DE69223851T2

DE69223851T2 - Nitro- oder Nitroso-substituierte polyhalogenierte Phenolsulfonphtaleine

Info

Publication number: DE69223851T2
Application number: DE69223851T
Authority: DE
Inventors: Paul F Corey; Angela A Michaels; Lois J Proud; Michael Salvati; Ronald G Sommer; Robert W Trimmer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1991-06-06
Filing date: 1992-05-23
Publication date: 1998-04-16
Anticipated expiration: 2012-05-24
Also published as: ATE161838T1; KR100232439B1; ZA923804B; FI922588L; DE69223851D1; AU1804592A; CA2070039A1; NO922071L; NZ242731A; US5187104A; KR930000498A; GR3026262T3; JPH05230054A; IL101859A; FI922588A0; ES2111009T3; NO922071D0; IE921838A1; DK0517054T3; IL101859A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein den Nachweis von Protein in biologischen Proben; insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zur Bestimmung von Protein in einer biologischen Probe, wobei neue Proteinfehler-Indikatoren zur Anwendung gelangen.
Die Bestimmung des Vorliegens bzw. Vorhandenseins von Protein in einer biologischen Probe ist von ausserordentlicher Bedeutung bei der Diagnose verschiedener pathologischer Krankheitszustände, betreffend die Niere, das Kreislaufsystem und das zentrale Nervensystem. Häufig ist es auch notwendig, Protein (Albumin) in Urin qualitativ und quantitativ zu messen. Dies ist besonders wichtig bei der Diagnose von Diabetes, Harntraktinfektionen und Nierenerkrankungen. Das vorherrschende Protein bei Diabetes und einer Nierenkrankheit ist Albumin.
Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Albumin in Urin sind gut bekannt. Das billigste und einfachste Verfahren zur Albumin-Bestimmung beruht darauf, daß man einen Papierteststreifen mit einer kleinen Menge Urin benetzt. Der Teststreifen ist mit einem Proteinfehler-Indikator imprägniert. Beim Vorliegen von Albumin in der Probe zeigt der Teststreifen dies durch eine einfache Farbänderung an. Die beobachtete Farbe kann in Abhängigkeit von der Konzentration des Albumins in der Probe schwanken. Diese variable Farbänderung wird herangezogen, das Albumin in der Probe zu quantifizieren. Die korrekte Handhabung von Testpapieren des obigen Typs erfordert ein Minimum an Training. Diese Teststreifen ergeben ein genaues, einfaches und rasches Mittel zur Auf-der-Stelle-Bestimmung von Protein. Testpapiere wie diese werden in großem Umfang von Technikern in klinischen Laboratorien sowie von Arzten in ihren Praxen angewandt.
Detaillierter, schließen diese Teststreifen einen absorbierenden Trägerstreifen, d.h. Papier, ein, dermit einem Puffer, einem Polymer/oberflächenaktiven Mittel (zur Stabilität, Benetzbarkeit oder zur Verhinderung des Ausleckens des Puffers) sowie einem Proteinfehler-Indikator imprägniert ist. Im wesentlichen sind alle in handelsüblichen Trockenphasen-Tests verwendeten Proteinfehler-Indikatoren Triphenylmethan-Derivate, denen die folgenden Grundstrukturen gemeinsam sind:
Struktur A stellt die allgemeine Struktur von Triphenylmethan- Derivaten in protischen Lösungsmitteln (Wasser, Alkoholen usw.) dar, wogegen Struktur B diejenige Form darstellt, die im Trockenzustand oder in aprotischen Lösungsmitteln (Ethern, Acetonitril usw.) hauptsächlich vorliegt. Ganz allgemein sind die von Triphenylmethan abgeleiteten Proteinfehler-Indikatoren (Phenolsulfonphthaleine) durch die Struktur B dargestellt. Aus Gründen des Gesamtzusammenhangs sind die Proteinfehler-Indikatoren der vorliegenden Erfindung durch Struktur B dargestellt. Es sollte allerdings selbstverständlich sein, daß die Proteinfehler-Indikation der vorliegenden Erfindung auch als Struktur A vorliegen können.
Proteinfehler-Indikatoren sind pH-Indikatoren, die eine ionisierbare Gruppe enthalten, die einen pKa-Wert aufweist, der durch das Vorliegen von Protein verschoben wird. Im Falle von Phenolsulfonphthaleinen ist die ionisierbare Gruppe die phenolische Hydroxylgruppe am Ring C. Der pKa-Wert des Phenolsulfonphthalein-Indikators ist derjenige pH-Wert, bei dem die Hälfte der Indikator-Moleküle deprotonierte phenolische Hydroxigruppen am Ring C aufweist.
Bezüglich der obigen Phenolsulfonphthalein-Proteinfehler-Indikatoren gibt es zwei Deprotonierungsstufen, um eine erkennbare Farbänderung hervorzurufen. Mit der ersten Deprotonierung wird das Proton von der Arylsulfonsäure entfernt, um die folgende Verbindung zu ergeben:
Der pPa-Wert dieses Protons beträgt weniger als 1. Somit liegt dieser Rest bei allen gebräuchlichen pH-Werten ionisiert vor. Diese ionisierte Gruppe ist auch für die Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen verantwortlich.
Die zweite Deprotonierung beruht darauf, daß ein Proton von der phenolischen Hydroxylgruppe des Rings C abgespalten wird, um das folgende Dianion zu ergeben:
In Proteinfehler-Indikatoren verursacht die zweite Deprotonierung die erkennbare Farbänderung, die das Vorliegen eines Proteins in der getesteten Probe anzeigt.
Der Puffer liefert für den Indikator eine Umgebung eines konstanten pH-Wertes, worin er seine Funktion ausüben soll. Somit wird der Indikator, wenn der Teststreifen in eine biologische Flüssigkeit getaucht wird, die häufig einen pH-Wert aufweist, der sich deutlich von der gepufferten Umgebung unterscheidet, nicht durch den pH-Wert der biologischen Flüssigkeit beeinflusst. Dies gewährleistet, daß eine sich anschließende Farbänderung im Indikator das Ergebnis einer Verschiebung des pKa-Wertes des Indikators und nicht das Ergebnis bzw. die Folge des pH-Wertes der getesteten Probe ist.
Teststreifen, die ganz allgemein als geeignet zur analytischen Bestimmung von Protein in einer biologischen Probe angesehen werden, sind in US 2 986 453, 3 095 277, 3 485 587 und 4 013 416 beschrieben. Die dort beschriebenen Teststreifen enthalten einen absorbierenden Träger, der mit einem mit Wasser nicht mischbaren Polypropylenglycol, einem Puffer und einem pH- Indikator der Gruppe der Octahalosulfophthaleine imprägniert ist. Die Octahalosulfophthalein- Indikatoren sind Triphenylmethan-Derivate, die an den Positionen 3', 3", 5', 5", 3, 4, 5 und 6 halogeniert sind. Gemäß diesen Patenten werden Teststreifen, die Octahalosulfophthalein und mit Wasser unmischbare Polypropylenglycole enthalten, durch in der Testprobe vorliegende wechselwirkende stickstoffhaltige Verbindungen weniger gestört, als dies in Teststreifen der Fall ist, die andere Phenolsulfonphthal-Inindikatoren und oberflächenaktive Mittel enthalten.
