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DE69713601T2 - Wasserlösliche tetrazoliumsalz-verbindungen - Google Patents

Wasserlösliche tetrazoliumsalz-verbindungen

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DE69713601T2
DE69713601T2 DE69713601T DE69713601T DE69713601T2 DE 69713601 T2 DE69713601 T2 DE 69713601T2 DE 69713601 T DE69713601 T DE 69713601T DE 69713601 T DE69713601 T DE 69713601T DE 69713601 T2 DE69713601 T2 DE 69713601T2
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DE
Germany
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general formula
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tetrazolium salt
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Munetaka Ishiyama
Yoko Miyazono
Kazumi Sasamoto
Masanobu Shiga
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Dojindo Laboratory and Co Ltd
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Dojindo Laboratory and Co Ltd
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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige wasserlösliche Tetrazoliumsalz- Verbindungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung wasserlösliche Tetrazoliumsalz-Verbindungen, die zum Beispiel für die quantitative Messung von Dehydrogenasen und anderem in geeigneter Weise verwendet werden können, und Messverfahren unter Verwendung der Verbindungen.
    • Technischer Hintergrund
  • Die quantitative Messung verschiedener Dehydrogenasen wie etwa Lactatdehydrogenase (nachstehend in der Beschreibung gelegentlich als "LDH" abgekürzt), Alkoholdehydrogenase und Glutamatdehydrogenase, wird üblicherweise unter Verwendung von Tetrazoliumsalz-Verbindungen durchgeführt. Eine Eigenschaft der Tetrazoliumsalz-Verbindungen ist ihre Fähigkeit, Wasserstoff aufzunehmen, der durch die Wirkung einer Dehydrogenase, darunter die verschiedenen vorstehend erwähnten Arten, über einen intermediären Elektronenüberträger wie etwa reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (nachstehend in der Beschreibung gelegentlich als "NADH" abgekürzt) freigesetzt wird, um eine entsprechende Formazan-Verbindung zu ergeben. Dementsprechend können Dehydrogenasen durch Messen der Extinktion der resultierenden Formazan-Verbindung quantitativ bestimmt werden.
  • Von diesen Dehydrogenasen findet sich die Lactatdehydrogenase überall in somatischen Zellen und ist insbesondere im Myocardium, in der Leber, in Skelettmuskeln und in den Nieren reichlich vorhanden. Es ist bekannt, dass die Aktivität von Serum-LDH bei Patienten, die an Erkrankungen wie z. B. Herzinfarkt, bösartigen Tumoren, Leberversagen, fortschreitender muskulärer Atrophie, intravaskulärer Hämolyse und megaloblastischer Anämie leiden, deutlich erhöht ist. Dementsprechend können durch Messen der Serum-LDH-Aktivität überaus nützliche klinische Informationen für die Diagnose erhalten werden.
  • In den letzten Jahren ergab sich der Wunsch nach Entwicklung eines Verfahrens zur Dehydrogenase-Messung, das für biogene Substanzen weniger störanfällig ist, um Spurensubstanzen wie z. B. Harnsäure und Gallensäure mit hoher Empfindlichkeit in Blut nachzuweisen. Für diesen Zweck werden im Allgemeinen 3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5- phenyl]-2H-tetrazoliumchlorid (nachstehend in der Beschreibung gelegentlich als "Nitro-TB" abgekürzt) und andere als Wasserstoffakzeptoren verwendet.
  • Die nach Aufnahme eines Wasserstoffs durch Nitro-TB gebildete Formazan- Verbindung hat jedoch geringe Wasserlöslichkeit, woraus sich praktische Probleme ergeben. Insbesondere bei automatischer Analyse fällt die resultierende Formazan-Verbindung innerhalb eines Messsystems mit Röhrchen und Zellen aus und kann Positivfehler zu gemessenen Werten addieren. Zur Lösung dieses Problems musste ein Verfahren unter Verwendung eines Tetrazoliumsalzes entwickelt werden, das eine wasserlösliche Formazan-Verbindung bildet.
  • Als wasserlösliche Tetrazoliumsalz-Verbindungen, die Formazan- Verbindungen mit ausreichender Löslichkeit bilden, offenbart die ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. (Hei) 7-70092/1995 eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (2):
  • worin R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Nitro-Gruppe bedeuten und M ein Alkalimetall oder Ammonium darstellt.
