

Lungengewebe eines Patienten mit Nicht-Kleinzelien-Lungenkarzinom mit (ii) einer Myelomzelle; und b) Ernten der von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.

Der monoklonale Antikörper ist mit einer Determinanten eines Giycoprotein-Antigens, assoziiert mit NSCLC-Zellen und auch mit anderen Karzinomen, einschließlich Brust-, Dickdarm- und Kleinzellen-Lungen-Karzinomen reaktiv. Er besitzt unterscheidende Charakteristika und Fähigkeiten, welche ihn für klinische diagnostische Zwecke sowohl in vivo als auch in vitro geeignet machen. Außerdem ist er für therapeutische Zwecke geeignet. So kann zum Beispiel der Antikörper ais ein targetselektiver Träger von verschiedenen Agentien verwendet werden, die Antitumorwirkung haben, wie zum Beispiel Chemotherapeutika, Toxine, immunologische Respons-Modifizierer und Radioisotope. Darüber hinaus können die Hybridome, die solchen Antikörper erzeugen, unter Verwendung der Recombinant-DNA-Technologie modifiziert werden, so daß die resultierenden Antikörper antikörperabhängige Zellularcytotoxizität vermitteln können oder cytolytisch zu Tumorzellen in Gegenwart von Komplementkomponenten sein können.

Human-Lungenkarzinom.

Lungenkarzinome sind für die Mehrzahl der Karzinom-Todesfälle beim Menschen verantwortlich und holen die Brustkarzinome ais die häufigste Ursache von Krebstod bei Frauen ein. Diese Krankheit kann in vier histologische Haupttypen unterteilt werden; (1) epidermoider oder schuppiger Typ (30%), (2) Adenokar-zonom-Typ (35%), (3) undifferenzierter Großzellen-Typ (15%) und (4) Kleinzellen-Typ (20%). Der Ausdruck Nicht-Kleinzelien-Lungenkarzinom ("NSCLC") schließt folgende Zelltypen ein: epidermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und große undifferenzierte Karzinomzellen.

Die meisten Lungenkarzinom-Fälle sind durch Chemotherapie und Strahlentherapie nicht heilbar. Kleinzeilen-Lungenkarzinome können auf Chemotherapie und Strahlentherapie durch Verminderung in der Größe ansprechen, aber dies bedeutet keine vollständige Heilung. Vollständige chirurgische Entfernung des Tumors scheint die einzige wirksame Therapie zu sein. Leider haben jedoch weniger als 30% der Lungenkarzinompatienten Tumore, die nach Diagnose vollständig durch Resektion entfernt werden können. Von diesen überleben weniger als ein Drittel fünf Jahre nach der scheinbar vollständigen chirurgischen Entfernung des Tumors. Es besteht daher eine große Nachfrage nach Verfahren, die eine frühzeitigere Diagnose des Lungenkarzinoms und eine bessere Bestimmung des Grades der Karzinomausbreitung möglich machen würden, und nach einer wirksameren Therapie.

Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper, dargestelit durch homogene Antikörpermoleküle, welche sich an eine einzige Moiekülstelle (d.h. ein Epitop) an einem Antigen mit einer spezifischen Bindungs- oder Affinitätskonstanten binden, werden nach drei bekannten Methoden hergestellt.

Monoklonale Antikörper können nach den Hybridom-Techniken von Köhler und Milstein hergestellt werden (1975 Nature 256: 495; 1976, Eur. J. Immunol. 6: 511). Durch Verschmelzen von Antikörper erzeugenden Zellen (Milzlymphocyten) mit Myelomzellen erzeugten Köhler und Milstein Hybridzellen, die immortale Zellstämme hervorrufen, die beides besitzen, die Fähigkeit, Antikörper zu bilden und die Fähigkeit, in Zellkulturen permanent zu wachsen. Die Hybridome scheiden einen einzigen Immunglobulintyp von vorbestimmter Antigenspezifität aus, abhängig von dem Antigen, welchem die Lymphocyten vorher ausgesetzt gewesen sind. 2 ΑΤ 400 577 Β

Alternativ können monoklonale Antikörper durch in vitro Transformation von peripherem Säugetierblut B-Lymphocyten, zum Beispiel mit dem Epstein Barr-Virus (EBV) erzeugt werden. Das Virus macht die Antikörper erzeugenden Lymphocyten immortal. Techniken für solche Transformation sind Stand der Technik (siehe zum Beispiel Steinmetz et al. 1977, Nature 269: 420; Crawford et al., 1983, The Lancet, i: 386).

Schließlich können monoklonale Antikörper durch Anwendung von Techniken erzeugt werden, welche die EBV-Immortalisation und die Zellfusion- oder Hybridom-Technik kombinieren. Cole et al. (1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pp. 77-96) beschreiben Techniken zum Verschmelzen eines Human-Plasmacytom- oder lymphoblastoid-Zellstammfusionspartners mit EBV-trans-formierten Donorlymphocyten, die vorher als ein Zellstamm nachgewiesen worden sind. In einem solchen System sind beide parenteralen Zellstämme immortal. Deshalb muß der Fusionspartner eine geeignete Kennzeichnung zum Zähl-Auswählen gegenüber den parenteralen Stämmen haben, wenn das verschmolzene Hybridom kultiviert wird.

Die resultierenden EBV-Hybridome erzeugen Antikörper mit der Spezifität des verwendeten EBV-Lymphocyten-Zellstammes.

Monoklonale Antikörper können in großen Mengen durch in vitro Zellkultur von bestimmten Hybridom-oder transformierten Zellstämmen gemacht werden. Außerdem resultiert Inokulieren eines Hybridom-Zellstammes in den peritonealen Hohlraum verträglicher Säugetiere, wie Mäuse, in einem Tumor, der hohe Konzentrationen (1 bis 20 mg/ml) des monoklonalen Antikörpers in die Tumoraszites-Flüssigkeit sekretiert. Durch Entfernung der Aszitesflüssigkeit und Reinigen des monoklonalen Antikörpers kann eine einzige Maus genügend Antikörper für die Verwendung in Tausenden von diagnostischen Essays liefern.

Monoklonale Antikörper und Antigene, assoziiert mit Lungenkarzinom

Monoklonale Antikörper für Human-Lungenkarzinom-Antigene sind beschrieben worden von: Sikora et al., 1981, Brit. J. Cancer 43: 696; Cuttita et al., 1981, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 78: 4591; Moody et al., 1981, Science 214: 1246; Minna et al.,1981, In Vitro 17: 1058; Kennel et al., 1981, Cancer Res. 41: 3465; Chem. Abst. 95(15): 1308502; Baylin et al., 1982, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 79: 4650; Carney et al., 1982, Pathobiology Annual 12: 115; Gazdar et al., 1983, Seminars in Oncology 10: 3; Hollinshead et al., 1983, Cancer Detect. Prevent 6: 185; Mulshine et al., 1983, J. Immunol. 131: 497; Huang et al., 1983, Arch. Biochem.Biophys. 220: 318; Saji et al., 1984, Hybridoma 3: 119; Bio. Abst. 79005569; Bosslet et al., Behring. Inst. Mitt. 74: 27; Chem. Abst. AC101(9): 706686; Roset et al., 1984, Cancer Res. 44: 2052; Bio. Ast. 79023605; Princler et al., 1982, Cancer Res. 42: 843; Mazauric et al., 1982, Cancer Res. 42: 150; Braatz et al., 1982, Cancer Res. 42: 849; Sobel et al., 1982, Fed. Proc. 41: 409; Cole et al., 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pp. 77-96; und Varki et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc. p. 207.