Obwohl die oben beschriebenen Teststreifen durch in der Probe vorliegende stickstoffhaltige Verbindungen weniger gestört werden, sind diese und weitere derzeit verfügbare Teststreifen durch verschiedene allgemeine ernste Nachteile beeinträchtigt. Derzeit verfügbare Teststreifen weisen eine starke Hintergrund-Negativfärbung auf. Beispielsweise sind die Indikatoren der Gruppe der Octahalosulfophthaleine in der Abwesenheit von Albumin gelb gefärbt. Anschließend ändert sich die Farbe, wenn Albumin der Probe zugefügt ist, von gelb nach gelb-grün bis grün, und zwar in Abhängigkeit von der Konzentration von Albumin in der Probe. Diese Hintergrundfärbung ist besonders problematisch, und zwar im Hinblick darauf, daß eine sehr häufig getestete biologische Flüssigkeit Urin ist, der normalerweise gelb gefärbt ist. Somit könnten kleine Anderungen in der Farbe des Teststreifens, die durch Spurenmengen von Albumin, d.h. von ca. 10 bis 30 mg/dl (Milligramm/Deciliter), in Urin verursacht werden, leicht durch die Farbe der Probe selbst maskiert werden und unnachgewiesen bleiben. Dieses Problem wird noch weiter dadurch verstärkt, daß diese Teststreifen von minimal trainierten Technikern verwendet werden, die bei der Interpretation der beobachteten Ergebnisse erhöhten Schwierigkeiten ausgesetzt sein dürften. Weil eine medizinische Behandlung häufig auf der Grundlage von Ergebnissen aus diesen Testuntersuchungen begonnen wird, ist eine genaue Interpretation der Ergebnisse unbedingt erforderlich. Des weiteren sind derzeit verfügbare Teststreifen nicht empfindlich genug, um sehr niedrige Gehaltsmengen von Protein nachzuweisen. Urinäre Albumingehaltsmengen von ca. 3 bis ca. 10 mg/dl sind bereits signifikant bei der Diagnose verschiedener lebensbedrohender Pathologien, wie von Diabetes und Nierenkrankheiten. Nichtsdestoweniger vermögen Teststreifen, die derzeit verfügbar sind, Albumin von weniger als ca. 10 bis 15 mg/dl nicht immer genau nachzuweisen.
Ferner sind in FR 2 237 228 Nitrophenolsulfonphthaleine und ihre Verwendung in einem indirekten Elektrofotografieverfahren beschrieben.
Demnach wäre es, zur Überwindung der oben diskutierten Nachteile und Mängel, äußerst vorteilhaft, einen Proteinfehler-Indikator bereitzustellen, der sich von keiner Farbe (farblos) zu einer Farbe in der Gegenwart bzw. bei Vorliegen von Albumin verändert. Es wäre sogar noch vorteilhafter, wenn der Proteinfehler-Indikator genau und klar anzeigen würde, ob Albumin bei Konzentrationen vorhanden war, die unterhalb derjenigen liegen, die gegenwärtig nachweisbar sind. Noch ein Vorteil wäre mit einem Teststreifen bewerkstelligt, der einen derartigen Proteinfehler-Indikator enthält.
Durch die vorliegende Erfindung sind die oben beschriebenen Vorteile erbracht, und zwar durch Bereitstellen der folgenden Proteinfehler Indikatorverbindung:
worin gilt:
X ist -Cl, -Br, -J;
Y ist -NO&sub2; oder -NO; und
Z ist -Cl, -Br oder -J. Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung sind X -J oder -Br, Y -NO&sub2; und Z -Br oder -Cl.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Proteinfehler-Indikatorverbindung bereitgestellt, die die folgende Formel aufweist:
worin gilt:
X ist -Cl, -Br, -J;
Y' ist -NO&sub2; oder -NO;
Y" ist -Cl, -Br, -J und
Z ist -Cl, -Br, -J. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung sind X -J, Y' -NO&sub2;, Y" -Br und Z -Br.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen analytischen Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit einer der oben beschriebenen Proteinfehler- Indikatorverbindungen imprägniert ist.
Schließlich betrifft eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Proteinen einer biologischen Probe, wobei das Verfahren eine Stufe umfaßt, in welcher man einen analytischen Teststreifen mit der biologischen Probe benetzt. Der Teststreifen enthält einen absorbierenden Träger, der mit einer der oben beschriebenen Proteinfehler-Indikatorverbindungen imprägniert ist. Der Teststreifen wird dann in Augenschein genommen, um eine Farbänderung festzustellen. Eine Farbänderung zeigt Protein in der biologischen Probe an.
Fig. 1 ist ein Schema von Verfahren zur Synthese von Nitrososubstituierten Proteinfehler-Indikatoren;
Fig. 2 ist ein Schema von Verfahren zur Synthese von Nitrosubstituierten Proteinfehler-Indikatoren;
Fig. 3 veranschaulicht die Titrationskurven für analytische Teststreifen, die mit DIDNTB (5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4,5,6-= tetrabromphenolsulfonphthalein) alleine (-o-), und mit einem Polypropylenglycol eines Molekulargewichts von 2000 (-Δ-), imprägniert sind;
Fig. 4 veranschaulicht die Dosisreaktionskurven analytischer Teststreifen, die mit DIDNTB alleine (- -), und mit einem Polypropylenglycol eines Molekulargewichts von 2000 (- -), imprägniet sind;
Fig. 5 veranschaulicht die kinetischen Reaktionskurven analytischer Teststreifen, die mit DIDNTB alleine (-A-), und mit Polypropylenglycol eines Molekulargewichts von 2000 (-B-), imprägniert sind; und
Fig. 6 ist eine Balken-Grafik-Darstellung der Dosisreaktion analytischer Teststreifen, die mit DIDNTB alleine (- -) , DIDNTB und Fenoil D4030 (- -), DIDNTB und Baylube FE3016 (- -), DIDNTB und P-2000 (- -), DIDNTB und KOK 10002 (- -) sowie mit DIDNTB und PPG D400 (- -) imprägniert sind.
Gemäß der Erfindung ist herausgefunden worden, daß zur Bestimmung von Protein in biologischen Flüssigkeiten vorgesehene Teststreifen, die eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Protein aufweisen, erhältlich sind, wobei man einen absorbierenden Papierteststreifen mit den neuen Proteinfehler-Indikatoren der vorliegenden Erfindung imprägniert.