  • Da diese Verbindungen Formazan-Verbindungen mit äußerst hoher Nachweisempfindlichkeit bilden, kann im Vergleich zum üblicherweise eingesetzten Nitro-TB durch Verwendung dieser Verbindungen eine Messung mit höherer Empfindlichkeit erreicht werden. Aufgrund der Wasserlöslichkeit der Formazan-Verbindungen zeigen diese kein Anhaften an Messgeräten und sind dementsprechend für die klinische Diagnostik brauchbar. Insbesondere zeigen Verbindungen der oben genannten allgemeinen Formel, worin R¹ und R² Nitro-Gruppen sind, das Merkmal wirksamer Reaktivität mit NADH unter Bildung einer Formazan-Verbindung, die äußerst hohe Extinktion aufweist.
  • Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung ergaben jedoch, dass diese Verbindungen Probleme hinsichtlich geringer Lagerbeständigkeit aufweisen, wenn sie als wässrige Lösung gelagert werden. Weil wässrige Lösungen nach ihrer Herstellung häufig über einen langen Zeitraum gelagert werden, etwa 3 bis 6 Monate bei den üblichen klinischen Analysen, ist erwünscht, dass die als Wasserstoffakzeptoren verwendeten Tetrazoliumsalz- Verbindungen als wässrige Lösung hohe Lagerbeständigkeit aufweisen.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten verschiedene Untersuchungen durch, um Verbindungen bereitzustellen, die als wässrige Lösung hohe Lagerbeständigkeit aufweisen und zudem die charakteristische ausgezeichnete Nachweisempfindlichkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel (2) beibehalten. Dabei fanden sie heraus, dass die nachstehend gezeigten Verbindungen der allgemeinen Formel (1) die gewünschten Merkmale aufweisen. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde erzielt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit Tetrazoliumsalz-Verbindungen bereit, die durch die folgende allgemeine Formel (1) dargestellt werden:
  • worin R¹ eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppe oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Gruppe bedeutet und M ein Alkalimetall oder Ammonium darstellt.
  • Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die oben genannten Tetrazoliumsalz-Verbindungen bereitgestellt, worin R¹ eine Methyl-Gruppe oder Methoxy-Gruppe und M Natrium ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Reagens zur Messung einer Dehydrogenase bereitgestellt, das die oben genannte Tetrazoliumsalz-Verbindung umfasst. Als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das oben genannte Reagens für eine Messung bereitgestellt, bei der reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid als intermediärer Elektronenüberträger verwendet wird.
  • Gemäß einem weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Formazan-Verbindungen bereitgestellt, die durch die folgende allgemeine Formel (6) dargestellt werden:
  • worin R¹ eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppe oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Gruppe ist.
  • Gemäß einem weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Messung einer Dehydrogenase bereitgestellt, wobei die Verbindung der obigen allgemeinen Formel (1) als Wasserstoffakzeptor verwendet wird. Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen des oben genannten Verfahrens wird ein Verfahren bereitgestellt, das den Schritt der Messung der Extinktion der Formazan-Verbindung umfasst, die durch die obige allgemeine Formel (6) dargestellt ist, sowie ein Verfahren, bei dem reduziertes Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid als intermediärer Elektronenüberträger verwendet wird.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 beschreibt die Änderung der Extinktion der Verbindung der vorliegenden Erfindung (Verbindung a) und einer Verbindung, die in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. (Hei) 7-70092/1995 (Verbindung b) offenbart ist, wenn diese bei 4ºC gelagert werden.
  • Fig. 2 beschreibt die Eichkurven von NADH, erhalten aus Messungen des Absorptionsspektrums. In den Abb. 1 und 2 stellt O die Ergebnisse dar, die bei Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung (Verbindung a) erhalten wurden, und stellt die Ergebnisse dar, die bei Verwendung der in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. (Hei) 7- 70092/1995 offenbarten Verbindung (Verbindung b) erhalten wurden.
  • Fig. 3 beschreibt die Eichkurven von NADH, erhalten aus Messungen des Absorptionsspektrums. In der Abbildung stellt O die Ergebnisse dar, die bei Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung (Verbindung a) erhalten wurden, und stellt die Ergebnisse dar, die bei Verwendung von Nitro-TB erhalten wurden.
    • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Als Alkyl-Gruppe, die durch R¹ dargestellt ist, wird eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppe verwendet. Insbesondere können eine Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl- Gruppe, Isopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, sec-Butyl-Gruppe, tert-Butyl- Gruppe und andere verwendet werden. Als Alkoxy-Gruppe, die durch R¹ dargestellt ist, wird eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Gruppe verwendet. Insbesondere können eine Methoxy-Gruppe, Ethoxy-Gruppe, n-Propoxy-Gruppe, Isopropoxy-Gruppe, n-Butoxy-Gruppe, sec-Butoxy-Gruppe, tert-Butoxy-Gruppe und andere verwendet werden. R¹ kann bevorzugt die Methyl-Gruppe oder die Methoxy- Gruppe sein.
