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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur
optischen Messung von Bilirubin und ein dafür verwendetes
Reagens, wobei das Verfahren zur klinischen Untersuchung
verwendbar ist. Sie bezieht sich insbesondere auf ein
Verfahren zur optischen Messung von Bilirubin, speziell von
Gesamt-Bilirubin und direktem Bilirubin, das eine Umsetzung
einer Bilirubin-enthaltenden Probe mit einer Zinkverbindung,
einem Farbmittel und einer Bilirubinoxidase in einem Puffer
umfaßt, sowie auf ein dazu verwendetes Reagens.
STAND DER TECHNIK
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Es gibt zwei Typen von Bilirubin, d. h. Bilirubin des
konjugierten Typs (auch als "Bilirubin des direkten Typs"
oder nur als "direktes Bilirubin" bezeichnet) und Bilirubin
des nicht-konjugierten Typs (auch als "Bilirubin des
indirekten Typs" oder nur als "indirektes Bilirubin"
bezeichnet). Direktes Bilirubin und indirektes Bilirubin
werden zusammen als Gesamt-Bilirubin bezeichnet. In der
klinischen Untersuchung werden normalerweise Gesamt-Bilirubin
und direktes Bilirubin gemessen, indirektes Bilirubin wird
errechnet, indem die Menge des direkten Bilirubin von jener
des Gesamt-Bilirubin abgezogen wird. Diese beiden Bilirubin-
Typen stehen in folgender Beziehung zu Krankheiten. Bei
akutem Verschlußikterus beispielsweise ist direktes Bilirubin
im Blut erhöht; und bei hämolytischem Ikterus ist indirektes
Bilirubin im Blut erhöht. Demnach ist es für die klinische
Untersuchung wesentlich, Gesamt-Bilirubin und direktes
Bilirubin genau zu messen.
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Das Serum-Bilirubin wird normalerweise durch Kolorimetrie mit
einem Diazo-Reagens nach dem Verfahren von Malloy-Evelyn oder
dem Verfahren von Michaëlsson gemessen. Allerdings ist die
Reaktion nicht spezifisch, und die Arbeitsgänge sind sehr
kompliziert.
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Kürzlich wurde ein Verfahren zur Messung von Gesamt-Bilirubin
mit einem Enzym entwickelt; z. B. ein Verfahren, das
Bilirubinoxidase verwendet, die von Agaricus bisporus stammt
(japanische Offenlegungsschrift Nr. 11194/1983); ein
Verfahren, das Bilirubinoxidase verwendet, die von einer
Spezies der Gattung Myrothecium stammt (japanische
Offenlegungsschrift Nr. 17999/1984); ein Verfahren, das
Bilirubinoxidase M-1 verwendet, die von Trachyderma tsunodae
stammt (japanische Offenlegungsschrift Nr. 249060/1985) und
dergl. Außerdem wurde ein Verfahren zur enzymatischen Messung
von direktem Bilirubin entwickelt (japanische
Offenlegungsschrift Nr. 44000/1986). Das enzymatische
Verfahren, das eine Umsetzung einer Bilirubin-enthaltenden
Probe mit Bilirubinoxidase und optisches Messen einer Abnahme
der gelben Farbe von Bilirubin aufgrund der enzymatischen
Reaktion umfaßt, ist aufgrund der Spezifität der Reaktion
günstiger als das chemische Verfahren, bei dem Bilirubin
genau gemessen wird, es erfordert allerdings einen
Vergleichstest.
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Es wurde auch ein kolorimetrisches Verfahren zur Messung des
Gesamt-Bilirubin entwickelt, in welchem ein Farbmittel zur
Entwicklung von Bilirubin in der enzymatischen Reaktion
eingesetzt wird; beispielsweise ein Verfahren zur Messung von
Bilirubin, welches eine Reaktion einer Bilirubin-enthaltenden
Probe mit 3-Methyl-2-benzothazolinon-Hydrazon (MBTH) als
Farbmittel und Bilirubinoxidase M-1 unter Bildung eines roten
Pigments und anschließendes Ansäuern der Reaktionslösung mit
einer starken Säure (z. B. HCl, usw.) unter Bildung eines
blauen Pigments und anschließende optische Messung des blauen
Pigments umfaßt (japanische Offenlegungsschrift Nr.
31096/1986), ein entsprechendes Verfahren zur Messung von
Bilirubin, das eine andere Bilirubinoxidase verwendet
(japanische Offenlegungsschrift Nr. 112068/1987), und dergl.
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Darüber hinaus wird noch ein kolorimetrisches Verfahren zur
Messung von Bilirubin durch chemische Entwicklung mit
Eisen(III)-chlorid in einer starken Säure vorgeschlagen [J.
Fog. Nature, 195, 490 (1962)].
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Diese kolorimetrischen Verfahren zur Messung von Bilirubin
erfordern keinen Vergleichstest für eine Probe und sind daher
vorteilhafter als das enzymatische Verfahren, bei dem eine
Verringerung der gelben Farbe von Bilirubin gemessen wird.