Teststreifen, die die unten beschriebenen neuen Proteinfehler- Indikatoren enthalten, sind hellgrau oder farblos und färben sich, bei Eintauchen in eine Protein enthaltende Probe, stark blau, wobei die Intensität der Farbe die Konzentration von Protein in der Probe reflektiert. Die erzeugte blaue Farbe unterscheidet sich klar und deutlich vom hellgrauen oder farblosen Negativtest.
Bezüglich der erkennbaren Farbänderung von hellgrau oder farblos nach blau, ergaben Teststreifen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, ein verbessertes diagnostisches Hilfsinstrument zum Nachweis von Protein in biologischen Flüssigkeiten, wobei Farbe in der Gegenwart von Protein "erzeugt" wird. Dies unterscheidet sich von anderen Teststreifen, in denen sich Farbe in der Gegenwart von Albumin lediglich "ändert". Das kennzeichnende Merkmal von hellgrau oder farblos für einen Negativtest und einer Farbe in einem Positivtest ist als ein signifikantes Abweichen von früheren Verfahren und Indikatoren anzusehen, die zum Nachweis von Protein in biologischen Proben angewandt bzw. eingesetzt wurden. Insbesondere ibt die Erfindung Klinikern ein einfaches, zuverlässiges und genaues Verfahren zum Nachweis von Protein in biologischen Proben an die Hand. Die Änderung von hellgrau oder farblos in eine blaue Farbe bewirkt, daß analytische Teststreifen, die diese Proteinfehler-Indikatoren enthalten, leicht abzulesen sind. Dies führt zu weniger Fehldiagnosen und demzufolge zu geringeren Kosten für Patienten und Gesundheitsvorsorge.
Ferner wird mit gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Teststreifen ein Bereich von ca. 2 bis ca. 500 mg/dl Protein in einer Probe positiv nachgewiesen. Vor der erfolgreichen Durchführung der vorliegenden Erfindung waren Albumin-Konzentrationen von weniger als ca. 10 mg/dl nicht genau nachweisbar. Der Nachweis von Protein bei diesen sehr niedrigen Konzentrationen unter Anwendung der vorliegenden Erfindung ermöglicht die frühe Diagnose verschiedener lebensbedrohender Patologien, einschließlich Diabetes und einer Nierenkrankheit. Beispielsweise verhilft der Nachweis von Albuminune bei Gehaltsmengen von 3mg/dl oder mehr zu einer besseren Dignose von Diabetes in ihren frühen Stufen. Im Lichte dieses deutlichen Fortschritts bei der Diagnose einer Krankheit, welcher durch die vorliegende Erfindung bewerkstelligt wird, stellen die Proteinfehler-Indikatoren und Teststreifen der vorliegenden Erfindung eine signifikante Weiterentwicklung des Standes der Technik dar.
Durch die vorliegende Erfindung werden die oben beschriebenen signifikanten Vorteile bewerkstelligt, indem eine neue Gruppe von Proteinfehler- Indikatoren bereitgestellt ist, welche Nitro- oder Nitroso-Substituenten- Gruppen in den Ringen B und C einer partiell halogenierten Triphenylmethan- Verbindung aufweisen. Detaillierter, ist gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung der Proteinfehler-Indikator der vorliegenden Erfindung die Verbindung:
worin gilt:
X ist -Cl, -Br, -J; Y ist -NO&sub2; oder -NO; und Z ist -Cl, -Br, -J. Vorzugsweise sind X -J oder -Br, Y -NO&sub2; und Z -Br oder -Cl. Noch bevorzugter sind X -J, Y -NO&sub2; und Z -Br.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist eine Proteinfehler-Indikatorverbindung bereitgestellt, die die folgende Formel aufweist:
worin gilt: X ist -Cl, -Br oder -J; Y' ist -NO&sub2; oder -NO; Y" ist -Cl, -Br oder -J; und J ist -Cl, -Br oder -J. Noch bevorzugter sind X -J, Y' -NO&sub2;, Y" -Br und Z -Br.
Bezüglich der Figuren ist in Fig. 1 ganz allgemein die Synthese von 2 Dinitroso-substituierten Indikatoren der vorliegenden Erfindung dargestellt. Insbesondere zeigt Fig. 1 mögliche Synthese-Protokolle für 3',3"- Dinitroso-5',5",3,4,5,6-hexabromsulfonphthalein (Verbindung C von Fig. 1) und für 3',3"-Dinitroso-5',5"-dijod-3,4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein (Verbindung E von Fig. 1) aus dem im Handel erhältlichen 3,4,5,6-Tetrabromphenolsulfonphthalein (Vebindung A von Fig. 1) Die Dibrom-Zwischenproduktverbindung (Verbindung B von Fig. 1) läßt sich leicht und rasch herstellen, indem man eine Lösung von Tetrabromphenolsulfonphthalein in Essigsäure (HOAc) mit 2 Äquivalenten molekularen Broms bei Umgebungstemperatur behandelt. Diese Verbindung wird dann in Acetonitril (CH&sub3;CN) durch eine mit Säure katalysierte Reaktion mit Isoamylnitrit nitrosyliert, um 3',3"-Dinitroso-5',5"-3,4,5,6- hexabromphenolsulfonphthalein zu ergeben.
Die Dijod-Analoga werden in ähnlicher Weise hergestellt. 3,4,5,6- Tetrabromphenolsulfonphthalein wird durch Reaktion mit 3,0 Äquivalenten Jodmonochlorid (JCl) in HOAc bei Umgebungstemperatur jodiert, um die als Verbindung D in Fig. 1 dargestellte Verbindung zu ergeben. Diese Verbindung wird dann wie oben nitrosyliert, um 3',3"-Dinitroso-5',5"-dijod-3,4,5,6tetrabromphenolsulfonphthalein zu ergeben. Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll verläuft die Synthese analoger Verbindungen, die weitere Halogene, Alkylgruppen oder Protonen (H) in den Positionen 3', 3", 3,4,5,5',5" oder 6 aufweisen, in entsprechender Weise und ergeben die beabsichtigten Verbindungen.
Fig. 2 veranschaulicht ganz allgemein die Synthese der Nitrosubstituierten Proteinfehler-Indikatoren der vorliegenden Erfindung. Die Behandlung einer Lösung von Verbindung A von Fig. 2 in HOAc mit nicht mehr als 2 Äquivalenten Salpetersäure (HNO&sub3;) bei Umgebungstemperatur ergibt 3',3"-Dinitro-5',5"-dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (Verbindung B von Fig. 2). Langsame Behandlung von Verbindung A von Fig. 2 mit 1 Äquivalent HNO&sub3; in HOAc bei Umgebungstemperatur und anschließende Behandlung mit überschüssigem Br&sub2; am Rückfluß ergibt das Mononitro-Analog 3"-Nitro-5',5"-dijod-3,3',4,5,6-pentabromphenolsulfonphthalein (Verbindung C von Fig. 2). Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll verläuft die Synthese analoger Verbindungen, die weitere Halogene, Alkylgruppen oder Protonen (H) in den Positionen 3',3",3,4,5,5',5" oder 6 aufweisen, in entsprechender Weise und ergeben die beabsichtigten Verbindungen. Weiter unten in den Beispielen werden detaillierte Synthese-Protokolle zur Herstellung einer jeden der in Fig. 1 und 2 dargestellten Verbindungen beschrieben.