Die US-PS en 4 737 579, 4 935 495, 4 906 562, 4 873 188 und die GB-PS 2 182 949 offenbaren bestimmte monoklonale Antikörper gegen Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom.

Monoklonale Antikörper können für Verfahren verwendet werden, die eine frühere Diagnose von Lungenkarzinom und eine bessere Definition der Ausbreitung des Karzinoms möglich machen würden und die auch wirksamere Methoden zur Therapie von Lungenkarzinom ermöglichen würden. Ein Erfordernis ist jedoch,Antikörper für Antigene zu finden, die sich in Lungenkarzinomen schneller zu erkennen geben als in normal reifen Geweben. Im Hinblick auf die bekannte Heterogenität von Tumorzellenpopulationen, die Anwesenheit von verschiedenen Determinanten in dem gleichen Antigenmolekül, die erwarteten Unterschiede zwischen Antigenen mit Bezug auf ihre Stabilität als diagnostische Anzeiger und therapeutische Targets und die verschiedenen biologischen Charakteristiken von verschiedenen Antikörpern zum gleichen Antigen können eine Anzahl von verschiedenen Antikörpern für eine Anzahl von verschiedenen Antigenen notwendig machen.

Wie eingangs erwähnt, bezieht sich die Erfindung auf eine neue Klasse von monoklonalen Antikörpern, bezeichnet mit L20, die für eine Determinantstelle an einem Giycoprotein-Antigen, assoziiert mit Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom (NSCLC)-Zellen spezifisch ist. Der Ausdruck "NSCLC-Zellen" umfaßt epidermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und undifferenzierte Großzellen-Karzinomzellen. Die Determinantstelle kann auch an Antigenen von anderen Karzinomen, zum Beispiel einigen Karzinomen der Brust und des Dickdarms und Kleinzellen-Lungenkarzinom gefunden werden. So wird sich der neue Antikörper auch an Zellen von anderen Karzinomen binden und für die Diagnose und Therapie von allen anderen Tumoren geeignet sein, die das Antigen auspressen, das durch den Antikörper L20 identifiziert wird. Der monoklonale Antikörper bindet sich in einem viel geringeren Grade an normal gereifte Zellen als an Tumorzellen. Der Ausdruck "bindet sich in viel geringerem Grade" bedeutet, daß die Bindung überhaupt 3

AT 400 577 B nicht nachweisbar sein wird oder nur als eine sehr schwache Färbung, wenn immunhistologische Techniken angewendet werden. So hat der Antikörper einen hohen Spezifitätsgrad für Antigencharakteristik von NSCLC und bestimmten anderen Karzinomen.

Durch den Antikörper L20 wird das neue Antigen L20 identifizient, und die Klasse von Antikörpern·, die daran binden, sind immunspezifisch für oder immunreaktiv mit diesem Antigen. Es ist möglich, das gereinigte oder geklonte Antigens L20 als eine Vakzine zur Immunisierung gegen bestimmte Karzinome zu verhenden.

Die Erfindung bezieht sich auch auf bestimmte Diagnoseverfahren, die den erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper verwenden. Der Antikörper kann zum Beispiel in Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von dem bösartigen Zustand in Human-Lungengewebe und anderen Humangeweben verwendet werden. Die Verfahren schließen die Prüfung von Gewebe auf die Anwesenheit eines Antigens ein, das die Charakteristiken eines Glycoproteins, 110 000 Dalton, definiert durch den Antikörper L20 hat. Zum Beispiel kann das Gewebe mit einem Antikörper in Kontakt gebracht werden, der eine Determinantstelle an einem zellassoziierten Antigen definiert, welches die Charakteristika des durch den Antikörper L20 bestimmten Antigens, eine funktionale Äquivalenz oder ein Fragment dieses Antikörpers hat und irgendwelche Zwischenwirkungen des Antikörpers und der antigenen Determinanten werden nachgewiesen. Ein solches Verfahren schließt die Bestimmung der Anwesenheit von NSCLC-Zellen in einer Probe, bei der solche Zellen vermutet werden, ein. Die Probe wird mit dem monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der in der Lage ist, solche Zellen von anderen Zelltypen, die in der Probe vorhanden sein können, zu unterscheiden. Der Kontakt wird unter Bedingungen zur Bindung des Antikörpers an solche Zellen ausgeführt. Nach dem Kontakt wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bindung des Antikörpers an die Zellen in der Probe bestimmt. Diese Bindung wird mit der Anwesenheit oder dem Fehlen von NSCLC-Zellen in der Probe in Verbindung gebracht. Im allgemeinen wird die Probe mit einem markierten spezifischen Bindungspartner des monoklonalen Antikörpers in Kontakt gebracht. Diese Markierung ist in der Lage, ein nachweisbares Signal zu erzeugen.

Ein anderes diagnostisches Verfahren schließt die in vivo Lokalisation eines Tumors durch Verabreichen eines neuen gereinigten Antikörpers oder Antikörper-Bruchstücks, markiert mit einem Agens, welches ein nachweisbares Signal gibt, an einen Patienten ein. Die Lokalisation wird dann unter Anwendung externer Szintographie, Emissionstomographie oder Kernstrahlungsabtastung nachgewiesen. Dieses Verfahren kann auch bessere Möglichkeiten bieten, Patienten hinsichtlich des Ausmaßes der Krankheit einzustufen und Änderungen in Erwiderung auf Therapie zu überwachen. Möglich sind auch therapeutische Anwendungen ein, da der Antikörper L20 und ähnliche Antikörper mit dem Antigen L20, das in hohen Konzentrationen an der Tumorzelloberfläche ausgepreßt wird, reagieren können. Die Antikörper können daher als Träger verschiedener Agenzien verwendet werden, die Antitumorwirkung haben, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Chemotherapeutika, Toxine, Immunantwort-Modifikatoren und Radioisotope.

Darüber hinaus kann der Antikörper L20 so modifiziert werden, daß er antikörperabhängige Zellularcy-totoxizität (ADCC) vermitteln kann, d.h., daß er NSCLC-Zellen in Gegenwart von Human-Lymphocyten oder Makrophagen töten kann oder daß er cytolytisch gegenüber Tumorzellen in Gegenwart des Human-Komplements wird. Eine derartige Modifikation kann zum Beispiel durch in neuerer Zeit entwickelte Techniken zur Erzeugung von "schimärischen Antikörpern" durchgeführt werden. Demgemäß werden Gencodierung für den variablen Bereich des Antikörper-Moleküls L20 mit Humangencodierung für den fc-Bereich eines Antikörpers mit geeigneter biologischer Aktivität (wie der Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln) zusammengefügt. Neue Antikörper, deren Herkunft die Maus oder der Mensch ist, können auch zu dem Antigen L20 mit den geeigneten biologischen Funktionen gemacht werden.