  • Als Alkalimetall, das durch M dargestellt ist, können beispielsweise Natrium, Kalium und andere verwendet werden, wobei Natrium bevorzugt ist.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (1), können mit Hilfe der üblichen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Hydrazin-Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (3):
  • mit einer Aldehyd-Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (4):
  • in einer alkoholischen Lösung umgesetzt werden, um eine Hydrazon- Verbindung zu ergeben, die durch die allgemeine Formel (5) dargestellt ist:
  • und anschließend kann die resultierende Verbindung mit einem entsprechenden Diazoniumsalz in einem organischen Lösungsmittel oder Wasser unter basischen Bedingungen umgesetzt werden, um eine Formazan-Verbindung zu ergeben, die durch die allgemeine Formel (6) dargestellt ist:
  • In der obigen allgemeinen Formel (6) stellt R¹ eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppe oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Gruppe dar.
  • Bei den oben erwähnten Reaktionen können Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder andere als basisch stellende Reagenzien verwendet werden. Anschließend kann die resultierende Formazan-Verbindung der allgemeinen Formel (6) unter Verwendung eines Oxidationsmittels wie etwa Butylnitrit in einem alkoholischen Lösungsmittel oxidiert werden, um die Tetrazoliumsalz- Verbindung der allgemeinen Formel (1) zu ergeben.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen das charakteristische Merkmal auf, dass sie Wasserstoff aufnehmen, der durch die Wirkung einer Dehydrogenase über NADH oder anderen erzeugt wird, und dass sie per se reduziert werden, um die Formazan-Verbindungen zu bilden, die durch die obige allgemeine Formel (6) dargestellt sind. Dementsprechend kann die Konzentration einer Dehydrogenase wie etwa Lactatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase und Glutamatdehydrogenase unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Wasserstoffakzeptoren quantitativ gemessen werden. Sie können auch zur quantitativen Messung reduzierender Substanzen wie etwa NADH verwendet werden, wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird. Im Allgemeinen kann die Extinktion der in einem Reaktionssystem gebildeten Formazan-Verbindung der allgemeinen Formel (6) gemessen werden, um die quantitative Messung dieser Substanzen durchzuführen, oder die Messung kann alternativ auch mittels Fluoreszenzmessung oder anderer spektrometrischer Hilfsmittel durchgeführt werden. Methoden zur Messung einer Dehydrogenase unter Verwendung eines intermediären Elektronenüberträgers wie etwa NADH sind an sich in der Fachwelt bekannt, und die Reaktionsbedingungen, Hilfsmittel zur Messung u. a. können von einem Durchschnittsfachmann passend gewählt werden.
    • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung soll im Einzelnen anhand der folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben werden. Allerdings ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
    • Beispiel 1: Synthese der Verbindung der allgemeinen Formel (1), worin R¹ eine Methoxy-Gruppe ist (Verbindung a)
  • p-Nitrophenylhydrazin (18,4 g) und Natrium-4-formyl-1,3-benzoldisulfonat (37,2 g) wurden mit Methanol vermischt, und die Mischung wurde zwei Stunden am Rückfluss erhitzt. Die resultierenden Niederschläge wurden durch Filtrieren gewonnen, um ein Hydrazon mit 85% Ausbeute zu ergeben. Das resultierende Hydrazon (6,7 g) wurde in Wasser (200 ml) gelöst und auf 0ºC abgekühlt. Getrennt davon wurde 5-Nitro-o-anisidin (2,7 g) auf herkömmliche Weise diazotiert, und das Produkt wurde zur oben erhaltenen Hydrazon-Lösung gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei -5 bis 0ºC gehalten und tropfenweise mit einer wässrigen Lösung versetzt, die erhalten wurde durch Lösen von NaOH (2,6 g) in Wasser (40 ml). Nach der tropfenweise Zugabe wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Salzsäure versetzt und eingeengt. Die durch Zugabe von Isopropanol gebildeten Niederschläge wurden durch Filtrieren gewonnen, um ein Formazan mit 63% Ausbeute zu ergeben. Das resultierende Formazan (5 g) wurde in Methanol (250 ml) suspendiert, mit konzentrierter Salzsäure (6,7 ml) und Butylnitrit (4,1 g) versetzt, und anschließend wurde die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und mit Isopropanol versetzt. Die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Filtrieren gewonnen, und das Rohprodukt wurde aus Ethanol umkristallisiert, um das in der Überschrift genannte Tetrazoliumsalz (Verbindung a) mit 45% Ausbeute zu ergeben.
  • Elementaranalyse: Berechnet (C&sub2;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub6;O&sub1;&sub1;S&sub2;Na): C: 40,00%, H: 2,18%, N: 14,00%. Gefunden: C: 39,78%, H: 2,15%, N: 13,76%.