Ohne die Erfindung darauf einzuschränken, wird davon ausgegangen, daß die Substitution mit Nitro- oder Nitroso-Gruppen in den Ringen B und C für die gesteigerte Empfindlichkeit dieser Verbindungen gegenüber urinärem Albumin und für das überraschende kennzeichnende Merkmal der Anderung von hellgrau oder farblos nach blau in der Gegenwart sehr niedriger Konzentrationen von Protein verantwortlich ist. Es wird angenommen, daß die Phänomene eines elektronenabziehenden Effekts und einer Ladungsverteilung zusammenwirken, um Indikatoren einer erhöhten Empfindlichkeit bereitzustellen.
Detaillierter, ist davon auszugehen, daß die hoch elektronegativen Nitro- und Nitrosogruppen, die in Nachbarschaft zu den Hydroxigruppen in den Positionen 4' und 4" angeordnet sind, die Reaktivität dieser Hydroxigruppen erhöhen. Ausserdem wird auch angenommen, daß die Reaktivität der Hydroxigruppen durch Resonanzstabilität weiter erhöht wird. Ionische Formen des Moleküls sollten durch Ladungsverteilung stabilisiert sein. Die durch die substituierenden Nitro- und Nitroso-Gruppen verliehene Resonanzstabilität erhöht die Azidität des benachbarten Hydroxiwasserstoffs in den Positionen 4' und 4" . Diese Phänomene wirken zusammen, und zwar, wie anzunehmen ist, synergistisch, um den pKa-Wert der Indikatoren herabzusetzen und demzufolge die Empfindlichkeit des Indikators gegenüber Albumin zu erhöhen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einenanalytischen Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Proteinfehler- Indikatorverbindungen imprägniert ist. Das absorbierende Matrixmaterial des Teststreifens ist vorzugsweise ein Filterpapier. Weitere Materialien, die sich als absorbierendes Matrixmaterial eignen, schließen Filz, poröse Keramikstreifen, poröse synthetische Membranen und gewebte oder mattierte Glasfasern ein, beschrieben in US 3 846 247. Ebenfalls zu empfehlen ist die Anwendung von Holz, Tuch, Schwamm-Material und tonartiger Substanzen, beschrieben in US 3 552 928. Alternativ dazu, kann die Trägermatrix nicht-porös sein, wie verschiedene Polymerfilme, Glas und dgl.. Alle derartigen Trägermatrixmaterialien eignen sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, wie dies auch für weitere Materialien der Fall ist. Es hat sich herausgestellt, daß Filterpapier besonders geeignet ist.
Der absorbierende Streifen wird vorzugsweise mit einem Puffer imprägniert. Ein Puffer-System, das sich auf einen pH-Wert von ca. 1,5 bis ca. 4,5 einstellen läßt, ist zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet. Vorzugsweise wird das Puffer-System auf einen pH-Wert von ca. 2,0 bis ca. 3,0 und am meisten bevorzugt von ca. 2,5 eingestellt.
Der Teststreifen kann auch mit einem Farbverstärkungspolymer imprägniert werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Farbverstärkungspolymer" ein Polymer bedeuten, das ein Molekulargewicht von ca. 400 bis ca. 25000 aufweist und sowohl die Kinetiken der Farbbildung als auch die Dosisreaktion der Proteinfehler-Indikatoren der Erfindung steigert oder die Hintergrundfarbe eines Negativtests herabsetzt. Bevorzugte Farbverstärkungspolymere schließen Polypropylenglycole, Polcarbonate und Polyvinylether ein. Sowohl mit Wasser mischbare als auch unmischbare Polypropylenglycole eigenen sich zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Es ist bevorzugt, daß das Polypropylenglycol ein Molekulargewicht von ca. 400 bis ca. 10000 aufweist. Noch bevorzugter weist das Polypropylenglycol ein Molekulargewicht von ca. 1000 bis ca. 4000 auf. Am meisten bevorzugt weist das Polypropylenglycol allerdings ein Molekulargewicht von ca. 2000 auf. Mit Wasser nicht mischbare Polypropylenglycole zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung sind im Detail in US 4 013 416 diskutiert. Dennoch ist ermittelt worden, daß mit Wasser mischbare Polypropylenglycole, die ein Durchschnittsmolekulargewicht von ca. 400 aufweisen, sich zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung eignen. Weitere bevorzugte Farbverstärkungspolymere schließen ein: ein Polycarbonat, erhältlich unter der Bezeichnung KOK 10,002 von Bayer AG, Deutschland (ein Polyethercarbonat, erhältlich durch Reaktion kurzkettiger Polypropylenglycole (MW: 200 - 800) und Diphenylcarbonat unter Abspaltung von Phenol, gegebenenfalls unter Addition von Diolen und/oder Triolen. Die Polyethercarbonate sollten Molekulargewichte von 1000 bis 30000 und vorzugsweise von 1500 bis 5000 aufweisen) ; ein Polypropylenoxid- und -ethylenoxid-Addukt von 1,6 Dimethyl-4-nonylphenol, erhältlich unter der Handelsbezeichnung Fenoil D4030 von Bayer AG, Deutschland; einen Polyvinylether, erhältlich unter der Handelsbezeichnung Lutonal 130 von BASF, US; sowie ein Polymer, erhältlich unter der Handelsbezeichnung Baylube FE3016 von Bayer AG, Deutschland.
Es ist festgestellt worden, daß Teststreifen der vorliegenden Erfindung, die bestimmte Farbverstärkungspolymere, d.h. Polypropylenglycole, enthalten einen erhöhten Dosisreaktionsbereich aufweisen. Polypropylenglycole verbesserten auch die Kinetik für das Albumin-Reagiervermögen über den gesamten Dosisreagierbereich für den Teststreifen. Als Ergebnis entwickeln Teststreifen, die die erfindungsgemäßen Indikatoren und ein Polypropylenglycol enthalten, mehr Farbe in einer viel höheren Geschwindigkeit als ohne das Farbverstärkungspolymer. Testreihen mit der Erfindung belegen auch, daß Teststreifen, enthaltend bestimmte Farbverstärkungspolymere, d.h. KOK 10002 und Polypropylenglycole, ein besseres Auflösungsvermögen zwischen Albumingehaltsmengen erzeugen. Die unten in den Beispielen aufgezeigten bzw. angegebenen Meßergebnisse belegen, daß die bevorzugten Farbverstärkungspolymere, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden, in einigen Fällen den pKa-Wert des Indikators, das Auflösungsvermögen und das Albumin- Dosisreagiervermögen sowie die Kinetik der Farbentwicklung zu steigern vermögen.
Die folgenden Beispiele sollen bevorzugte Ausgestaltungsformen und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegehden Erfindung beschreiben, die Erfindung aber darauf nicht einschränken, es sei denn, daß in den beigefügten Ansprüchen etwas anderes ausgesagt ist.