Verfahren zur Erzeugung von monoklonalem Antikörper gegen NSCLC

Monoklonale Antikörper gegen Human-NSCLC und bestimmte andere Humankarzinome können durch Hybridom-Fusionstechniken, durch EBV-Transformation von Human-Antikörper produzierenden Lymphocy-ten oder durch Techniken, die Zellfusion und EBV-Immortalisationstechnologien vereinigen, hergestellt werden.

Fusionstechniken

Es ist möglich, monoklonale Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung der Hybridom-Zellfusionstech-nik herzustellen. So werden zum Beispiel Human-Lungenkarzinomzellen von in Kulturen gezüchteten 4

AT 400 577 B

Pleuraleffusionszellen von explantierten Human-NSCLC-Tumoren oder Zellen von einer normalen Fetallunge oder Lysate von solchen Zellen als das Immunogen verwendet. In einem Erläuterungsbeispiel wurden explantierte Zellen von einem NSCLC-Human-Lungenadenokarzinom Nr. 3082 als das Immunogen verwendet. Die Zeilen wurden zum Beispiel einer Maus injiziert. Nach ausreichender Zeit wurde die Maus geopfert 5 und es wurden somatische Antikörper produzierende Lymphocyten erhalten. Antikörper produzierende Zellen können von Lymphknoten, Milz und peripherem Blut von vorbereiteten Tieren stammen. Milzzellen werden bevorzugt. Mäuselymphocyten geben einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen mit dem weiter unten beschriebenen Maus-Myelom. Es ist auch möglich, somatische Zellen von Ratten, Kaninchen und Fröschen zu verwenden. Die Milzzellenchromosomen, die gewünschte Immunglobuline codieren, io werden durch Fusion der Milzzellen mit Myelomzellen immortalisiert, im allgemeinen in Gegenwart von Polyethylenglycol. Es können verschiedene Myelomzellstämme zur Erzeugung von verschmolzenen oder vereinigten Zellhybriden verwendet werden, einschließlich NSI-Ag4/1, X63-Ag8, MPC11-45. 6TG1.7, X63-Ag.653, Sp2/0-Ag14, Fo, und S194/5XXO.Bu.1, von Mäusen stammend, und 210.RCY3.Ag1.2.3, U-226AR und GM1500GTGAL2 von Ratten stammend (Hammerling, et al., 1981, "Monoclonal Antibodies and T-cell 15 hybridomas" in Research Monographs in Immunology, Vol. 3, J.L. Turk, ed; Elsevier/North Holland Biomedical Press. New York). In einem Erläuterungsbeispiel wurden NS1-Zellen verwendet (siehe Abschnitt 5.1). Die resultierenden Zellen, welche die vereinigten Hybridome einschließen, werden in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium, gezüchtet und die überlebenden Zellen werden in solchem Medium unter Anwendung begrenzender Verdünnungsbedingungen gezüchtet. Die Zellen werden in einem geeigneten 20 Behälter, zum Beispiel in Mikroliter-Behältern, gezüchtet und der Überstand wird abgesiebt für die Gewinnung monoklonaler Antikörper der gewünschten Spezifität.

Es gibt verschiedene Methoden für die Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper, um sie von anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen zu befreien. 25 EBV-Transformationstechniken

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden monoklonale Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung von EBV-Transformationstechniken hergestellt. So werden zum Beispiel Lymphocyten von peripherem Blut, Tumor-dränierenden Lymphknoten, Knochenmarkaspiraten, Tumoren oder 30 Pleuraleffusionen von Patienten mit NSCLC unter Anwendung von EBV immortalisiert nach den Methoden von Cole et al., 1984, Cancer Rs. 44: 2750. Wie von Cole et al. bemerkt, sind für Tumorantigene spezifische B-Lymphocyten bei Lungenkarzinompatienten selten. Daher ist es besonders wichtig, die Zahl der Antikörper erzeugenden Lymphocyten durch vorselektierende Lymphocyten, die Antikörper gegen das relevante Antigen erzeugen, zu erhöhen. So schließen die EBV-Transformationstechniken zwei Stufen ein: (1) 35 Anreicherung von Zellen mit Rezeptoren für das gegebene Antigen, d.h. das Antigen L20, und (2) Immortalisation solcher Zellen durch Infektion mit EBV. ' ' . EBV-Hybridom-Techniken 40 Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden monoklonale Antikörper gegen NSCLC durch Verwendung einer Kombination von EBV-Transformation und Hybridom-Fusionstechnik hergestellt, wie beschrieben bei Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.; pp. 77-96. Zum Beispiel wird ein Myelom-Zellstamm mit Donorlymphocyten von NSCLC-Patienten, die vorher durch EBV transformiert und als Zellstamm, der in Kultur gezüchtet und entwickelt werden kann, nachge-45 wiesen worden ist, vereinigt. Um in der Lage zu sein, die resultierenden EBV-Hybridom-Fusionszellstämme zu selektieren, ist es notwendig, daß der Fusionspartner dominant geeignet selektierbare Markierungen besitzt, wie Ouabain-oder Neomycin-Resistenz, so daß sich Parentalzellen nicht entwickeln, wenn die vereinigten Hybridomzellstämme gezüchtet werden. Geeignete Zellstämme sind der Thioguamin-resistente GM-150, der Ouabain-resistente Lymphoblastoide Zellstamm KR-4, beschrieben bei Cole et al. weiter oben. 50 Die resultierenden Hybridome werden nach üblichen Techniken geklont.

Zellvermehrung und Antikörpererzeugung

Sobald die gewünschten verschmolzenen Zellhybride oder transformierten Zellstämme selektiert und in 55 individuelle Antikörper erzeugende Zeilstämme geklont worden sind, kann jeder Zellstamm nach einer von zwei üblichen Methoden vermehrt werden. Der einzelne Zellstamm kann in vitro vermehrt werden, zum Beispiel in Laborkulturgefäßen, und das Kulturmedium, das hohe Konzentrationen eines einzigen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthält, kann durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren geerntet 5

AT 400 577 B werden. Alternativ kann die Ausbeute an monoklonalem Antikörper erhöht werden durch Injizieren einer Probe des Hybridoms in ein gewebeverträgliches Tier des Typs, der verwendet worden ist, um die somatischen und Myeiomzellen für die ursprüngliche Fusion zu liefern. Tumore, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sekretieren, der durch das vereinigte Zellhybrid erzeugt worden ist, entwickelt sich in dem Tier. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie Aszitesflüssigkeit oder Serum, liefern monoklonale Antikörper in hohen Konzentrationen. Wie von Cole et al. in der weiter oben angegebenen Literaturstell'e diskutiert, ist es bei Verwendung von Humanhybridomen oder EBV-Hybridomen nicht nötig, Rejektion des in die Tiere, wie Mäusen, injizierte Xenograft zu vermeiden. Immundefiziente oder kahle Mäuse können verwendet werden oder das Hybridom kann passiert werden zuerst durch bestrahlte kahle Mäuse als ein fester subkutaner Tumor, in vitro gezüchtet und dann intraperitoneal in pristane vorbereitete bestrahlte kahle Mäuse injiziert, welche Aszitestumore entwickeln, die große Mengen der spezifischen Human-monoklonalen Antikörper sekretieren (siehe Cole et al. weiter oben).