Allerdings beinhalten diese Verfahren wie Azidifizierung der
Reaktionslösung, und das Ergebnis ist, daß das Verfahren
komplizierter und weniger schnell wird und für eine
automatische Analyse nicht geeignet ist. Zur Messung des
Gesamt-Bilirubin wird außerdem ein Beschleuniger zur
Umwandlung von indirektem Bilirubin in direktes Bilirubin
(z. B. Natriumcholat, Natriumdodecylsulfat (SDS), usw.)
verwendet. Das obengenannte Agens ist allerdings in der stark
sauren Reaktionslösung unlöslich, daher wird die Lösung
undurchsichtig und für eine Messung des Gesamt-Bilirubin
ungeeignet. Dementsprechend kann weder das Gesamt-Bilirubin
noch das direkte Bilirubin im Patientenserum nach dem
kolorimetrischen Verfahren gemessen werden.
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Wie oben erwähnt wurde, ist die Reaktion in dem chemischen
Verfahren nicht-sepzifisch und das Verfahren kompliziert. Für
das enzymatische Verfahren gilt, daß das Verfahren, obgleich
die Reaktionsspezifität höher als die des chemischen
Verfahrens ist, den Vergleichstest für die Probe erfordert.
Das kolorimetrische Verfahren unter Verwendung des
Farbmittels wie z. B. MBTH ist günstiger als das enzymatische
Verfahren, da es keinen Vergleichstest für die Probe
erfordert. Das Verfahren kann allerdings nicht in geeigneter
Weise für eine automatische Analyse ausgelegt werden, da
jedes Reagens, das in dem Verfahren eingesetzt wird, unter
dem Gesichtspunkt der Stabilität getrennt eingesetzt werden
sollte, d. h. das erste Reagens aus einem Puffer, der ein
Farbmittel enthält; das zweite Reagens, das Bilirubinoxidase
enthält, und das dritte Reagens aus einer sauren Lösung. Der
Ablauf des kolorimetrischen Verfahrens wird darüber hinaus in
drei Schritten durchgeführt, ist von daher kompliziert und
nicht schnell. Außerdem kann der Beschleuniger zur Umwandlung
von indirektem Bilirubin in direktes Bilirubin wie z. B.
Natriumcholat und SDS, aufgrund seiner Unlöslichkeit in der
finalen Reaktionslösung, welche mit einer starken Säure sauer
gemacht ist, nicht in dem kolorimetrischen Verfahren
verwendet werden; und daher ist das Verfahren zur Messung von
Gesamt-Bilirubin und direktem Bilirubin ungeeignet. Daher
wird die Entwicklung eines verbesserten Verfahrens, bei dem
Gesamt-Bilirubin und direktes Bilirubin ohne die
obengenannten Nachteile leicht gemessen werden können,
ernsthaft verlangt.
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Unter diesen Umständen haben die Erfinder der vorliegenden
Erfindung ausgedehnte Untersuchungen zur Entwicklung eines
verbesserten Verfahrens zur Messung von Bilirubin ohne die
obengenannten Nachteile durchgeführt; im Ergebnis haben sie
herausgefunden, daß Bilirubin in einfacher Weise gemessen
werden kann, indem eine Bilirubin-enthaltende Probe mit einem
Farbmittel und Bilirubinoxidase in Gegenwart einer
Zinkverbindung in dem oben erwähnten kolorimetrischen
Verfahren umgesetzt werden, wobei ein Enzym verwendet wird,
so daß das stabile grüne Pigment gebildet wird, ohne daß die
Reaktionslösung mit einer starken Säure sauergemacht wird und
daß sowohl Gesamt-Bilirubin wie auch direktes Bilirubin durch
Einstellen des pH des Puffers auf einen geeigneten Bereich
gemessen werden können.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung eines Verfahrens zur optischen Messung von
Bilirubin, das eine Umsetzung einer Bilirubin-enthaltenden
Probe mit einer Zinkverbindung, einem Farbmittel und
Bilirubinoxidase in einem geeigneten Puffer umfaßt. Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines
Verfahrens zur Messung des Gesamt-Bilirubin unter Verwendung
eines Puffers mit einem pH von 6,0 bis 9,0. Noch eine weitere
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Messung von direktem Bilirubin unter
Verwendung eines Puffers mit einem pH von 3,0 bis 4,5. Noch
eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung eines Reagenzes, das zur Messung von Bilirubin
in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist. Diese und
andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden dem Fachmann auf diesem Gebiet aus der folgenden
Beschreibung klar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 ist eine Absorptionskurve einer Messung von Gesamt-
Bilirubin in einer Probe gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren;
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Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Absorption bei der Messung
von Gesamt-Bilirubin in einem Standardserum bei
verschiedenen Verdünnungen zeigt;
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Fig. 3 ist eine Absorptionskurve einer Messung von direktem
Bilirubin in einer Probe nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren;
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Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Absorption einer Messung
von direktem Bilirubin in einem Standardserum bei
verschiedenen Verdünnungen zeigt;
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Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den
Gesamt-Bilirubin-Werten, die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren gemessen wurden, und