Beispiele

Beispiel 1: 5',5"-Dinitroso-3',3",3,4,5,6- hexabromphenolsulfonphthalein

Eine gerührte Lösung von 3',3",3,4,5,6-Hexabromphenolsulfonphthalein (0,67 g, 0,8 mMol) in wasserfreiem Acetonitril (CH&sub3;CN, 50 ml) wurde bei Umgebungstemperatur unter einer Inertgasatmosphäre gehalten. Die Lösung wurde mit einer katalytischen Menge HOAc (1 Tropfen) und mit Isoamylnitrit (0,56 g, 4,8 mMol) behandelt und dann 4 Tage lang gerührt. Die Feststoffe, die sich aus der Reaktionsmischung abtrennten, wurden durch Futration gesammelt und mit CH&sub3;CN (10 ml) gewaschen. Der Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, um 5',5"-Dinitroso-3',3",3,4,5,6-hexabromphenolsulfonphthalein (0,45 g , 64%) als ein analytisch reines gelbes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 267 bis 269ºC zu ergeben. Eine weitere Ausbeutemenge wurde anschließend aus den eingeengten Mutterflüssigkeiten erhalten (0,03 g; 4%) Spektroskopische Daten, die die Verbindung identifizieren, sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2

Beispiel 2: 5',5"-Dinitroso-3',3"-dijod-3,4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein

Eine Lösung von 3',3"-Dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (1,47 g, 1,6 mMol) in wasserfreiem CH&sub3;CN (50 ml) wurde bei Umgebungstemperatur unter einer Inertgasatmosphäre gehalten. Die Mischung wurde danach mit einer katalytischen Menge HOAc (2 Tropfen) und mit Isoamylnitrit (2,3 g, 20 mMol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Tage lang gerührt. Die Feststoffe, die sich aus der Reaktionsmischung abschieden, wurden durch Futration gesammelt, mit kaltem CH&sub3;CN gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die Verbindung 5',5"-Dinitroso-3,3"-dijod-3,4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein (0,41 g, 26%) zu ergeben. Umkristallisation aus CH&sub3;CN (150 ml) ergab die analytische Probe als blaßgelbe wollartige Substanz mit keinem Schmelzpunkt unterhalb 270ºC.
Spektroskopische Daten, die die Verbindung identifizieren, sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4

Beispiel 3: 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4,5,6- tetrabromhenolsulfonphthalein (DIDNTB)