Monoklonale Antikörper

Der erfindungsgemäß hergestellte Antikörper verbindet sich mit einem neuen Zelloberflächen-Glycopro-tein-Antigen, bezeichnet mit Antigen L20, charakteristisch für Human-NSCLC-Zellen und Zellen von bestimmten anderen Humankarzinomen (siehe Abschnitt 4.2.1.). Das Glycoprotein-Antigen hat ein Molekulargewicht von etwa 110.000 Dalton, wenn es der Immunpräzipitation bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel unterworfen wird (siehe Abschnitt 5.3). Digerieren des Antigens L20 mit Glycanase zeigte, daß es N-verknüpfte Oligosaccharidketten enthält.

Als ein Erläuterungsbeispiel wird der Antikörper L20 durch das murine (zu Mäusen gehörige) Hybridom erzeugt. Der Antikörper L20 ist vom IgGI-Isotyp und hat eine Aktivität von etwa 3 x 108. Es bindet sich nicht nachweisbar an normale Zellen, wie Fibroblaste, Endothelzellen oder Epithelzellen in den wichtigsten Organen. Mit "bindet sich nicht nachweisbar" ist gemeint, daß nur eine sehr schwache Färbung oder überhaupt keine Färbung in immunhistologischen Tests nachweisbar ist.

Im Rahmen der Erfindung hergestellt werden auch geeignete Bindungsfragmente von dem vorstehenden monoklonalen Antikörper, wie Fab, F(ab')2, Fv-Fragmente usw. Die Antikörperfragmente werden nach üblichen Techniken erhalten. So können zum Beispiel geeignete Bindungsfragmente durch-Peptidase-Digestion des Antikörpers unter Verwendung von Papain oder Pepsin hergestellt werden. Ähnliche Antikörper, einschließlich Antikörper verschiedener Isotypen, verschiedener Affinität und neuer biologischer Funktionen, wie die Fähigkeit, Tumorzellen in Gegenwart von Komplement- oder Effektorzellen, wie Lymphocyten oder Makrophage, zu töten, können ebenfalls im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden. Während das weiter vorne gebrachte spezifische Beispiel für den neuen Antikörper auf einen Antikörper gerichtet ist, der an eine spezifische Determinantstelle an dem jeweiligen Antigen bindet, und von der Unterklasse IgGI einer murinen (murine = zu den Mäusen gehörig) Quelle ist, ist dies nicht als eine Beschränkung hierauf aufzufassen. Die Herstellung der vorstehend beschriebenen Antikörper und von Antikörpern mit funktionaler Äquivalenz mit dem oben beschriebenen Antikörper ist von Rahmen die Erfindung umfaßt, gleichgültig, ob die Antikörper von einer murinen Quelle stammen oder von anderen Säugetierquellen, einschließlich den Menschen oder anderen Quellen oder Kombinationen davon, sowie Antikörper anderer Isotypen sind. Der Ausdruck "funktionale Äquivalenz" bedeutet, daß der Antikörper in der Lage ist, sich an die oben beschriebene Determinantstelle zu binden und in der Lage ist, mit einem bestimmten erfindungsgemäß hergestellten Antikörper um eine solche Stelle zu konkurrieren. Das heißt, wenn ein solcher Antikörper mit einer Probe zusammengebracht wird, die eine Zelle oder ein Zellfragment mit einer solchen Determinantstelle enthält, wird er sich an die Determinantstelle binden und einen erfindungsgemäß hergestellt Antikörper am Binden an der Stelle hindern. Da ferner das erwähnte Antigen mehr als eine Determinantstelle haben kann, schließt die Erfindung die herstellung monoklonaler Antikörper ein, die andere Determinantstellen als die durch den vorstehend beschriebenen monoklonalen Antikörper definierte Determinantstelle definieren und die durch in der einschlägigen Technik bekannten aufeinanderfolgenden Immunpräzipitations-Essays identifiziert werden können.

Die Erfindung schließt auch die herstellung von Antikörpern ein, die in Gegenwirkung auf Antigen-Bindungsstellen hergestellt sind, oder Idiotypen von dem Antikörper L20, weil solche anti-idiotypischen Antikörper zum Analysieren der Immunantwort auf Tumorantigene für Diagnosezwecke zum Einleiten von Immunantworten für therapeutische oder profilaktische Zwecke verwendet werden können (Nepom et al., 1984, Proc. Nat’1 Acad. Sei. 81: 2664). 6

AT 400 577 B

Antigen L20, erkannt durch monoklonale Antikörper

Das durch die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper erkannte Antigen, ist ein neues Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen, charakteristisch für NSCLC-Zellen und bestimmte andere Karzinome, einschließlich Brust-, Dickdarm- und Kleinzellen-Lungen-Karzinome. Das Antigeri hat ein Molekulargewicht von etwa 110.000 Dalton.

Die aminoterminaie Aminosäuresequenz des neuen Glycoprotein-Antigens ist wie folgt: 15 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-v-A-L-V-G-T-D-A-X-L in welcher X für eine Aminosäure steht, die bis jetzt noch nicht identifiziert ist, und die übrigen Buchstaben die für die Aminosäuren gebräuchlichen Abkürzungen sind. Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen, die in der gegenwärtigen Proteindatenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert sind, zeigt keine signifikante Sequenzübereinstimmung mit irgendwelchen anderen bekannten Sequenzen.

Verwendung der monoklonalen Antikörper und des Antigens L20

Diagnostische Anwendungen

Die erfindungsgemäß hergestellte monoklonalen Antikörper können als Sonden zum Nachweis diskreter Antigene in Human-NSCLC und anderen Tumoren verwendet werden. Ein Verfahren nach der Erfindung umfaßt die Bestimmung der Anwesenheit einer bösartigen Kondition in Lungengewebe und anderen Humangeweben durch Prüfung des Gewebes auf das Auspressen oder das Fehlen des Auspressens eines Glycoprotein-Antigens mit den Charakteristiken von dem Antigen L20. Der Ausdruck "mit den Charakteristiken von" bedeutet, daß das Antigen mit einem Antikörper reaktiv ist, welcher das Antigen L20 erkennt. Das Auspressen oder das Fehlen des Auspressens dieses Antigens kann eine klinisch ausnutzbare Information geben, die mit Standard histopathologischen Techniken nicht verfügbar ist.

Die neuen monoklonalen Antikörper können zum Beispiel verwendet werden zum Nachweis von Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen in histologischen und cytologischen Proben. Bei Verwendung der Im-munperoxidase-Färbetechnik, beschrieben in Abschnitt 5.4., zeigen herausgeschnittene Gewebsproben von Adenokarzinom, Epidermoid- und Kleinzellen-karzinom der Lunge intensive positive Färbung. Normale Lunge, Milz, Brust, Dickdarm, Niere, Leber, Gehirn, Herz, Haut, Schilddrüse, Hoden, Vagina und normale Lymphocyten waren negativ.

Eine andere wichtige diagnostische in vitro Anwendung der erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper ist die Bewertung von anderen Karzinomen als dem NSCLC. Der Antikörper ist zum Nachweisen des Epitops in Karzinomen der Brust, des Dickdarms und in Kleinzellen-Lungenkarzinomen verwendet worden. Normale Proben dieser Gewebe preßten die Determinante nicht aus. So ist der monoklonale Antikörper zum Nachweis einer antigenen Determinante in diesen Karzinomen, welche tumorassoziiert ist, geeignet. Daher ist der monoklonale Antikörper ein geeignetes diagnostisches Reagens für Brust- und Dickdarm-Karzinome und für Kleinzellen-Lungenkarzinom.