jenen, die nach dem herkömmlichen Diazo-Verfahren
gemessen wurden, zeigt;
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Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Korrelation zwischen den
Werten für direktes Bilirubin, die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren gemessen wurden, und
jenen, die nach dem herkömmlichen Diazo-Verfahren
gemessen wurden, zeigt; und
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Fig. 7 zeigt Absorptionskurven der Messung von Gesamt-
Bilirubin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren,
wobei eine Reihe von Zinkverbindungen verwendet
wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Bilirubin
gemessen, indem ein Puffer, der eine Zinkverbindung und ein
Farbmittel enthält, zu einer Bilirubin-enthaltenden Probe
gegeben wird, die Reaktionslösung inkubiert wird,
Bilirubinoxidase der Reaktionslösung unter Bildung eines
grünen Produktes zugesetzt wird und das Produkt dann durch
Kolorimetrie gemessen wird. Im Unterschied zu einem
herkömmlichen kolorimetrischen Verfahren, wie es in der
japanischen Offenlegungsschrift Nr. 112068/1987 beschrieben
ist, erlaubt dieses Verfahren die Bildung eines stabilen
grünen Pigments, das einen großen molaren
Extinktionskoeffizienten aufweist, ohne Azidifizierung der
Reaktionslösung mit einer starken Säure. Im Unterschied zu
dem herkömmlichen kolorimetrischen Verfahren, bei dem eine
Bilirubin-enthaltende Probe mit Bilirubinoxidase und einem
Farbmittel ohne Zinkverbindung umgesetzt wird, und das in
unvorteilhafter Weise Absorptionsstörungen aufgrund einer
nicht-spezifischen Reaktion zeigt, erlaubt das
erfindungsgemäße Verfahren, in dem die Reaktion in Gegenwart
einer Zinkverbindung durchgeführt wird, eine genaue Messung
von Bilirubin, da die Zinkverbindung Wirksamkeit zur
Eliminierung einer derartigen Absorptionsstörung zeigt.
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Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte
Zinkverbindung kann irgendeine Substanz sein, die Zink
enthält; beispielsweise Zinkoxidverbindungen (z. B. Zinkoxid,
Zinkhydroxid), Zinksalze anorganischer Säuren (z. B.
Zinksulfat, Zinknitrat), Zinksalze organischer Säuren (z. B.
Zinkacetat, Zinklaktat, usw.), Zinkhalogenide (z. B.
Zinkfluorid, Zinkchlorid, Zinkbromid, Zinkjodid), Zinkcyanid.
Die Zinkverbindung wird in geeigneter Konzentration
eingesetzt. Um ein grünes Pigment, das einen großen
molekularen Extinktionskoeffizienten hat, zu erhalten, wird
die Zinkverbindung in der Reaktionslösung in einer
Konzentration im Bereich von 0,02 bis 3,0 mM, vorzugsweise
von 0,05 bis 2,1 mM zur Messung von Gesamt-Bilirubin, von 0,1
bis 3,0 mM, vorzugsweise von 0,4 bis 2,1 mM zur Messung
direktem Bilirubin eingesetzt.
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Beispiele für das Farbmittel, das in dem erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden kann, sind außer dem obengenannten
MBTH, 2-Hydrazinobenzothiazol, 1-Hydrazinophthalazin-
Hydrochlorid, die alle ein stabiles grünes Pigment bilden
können. Das Farbmittel wird in geeigneter Weise in einer
Menge verwendet, die zur Farbbildung wirksam ist,
üblicherweise im Bereich von 0,3 bis 3,0 mM.
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Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Puffer kann
irgendein bekannter Puffer sein, soweit er mit der
Zinkverbindung kein Chelat bildet. Allerdings wird der Puffer
in Abhängigkeit davon, welche Art des Bilirubin zu bestimmen
ist, Gesamt-Bilirubin oder direktes Bilirubin, mit einem
unterschiedlichen pH-Bereich angewendet.
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zur Messung des Gesamt-Bilirubin wird der Puffer mit einem pH
von 6,0 bis 9,0 verwendet. Beispiele für den Puffer sind ein
Good-Puffer wie z. B. N-(2-Acetamid)-2-aminoethansulfonsäure
(ACES)-Puffer, 3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropansulfonsäure
(MOPSO)-Puffer, 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-
Puffer, 3-[N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-
hydroxypropansulfonsäure (TAPSO)-Puffer, die einen pH von 6,0
bis 9,0 haben. Der Puffer enthält vorzugsweise den
Beschleuniger zur Umwandlung von indirektem Bilirubin in
direktes Bilirubin, beispielsweise Natriumcholat, SDS und
Larylbenzolsulfat (LBS), so daß die Reaktion im Verfahren zur
Messung des Gesamt-Bilirubin effizient abläuft.
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Der Puffer zur Messung von direktem Bilirubin hat einen pH
von 3,0 bis 4,5. Beispiele für den Puffer sind Milchsäure-
Natriumlaktat-Puffer, Weinsäure-Natriumtartrat-Puffer,
Glycin-Salzsäure-Puffer, Essigsäure-Natriumacetat-Puffer,
Natriumacetat-Salzsäure-Puffer. Zitronensäure-Puffer und
Phosphorsäure-Puffer können nicht für die Messung von
direktem Bilirubin verwendet werden, da Zink durch diese
Puffer blockiert wird.
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Bilirubinoxidase kann irgendein bekanntes Enzym sein,
einschließlich Bilirubinoxidase, die von einer Spezies der
Gattung Myrothecium stammt; Bilirubinoxidase, die von
Trachyderma tsumodae produziert wird, und dergl.