Eine gerührte Lösung aus 3',3"-Dijod-3,4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein (1,85 g, 2,0 mMol) in siedendem HOAc (90 ml) wurde auf ca. 16 bis 20ºC abgekühlt. Die Lösung wurde tropfenweise, über 4 Minuten, mit einer 90%-igen Lösung von Salpetersäure (0,28 g, 4,0 mMol) in HOAc (10 ml) behandelt und über Nacht bei Umgebungstemperatur unter einer Inertgasatmosphäre gerührt. Die Feststoffe, die sich aus der Reaktionsmischung abschieden, wurden durch Filtration gesammelt, mit HOAc (5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um eine Rohzubereitung von 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein zu ergeben. Eine einmalige Umkristallisation aus HOAc (110 ml) ergab die analytisch reine Verbindung 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (0,90 g, 38%) als gelbes Pulver. Dieses Material wies keinen exakten Schmelzpunkt auf. Allerdings schrumpfte das Material bei ca. 189 bis 190ºC, entwickelte Gas bei ca. 210 bis 220ºC und schmolz bei ca. 225ºC.
Spektroskopische Daten, die die Verbindung identifizieren, sind in der folgenden Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5

Beispiel 4: 5'-Nitro-3',3"-dijod-5",3,4,5,6- pentabromphenolsulfonphthalein

Eine gerührte Lösung von 3',3"-Dijod-3,4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein (0,92 g, 1,0 mMol) in siedender HOAc wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und unter einer Inertgasatmosphäre gehalten. Diese Lösung wurde langsam tropfenweise, 1,5 h lang, mit 1 M HNO&sub3; in HOAc (1,05 ml, 1,05 mMol) behandelt. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung 5 Minuten lang geröhrt. Danach wurde die Reaktionsmischung mit einer Lösung von Br&sub2; in HOAc (1,5 ml, 1,5 mMol) behandelt und 5,5 h lang am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde danach auf Umgebungstemperatur abgekühlt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, um eine goldbraune glasartige Substanz (1,10 g) zu ergeben. Das Rohprodukt wurde in einem Minimalvolumen von Ethylacetat (EtOAc) aufgenommen und mit HOAc verdünnt, um einen kristallinen Feststoff zu ergeben. Nach zwei Umkristallisationen wurde analytisch reines 5'-Nitro-3',3"-dijod-5",3,4,5,6- pentabromphenolsulfonphthalein (0,57 g, 54,5%) als hellgelbes Pulver erhalten. Spektroskopische Daten, die die Verbindung identifizieren, sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6

Beispiel 5: pKa-Titration des Indikators

Der pKa-Wert des Indikators wurde erhalten, indem man E & D 237 Filterpapierstreifen (Ablstrom Filtration, Inc., Mount Holley Springs, PA, USA) titrierte, die den Farbstoff DIDNTB mit Puffern verschiedener pH-Werte enthielten. Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt. In 1 Versuchsreihe enthielt der Teststreifen zusätlich das Proteinverstärkungspolymer Polypropylenglycol (PPG) mit einem Molekulargewicht von ca. 2000. In dem Streifen, der PPG enthielt, erhöhte sich das Verhältnis der protonierten zu den deprotonieten Species. Dies wurde als Herabsetzung beim ungeschützten K/S- Wert für den PPG enthaltenden Streifen ausgedrückt. Alle Streifen waren leicht grau oder weißlich bei Abwesenheit von Protein und verfärbten sich in der Gegenwart von Protein blau.
Die Bildung der blauen Species wurde bei 610 nm verfolgt und ist in K/S-Einheiten ausgedrückt. Die K/S-Einheiten wurden aus der Formel berechnet:
K/S= 1-R)²/2R
worin R der Brechungsindex aus der Testvorrichtung, K eine Konstante und S der Lichtstreukoeffizient des besonderen reflektierenden Medium sind. Die obige Gleichung ist eine vereinfachte Form der gut bekannten Kubelka- Munk-Gleichung (siehe Gustav Kortüm, "Reflectance Spectroscopy", S. 106-11, Springer Verlag, New York (1969)).
Bezüglich Fig. 3, zeigen die niedrigen und hohen Plateau-Verläufe in den Titrationskurven an, bei welchen pH-Werten die protonierten und deprotonierten Formen von 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein (DIDNTB) auftreten. In beiden Versuchsreihen war die Hydroxigruppe am Ring C von DIDNTB bei pH < 2,5 (K/S lag bei einem Minimum) vollständig protoniert und bei pH > 5 (Maximum-K/S) vollständig deprotoniert. Die K/S-Werte wurden bei 25 Sekunden ermittelt.
In der Gegenwart eines Polypropylenglycol (PPG) mit einem Molekulargewicht von ca. 2000 erhöhte sich der pKa-Wert von DIDNTB von 4,06 auf 4,47. Dieser Parameter wurde lediglich als eine offensichtliche Größe angesehen, da er auch den Effekt der Papiermatrix beinhaltete. Tatsächlich betrug der pKa-Wert der Lösung von DIDNTB 2,9. Im Lichte der ermittelten Titrationsparameter ist davon auszugehen, daß der pKa-Wert des Indikators von sowohl der Papiermatrix als auch dem Farbverstärkungspolymer beeinflußt sein sollte.
Beim pH-Wert von 1 Einheit unter dem pKa-Wert schwächte sich die Farbe des Indikators DIDNTB durch das Polypropylenglycol von leicht grau hin zu farblos ab. Ferner erhöhte sich im Polypropylenglycol enthaltenden Teststreifen der K/S-Wert des deprotonierten Peak von 2,5 aus 3,9, entsprechend einer Erhöhung von 56% beim erkennbaren Extinktionskoeffizient. Dies wurde als mehr an Farbe reflektiert, die durch den Indikator in der Gegenwart von Protein erzeugt wird.