Alternativ können Immunfluoreszenztechniken zur Prüfung von Humangewebsproben mit den erfindungsgemäß hergestellte monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Objektträger mit kryostatischen Sektionen von gefrorenen unfixierten Biopsie-Geweben oder herausgeschnittenen Tumorproben oder cytologischen Abstrichen werden an der Luft getrocknet und mit dem monoklonalen Antikörper in einer befeuchteten Kammer von Raumtemperatur bebrütet. Die cytologischen Abstriche schließen abblätternde Zellproben ein. Der Ausdruck "abblätternd" bedeutet, daß die Probe isolierte Zellen oder Zellklumpen, die durch Abschaben oder Abwaschen der Gewebsoberfläche erhalten worden sind, einschließt, wobei die Zellen einzeln oder in Schuppen oder Schichten entfernt werden. Die abblätternde Zellprobe ist von herausgeschnittenen Geweben und durch Biopsie erhaltenen zu unterscheiden. Das Verfahren kann zum Nachweis einer bösartigen Kondition in abblätternden Zellproben der Lunge, wie Sputumproben, der Brochien, dem Gastrointestinaltrakt, einschließlich oraler Pharynx, Mund, einem Halsabstrich usw. Verwendung finden.

Nach dem Trocknen werden die Objektträger mit einer Zubereitung von Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper beschichtet, gewöhnlich mit irgendeinem Typ von Antimaus-Immunglobulin, wenn der verwendete monoklonale Antikörper von der Fusion von Mausmilz-Lymphocyten und einem Maus-Myelomstamm stammt. Dieses Antimaus-Immunglobulin wird unter Anwendung bekannter Techniken mit 7

AT 400 577 B einer Verbindung, wie Rhodamin oder Fiuorescein-Isothiocyanat, die bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert, konjugiert. Das Farbmuster und die Intensität der Probe werden dann durch Fluoreszenzlichtmikroskopie bestimmt und wenn gewünscht, fotografisch festgehalten.

Die vorstehende Beschreibung ist in erster Linie auf die Vewendung der erfindungsgemäß hergestellte Antikörper bei Immunofluoreszenztechniken gerichtet. Die neuen Antikörper können jedoch in den meisten Essays verwendet werden, die Antigen-Antikörper-Reaktionen einschließen. Die Essays können homogen oder heterogen sein. In einem homogenen Essay kann die Probe ein gelystes und zur Entfernung von Resten geklärtes Gewebe sein. Die immunologische Reaktion umfaßt gewöhnlich den spezifischen Antikörper, eine markierte Analysierkomponente und die interessierende Probe. Das Signal, das von der Markierung kommt, wird nach der Bindung des Antikörpers an die markierte Analysierkomponente (analyte) direkt oder indirekt modifiziert. Beides, die immunologische Reaktion und der Nachweis des Grades derselben werden in einer homogenen Lösung vorgenommen. Immunochemische Markierungen, die verwendet werden können, schließen freie Radikale, Flureszenzfarbstoffe, Enzyme, Bakteriophage, Coenzyme und dergleichen ein.

Bei einem heterogenen Essay-Versuch sind die Reagenzien gewöhnlich die Probe, der spezifische Antikörper und ein Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals. Der monoklonale Antikörper ist gewöhnlich als eine Schicht auf einen festen Träger oder einer festen Phase aufgebracht. Die in flüssiger Phase befindliche Probe wird dann mit dem Antikörper in der festen Phase in Kontakt gebracht. Der Festphasen-Träger wird dann von der flüssigen Phase getrennt und entweder die feste Phase oder die flüssige Phase auf ein nachweisbares Signal hin geprüft, wobei Mittel zur Erzeugung eines solchen Signals verwendet werden. Das Signal zeigt die Anwesenheit der analytischen Komponente in der Probe an. Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals sind zum Beispiel die Verwendung von radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Verbindungen, Enzymen usw. Beispiele für heterogene Immunessays sind der Radioimmunessay, Immunfluoreszenzverfahren, enzymverknüpfte Immungessays und dergleichen. Über eine detailliertere Besprechung der vorstehenden Immunassaytechniken siehe: "Enzyme-Immuno-assay" von Edward T. Maggio, 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida; US-PS en 3 690 834, 3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345 und 4 098 876. Diese Liste ist nicht vollständig.

Die neuen Antikörper können auch für in vivo diagnostische Anwendungen herangezogen werden. Zum Beispiel können Antikörper oder Fragmente, hergestellt aus Antikörpern, wie Fab und F(ab’)2-Fragmente zur Darstellung von Tumoren verwendet werden, einschließlich metastabiler Abscheidungen in Humanpatienten mit NSCLC analog der Art und Weise wie es Larson et al. für bösartiges Melanom beschrieben hat: 1983, J. Nucl. Med. 24: 123, und 1983, J. Clin. Invest. 72: 2101. Der gereinigte Antikörper oder die Fragmente davon werden mit einem Agens markiert, das ein nachweisbares Signal gibt, zum Beispiel mit einem Radioisotop, wie 1311 und in einem geeigneten -Träger, zum Beispiel intravenös einem Patienten eingegeben. Die Lokalisation des tumorgebundenen Antikörpers wird nachgewiesen durch externe Szinto-graphie, Emissionstomographie oder Kernstrahlen-Scannen unter Verwendung von zum Beispiel einer Gamma-Kamera.

Therapeutische Anwendungen

Die neuen Antikörper können auch therapeutisch verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper können in Verbindung mit einem breiten Spektrum von pharmazeutischen und cytotoxischen Mitteln verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Antikörper gebunden werden an ein Toxin zur Bildung eines Immuntoxins (Jansen et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 185) oder an ein radioaktives Material, z.B. 125J, 13,J usw. (Order, 1984, Compr. Ther. 10: 9; Larson et al., 1983, J. Clin. Invest 72: 2101; Carrasquillo et al., 1984, Cancer Treatment Reports, 68: 317) oder an ein Arzneimittel (Rowland et al., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 19: 1), um ein Radiopharmazeutikum oder Pharmazeutikum zu bilden. Konjugierte Antikörper können Patienten verabreicht werden, um die tumoriziden Effekte durch die cytotoxische Wirkung des chemotherapeutischen Mittels, das an den Tumor abgegeben wird und auf der Bindungsaffinität des Antikörperteils basiert, zu erhöhen.

Sogenannte "schimärische Antikörper"-Moleküle des neuen Antikörpers können hergestellt werden, die eine Maus-Antigen-Bindungsdomäne mit Humandomänen mit konstantem Teil (mouse antigen-binding domain with human constant region domains) enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 81:6851; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452). Dieser Versuch kann benutzt werden, um neue Antikörpermoleküle mit den gewünschten Wirkfunktionen aufzubauen, wie mit der Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln (Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604). 8

AT 400 577 B

Eine andere therapeutische Anwendung der neuen monoklonalen Antikörper ist die Herstellung von anti-idiotypischen Antikörpern unter Verwendung des Antikörpers L20 als dem Immunogen (siehe zum Beispiel Nepom et al., 1984, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA, 81: 2864; Lee et al:, 1985, Proc. Nat'1 Acad. Sei 82: 6286). 5 Ein attraktiver Aspekt der Erfindung ist, daß die Antikörper mit anderen Antikörpern auf NSCLC und andere Tumore kombiniert werden kann, wie offenbart in den US-PS en 4 737 579, 4 935 495 und 4 873 188. Die Kombination ist zum Nachweis der oben erwähnten Typen von Nichtkleinzellen-Lungenkarzinomen, nämlich undifferenziertem Großzellen-Lungenkarzinom, Adenokarzinom und Epidermoidkarzinom geeignet.