Bilirubinoxidase wird geeigneterweise in einer Menge
eingesetzt, die wirksam ist, um die gewünschte Enzymaktivität
zu zeigen, normalerweise in einer Menge von 0,04 bis 10 E/ml,
vorzugsweise 0,08 bis 4 E/ml zur Messung von Gesamt-
Bilirubin, in einer Menge von 0,04 bis 10 E/ml, vorzugsweise
0,4 bis 8 E/ml zur Messung von direktem Bilirubin.
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Wenn notwendig, kann auch ein Reaktionspromotor eingesetzt
werden, die Verwendung des Reaktionspromotors kann die Menge
der Bilirubinoxidase reduzieren. Wenn z. B. 10 bis 500 uM
Kaliumhexazyanoferrat(III) als Reaktionspromotor der
Reaktionslösung zur Messung von direktem Bilirubin zugesetzt
werden, wird die Menge an Bilirubinoxidase auf einen Bereich
von 0,04 bis 1,2 E/ml reduziert.
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Der Reaktionspromotor umfaßt beispielsweise zusätzlich zu dem
obengenannten Kaliumhexacyanoferrat(III)
Natriumhexacyanoferrat(III), Kaliumhexacyanoferrat(II) und
Natriumhexacyanoferrat(II) wie auch eine zweiwertige
Kupferionverbindung wie z. B. Kupfersulfat, Kupfernitrat,
Kupfer(II)-acetat, Kupfer(II)-bromid, Kupfer(II)-chlorid. Der
Reaktionspromotor wird normalerweise in einer Menge von 1 bis
700 mM eingesetzt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen so
durchgeführt, daß ein Puffer, der die Zinkverbindung und das
Farbmittel und wahlweise den Beschleuniger zur Umwandlung von
indirektem Bilirubin in direktes Bilirubin enthält, zu einer
Bilirubin-enthaltenden Probe gegeben wird, die resultierende
Reaktionslösung für 3 bis 15 Minuten bei 25 bis 45ºC,
normalerweise für 5 Minuten bei 37ºC, vorinkubiert wird, ein
Puffer, der Bilirubinoxidase und wahlweise den
Reaktionspromotor (der Puffer gehört zu dem Enzymreagens)
enthält, zu dem Reaktionsgemisch gegeben wird und die
Mischung für 3 bis 15 Minuten bei 25 bis 45ºC, normalerweise
für 5 Minuten bei 37ºC, inkubiert wird, so daß die Reaktion
abläuft.
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Die erhaltene grüne Reaktionslösung wird dann der
Kolorimetrie unterzogen, um das gewünschte Bilirubin zu
messen.
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Die Kolorimetrie (Farbmessung) kann nach einem herkömmlichen
Verfahren erfolgen, beispielsweise indem die optische Dichte
des Reaktionsgemisches bei einer Wellenlänge von 580 nm gegen
ein Vergleichsreagens gemessen wird, wobei ein
handelsübliches Spektralphotometer (z. B. UV-2100
Sepktralphotometer, hergestellt von Shimadzu Corporation,
Japan) verwendet wird. Als Referenz wird eine Serumprobe, die
eine vorgeschriebene Menge (bekannte Konzentration) Bilirubin
(nachfolgend als "Standard-Bilirubin" bezeichnet) enthält,
verwendet; die optische Dichte derselben wird entsprechend
gemessen. Auf der Grundlage der Daten jeder Messung wird der
Bilirubinspiegel in der Testserumprobe (mg/dl) nach der
folgenden Gleichung errechnet:
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Konzentration von Bilirubin (mg/dl) = AT/AST x X (I)
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in der AT: Optische Dichte der Testserumprobe
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AST: Optische Dichte von Standard-Bilirubin
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X: Konzentration von Bilirubin im Standard-
Bilirubin (mg/dl)
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Der Ablauf der obigen Messung wird nun detaillierter
erläutert.
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Im Fall der Messung von Gesamt-Bilirubin wird eine
Pufferlösung (z. B. 0,1 M ACES-Puffer, der 0,3 %
Natriumcholat enthält, pH 7,0), welche eine Zinkverbindung
(z. B. 0,13 M Zinksulfat) und ein Farbmittel (z. B. 3 mM
MBTH) wie auch eine vorgeschriebene Menge Bilirubinoxidase
enthält, zu einer Testserumprobe gegeben, dann wird das
Gemisch inkubiert (z. B. 5 Minuten bei 37ºC). Alternativ wird
die obengenannte Pufferlösung, die keine Bilirubinoxidase
enthält, der Testserumprobe zugesetzt und das Gemisch dann
(z. B. bei 37ºC 3 Minuten lang) inkubiert; danach wird eine
vorgeschiebene Menge Bilirubinoxidase zugesetzt und das
Gemisch erneut inkubiert (z. B. bei 37ºC 5 Minuten lang). Das
inkubierte Gemisch wird dann einer Messung der optischen
Dichte (AT) bei einer Wellenlänge von 580 nm gegen die
Vergleichstestprobe unterzogen. Das obige Verfahren wird noch
einmal wiederholt, außer daß Standard-Bilirubin anstelle der
Testserumprobe verwendet wird, um die optische Dichte (AST)
zu messen.
