DE2646033C3 - L-Leucin-p-aminoanilide, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur Messung der Aktivität von Leucylaminopeptidase - Google Patents

Description

H₃C-CH-CH₂-CH-C-NH^f >-N (I)

R'

CH₃

NH₂

in der bedeuten:

R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁- bis CU-AlkyL das durch eine Hydroxylgruppe oder eine Methansulfonamidogruppe sub- is stituiert sein kann; R³ Wasserstoff oder C₁- bis C₄-ADCyL

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein p-Phenylendiariiinderivat der allgemeinen Formel

H,N

(H)

worin R¹, R² und R³ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit L-Leucin, in dem die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, umsetzt und die Schutzgruppe entfernt.

3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Messung der Aktivität von Leucylaminopeptidase.

wird bei Verwendung von L-Leucin-p-nitroamlid als synthetisches Substrat die gelbe Farbe des erhaltenen p-Nitroanilins bestimmt; es ist jedoch nicht möglich, die Einflüsse von Serumkomponenten auszuschalten. Verwendet man das gegenwärtig häufig eingesetzte L-Leucin-zi-naphthylamid als synthetisches Substrat, so erhält man ein farbiges Produkt durch Kupplung des erhaltenen /f-Naphthylamins mit einem Diazoniumsalzoder durch Diazotieren des erhaltenen /Ϊ-Naphthylamins und anschließende Kupplung mit einer Verbindung, die zu einem Chromogen werden kann, oder auch durch Kondensieren mit p-Dimethylaminobenzaldehyd oder p-Dimethylaminozimtaldehyd. Bei dieser colorimetrischen Bestimmung kanu die Aktivität von LAP auf einfache Weise und mit hoher Präzision gemessen werden, jedoch ist die Verwendung von 0-NaphthyIamin als Standardsubstar? problematisch. Es ist bekannt, daß /^-Naphthylamin carcinogen ist, seine Herstellung in Japan beispielsweise gesetzlich verboten ist und es vorsichtig unter An-

wcuuuiig ciiici OLiiuU¥uiiit.uLuug gcuauuuaui weiden sollte.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde daher versucht, die vorstehenden Nachteile üblicher Verfahren zur Messung der Aktivität von LAP auszuschalten und es wurde gefunden, daß neue L-Leucinp-aminoanilide wirksam als Substrat zur Messung der Aktivität von LAP sind.

Die Erfindung betrifft daher L-Leucin-p-aminoanilide der allgemeinen Formel

O R¹

H₃C CHCH₂ CHCNH

CH₃

NH₂

R²
/

N (I)

R³

Die Erfindung betrifft L-Leucin-p-aminoanilide-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Substrate zur Messung der Aktivität von Leucylaminopeptidase, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Leucylaminopeptidase, die im folgenden als LAP bezeichnet wird, ist ein Enzym, das Leucin aus einem Peptid freisetzt, das Leucin als N-endständige Aminosäure enthält. Sie ist weit verbreitet in jedem Gewebe eines lebenden Körpers, ist auch im Blutserum vorhanden und man weiß, daß ihre Aktivität in Abhängigkeit von pathologischen Zuständen ansteigt. So wird die Aktivität von LAP im Falle einer Verletzung des Leberparenchyms, einer Blockierung von Gallenwegen, einschließlich des Gallenganges in der Leber, bei Diabetes mellitus, Gastritis, Krebs und Schwangerschaft, erhöht. Daher ist die Messung der Aktivität von LAP eine unerläßliche klinische, biochemische Untersuchung in solchen Fällen und zwar nicht nur zur Diagnose einer Änderung zum krankhaften Zustand hin, sondern auch für die prognostische Beobachtung.

Bisher wurden verschiedene Methoden zur Messung der Aktivität Von LAP vorgeschlagen, die viele Vorteile, jedoch auch viele Nachteile besitzen! Die gegenwärtig am häufigsten Verwendete Methode ist die colorimetrische Bestimmung einer Aminverbindung, die aus einem synthetischen Substrat durch LAP erzeugt wird. Bei dieser colorifnetrischefi Bestimmung in der bedeuten:

R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Ct- bis C₄-Alkyl, das durch eine Hydroxylgruppe oder eine Methansulfonamidgruppe substituiert sein kann; R^J Wasserstoff oder C,- bis Q-Alkyl.

In der vorstehenden Formel I kann die Alkylgruppe

mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl sein.

Die L-Leucin-p-aminoanilide der allgemeinen Formel I umfassen beispielsweise folgende Verbindungen.