Die neuen monoklonalen Antikörper definieren auch Determinantstellen an einem Antigen, das mit io anderen Karzinomen assoziiert ist, wie Brustkarzinom, Dickdarmkarzinomen und KleinzeJIen-Lungenkarzi-nom (siehe Abschnitt 5. Tabelle 1). Folglich können die neuen Antikörper in therapeutischen Verfahren und therapeutischen Produkten, die auf solche Karzinome gerichtet sind, Verwendung finden.

Das neue Antigen, mit Antigen L20 bezeichnet, kann auch therapeutisch verwendet werden. Das ' Antigen kann aus Tumoren herausgewaschen oder nach der DNA-Rekombinant-Technologie erzeugt 15 werden (US-PS 5 141 742 und hier durch den Hinweis eingearbeitet). Die Gencodierung für das Antigen L20 kann nach Verfahren kloniert werden, bei welchen zuerst das mRNA des Antigens L20 angereichert wird. Bei einem solchen Verfahren können Polysome (bestehend aus mRNA, Ribosome und naszierenden Polypeptidketten) gereinigt werden durch Immunaffinitätschromatographie mit einem Antikörper, der die antigenische Determinante von L20 an der naszierenden Kette erkennt. Das mRNA wird durch Immunpräzi-20 pitation mit zum Beispiel dem Antikörper L20 isoliert und das cDNA wird in einem geeigneten Expressionsvektor geklont.

Alternativ kann der Antikörper L20 oder das Antiserum zum Antigen L20 verwendet werden "to screen a cDNA library" unter Verwendung eines Expressionsvektors. Das gereinigte oder geklonte Antigen L20 kann allein als ein Immunogen oder zusammen mit einem geeigneten immunologischen Adjuvant verabreicht 25 werden. Alternativ kann die Gencodierung für das Antigen in das Gen eines Virus .eingesetzt werden, zum Beispiel in das Vakzinevirus, um ein Rekombinant-DNA-Produkt zu erzeugen, das als Immunogen verwendet werden kann (US-PS 5 141 742).

Diagnostik-Kits (Diagnostik-Reagenssätze) 30

Es besteht die möglichkeit der Erstellung von Diagnostik-Kits zur Ausführung der vorstehend offenbarten Verfahren. Nach einer Ausführungsform'enthält das Diagnostik-Kit (a) einen monoklonalen Antikörper, der vorstehend genauer beschrieben ist, und (b) ein Konjugat eines spezifischen Bindungspartners für den monoklonalen Antikörper und eine Markierung, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen. 35 Die Reagenzien können auch Hilfsagerizien einschließen, wie.Puffer und Proteinetabilisierungsmittel, zum Beispiel Polysaccharide und dergleichen. Das Diagnostik-Kit kann ferner, wenn nötig, andere Komponenten des signalerzeugenden Systems enthalten, einschließlich Mittel zur Herabsetzung der Hintergrundinterferenz, Kontrollreagenzien, ein Gerät zur Durchführung eines Tests usw. Bei einer anderen Ausführungsform enthält das Diagnostik-Kit ein Konjugat eines monoklonalen Antikörpers nach der Erfindung und eine 40 Markierung für die Erzeugung eines nachweisbaren Signals. Hilfsmittel, wie vorstehend angegeben, können ebenfalls vorliegen.

Beispiele 45 Die Erfindung wird nun an Beispielen näher beschrieben, auf die die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist. 1. Herstellung von monoklonalen Antikörpern so Monoklonale Antikörper wurden unter Anwendung der HybridomFusionstechniken, beschrieben von Yeh et al., 1979, Int. J. Cancer 29: 299, hergestellt. Eine drei Monate alte Balb/c-Maus wurde unter Verwendung explantierter gezüchteter Zellen von einem Human-Adenokarzinom der Lunge, bezeichnet mit 3082, als dem Immunogen immunisiert. Die Maus erhielt vier intraperitoneale Injektionen von etwa 107 Zellen. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde ihr die Milz entfernt, in Kulturmedium suspendiert und mit NS1-55 Maus-Myelomzellen durch Fusion vereinigt (Köhler und Milstein, o.a.). Die Mischung wurde geimpft, um Kulturen niedriger Dichte zu bilden, die aus einzelnen durch Fusion vereinigten Zellen entstanden sind (Klone). 9

AT 400 577 B Überstände von Hybridzellen wurden gesichtet auf (screened for) direkte Bindungsaktivität an Lungenkarzinom-Zellstämmen unter Anwendung sowohl eines Elisa-Essays, als auch eines autoradiographischen Essays mit 125J-markiertem Protein A (Brown et al., 1979, J. Immunol. Meth., 31: 201). Extrakte von Zellmembranen von dem Tumor, verwendet für Immunisierung, wurden hergestellt unter Anwendung eines 5 Verfahrens, modifiziert von Colcher et al., 1981, Cancer Res. 42: 1451; Yeh et al., o.a. Gewebe wurden mit PBS gewaschen und Zellen von intakten Tumoren wurden durch Pressen durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl suspendiert. Danach wurde 1 mM NaHC03, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltend (Calbio-chem-Behring Corp., San Diego, CA) zugegeben und das Material auf Eis mit 50 Schlägen des Stößels B eines Dounce-Homogenisators homogenisiert. Nach 15 Minuten langem Zentrifugieren bei 27.000 x g wurde io der überstand entfernt, das Pellet in PBS resuspendiert, 1 Minute beschallt und bei -70°C gelagert.

Hybridome, die Antikörper erzeugen, welche an die Zellmembranextrakte binden, wurden geklont, in vitro expandiert und auf Antikörper-Spezifität getestet. Die Hybridome, die Antikörper von ersichtlicher Spezifität auf Human-Lungenkarzinom erzeugen, wurden reklont, expandiert und in mit Pristan vorbehandelte, drei Monate alte Balb/c-Mäuse injiziert, wo sie als Aszitestumore wuchsen. 15 Nach diesem Verfahren wurde der Hybridom-Zellstamm L20 erhalten, geklont und Mäusen injiziert, um einen Aszites-Tumor zu entwickeln. Antikörper, in den Aszites-Tumor sekretiert, wurde an Protein A Separose (Ey et al., 1978, Immunochemistry, 15: 429) oder durch Gelfiltration in Sephacryl $-300 gereinigt. Der gereinigte Antikörper wurde für eine weitere Charakterisierung verwendet. 20 2. Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers L20 2.1 Nachweisen und Binden von L20 an gezüchteten Zellen