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Im Fall der Messung von direktem Bilirubin werden das oben
beschriebene Verfahren und die Messung wiederholt, außer daß
eine Pufferlösung mit einem pH von 3,0 bis 4,5 verwendet
wird.
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Das erfindungsgemäße Reagens zur Messung von Bilirubin
besteht aus:
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(i) einer Pufferlösung, die ein Zinkverbindung, ein
Farbmittel und wahlweise einen Beschleuniger zur
Umwandlung von indirektem Bilirubin in direktes
Bilirubin enthält (als farbgebendes Reagens
bezeichnet),
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(ii) eine Pufferlösung, die Bilirubinoxidase und wahlweise
einen Reaktionspromotor enthält (als Enzymreagens
bezeichnet), und
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(iii) ein Serum, das eine vorgeschriebene Menge an Bilirubin
enthält (als Standard-Bilirubin bezeichnet).
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Unter dem Gesichtspunkt der Stabilität des Reagenzes liegt
das erfindungsgemäße Reagens vorzugsweise in Form eines Sets
vor, das aus
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(i) einem Farbmittel (gefriergetrocknet),
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(ii) einer Pufferlösung zur Auflösung des Farbmittels, die
eine Zinkverbindung enthält (i),
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(iii) Bilirubinoxidase (gefriergetrocknet),
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(iv) einer Pufferlösung zur Auflösung des Enzyms (iii), und
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(v) Standard-Bilirubin (gefriergetrocknet),
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besteht.
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Erfindungsgemäß wird aufgrund der Wirkung der Zinkverbindung
ein stabiles grünes Pigment gebildet, das einen großen
molekularen Extinktionskoeffizienten hat; das Bilirubin kann
in der Probe spezifisch gemessen werden. Da es nicht
notwendig ist, die Reaktionslösung nach Beendigung der
Reaktion mit einer starken Säure zu azidifizieren, ist das
Verfahren außerdem einfacher als das herkömmliche
kolorimetrische Verfahren; ferner kann der Beschleuniger zur
Umwandlung von indirektem Bilirubin in direktes Bilirubin,
welcher in einer stark sauren Lösung unlöslich ist, verwendet
werden und daher läuft die Reaktion von Bilirubin im
Patientenserum schnell ab. Demnach sind das erfindungsgemäße
quantitative Verfahren und das entsprechende Reagens für eine
klinische Bestimmung von Gesamt-Bilirubin und direktem
Bilirubin in Serum ziemlich wertvoll. Das Verfahren der
vorliegenden Erfindung kann einfach und schnell durchgeführt
werden und daher ist es in geeigneter Weise für eine
automatische Analyse bestimmt.
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Das erfindungsgemäße Reagens und das erfindungsgemäße
Verfahren zur Messung von Bilirubin werden anhand der
folgenden Beispiele erläutert; diese sollen aber nicht zur
Beschränkung der Erfindung dienen.
BEISPIEL 1
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Reagens zur Messung von Gesamt-Bilirubin:
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(1) Erstes Reagens:
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Zinksulfat und MBTH werden in 0,1 M ACES-Pufferlösung
(pH 7,0), die 0,3 Natriumcholat enthält, so gelöst, daß
der Puffer 1,3 mM Zinksulfat und 3 mM MBTH enthält.
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(2) Zweites Reagens:
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10 Einheiten Bilirubinoxidase (aus einer Spezies der
Gattung Myrothecium gewonnen) werden in 0,1 M ACES-
Pufferlösung (pH 7,0) gelöst, dann wird das
Gesamtvolumen auf 10 ml aufgefüllt.
MESSVORGANG
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(i) Unter Verwendung eines automatischen Analysators,
Hitachi 7150, wurden R-1 und R-2 mit dem ersten Reagens
bzw. mit dem zweiten Reagens beschickt. Zu einer
Testprobe (10 ul) wurde das erste Reagens in R-1
(0,3 ml) gegeben, dann wurde das Reaktionsgemisch bei
37ºC für 5 Minuten vorinkubiert. Danach wurde das
zweite Reagens (0,75 ml) zu dem Gemisch gegeben und das
Reaktionsgemisch für 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, um
die Reaktion ablaufen zu lassen. Dann wurde die
optische Dichte bei einer Wellenlänge von 580 nm
(hauptsächlich) und 700 nm (untergeordnet) gegen das
Vergleichsreagens gemessen. Als Referenz wurde das
Standard-Bilirubin eingesetzt und seine optische Dichte
entsprechend gemessen. Auf der Basis der so erhaltenen
optischen Dichten wurde die Konzentration an Gesamt-
Bilirubin gemäß der vorstehend genannten Gleichung (1)
berechnet.
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Die Absorptionskruve wurde gemessen, indem das erste
Reagens (2,0 ml) zu einem Serum (0,1 ml) das direktes
Bilirubin enthielt, gegeben wurde, das Gemisch 5
Minuten bei 37ºC inkubiert wurde, das zweite Reagens
(0,5 ml) dem Gemisch zugesetzt wurde, das Gemisch zum
Ablauf der Reaktion bei derselben Temperatur 10 Minuten
inkubiert wurde, und dann die Absorptionen bei 300 nm
bis 800 nm unter Verwendung eines Spektralphotometers,
Shimadzu UV-2100, gegen gereinigtes Wasser gemessen
wurden. Fig. 1 zeigt die erhaltene Absorptionskurve bei
einer Messung von Gesamt-Bilirubin. Wie aus den in Fig.