    • Beispiel 2: Synthese der Verbindung der allgemeinen Formel (1), worin R¹ eine Methylgruppe ist
  • Die in der Überschrift genannte Verbindung wurde auf dieselbe Art wie in Beispiel 1 hergestellt.
  • Elementaranalyse: Berechnet (C&sub2;&sub0;H&sub1;&sub3;N&sub6;O&sub1;&sub0;S&sub2;Na): C: 41,10%, H: 2,24%, N: 14,38%. Gefunden: C: 40,86%, H: 2,44%, N: 14,17%.
    • Beispiel 3: Prüfung der Lagerbeständigkeit
  • 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0), enthaltend 1 mM der Verbindung a, wurde bei 4ºC über 0, 1, 7, 14, 31 und 90 Tage gelagert, und die Extinktionen bei 460 nm wurden gemessen. Gleichzeitig wurde die Verbindung der obigen allgemeinen Formel (2), die beschrieben ist in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. (Hei) 7-70092/1995, worin sowohl R¹ als auch R² Nitro-Gruppen sind (Verbindung b: siehe Abschnitt "Technischer Hintergrund"), auf dieselbe Art gelagert, und die Änderungen der Extinktion wurden gemessen. Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen der Lagerzeit in Tagen und der Extinktion, die sich für Verbindung a und Verbindung b ergibt. Verbindung b zeigte eine deutliche Zunahme der Extinktion, während die Verbindung a der vorliegenden Erfindung über 90 Tage keine Zunahme der Extinktion ergab, womit sich ihre ausgezeichnete Stabilität zeigte.
    • Beispiel 4: Messung der NADH-Konzentration
  • 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0, 5 ml), enthaltend 0,1 mM der Verbindung a und 5 uM 1-Methoxy-5-methylphenazinium-methosulfat, wurde mit 0, 10, 20, 30, 40 oder 50 ul 5 mM NADH versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur reagieren lassen. Anschließend wurde die Extinktion gemessen. Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen den NADH-Konzentrationen und den Extinktionen. Die Messungen wurden auf dieselbe Art unter Verwendung der Verbindung b durchgeführt. Die jeweiligen Verbindungen ergaben vom Ursprung an eine lineare Eichkurve zwischen NADH-Konzentration und Extinktion und zeigten nahezu die gleiche Nachweisempfindlichkeit. Wurde andererseits die Beziehung zwischen NADH-Konzentration und Extinktion unter Verwendung von Nitro-TB auf die gleiche Weise gemessen, so wurde gefunden, dass die Nachweisempfindlichkeit gegenüber der Verbindung der vorliegenden Erfindung offenbar niedriger war, wie in Fig. 3 gezeigt.
    • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die Tetrazoliumsalz-Verbindungen der vorliegenden Erfindung ergeben bei Verwendung als Wasserstoffakzeptoren wasserlösliche Formazane. Dementsprechend tritt keine Abscheidung an Messgeräten auf, und Messungen unter Verwendung automatischer Analysengeräte werden einfacher. Weiterhin weisen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung das Merkmal auf, dass sie im Vergleich zu Nitro-TB, das im Allgemeinen als Wasserstoffakzeptor in der klinischen Diagnostik verwendet wird, höhere Empfindlichkeit zeigen und NADH problemlos nachweisen können. Zudem haben sie als wässrige Lösung das Merkmal ausgezeichneter Lagerbeständigkeit. Dementsprechend sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise als Reagenzien in der klinischen Diagnostik überaus hilfreich.

Claims (8)

1. Tetrazoliumsalz-Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (1):
wobei R¹ eine C&sub1;&submin;&sub4; Alkylgruppe oder eine C&sub1;&submin;&sub4; Alkoxygruppe ist und M ein Alkalimetall oder ein Ammonium darstellt.
2. Die Tetrazoliumsalz-Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ eine Methylgruppe oder Methoxygruppe ist; und M Natrium ist.
3. Ein Reagenz zur Messung einer Dehydrogenase, das die Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2 umfasst.
4. Das Reagenz nach Anspruch 3, das für ein Messverfahren verwendet wird unter Anwendung von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid als intermediären Elektronenüberträger.
5. Eine Formazan-Verbindung, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (6):
wobei R¹ eine C&sub1;&submin;&sub4; Alkylgruppe oder eine C&sub1;&submin;&sub4; Alkoxygruppe ist.
6. Ein Verfahren zur Messung einer Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2 als Wasserstoffakzeptor verwendet wird.
7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, das den Schritt der Messung der Absorption einer Formazan-Verbindung gemäß Anspruch 5 umfasst.
8. Das Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid als intermediärer Elektronenüberträger verwendet wird.
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