Die subzellulare Lokalisation von Antigen wurde bestimmt durch Messung der Antikörperbindung an 25 Zellen vor und nach der Permeabiiisation mit nicht-ionischem Detergens. Die Antikörperbindungen an die Zelloberfläche von intakten gezüchteten Zellen wurde identifiziert entweder durch direkte Bindungsessays mit 125J-markiertem Antikörper (Brown et al., 1981, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA, 78: 539) oder durch indirekte Fluoreszenz unter Verwendung des fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS) II. Antikörperbindungen an intrazellulare Lagen wurden bestimmt durch direkte Bindung von mit 125J-markiertem Antikörper 30 an Zellen, Fixierung mit Paraformaldehyd und anschließender Permeabilisierung mit dem nicht-ionischen Detergens NP-40. Für die Bindungsessays, die Unter Verwendung von mit radioisotopen markierten Antikörpern (Brown et al., o.a.) durchgeführt wurden, wurden gezüchtete Zellen (106) 30 Minuten auf Eis mit 106 cpm von 125 J-markiertem Antikörper in 100 u.l Bindungspuffer bebrütet. Die Suspension wurde als Schicht auf 0,2 ml 35 Dinonylphthalat:Dibutylphthalat (1:1 v/v) aufgetragen und zentrifugiert. Das Pellet und die wäßrige Phase wurden auf125 J gezählt. Zum Bestimmen von nicht-spezifischen Bindungen wurden parallel dazu Bebrütungen von unmarkiertem Antikörper als Vergleich durchgeführt (Brown et. al., o.a.).

TABELLE I 40

Bindung von mit radioaktivem Jod markiertem Antikörper L20 an gezünchtete Zellen Zellen Spezifische Bindungen Calu-1 -Lungen-Adenokarzinom 45.400 H3082 Lungen-Adonokarzinöm 50.100 H2981 Lungen-Adonokarzinom 64.100 H2984 Lungen-Adenokarzinom 119.300 MCF7 Brustkarzinom 78.800 3017 Melanom 2.200 Normal T Zellen 200 Jurkat T Leukemia 200 Daudi B Lymphoma 200 45 50 55

AT 400 577 B 2.2. Isotyp-Bestimmung von Antikörper L20

Um die Klasse der Immunglobuline, die durch den Hybridomzellstamm L20 erzeugt werden, zu bestimmen, wurden folgende Techniken angewendet: a) Ouchteriony Immundiffusion

Ein Aliquotüberstand von partikulären Hybridomzellen wurde in den im mittleren Behälter einer 25%igen Agarplatte eingebracht. Monospezifische Kaninchen-Antimaus-Ig-Isotype Antikörper (Southern Biotechnoiogy, Birmingham, AL) wurden in die äußeren Behälter eingebracht und die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4°C bebrütet. b) ELISA-Isotyping

Dynatech Immuolon-Platten mit 96 Behältern wurden mit jedem Antiserum einer Konzentration von 1 U.g/ml in PBS, 50 ul pro Behälter,beschichtet und über Nacht bei 4°C zugedeckt stehen gelassen. Die Platten wurden mit PBS/Tween 20, 0,05%ig, gewaschen und mit Nährboden (medium) 100 ul pro Behälter eine Stunde bei Raumtemperatur eingeschlossen. Nach dem Waschen der Platten wurden die überstände von dem Hybridom L20 zugefügt und bei Raumtemperatur eine Stunde bebrütet. Nach dem Waschen mit PBS wurden Rinderserumalbumin (BSA)-Platten bei 37°C zwei Stunden mit monospezifischen Kaninchen-Antimaus-Ig-Isotyp-Antikörpern an Peroxidase (Zymed) gekuppelt. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,03%igem H2O2 in 0,1 M Citratpuffer von ph 4,5 bebrütet. Die optische Dichte bei 630 nm wurde an einem Dynatec-ELISA-Plattenableser bestimmt.

Der monoklonale Antikörper L 20 ist von dem IgGi-Isotyp.

3. Antigen, erkannt durch den Antikörper L2Q

Um Protein-Antigene zu identifizieren, wurden Lungenkarzinomzellen an der Oberfläche mit radioaktivem Jod oder metabolisch mit 35S-Methionin markiert. Antigene wurden aus Zellysaten isoliert durch Bebrüten mit monoklonalem Antikörper, Zugeben von Ziegen-Antimaus-IgG und Adsorption an Staphylo-coccus aureus. Die Immunpräzipitate wurden gewaschen und der präparativen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Eiektrophorese (SDS-PAGE) an einem 10 bis 20%igem Acrylamidgel ausgesetzt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brillant Blau (0,5 Gew.-% zu 10% Essigsäure und 30% Isopropanol) gefärbt und in einer Lösung von Essigsäure (5%, v:v) und Methanol (17%, v:v) entfärbt. Das gefärbte Antigen L20-Band wurde mit einer Rasierklinge beaufschlagt und unmittelbar einer Elektroelution mit einem ECU-040-Elektroeiuter/Konzentrator (C.B.S. Scientific Co., San Diego, CA) nach den Methoden von Hunkapiller et al., 1983, Methods in Enzymol. 91: 227-236 unterworfen.

Der automatisierte Edman-Abbau wurde mit etwa 23 pMol Antigen L20 (basiert auf der Ausbeute von identifiziertem L-1) in einem Gasphasen-Sequenzer (Modell 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) durchgeführt. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäure-Derivate wurden analysiert mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Model 120A on-line HPLC-Einheit (Applied Biosystems, Inc.) mit einer PTH-C18-Säule (2,1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc.) und einem Natrium-acetat/Tetrahydrofuran/Acetonitril-Gradient für die Elution.

Die aminoterminale Aminosäuresequenz ist wie folgt: 15 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L in der X eine Aminosäure bedeutet, die nicht identifiziert worden ist.

Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen, die in der Protein-Datenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert sind, zeigte keine signifikante Ähnlichkeit mit irgendeiner anderen bekannten Sequenz.

Das Antigen, das von dem Antikörper L20 erkannt wurde, ist ein Glycoprotein-Antigen eines Molekulargewichts von etwa 110.000 Dalton. 11

AT 400 577 B 4. In vitro immunhistologische Anwendung

Die Techniken mit unmarkiertem Antikörper von Sternberger, 1979, Immunochemistry, John Wiley + Sons, New York, pp: 104-169, modifiziert von Garrigues et ai., 1982, Int. J. Cancer 29: 511 wurde für immunhistologische Studien an eingefrorenen Gewebsschnitten (frozen sections) herangezogen. Die Target-Gewebe für diese Tests wurden bei chirurgischer Behandlung erhalten und innerhalb von vier Stunden nach Entnahme in in flüssigem Stickstoff vorgekühltem Isopentan eingefroren. Die Gewebe wurden dann in flüssigem Stickstoff oder bei -70°Cbis zu ihrem Gebrauch gelagert. Kaninchen-Antimaus-IgG (Sternberger-Meyer, Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde bei einer Verdünnung von 1/50 verwendet. Maus-Peroxidase-Antiperoxidase-Komplexe (PAP, Sternberger-Meyer, Immunochemicals, Inc.), die 2 mg/ml von speziell gereinigtem PAP enthielten, wurden bei einer Verdünnung von 1/80 verwendet. Die eingefrorenen Schnitte wurden präpariert, getrocknet, mit Aceton behandelt und getrocknet (Garrigues et al., o.a.). Die für die histologische Bewertung verwendeten Schnitte wurden mit Hämatoxylin gefärbt. Um die nicht-spezifischen Hintergründe zu vermindern, wurden die Schnitte mit Normalhumanserum, 1/5 verdünnt, vorbebrütet (Garrigues et al., o.a.). Maus-Antikörper, Ziegen-Antimaus-IgG und Maus-PAP wurden in einer Lösung von 10%igem Normalhumanserum und 3%igem Kaninchenserum verdünnt.