L-Leucin-4-dimethylaminoaniIid,

L-Leucin-4-diäthylaminoanilid,
L-Leucin-4-dipropyIaminoanilid,

L-Leudn-2-methyI-4-diäthyIaminoanilid,

L-Leucin-2-methyl-4-(N-äthyl-N-//-methansulfonamid-äthylj-aminoanilid,

L-Leucin - 2 - methyl -4- (N -äthyl - N -ß - hydroxyäthylf-ammoanilid.

Die L-Leucin-p-aminoanilide der Formel I werden hergestellt durch in an sich bekannter Weise vorgenommene Umsetzung eines p-Phenylendiaminderivates der allgemeinen Formel

H₂N

(ü)

worin R'₄ R² und R³ wie vorstehend definiert sind, mit

tg voo

L-Leucin, worin die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist und Entfernen der N-Schutzgruppe.

Die Kondensationsreaktion des p-Phenylendiaminderivats der Formel II mit dem geschützten L-Leucin kann bei einer Temperatur von 0 bis 20⁰C, vorzugsweise von 5 bis 10⁰C, durchgeführt werden. Falls erforderlich, kann die Umsetzung in einem Lösungsmittel, wie aliphatischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Estern, Äthern, Ketonen, Alkoholen oder Wasser, z. B. Methylenchlorid, Toluol, η-Hexan, Cydohexan, Aceton, Äthylacetat, Äthyläther, Äthylalkohol unter Zugabe eines Dehydratisierungsmittels, wie !^',N'-Dicyclohexylcarbodiimid, Ν',Ν'-Di-p-toIuoyIcarbodiimid, Tetraäthylpyrrophosphit, i-ÄthyI-3-(3-dimethyIaminopropyl)-carbodiimid ■ HCL I - Cyclohexyl - 3 - (2 - morpholino)-carbodiimid, meso-p-ToIuoIsulfonat durchgeführt werden. Das Reaktionsprodukt kann, falls erforderlich, in üblicher Weise, wie Filtrieren, Waschen mit Wasser, Kondensieren behandelt werden, um nicht umgesetzie Reaktionskomponenten, Verunreinigungen und das Lösungsmittel zu entfernen.

Die Entfernung der N-Schutzgruppe von dem Reaktionsprodukt kann in üblicher Weise erfolgen, wie durch Einbringen des Reaktionsprodukts in ein Lösungsmittel, wie Äthylacetat, das Chlorwasserstoff enthält. Bei dem Verfahren kann L-Leucin verwendet werden, das mit jeglicher üblichen Schutzgruppe geschützt ist.

L-Leucin-p-aminc-Tiilide der allgemeinen Formel I können als Substrate zur Messung ό>·τ Aktivität von LA P verwendet werden.

Sie werden durch die Einwirkung von LAP zu dem p-Phenylendiammderivat und L-Leuciu hydrolysiert. Zur Bestimmung der Aktivität von LAP kann die Substratabnahme oder die Menge des gebildeten p-Phenylendiaminderivats oder L-Leucins gemessen werden, jedoch besteht die bevorzugte Methode darin, die gebildete Menge des p-Phenyiendiaminderivats zu bestimmen.

Die meisten erfindungsgemäßen L-Leucin-p-aminoanilide zeigen im Vergleich mit L-Leucin-/?-naphthylamid die gleiche oder eine verbesserte Reaktivität mit LAP, wie aus der Tabelle 1 ersichtlich ist. Selbst wenn die Substratreaktivität mit LAP nicht so groß ist wie in der Tabelle I gezeigt, können die erfindungsgemäßen L-Leucin-p-aminoanilide zur Messung der Wirksamkeit von LAP verwendet werden.

Tabelle 1

Substrat

Substrat	Umgesctzte Menge*)	Veibältois
	(μΜοΙ χ ΙΟ"*)	(%)
L- Leuci n-4-dimethy lamin o- anilid	1090	100
L-Leucin-4-diäthyIaminoanilid	1145	105
L-Leucin-4-d ipropylammo-	1090	100
L-Leucin^-methyl^l-diälhyl·- aminoanilid	1070	98
I ,-Leucin^-methvl-^iN-äthvI-	271	25

Umgesetzte Verhältnis Menge»)

(μΜοΙ (%)

χ 10"⁴)

N-/?-methansulfonamido-äthyl}-amiriöariilid

L-Leucin-2-methyl-4-(N-äthyl- 243 22

N-ß-hydroxy-äthyl)-amin οίο aniiid

L-Leucin-zi-naphthylamid 1090 100

(Vergleich)

*) Die Menge an Substrat, freigesetzt durch 0,05 ml (etwa 600 Gii-Emheiten) Serum bei 37°C während 15 Minuten.