1 dargestellten Resultaten klar wird, wurde ein
stabiles grünes Pigment mit einem großen molekularen
Extinktionskoeffizienten in Gegenwart der
Zinkverbindung gebildet, und es wurde ein
hervorragender Effekt der Zinkverbindung bei Messung
des Gesamt-Bilirubin gezeigt.
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(ii) Als nächstes wurde ein geeigneter pH-Bereich des
Puffers für die Messung von Gesamt-Bilirubin
untersucht. Die ersten Reagenzien wurden mit pH 5,5, pH
6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0 und pH 10,0 verwendet. Das
erste Reagens mit einem pH von 5,5 wurde bei Zusatz von
Natriumcholat als Beschleuniger zur Umwandlung von
indirektem Bilirubin in direktes Bilirubin
undurchsichtig, und daher wurde der Puffer ohne
Natriumcholat verwendet. Es wurde dasselbe zweite
Reagens wie oben verwendet.
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Die Messungen wurden nach demselben Verfahren, wie es
oben beschrieben ist, durchgeführt, wobei ein
automatischer Analysator Hitachi 7150 verwendet wurde.
Zur Messung verwendete Proben waren normales
menschliches Serum (Seraclear N, hergestellt von Nippon
Shoji K.K., Japan), Seraclear N ergänzt mit
Bilirubinpulver (indirektes Bilirubin, hergestellt von
ICN, USA) und zwei Patientensera. Zum Vergleich wurde
eine Messung in der gleichen Weise unter Verwendung
eines handelsüblichen enzymatischen Reagenzes zur
Messung von Gesamt-Bilirubin (Nescauto R-BIL-VE,
hergestellt von Nippon Shoji K.K., Japan) durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
Konzentration von Gesamt-Bilirubin (mg/dl)
Seraclear N *1
Seraclear N ergänzt mit indirecktem Bilirubin
Indirektes Bilirubin *2
Patientenserum
Nescauto T-BIL-VE
Anmerkung: *1: Wert für Seraclear N bedeutet Bilirubin-Wert in normalem
menschlichen Serum
*2: Wert für indirektes Bilirubin = (Wert für Seraclear N ergänzt mit indirektem
Bilirubin ) - (Wert für Seraclear N)
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Die Resultate von Tabelle 1 zeigen, daß bei den beiden
Patientenserumproben mit dem Puffer im pH-Bereich von
6,0 bis 9,0 beinahe dieselben Werte erhalten wurden wie
mit dem handelsüblichen Reagens. In den beiden
Patientenserumproben waren die Werte der Gesamt-
Bilirubin-Konzentrationen niedriger, wenn sie mit dem
Puffer bei pH 5,5 gemessen wurden. Dies kann dem Fehlen
des Agenzes zur Umwandlung von indirektem Bilirubin in
direktes Bilirubin in diesen Proben zuzuschreiben sein,
und als Folge einer Unvollständigkeit der enzymatischen
Reaktion innerhalb von 5 Minuten. Der niedrigere Wert,
der bei einem pH von 10,0 gemessen wurde, ist durch die
Inaktivität von Bilirubinoxidase bei diesem pH-Wert
begründet.
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(iii) Außerdem wurde ein Standardserum (Gesamt-Bilirubin
14,2 mg/dl, direktes Bilirubin 9,2 mg/dl) verdünnt
(Verdünnung 1/4, 2/4, 3/4 und 4/4) und einer Messung
mit einem automatischen Analysator Hitachi 7150
unterworfen, wobei die obigen Reagenzien verwendet
wurden. Die Resultate sind in Fig. 2 gezeigt. Wie in
Fig. 2 dargestellt ist, wurde eine gerade Linie
erhalten, die durch den Nullpunkt geht.
BEISPIEL 2
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Reagens zur Messung von direktem Bilirubin:
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(1) Erstes Reagens:
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Zinksulfat und MBTH werden in 0,1 M Milchsäure-
Natriumlakata-Pufferlösung (pH 3,7), die
oberflächenaktive Mittel (0,1 % Noigen EA-170,
hergestellt von Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd., 0,5 %
Emalgen , hergestellt von Kao Soap, Co. Ltd.) enthält,
gelöst, so daß die Pufferlösung 0,9 mM Zinksulfat und
10 mM MBTH enthält.
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(2) Zweites Reagens:
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40 Einheiten Bilirubinoxidase (aus einer Spezies der
Gattung Myrothecium gewonnen) werden in 0,5 mM
Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung gelöst und das
Gesamtvolumen wird auf 10 ml aufgefüllt.