Das Färbeverfahren bestand aus 2,5 Stunden langem Behandeln von Reihenschnitten mit entweder spezifischem oder Kontroll-Antikörper, 30 Minuten langem Bebrüten mit Kaninchen-Antimaus-IgG, 1/50 verdünnt, und 30 Minuten langem Aussetzen dem PAP-Komplex, 1/80 verdünnt. Nach jeder Behandlung mit Antikörper wurden die Objektträger zweimal in PBS gewaschen. Die immunhistochemische Reaktion wurde mit frisch bereitetem 0,5%igem 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) und 0,01%igem H2O2 in 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6, 8 Minuten entwickelt. Weiteres Aussetzen einer 1%igen OsOt-Lösung in destilliertem Wasser 20 Minuten lang verstärkte die Färbung. Die Schnitte wurden mit Wasser gespült, in Alkohol entwässert, in Xylol gereinigt und auf Objektträger aufgebracht.

Jeder der Objektträger wurde unter einem Code bewertet und die codierten Proben wurden durch einen unabhängigen Wissenschaftler geprüft. Typische Objektträger wurden unter Benutzung von Differential*. Interferenz-Kontrast-Optiken (Zeiss-Nomarski) fotografiert. Der Grad der Antikörperfärbung wurde wie folgt bewertet: 0 keine Reaktivität, + ganz schwach positive Zellen, + + mindestens ein Drittel der Zellen positiv, + + + fast alle Zellen positiv, + + + + nahezu alle Zellen stark positiv. Da die Unterschiede zwischen + und 0-Färbung weniger deutlich waren als zwischen + und + + -Färbung, wurde eine Färbung mit + + und mehr als "positiv” angesehen. Sowohl neoplastische als Stromazellen wurden in Tumorproben beobachtet. Die registrierte Färbung ist die der Tumorzellen, da die Stromazellen überhaupt nicht gefärbt wurden oder wenn gefärbt, dann sehr viel schwächer als die Tumorzellen. 12

AT 400 577 B

TABELLE II

Immunperoxidase-Färbung von Tumoi— und normalen Gewebszell-proben mit dem monoklonalen Antikörper L20_ _

Gewebetyp Lungenkarzinom: Adenokarzinom Epi dermoi d Bronchial Kleinzellen

Zahl positiv/Zahl getestet* 18/20 3/3 0/1 4/4

Lungenkarzinom: Zellstämme 3/3

Brustkarzi nom Dickdarmkarzi nom Melanom Rückenmarkskarzinom Li posarcom Normale Lunge Normale Milz Normale Brust Normaler Dickdarm Normale Niere Normale Leber Norma les Gehi rn 4/7 5/8 5/8 1/1 0/1 1 von 3 getesteten Proben schwach gefärbt negativ negativ negativ negativ negativ negativ 13

Claims (13)

1. AT 400 577 B Normales Herz negativ Normale Haut negativ Normale Schilddrüse negat i v Normaler Hoden negativ Normale Vagina negat i v Normales Lymphocyten-Pellet negat i v *Alle geprüften Proben waren eingefrorene Gewebsschnitte, die chirurgisch erhalten worden sind. Siehe Text der detaillierten Beschreibung von immunhistologischen Methoden. Eine Färbung von 2+ (was bedeutet, daß mindestens ein Drittel aller Zellen positiv waren) wurde als positiv angesehen. Ein Zellstamm L20, wie er hier beschrieben ist, ist hinterlegt worden bei "The American Type Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland" und hat die ATCC-Hinterlegungsnummer HB8913 erhalten. Patentansprüche 1. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers, der sich an eine Determinantstelle an einem Zelloberfiächen-Glycoprotein-Antigenvon Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen, von Human-Brust-Karzinomzellen und/oder von Human-Dickdarm-Karzinomzellen bindet, gekennzeichnet durch a) Vermehren eines Hybridoms, das die identifizierenden Charakteristika von A.T.C.C. Nr. HB 8913 hat und erhalten wurde durch Fusion von (i) einer Antikörper erzeugenden Zelle, die von der Milz eines Tieres stammt, das mit in Kulturen gezüchteten Pleuraleffusionszellen immunisiert worden ist, oder Lungengewebe eines Patienten mit Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom mit (ii) einer Myelomzel-le; und b) Ernten der von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom in vivo vermehrt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom durch Injizieren einer Pristane-vorbereiteten BALB/c-Maus und Wachsenlassen eines Aszites-Tumors vermehrt wird und die monoklonalen Antikörper, sekretiert in die Aszitesflüssigkeit, durch Adsorption an Protein A-Sepharose oder durch Gelfiltration gereinigt werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem sich der erzeugte monoklonale Antikörper an eine Determinantstelle an einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Azitigen bindet, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton, bestimmt mittels Polyacryiamidgel-Elektropho-rese, aufweist und eine aminoterminale Aminosäuresequenz wie folgt hat: 14 AT 400 577 B 1 5 10 15 Leu-X-Val-Gln-Val-Pro-Glu-X-Pro-Val-Val-Ala-Leu-Val-Gly-20 Thr-Asp-Ala-X-Leu ^ in welcher X eine nicht identifizierte Aminosäure bedeutet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erzeugte monoklonale Antikörper von der Klasse IgG ist.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erzeugte monoklonale Antikörper von der Unterklasse IgGI ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch a) Vermehren des Hybridom-Zellstamms L20, A.T.C.C. Nr. HB 8913, der erhalten worden ist durch Fusion von (i) einer Antikörper erzeugenden Zelle, stammend von der Milz einer BALB/c-Maus, immunisiert mit Human-Lungenkarzinomzellen 3082, mit (ii) einer NS1-Maus-Myelomzelle; und b) Ernten der von dem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörper.
8. 8. Verfahren zum Nachweisen von malignen Zellen in einer Probe, bei der Verdacht auf das Vorliegen solcher Zellen besteht, gekennzeichnet durch a) Inkontaktbringen der Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche i bis 7 erhalten worden ist, unter Reaktionsbedingungen, die dem monoklonalen Antikörper gestatten, sich an die Determinantstelle zu binden; b) Entfernen nicht gebundener monoklonaler Antikörper-Moleküle aus der Probe; und c) Prüfen der Probe auf die Anwesenheit von gebundenem monoklonalem Antikörper, wobei Bindung des monoklonalen Antikörpers die Anwesenheit maligner Zellen in der Probe anzeigt.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die malignen Zeilen Nicht-KIeinzellen-Lungenkarzinomzellen sind.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Probe Lungengewebe verwendet wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die malignen Zellen Brustkarzinomzellen sind.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die malignen Zellen Dickdarmkarzinomzellen sind.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung mittels immunhistologischer Färbung nachgewiesen wird. 15