Die Umsetzung eines Substrats mit LAP führt man vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0 bei einer Temperatur von 10 bis 45 C, vorzugsweise von 35 bis 40 C, durch. Um den pH-Wert im bevorzugter. Bereich zu halten, kann man einen Puffer, wie einen Phosphatpuffer, einen tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanpuffer, einen Barbital- bzw. 5,5-Diäthylbarbilursäurepuffer, einen Boratpuffer, einen AminomethylpropanolpufTer und dergleichen verwenden

Zur Bestimmung der .Vienge des gebildeten p-Phenylendiaminderivats kann dieses in alkalischem Zustand oxidiert werden unter Bildung einer Verbindung, die eine rote Farbe entwickelt, oder kann vorzugsweise ein Kupplungsmittel, wie Phenole und Naphthole zu dem p-Phenylendiaminderivat zugesetzt werden, um durch oxidative Kondensation einen Farbstoff zu bilden. Als derartige Kupplungsmittel können Phenol, »-Naphthol, /Ϊ-Naphthol und ihre Derivate, z. B. Monosulfonsäurederivate, wie I-Naphthol-2-suI-fonsäure, l-Naphthol-4-sulfonsäure, 2-Naphthol-7-sulfonsäure, 2-NaphthoI-8-sulfonsäure und dergleichen, Disulfonsäurederivate, wie "*-Naphthol-3,6-disulfonsäure, 2-Naphthol-6,8-disuIfonsäure und dergleichen, Carbonsäurederivate, wie 1-NaphthoI-2-carbonsäure, Salicylsäure und dergleichen, mehrwertige Phenole, wie Brenzkatechin, Pyrogallol und dergleichen, verwendet werden. Der zu einer roten Farbe entwickelte Farbstoff kann in üblicher Weise bei 510 nm gemessen werden. Eine bevorzugte Methode zur Messung liegt darin, einen Farbstoff zu verwenden, den man zu einer blauen Farbe entwickelt hat. Da alle Farbstoffe, die durch oxidative Kondensation des p-Phenylendiaminderivats und des Kupplungsmittel hergestellt wurden, eine blaue Farbe annehmen, die eine maximale Absorption bei etwa 660 nm aufweisen und die Färbung bemerkenswert stabil ist. kann die Messung der Aktivität von LAP an Proben von lebenden Körpern vorteilhaft durchgeführt werden, ohne daß andere Bestandteile der Proben einen Einfluß ausüben wurden.

Die Farbentwicklung durch Oxidation wird unter Anwendung eines Oxidationsmittels und Einstellen

des pH-Wertes auf 9 12 unter Anwendung eines üblichen alkalisch machenden Mittels« wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat oder dergleichen durchgerührt« Als Oxidationsmittel können übliche, wie Natriurnmetaperjodat, Ammoniumpersulfat, Wasserstoffperoxid, Natriumhypochlorit. Kaliumfcrricyanid verwendet werden.

Insbesondere wird die Aktivität von LAP wie folgt gemessen,Zu 1,0 ml einer0,1 nvPhosphatpufferlösüng.

Probe Nr.

die 1,0 niMol von beispielsweise L-Leucin-4-N,N-di- Tabelle

äthylaminoanilid enthält und einen pH-Wert von 7,0

aufweist, lügt man 0,05 ml Blutserum und erwärmt die Mischung 15 Minuten lang in einem Thermostaten auf 37° C. Zu der Reaktionslösung fügt man 1,0 ml 5 0,2%igen Phenollösung und 1,0 ml einer 0,5%igen Natriummelaperjodatlösung in 0,I5n-Kaliumhydroxid. Di> Reaktionslösung nimmt sofort eine blaue Farbe mit einem Absorplionsmaximum bei 660 nm an. Die Absorption bei 660 nm wird sowohl an einer Probe der resultierenden Lösung, die das Serum enthält, als auch an einer Kontrollösung gemessen, die Wasser anstelle des Serums enthält und in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt hergestellt wurde. Außerdem wird eine Kontrollösung, die ein Serum enthält, dessen LA P-Aktivilät bekannt ist, in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt, hergestellt und seine Absorption gemessen. Die LA P-Aktivilät der Serumprobe kann durch eine Dreisatzrechnung aus den erhaltenen Daten berechnet werden.

