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DE3249743C2 - - Google Patents

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DE3249743C2
DE3249743C2 DE3249743A DE3249743A DE3249743C2 DE 3249743 C2 DE3249743 C2 DE 3249743C2 DE 3249743 A DE3249743 A DE 3249743A DE 3249743 A DE3249743 A DE 3249743A DE 3249743 C2 DE3249743 C2 DE 3249743C2
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Germany
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oxidase
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blood serum
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DE3249743A
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Kosaka Seto Aichi Jp Akira
Murao Sakai Osaka Jp Sawao
Hirano Iwakura Aichi Jp Kenichi
Tanaka Sakai Osaka Jp Noriaki
Matsunaga Ichinomiya Aichi Jp Kuniyoshi
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Amano Enzyme Inc
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Amano Pharmaceutical Co Ltd
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Priority claimed from JP12763282A external-priority patent/JPS5917999A/ja
Priority claimed from JP12763382A external-priority patent/JPS5918000A/ja
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer physiologischen Komponente aus der Gruppe Glukose. Cholesterin, neutrale Fette, freie Fettsäuren, Phospholipide und Harnsäure, die alle in menschlichem Blutserum enthalten sind, unter Verwendung von Reagenzien einschließlich eines oxidierenden Enzymes.
Die Verfahren zur quan­ titativen Bestimmung der genannten physiologischen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten durch Ver­ wendung eines oxidierenden Enzyms (z. B. Glukose- Oxydase, Cholesterin-Oxydase, Harnstoff-Oxydase, Azyl­ koenzym-A-Oxydase, Cholin-Oxydase, Glycerol-3-Phosphat- Oxydase oder drgl.) wurden bisher auf dem Gebiet der klinischen Chemie durchgeführt. Nach diesen Verfahren wird das Wasserstoffperoxid, das aus der interessierenden physiologischen Komponente gewonnen wurde, weiter umgesetzt und die photometrische Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischung gemessen. Der gemessene Wert wird mit denen einer Eichkurve verglichen, die vorher durch Messungen mit der physiologischen Komponente in reiner Form gewonnen worden ist, woraus die Konzentration der physiologi­ schen Komponente in der biologischen Flüssigkeit er­ rechnet wird (vgl. Biochem. J. 42, 221 (1948); ibd., 33 (1901); Clin.Chem.,19, 1350 (1973)). Diese Verfahren zum Bestimmen der physiologischen Komponenten wurden jedoch zu einem gewissen Grad von physiologischen Komponenten beeinträchtigt, die sich normalerweise nicht in der biologischen Flüssigkeit befanden. Bilirubin ist einer dieser interferierenden Stoffe für diese Ver­ fahren, dessen Konzentration im Blutserum nicht größer als 1 mg/dl im gesunden Menschen ist. Sie steigt unter pathologischen Bedingungen auf 20 mg/dl an (vgl. Clin.Chem.,19, 253 (1973); ibd.19, 308 (1973); ibd. 20, 1282 (1974)). Es wurden bislang daher mehrere Verfahren vorgeschlagen, die verhindern, daß Bilirubin die Bestimmung der physiologischen Komponenten beein­ trächtigt. Beispielsweise geschieht dies durch Beigabe Ferrocyanats, Ascorbinsäure, eines EDTA-Eisen-Komplexes oder eines sogenannten bilirubinspezifischen Fungal- Enzym-Präparates zum Reaktionssystem (vgl. JP-PS 25840/80 und die JP-OS 29718/80, 71398/82 und EP 5637. Diese vorveröffentlichten Verfahren weisen jedoch Nachteile auf und sie können nicht als befriedigend angesehen werden.