MESSVORGANG
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(i) Die Messung erfolgte mit einem automatischen
Analysators, Hitachi 7150, und die Messung der
Absorptionskurve wurde wie in Beispiel 1 beschreiben
durchgeführt. Die erhaltene Absorptionskurve von
direktem Bilirubin ist in Fig. 3 dargestellt. Wie aus
den in Fig. 3 dargestellten Resultaten klar hervorgeht,
wurde in Gegenwart der Zinkverbindung ein stabiles
grünes Pigment gebildet, das einen großen molekularen
Extinktionskoeffizienten hat, und es wurde ein
ausgezeichneter Effekt der Zinkverbindung bei der
Messung von direktem Bilirubin aufgezeigt.
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(ii) Als nächstes wurde ein geeigneter pH-Bereich des
Puffers bei der Messung von direktem Bilirubin
untersucht. Anstelle des obengenannten ersten Reagenzes
(0,1 M Milchsäure-Natriumlaktat-Pufferlösung) wurde
0, l M Weinsäure-Natriumtartrat-Pufferlösung verwendet
und auf pH 5,5, pH 3,0, pH 3,7, pH 4,0, pH 4,5 und pH
5,0 eingestellt. Es wurde dasselbe zweite Reagens wie
oben verwendet.
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Entsprechend dem Meßvorgang (ii) wurde eine Messung an
normalem menschlichem Serum (Seraclear N, hergestellt
von Nippon Shoji K.K., Japan), Seraclear N, ergänzt mit
pulverförmigem Bilirubin (indirektes Bilirubin,
hergestellt von ICN, USA) und an zwei Patientensera,
wie in Beispiel 1 beschreiben, durchgeführt. Zum
Vergleich wurde eine weitere Messung in derselben Weise
durchgeführt, wobei ein handelsübliches Enzymreagens
(Nescauto D-BIL-VE, hergestellt von Nippon Shoji K.K.,
Japan) zur Messung von direktem Bilirubin verwendet
wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
TABELLE 2
Konzentration von Gesamt-Bilirubin (mg/dl)
Seraclear N *1
Seraclear N ergänzt mit indirecktem Bilirubin
Indirektes Bilirubin *2
Patientenserum
Nescauto D-BIL-VE
Anmerkung: *1: und *2: siehe Tabelle 1
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Wie aus den in Tabelle 2 angegebenen Resultaten klar
wird, war die Konzentration an direktem Bilirubin in
den zwei Patientenserumproben, die mit dem Puffer pH
3,0 bis pH 4,5 gemessen wurden, beinahe dieselbe, wie
die, die mit dem handelsüblichen Enzymreagens gemessen
wurde. Der Wert für Seraclear N, das mit pulvrigem
Bilirubin (indirektes Bilirubin) ergänzt war, war
derselbe Wert wie für Seraclear N bei pH 2,5 bis 4,5;
und damit war bestätigt, daß keine Reaktion von
indirektem Bilirubin abläuft. Bei den zwei
Patientenserumproben mit dem Puffer von pH 2,5 wurde
fast der gleich Wert erhalten wie mit dem
handelsüblichen Enzymreagens; der Grund dafür ist, daß
in einer sauren Lösung mit einem pH von 2,5 ein blaues
Pigment gebildet wird und die Zinkverbindung bei diesem
pH nicht wirksam wird. Die Reaktion bei pH 2,5 kann der
Wirkung von Kaliumhexacyanoferrat (III) zugeschrieben
werden, das mit Bilirubinoxidase verwendet wird.
-
(iii) Außerdem wurde das obige Standardserum verdünnt
(Verdünnungen: 1/4, 2/4, 3/4 und 4/4) und einer Messung
mit einem automatischen Analysator, Hitachi 7150,
unterzogen, wobei die obigen Reagenzien zur Messung von
direktem Bilirubin verwendet wurden. Die Ergebnisse
sind in Fig. 4 dargestellt. Wie in Fig. 4 gezeigt ist,
wurde eine gerade Linie erhalten, die durch den
Nullpunkt geht.
BEISPIEL 3
-
In der gleichen Weise wie in den Beispielen 1 und 2
beschrieben, außer daß 2-Hydrazinobenzothiazol als erstes
Reagens anstelle von MBTH verwendet wurde, wurde Gesamt-
Bilirubin bzw. direktes Bilirubin gemessen, indem die
Absorptionskurve nach der Reaktion entsprechend gemessen
wurde. In beiden Messungen wurde ein stabiles grünes Pigment
(λ = 600 nm) erhalten.
BEISPIEL 4
-
In der gleichen Weise wie in den Beispielen 1 und 2
beschreiben, wurde Gesamt-Bilirubin gemessen, indem von
Trachyderma tsunodae stammende Bilirubinoxidase (10 E/ml)
anstelle des zweiten Reagenzes in Beispiel 1 verwendet wurde;
direktes Bilirubin wurde gemessen, indem von Trachyderma
tsunodae stammende Bilirubinoxidase (0,3 E/ml) anstelle des
zweiten Reagenzes in Beispiel 2 verwendet wurde, wobei die
Extinktion bei 580 nm für 10 Minuten gemessen wurde.
-
Bilirubin-Pulver (indirektes Bilirubin), das zu 5,5 %
menschlichem Albumin gegeben worden war, wurde bei der
Messung Gesamt-Bilirubin umgesetzt, es reagierte aber kaum
bei der Messung von direktem Bilirubin. Sera, die direktes
Bilirubin enthielten, wurden sowohl bei der Messung von
Gesamt-Bilirubin wie auch bei der Messung von direktem
Bilirubin umgesetzt.