Wie die folgende Tabelle 2 am Beispiel von L-Leucin-4-N,N-diäthylaminoanilid zeigt, stimmen die mit der vorstehend genannten Methode erhaltenen Ergebnisse gut mit den nach der derzeit weit verbreitet verwendeten Methode von Takenaka-Takah a s h i unter Anwendung von L-Leucin'/f-naphlhylamid als Substrat (Igaku to Seibulsugaku 65, 74-78 (1962) erhaltenen überein.

Tabelle 3

Erfindungsgemäße
Methode

Mcthode

2 3 4 5 6 7 8 9 10 450 GR-Einheiten

520

124

480

234

371

365

873

161

137

479 GR-Einheiten

510

114

470

220

378

360

880

159

138

Anmerkung: Als Proben wurden r.iiachliche Sera verwendet

Da L-Leudn^N^-diäthylaminoanilid, wie Tabelle 3 zeigt, sehr stabil ist, kann es als Lösung verwendet werden. Wird eine langzeiüge Lagerung gewünscht, so kann es mit einem Quellmittel vermischt und zu Tabletten geformt werden, oder kann es mit einem Puffer vermischt und unter Bildung von Feststoffen lyophilisiert werden, die unmittelbar vor der Anwendung zur Auflösung in Wrsser gelangen.

Zeitraum

Unmittelbar
danach

Nach 1 Woche Nach
I Monat

Nach

2 Monaten

Nach

3 Monaten

Kontrolluntersuchung )	0,020	0,020	0,020
LAP-Aktivität des Serums	137	138	137
(GR-Einheiten)2)
Retention des Substrats (%)	100	100	100

0,022
136

99,9

0,025 137

99.9

') L-Leucin-^N.N-diäthylaminoanilid wird in einer 0,1 m-Phospliatpuflerlösung beim pH-Wert 7,0 bei 2 bis 10°C gelagert. ²) Die LAP-Aktivität des gleichen Serums wird zu verschiedenen Zeiten nach der vorstehenden Methode gemessen.

Die Messung der LA P-AkIivität nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß Verunreinigungen, die gewöhnlich in einer Probe aus einem lebenden Körper vorhanden sind, praktisch keine Wirkung auf i!ie Messung aufweist. Verwendet man L-Leucyl-^-naphthylamid oder L-Leucyl-p-nitroanilid ils Substrat so wendet man Wellenlängen von 450 nm oder 410 nm für die Messung an, so daß durch Absorptionen von Verunreinigungen in der Probe bei 400 500 nm Irrtümer auftreten. Es ist daher notwendig, Kontrolltests mit dem Reagens und Konlrolltests mit der Probe durchzuführen, wodurch die Messung kompliziert wird. Da jedoch bei der erfindungsgemäßen Methode Wellenlängen von 660 nm verwendet werden, wirken sich Farbstoffe in Proben praktisch nicht auf die Messung aus, Liegen darüber hinaus in einer Probe reduzierende Substanzen, wie Harnsäure, Ascorbinsäure und dergleichen vor, so werden sie durch überschüssiges Oxidationsmittel zerstört und beeinträchtigen die Messung nicht. Wie aus der Tabelle 4 deutlich hervorgeht, können erfindungsgemäß genau? Daten erzielt werden, selbst wenn in der Probe reduzierende Substanzen vorhanden sind.

45 Tabelle 4	Konzentration	7.5	LAP-Aktivität
Zusatz	(mg/dl)	25	(GR-Einheiten)
		500
	—	10	160
Keiner	5	160
Ascorbinsäure	500	160
Creatinin		;59
55 Glukose	!58
Harnsäure	160
Bilirubin	156
Hämoglobin

Wie vorstehend erwähnt, können durch das erfindungsgemäße Verfahren bei LAP-Aktivitätsmessungen an Serum-Proben genaue Daten rasch und einfach in sicherer Weise erzielt werden.

Die folgende·,! Beispiele dienen zur Erläuterung der

Erfindung. . ...

B eis pi el 1

Zu einer Suspension von 15,0 g terl.^Butoxycarbonyl-L-leücinhydrat und 9,9 g N.N-Diäthyl-p-pheny-

lcndiamin in Mclhylenchlorid wurde cine Lösung von 14,9 g Ν,Ν'-Dicyclohcxylcarbodiimid in Mcthylcnchlorid tropfenweise unter Rühren bei 5 bis IO C wählend I bis 2 Stunden gefügt und das Lösungsmittel wurde durch Destillieren entfernt. Zu dem Rückstand wurde Äthylacetat, das 22 g gasförmigen Chlorwasserstoff enthielt, getropft, wodurch man Kristalle erhielt. Durch Umkristallisieren aus Methanol erhielt man 14,8 g (70,2% Ausbeute) L-Lcucin-4 - diäthylaminoiinilid-dihydrochlorid. F = 278 bis 260 C (Zcrs.), in Form von farblosen Prismen.