Beispiel 6: Dosisreagiervermögen mit einer biologischen Flüssigkeit

Eine Urin-Probenreihe mit einem speziischen Gewicht von 1,007, die sich gemäß Immunoassay als frei von Albumin erwies, wurde auf verschiedene klinisch signifikante Albumin-Gehaltsmengen mit Pentex Humanserumalbumin (Miles Inc., Elkhart, Indiana) versetzt. Diese entsprechend versetzten Urin-Sammeiproben wurden dann mit 1 Satz von Indikator-Streifen, enthaltend DIDNTB alleine, sowie mit einem zweiten Satz von Streifen, enthaltend DIDNTB und ein Polypropylenglycol mit einem Molekulargewicht von ca. 2000, an einem CLINITEK 200 Gerät (Miles Inc., Elkhart, Indiana) getestet. Die Daten sind in Fig. 4 zusammengefaßt. Der pH-Wert des Streifens betrug 2,5, 1,6 Einheiten unterhalb dem pKa-Wert von DIDNTB. Bei diesem-pH-Wert des Streifens liegt eine minimale Hintergrundfarbe bei maximaler Empfindlichkeit vor. Der K/S-Wert wurde bei 25 Sekunden ermittelt.
Das Auflösungsvermögen wurde in Delta-K/S-Werten zwischen Albumingehalten quantitativ ausgedrückt, wie in der folgenden Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7
Beide Teststreifen zeigten durch Farberzeugung die Gegenwart von Albumin in Konzentrationen von 15 mg/dl ganz klar an. Tatsächlich war der Streifen, der nur DIDNTB enthielt, empfindlicher gegenüber Protein- Konzentrationen von weniger als 30 mg/dl als gegenüber höheren Konzentrationen. Dies ist ein Niveau, unterhalb dem die meisten handelsüblichen Teststreifen nur ein geringes Auflösungsvermögen ergeben bzw. aufweisen. Andererseits erwies sich der Streifen, der auch noch Polypropylenglycol enthielt, empfindlich gegenüber Protein bis zu einer Konzentration von 500 mg/dl. Somit wurde eine Steigerung beim Auflösungsvermögen durch das Polypropylenglycol erzeugt. Ferner schwächte sich die Hintergrundfarbe beim Negativgehalt von leicht grau zu farblos oder weißlich ab, wie durch ein Absinken beim K/S-Wert des Streifens angezeigt.

Beispiel 7: Kinetische Messungen

Unter Einsatz derselben oben beschriebenen Urin-Sammelproben wurden kinetische Messungen mit denselben Teststreifen und einem Miles Schnellscannergerät durchgeführt. Die Messergebnisse sind in Fig. 5 zusammengefaßt und dargestellt. Fig. 5 zeigt erhöhte Kinetik und größeres Auflösungsvermögen zwischen Albumingehalten, und zwar bei Verwendung des Propylenglycol zusammen mit dem DIDNTB. Mit beiden Teststreifen wurde Albumin auch bei 15 mg/dl klar nachgewiesen.

Beispiel 8: Vergleich von Reagensstreifen, enthaltend eines von mehreren ausgewählten Farbverstärkungspolymeren

Unter Einsatz derselben oben beschriebenen Urin-Sammelprobe wurden Messungen mit Teststreifen durchgeführt, enthaltend DIDNTB, und kein Farbverstärkungspolymer oder 1 Farbverstärkungspolymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fenoil D4030, Baylube FE3016, KOK 10002, P-2000 (ein Polypropylenglycol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 2000, erhältlich von Fluka Chemical Company unter der Handelsbezeichnung P-2000) und PPG D400 (ein Polypropylenglycol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 400, erhältlich von Olin Chemical Company unter der Handelsbezeichnung PPG D400). Der K/S-Wert wurde bei 25 Sekunden ermittelt. Die Daten sind in Fig. 6 zusammengefaßt und dargestellt.
Die blanke Hintergrundfarbe wurde durch Fenoil D4030, Baylube FE3016 und durch P-2000 von leicht grau nach farblos geringfügig abgeschwächt. KOK 10002 und PPG D400 schwächten die Hintergrundfarbe nicht ab. Sie verursachten allerdings, zusätzlich zum P-2000, eine deutliche Steigerung beim Dosisreagierverhalten. Aus den in Fig. 6 dargestellten Daten ergibt sich, daß P-2000 ein bevorzugteres Farbverstärkungspolymer sein würde, da es das Auflösungsvermögen zwischen Albumin-Konzentrationen verbessert, bei gleichzeitiger Abschwächung der Hintergrundfarbe. Dieselben Ergebnisse sind auch mit Polypropylenglycolen mit Molekulargewichten von 1000 und 4000 belegt worden.

Beispiel 9: Zweiter Vergleich von Reagensstreifen, enthaltend eines von mehreren ausgewählten Farbverstärkungspolymeren

Whatman CCP 500-Papier-Reagensstreifen wurden mit den folgenden Tauchlösungen imprägniert und gemäß Standardverfahren wie folgt getrocknet. Der Vergleichsreagensstreifen wurde hergestellt, indem man zuerst den Streifen in einen 0,5 M Zitratpuffer, pH = 2,5, und dann in ein Bad tauchte, enthaltend 0,30 mM DIDNTB in Tetrahydrofuran (THF). Die weiteren Streifen wurden im wesentlichen genauso hergestellt, mit der Ausnahme, daß das zweite Bad auch noch 1% Farbverstärkungspolymer enthielt. Die im Beispiel eingesetzten Polymeren waren PPGP-2000 von Fluka, PPG-Produkte mit verschiedenen Molekulargewichten von Olin (D-Serien), Propylenglycolmonobutylether (PPGMBE) von Dow Chemical und KOK 10002 von Bayer.
Aus dem obigen Reagenspapier hergestellte Streifen wurden mit Urinproben aus einer Urin-Sammelprobe eines spezifischen Gewichts von 1,007, welche sich durch Immunoassay als frei von Albumin erwies, getestet und auf verschiedene klinisch signifikante Albumin-Gehaltsmengen mit Pentex Humanserumalbumin (HSA) versetzt. Das Reflektionsvermögen der Streifen wurde bei 610 nm bei 25 Sekunden gemessen, und zwar nach Eintauchen des Streifens in die Test-Lösung. Die Wirkung des Polymer auf die Leerprobe kann quantitativ als der K/S-Wert ausgedrückt werden, der in der Abwesenheit von Albumin (Negativgehalt) erhalten wird, wohingegen die Verbesserung beim Auflösungsvermögen als ein Ergebnis der erhöhten Geschwindigkeit der Farbentwicklung in Delta-K/S-Werten zwischen Albumin-Gehaltsmengen ausgedrückt werden kann. Die Daten sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:
Alle Polymeren in dieser Gruppe erzeugten einen großen Anstieg beim Auflösungsvermögen, der durch die Steigerung beim Delta-K/S vom 2-fachen auf das 20-fache des Vergleichs mit keinem Polymer dargestellt ist. Die viel kleinere Wirkung auf den Hintergrund ist aus dem Absinken beim K/S beim Negativgehalt für alle Polymeren, ausgenommen das PPG D-400 und das KOK 10002, ersichtlich. Daher ist die Befähigung zur Erzeugung beider Effekte gewöhnlich, aber nicht unbedingt immer im selben Polymer vorgegeben und enthalten. Die beiden PPGMBE-Polymeren weisen Leistungseigenschaften auf, die genauso gut oder geringfügig besser als die PPG-Polymeren waren.