Es ist festgestellt worden, daß bei den herkömmlichen Verfahren zum quantitativen Bestimmen der physiologi­ schen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten durch Verwendung oxidierender Enzyme, wie sie vorstehend beschrieben sind, die Beigabe der Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Myrothecium oder Coprinus sowie des Additivs zum Reaktionssystem dazu führt, daß das konjugierte und unkonjugierte Bilirubin, die beide in der biologischen Flüssigkeit vorkommen, vollkommen zu einer harmlosen Substanz wie Biliverdin ohne Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert. Dadurch wird verhindert, daß Bilirubin das Bestimmen der physiologischen Kompo­ nenten beeinträchtigt. Es wurde dabei aber erkannt, daß die sogenannten farberzeugenden Substanzen (z. B. 4-Amino­ antipyrin, Phenol) in den Reagenzien zu einem gewissen Grad mit der zugegebenen Bilirubin-Oxydase reagieren, was Abträglichkeiten bei der Messung der Absorptions­ fähigkeit zur Folge hatte. Dies konnte durch Beigabe von Natriumfluorid, Phenanthrolin oder Hydroxylamin zum Reaktionssystem behoben werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend näher erläutert: Zunächst wird im wesentlichen in derselben Weise wie beim herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen einer interessierenden physiologischen Komponente jede der Lösungen der Komponente in reiner Form (Kristalle, Pulver oder Öl) unterschiedlicher Konzentration mit den Reagenzien (einschließlich eines oxidierenden Enzyms), die auch bei dem herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen der Komponente zur Anwendung kommen, zur Reaktion ge­ bracht, wobei die Bilirubin-Oxydase vom Myrothecium oder Coprinus zusammen mit den genannten Additiven und, soweit wie nötig, Natriumfluorid, Phenanthrolin oder Hydroxyl­ amin ebenfalls in der Reaktionsmischung enthalten sind. Danach wird der Absorptionsgrad jeder Reaktionsmischung mit ganz bestimmten Wellenlängen gemessen. Die gemessenen Werte werden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Komponente in einem Koordinatenkreuz aufgetragen, so daß die Eichkurve die Beziehung zwischen den Größen angibt.
Dann wird die Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einer unbekannten Konzentration der physiologischen Komponente derselben Reaktion in der beschriebenen Weise unterworfen und es wird der Absorptionsgrad der Reak­ tionsmischung gemessen. Die Konzentration der Komponente in der Probe kann dann durch Vergleichen des gemessenen Wertes mit denen der Eichkurve ermittelt werden.
Unter den physiologischen Komponenten, die mit diesem Verfahren untersucht werden sollen, sind neutrale Fette, freie Fettsäuren und Phospholipide, wie es den folgenden Beispielen zu entnehmen ist, mit Triolein, Oleinsäure und Cholin-Chlorid bezeichnet, wie es in derartigen Fällen üblich ist. Die mit Hilfe der Erfindung zu untersuchenden physiologischen Komponenten sind durchweg im Handel in Form von Kristallen, Pulver oder Öl erhältlich. Sie dienen zum Aufbau der jeweiligen Eichkurve in den Bei­ spielen.
Besondere Beispiele der oben genannten Additive zur Anwendung in der Erfindung umfassen oberflächenaktive Reagenzien wie Taurocholsäure, Natriumdodecylsulfat, Natriumcholat, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und Sulfosalicylsäure.
Es können ferner Puffer, Enzymstabilisatoren und dergl. verwendet werden, wenn dies notwendig ist.
Die Menge der Bilirubin-Oxydase wird so gewählt, daß ihre Konzentration in der Reaktionsmischung gleich 0,003 bis 0,40 U/ml beträgt, ausgedrückt durch die Aktivität der Bilirubin-Oxydase, deren Definition noch angegeben werden wird. Die Mengen der Additiven sind wie folgt gewählt:
Beispielsweise wird Natriumdodecylsulfat in einer solchen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 0,5 bis 10 mM in der Reaktionsmischung ergibt. Natrium­ cholat wird in einer solchen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 2 bis 30 mM in der Reaktions­ mischung ergibt. Schließlich werden Natriumfluorid, Phenanthrolin oder Hydroxylamin in einer solchen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 0,5 bis 10 mM in der Reaktionsmischung ergibt. Die Einheit der Bilirubin-Oxydasen-Aktivität ist wie folgt festgelegt: Fünf mg Bilirubin-Kristalle werden in 250 ml einer 0,2 M Tris-HCL-Pufferlösung (pH 8,4) mit Äthylendiamintetraacetat-Säure (1 mM) gelöst. 2 ml dieser Lösung wird mit 0,2 ml der Enzymlösung ver­ mischt. Diese Mischung wird auf 37° C gehalten und ihre Absorptionsabnahme bei 440 nm wird dann gemessen. Die Enzymmenge, die 1 mM Bilirubin pro Minute oxidiert, wird als eine Einheit definiert.