Analyse C₁J-I₂₇NjO · 2HCI:

Berechnet ... C 54.86. H 8.34, N 11,99%:
gefunden .... C 54,76. H 8.39. N 11.96%.

IR (Nujol) cm ': 1690. 1620 (—CO -NII —).
'/!ils?: 243 nm.

Beispiel 2

Unter Anwendung der vorstehend in Beispiel I bcschricbcncn Methode, jedoch unter Ersatz des N₁N-Diüthyl-p-phcnylcndiamins durch 3,6 g 2-Mcthyl-4-diäthylaminoanilin erhielt man 3,1 g (42,5% Ausbeute) L - Leucin - 2 - methyl - 4 - diälhylaminoanilid - dihydrochlorid, F = 184 186 C, in Form eines weißen Pulvers.

Analyse C_I7H₂.,N₃O · 2HCl:

Berechnet ... C 56.04, Il 8.58. N 11.53%:
!■cfunden C 55.74. Il 8.41. N 11.27%.

15

IR (KBr) cm
/üi?: 230 lim.

1685. 1620 { -CO-NH-).

Beispiel 3

Unter Anwendung der in Beispiel I beschriebenen J5 Arbeitsweise, jedoch unter Ersatz des N,N-DiäthyI-p-phcnylendiamins durch 5.4 g 2-MclhyI-4-(N-äthyl-N-/ >'-mclhansulfonamido-äthyl)-aminoanilin. erhielt man 5.0 g (54.6% Ausbeute) L-Lcuciii-2-methyI-4-(N -iühyl- N-/i'-mclhansiiHbnamido-äthyl)-aminoanilid-dihydrochlorid. F = 144 146 C. als weißes Pulver (Äthanol-Äthylälhcr).

Analyse ChH₃₂N₄ O₃S · 2HCl:

Berechnet ... C 47,26. H 7.49. N 12,25%:
ucfundcn . Γ4Λ.98. H 7.51. N 12.36%.

45

IR(KBr)Cm ': 1685. 1620(-CO-NH-), 1315, 1145 (SO₂).
;.Si?: 263 nm.

B e i s ρ i e I 4

Unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode, jedoch unter Ersatz des 4,4-DiäthyI-p-phenylcndiamins durch 4,4 g N.N-Di-n-butyl-p-phenylendiamin erhielt man 2.4 g (Ausbeute 29,7%) L-Leucin-4-di-n-butyIaminoaniIid-dihydrochlorid in Form eines weißen Pulvers. F = 215 bis 217 C.

Analyse C_2nH₃₅N₃O · 2HCI:

Berechnet ... C 59,10, H 9.18. N 10.34%:
gefunden .... C 58.97. H 9.10. N 10.31%.

IR(NujoI)cm ': 1690. 1618(-CO-NH-).
Beispiel 5

Unter Anwendung der in Beispiel I beschriebenen Methode, jedoch unter Ersatz des 4,4-Diäthyl-p-phen\lendiamins durch 2,7 g N.N-Dimethyl-phenylendiamiii erhielt man 3.6 g (Ausbeute 55.1%) L-Leucin-

60 4-dimclhylaminoanilidHlihydroehlöfid in Form Weißer Nadeln. F = 193 bis 197 C. Die Kristalle sind aus Müthanol-Isopropanol timkristallisicrt worden.

Analyse C₁₄H₂₃NjO · 2HCI · ¹Z₄H₂O:

Berechnet ... C 51.46, 117,87, N 12,86%:
gefunden C 51,18, 117,69, N 13,06%.

IR (Ntijo!) cm ': 1687, 1615 (—CO—NH —).

Beispiel 6

Unter Anwendung der in Beispiel I beschriebenen Methode, jedoch unter Ersatz des N.N-Diäthylp-phcnylcndiamins durch 3,8 g Ν,Ν-Di-n-propylp-phenylcndiamin erhielt man 4.2 g (Ausbeute 56,1 %) L - Leucin - 4 - di - η - propylaminoanilid - dihydroclilorid in Form eines weißen Pulvers. F = 163 bN * * 1 f

WIl K. .