BEISPIEL 5
-
(i) Unter Verwendung eines automatischen Analysators,
Hitachi 7150, wurde die Menge an Gesamt-Bilrubin nach
dem Verfahren zur Messung von Gesamt-Bilirubin, das in
Beispiel 1 beschrieben ist, und nach dem üblicherweise
verwendeten Diazo-Verfahren (Nescauto -Bilirubin-Kit-N,
hergestellt von Nippon Shoji K.K., Japan) gemessen. Die
Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt, welche die
Korrelation zwischen den Werten, die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren gemessen wurden, und den
Werten, die nach dem Diazo-Verfahren gemessen wurden,
zeigt. In Fig. 5 sind die Werte, die nach dem Diazo-
Verfahren gemessen wurden, auf der X-Achse und die
Werte, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
gemessen wurden, auf der Y-Achse aufgetragen; der
Korrelationskoeffizient (γ) ist 0,998 und es wird eine
gute Regressionslinie der Formel: Y = 1,044X + 0,005
erhalten.
-
(ii) Dann wurde die Menge an direktem Bilirubin in der
gleichen Weise wie oben beschreiben, außer daß 0,1 M
Weinsäure-Natriumtartrat (pH 3,7) anstelle des ersten
Reagenzes zur Messung von direktem Bilirubin in
Beispiel 2, 0,1 M Milchsäure-Natriumlaktat (pH 3,7)
verwendet wurde, gemessen. Die Resultate sind in Fig. 6
dargestellt, welche die Korrelation zwischen den
Werten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
gemessen wurden, und den Werten, die nach dem Diazo-
Verfahren gemessen wurden, zeigt. In Fig. 6 war der
Korrelationskoeffizient (γ) ist 0,988 und es wird eine
gute Regressionslinie der Formel: Y = 0,963X + 0,061
erhalten, wobei X und Y wie oben definiert waren.
-
Die obigen Resultate bestätigten die Genauigkeit des
erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung von Gesamt-Bilirubin
und direktem Bilirubin.
BEISPIEL 6
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Es wurden verschiedene Metallverbindungen hinsichtlich ihrer
färbenden Wirkung bei der Messung von Gesamt-Bilirubin
getestet.
HERSTELLUNG VON REAGENZIEN:
-
(1) Erstes Reagens:
-
Verschiedene Metallveribndungen (siehe Tabelle 3 und
Fig. 7) und MBTH werden in 0,1 M MOPSO-Pufferlösung (pH
6,5) gelöst, so daß der Puffer 1,6 mM Metallverbindung
(0,1 mM für Zinkoxid, welches in Wasser kaum zu lösen
ist) und l mM MBTH enthält.
-
(2) Zweites Reagens:
-
40 Einheiten Bilirubinoxidase (aus einer Spezies der
Gattung Myrothecium erhalten) werden in 0,1 M MOPSO-
Pufferlösung (pH 6,5) gelöst und das Gesamtvolumen auf
10 ml aufgefüllt.
MESSVORGANG
-
Zu einer Serumprobe, die direktes Bilirubin (0,1 ml)
enthielt, wurde das erste Reagens (2,0 ml) gegeben, das
Gemisch wurde dann 5 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Zu dem
Gemisch wurde dann das zweite Reagens (0,5 ml) gegeben, das
Gemisch wurde dann 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert um die
Reaktion ablaufen zu lassen; anschließend erfolgte die
Messung einer Absorptionskurve bei 300 bis 800 nm gegen
gereinigtes Wasser, wobei ein Shimadzu UV-2100
Spektralphotometer verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in
der folgenden Tabelle 3 und in Fig. 7 dargestellt.
TABELLE 3
Metallverbindung
Ergebnis
Zinksulfat
Zinkchlorid
Zinkacetat
Zinkoxid
Cadiumchlorid
Cadiumsulfat
Berylliumsulfat
Berylliumhydroxid
Bariumfluorid
Bariumchromat
Kupferacetat
Kaliumhexacyanoferrat
Strontiumsulfat
Kupfersulfat
Lithiumsulfat
Eisenchlorid
Eisensulfat
Eisen(III)-ammoniumsulfat
Eisen(III)-ammoniumoxalat
Kaliumbromid
Natriumhydrosulfit
Calciumsulfat
Nickelchlorid
Kobaltacetat
Kobalt(III)-acetylacetonat
Titansulfat
Cersulfat
Manganchlorid
Natriumwolframat
Natriumfluorid
Magnesiumchlorid
(Anmerkung) o: Gefärbtes Pigment ist nach einer langen Wellenlänge verschoben.
x: Gefärbtes Pigment ist nicht nach einer langen Wellenlänge verschoben.
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Wie aus den in Tabelle 3 und Fig. 7 dargestellten Ergebnissen
klar wird, konnten nur die Zinkverbindungen ein stabiles
grünes Pigment mit einem großen molekularen
Extinktionskoeffizienten bilden, was den Effekt der
Zinkverbindungen bestätigt. Verbindungen anderer Metalle
derselben Gruppe wie Zink (d. h. Cadmium, Beryllium, Barium)
zeigten keinen Effekt.