Die Erfindung soll in Verbindung mit den Zeichnungen und den Beispielen erläutert werden.
Fig. 1 zeigt die beim Beispiel 1 erhaltene Eichkurve, das unten beschrieben wird. Die Kurve zeigt die Beziehung zwischen Glucosekonzentration und Absorptionsfähigkeit;
Fig. 2 zeigt die im Beispiel 3, das unten beschrieben wird, erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen Cholesterinkonzentration und Absorp­ tionsfähigkeit darstellt;
Fig. 3 zeigt die im Beispiel 5, das unten beschrieben wird, erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen Triolinkonzentration und Absorptions­ fähigkeit darstellt.
Fig. 4 zeigt die im Beispiel 6, das unten beschrieben wird, erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen Oleinsäurekonzentration und Absorp­ tionsfähigkeit darstellt.
Fig. 5 zeigt die im Beispiel 7 erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen Cholinchlorid­ konzentration und Absorptionsfähigkeit darstellt.
Beispiel 1 (Bestimmung von Glukose im Blutserum)
Zu jeweils 0,02 ml wäßriger Lösungen mit 0, 100, 200 und 400 mg% Glukose wurden 3 ml von 0,1 M Phosphat­ pufferlösung (pH 7,5) mit den Reagenzien zur Verwendung bei herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen von Glukose in biologischen Flüssigkeiten, d. h. 4-Aminoantipyrin (0,4 mM), Phenol (15 mM), Glukose-Oxydase (17 U/ml) und Peroxydase (0,3 U/ml), sowie die Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Myrothecium-Ursprung (0,1 U/ml) und Natrium­ cholat (14 mM) hinzugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37° C 20 Minuten lang gehalten und ihre Ab­ sorptionsfähigkeiten bei 505 nm gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Glukoselösungen aufgetragen, um eine Eichkurve (Fig. 1) zu erhalten. Dann wurde eine Blutserumsprobe (0,02 ml) mit einer unbekannten, aber in den Bereich von 0 bis 400 mg% fallenden Glukosekonzentration (wird im folgenden beibehalten) und einer gesamten Bilirubinkonzentration von 12,5 mg% in der beschriebenen Weise der Reaktion ausgesetzt und die Absorptionsfähigkeit der sich erge­ benden Reaktionsmischung gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Fig. 1 wurde die Glukosekonzentration in der Probe zu 96,1 mg% ermittelt.
Als Kontrolltest wurde dieses Verfahren wiederholt mit der Ausnahme, daß keine Bilirubin-Oxydase und kein Natriumcholat zugegeben wurde, so daß die Glukosemenge in der Probe auf 90,2 mg% geschätzt wurde. Das obige Verfahren wurde noch einmal wiederholt, aber Natrium­ fluorid (1 mM) diente in diesem Fall als zusätzliches Reagenz. Obwohl die Form der Eichkurve und die geschätzte Glukosemenge in der Probe gegenüber dem vorliegenden Beispiel nicht verändert wurden, lag das Ergebnis des Blindversuchs so niedrig, daß es für die Messung der Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischungen geeignet erschien.
Beispiel 2 (Bestimmung von Glukose im Blutserum)
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Coprinus (3 mM/ml), anstelle von Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Myrothecium verwendet wurde. Es ergab sich eine der Fig. 1 ähnliche Eichkurve. Die Glukose­ menge in der Blutserumprobe wurde auf 95,8 mg% geschätzt.