Analyse C_1K1I₃₁N₃O-2HCI:

Bcrechnn ... C 57.14. H 8.79, N 11,10%;
gefunden .... C 56.89. H 8.72. N 11,05%.

IRINujoDcm ': 1690. 1620 (- CO -NH-).
Beispiel 7

Unlcr Anwendung der in Beispiel I beschriebenen Methode, jedoch unlcr Ersatz des N.N-Diäthylp-phcnylcndiamins durch 3,9 g 2-MclhyI-4-(N-äthyI-N-/i-hydroxyäthyl)-aminoanilin erhielt man 2,3 g(Ausbeute 30,0%) L-Lcitcin-2-methyI-i-(N-ä!hyl-N-/i-hydroxyäthyl)-aininoanilid-dihydroci)ioridin Formeines hell-rosa Pulvers. F= 150 bis 152¹¹C.

Analyse C₁₇H₂<,N₃O₂ · 2HCI:

Berechnet ... C 53.68. H 8.22, N 11,05%:
gefunden .... C 53.40. H 8.09, N 11,04%.

IR (KBr) cm"': 1680. 1620 (-CO — NH-). 3360 (—OH, breit).

Beispiel 8

Bestimmung der Aktivität von LAP
Reagent ien

Eine Pufferlösung des Substrats: 0,1 m-Phosphatpufferlösung, pH-Wert 7,0, enthaltend 1.0 mMol L-Lcucin-i-N^J-dirncihylsrnJnoanüid.

Oxidalionslösung: 0.1 η-Kaliumhydroxidlösung, enthaltend 0.2% Natriummetaperjodat.

Arbeitsweise

Zu 2,0 ml der Pufferlösung des Substrats wurden 0,05 ml menschliches Serum unter ausreichendem Rühren gelugt und die Mischung wurde anschließend in einem Thermostaten 15 Minuten auf 37" C erwärmt. Anschließend wurden 1,0 ml der Oxidationslösung zur Farbbildung zu der resultierenden Mischung gefügt. Außerdem wurde die gleiche Arbeitsweise wiederholt, wobei man jedoch 0,05 ml Wasser anstelle der Serumprobe zur Verwendung als Reagens für den Konlrolllest verwendete. Es wurde die Absorption dieser Testproben bei 510 nm gemessen. Gleichzeitig wurde eine Kontrolllösung, die Serum, dessen LAP-Aktivität bekannt war. enthielt, in gleicher Weise wie vorstehend erwähnt hergestellt und seine Absorption wurde gemessen. Die LAP-Aktivität der Serumprobe erhielt man durch Dreisatzrechnung aus den vorstehenden Daten.

Beispiel ⁽) einem Thermostaten 15 Minuten lang auf 37 C er- ^L

Bestimmung der LAP-Aklivilät f^irml )^vmac- Anschließend wurden 101 ml der Oxi-

dalionslosiing zu der resultierenden Mischung /ur |

Rciigcnlicn Farbbildung zugefügt. Außerdem wurde die Arbcits- |

Pufferlösung eines Substrats: OJ m-Phosplüilpuffcr- <-, weise wiederholt, wobei jedoch 0.05 mi Wasser an-

lösung, pH 7,0, enthaltend 1,0 mMol L-Leucin- stelle der Scruinprobc verwendet wurden, um ein |

4-N,N-diäthyIaminoanilid und 0,1% Phenol. Reagens für den Kontrolltest zu erhalten. Für diese i|

Oxui;ilionslÖsung:0,I nKaliumhydroxidlösunp. ent- Testproben wurde die Absorption bei 660 ηm gc- |

haltend 0,5% Natriummctapcrjodat. messen. Gleichzeitig wurde eine Kontrotlösung, die |

, . _(i . ίο Serum enthielt, dessen LAP-Aklivitäl bekannt \var.

Arbeitsweise j_n g[gi_cncr Weise wie vorstehend erwähnt, hergestellt

Zu 2,0 ml der Pufferlösung des !sUbstrats* wurden und ihre Absorption wurde ebenfalls gemessen. Die

unter ausreichendem Rühren 0,05 ml einer Probe von LAP-Aktivität in der Scrumprobc erhielt maii durch

menschlichem-Serum gefügt,- worauf die Mischung in brcisatzrcchnung aus den erhaltenen Daten.

Claims (1)

nc a a 033 Patentansprüche:

1. L-Leucin-p-aminoanilide der aligemeinen Formel

O R³