Beispiel 12: Reagensstreifen-Herstellung

Es wird nun ein Verfahren zur Herstellung des hier diskutierten Reagensstreifens für urinäres Protein angegeben. Das beschriebene Verfahren ist ein kontinuierliches Verfahren zur Massenproduktion von Reagensteststreifen für urinäres Protein.
Gemäß dem Verfahren wird ein dünner absorbierender Papierstreifen durch die Produktionsanlage mit einer bevorzugten Geschwindigkeit von ca. 1,2 m pro Minute bewegt. Ein bevorzugtes Papier ist E & D 237. Wird ein Farbverstärkungspolymer, wie Polypropylenglycol, in den Teststreifen eingebracht, wird das Papier zuerst in ein Bad getaucht, das das Farbvestärkungspolymer enthält, das wiederum in Ethanol oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst ist. Bei Verwendung von Polypropylenglycol sollte das Ethanol-Bad beispielsweise 1% Polypropylenglycol enthalten. Ein bevorzugtes Polypropylenglycol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von ca. 2000 ist von Fluka Chemical Company unter der Handelsbezeichnung P-2000 erhältlich. Falls jedoch ein Testpapier hergestellt wird, das kein Farbverstärkungspolymer enthält, sollte der erste Tauchvorgang nur in Ethanol erfolgen. Das Papier wird anschließend ein zweites Mal in ein Bad getaucht, enthaltend den Proteinfehler-Indikator und einen Puffer, welche in einer wässrigen Ethanol-Mischung oder einem weiteren geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst sind. Gemäß einem bevorzugten Verfahren enthält das zweite Bad 0,025% DIDNTB und 0,45 M Kahumzitrat-Puffer bei einem pH von 2,5 in 50%-igem Ethanol. Man läßt dann den Teststreifen durch einen Trockner mit einem Luftdruck von ca. 2,5 cm Wassersäule und einer Temperatur von 60ºC mit einer Geschwindigkeit von 1,2 m pro Minute laufen. Der Teststreifen wird dann zurechtgeschnitten und verpackt.
Indem sich die vorliegende Erfindung für verschiedene Modifikationen und Alternativformen eignet, sind anhand von Beispielen besondere entsprechende Ausgestaltungsformen aufgezeigt und im Detail beschrieben worden. Es sollte jedoch klar und selbstverständlich sein, daß es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf besondere offenbarte Formen zu beschränken, sondern daß vielmehr die Absicht besteht, alle Modifikationen, Äquivalente und alternative Formen abzudecken, die unter den sinngemäßen Umfang und Rahmen der Erfindung fallen, wie dies durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.

Claims

1. Verbindung:

worin X -J oder -Cl ist.

2. Verbindung:

3. Verbindung:

worin gilt: X ist -J, -Br oder -Cl; Y' ist -J, -NO&sub2; oder -NO; Y" ist -J, -Br oder -Cl; und Z ist -J, -Br oder -Cl.

4. Verbindung:

5. Analytischer Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit der Verbindung imprägniert ist:

worin gilt: X ist -J, -Br oder -Cl;

Y ist -NO&sub2; oder -NO; und

Z ist -J, -Br oder -Cl.

6. Analytischer Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit der Verbindung imprägniert ist:

worin gilt:

X ist -J, -Br oder -Cl;

Y' ist -NO&sub2; oder -NO;

Y" ist -J, -Br oder -Cl; und

Z ist -J, -Br oder -Cl.

7. Analytischer Teststreifen gemäß Anspruch 5 oder 6, worin der Teststreifen ferner einen Puffer und ein Farbverstärkungspolymer enthält.

8. Verfahren zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren Stufen umfaßt, in denen man:

a) einen analytischen Teststreifen mit der biologischen Probe benetzt, wobei der Teststreifen einen absorbierenden Träger aufweist, der mit der Verbindung imprägniert ist:

worin gilt:

X ist -Cl, -Br, -J;

Y' ist -NO&sub2; oder -NO;

Y" ist -Cl, -Br, -J; und

Z ist -Cl, -Br, -J, und man b) eine Farbänderung des Teststreifens beobachtet und erfaßt, wobei die Farbänderung Protein in der biologischen Probe anzeigt.

9. Verfahren zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren Stufen umfaßt, in denen man: a) einen analytischen Teststreifen mit der biologischen Probe benetzt, wobei der Teststreifen einen absorbierenden Träger aufweist, der mit der Verbindung imprägniert ist:

worin gilt:

X ist -Cl, -Br, -J;

Y ist -NO&sub2; oder -NO; und

Z ist -Cl, -Br, -J, und man

b) eine Farbänderung des Teststreiens beobachtet und erfaßt, wobei die Farbänderung Protein in der biologischen Probe anzeigt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, worin der genannte Teststreifen ferner mit einem Puffer und einem Farbverstärkungspolymer imprägniert ist.