Beispiel 3 (Bestimmung des gesamten Cholesterins im Blutserum)
Zu jeweils 0,02 ml von Dioxanlösungen von 0, 100, 200 und 400 mg% Cholesterin (Kristalle) wurden 3 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5) mit den Reagenzien zur Verwendung beim herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen des gesamten Cholesteringehaltes in biologischen Flüssig­ keiten, d.h. 4-Aminoantipyrin (0,4 mM), Phenol (15 mM), Cholesterin-Esterase (1 U/ml), Cholesterin-Oxydase (2 U/ml) Peroxydase (6,0 U/ml) und Triton X-100 (Waren­ zeichen der Fa. Wako Pure Chemical Industries Ltd.) (0.1%), sowie die Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Myrothecium (0,1 U/ml), Natriumdodecylsulfat (2,5 mM) und Natriumfluorid (2,5 mM) zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37° 20 Minuten lang gehalten und ihre Absorptionsfähigkeit bei 505 nm wurde gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzen­ trationen der Cholesterinlösungen aufgetragen, um die entsprechende Eichkurve (Fig. 2) zu erhalten.
Dann wurden 0.02 ml einer Blutserumsprobe mit einer unbekannten Gesamtcholesterinkonzentration (und einer Gesamtbilirubinkonzentration von 15,2 mg%) in derselben Weise der Reaktion ausgesetzt und die Absorptionsfähig­ keit der sich ergebenden Reaktionsmischung gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Fig. 2 wurde die Gesamtcholesterinkonzentration zu 163 mg% ermittelt. Als Kontrolltest wurde dieses Ver­ fahren mit der Ausnahme wiederholt, daß keine Bilirubin- Oxydase, kein Natriumdodecylsulfat und kein Natrium­ fluorid zugegeben wurde, wodurch die Menge des gesamten Cholesterins in der Probe auf 145 mg% geschätzt wurde.
Beispiel 4 (Bestimmung des gesamten Cholesterins im Blutserum)
Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Coprinus (3 mU/ml), anstelle von Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Myrothecium verwendet wurde. Es ergab sich eine der in Fig. 2 gezeigten ähnliche Eichkurve. Die gesamte Cholesterinmenge in der Blutserumprobe wurde auf 160 mg% geschätzt.
Beispiel 5 (Bestimmung der neutralen Fette (wie Triolin im Blutserum)
Zu jeweils 0.02 ml von Acetonlösungen von 0, 100, 200, 300 und 400 mg% Triolin (Öl) wurden 3 ml einer 0.1 M-Trispufferlösung (pH 7,5) mit den Reagenzien zur Verwendung beim herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen neutraler Fette in biologischen Flüssigkeiten, d.h. 4-Aminoantpyrin (0,4 mM), Phenol (15 mM) Lipoprotein­ lipase (200 U/ml), Glycerol-Kinase (0,3 U/ml), Glycerol- 3-Phosphat-Oxydase (4 U/ml), Peroxydase (2 U/ml), Adenosin-Triphosphat (0,8 mM) und Triton X-100 (0,1%), sowie die Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Coprinus (0,05 U/ml), Natriumcholat (14 mM) und Phenanthrolin (2,5 mM) zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37° C 20 Minuten lang gehalten und ihre Ab­ sorptionsfähigkeit wurde bei 505 nm gemessen.
Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Kon­ zentrationen der Triolinlösungen aufgetragen, um eine Eichkurve zu erhalten (Fig. 3).
Dann wurde eine Blutserumsprobe von 0,02 ml mit unbe­ kannter Fettkonzentration (und einer Gesamtbilirubin­ konzentration von 14.2 mg%) der Reaktion in der be­ schriebenen Weise ausgesetzt und die Absorptions­ fähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung ge­ messen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit denen der Eichkurve nach Fig. 3 wurde die Konzen­ tration der neutralen Fette zu 78,0 mg% Triolin er­ mittelt. Als Kontrolltest wurde dieses Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß keine Bilirubin-Oxydase, kein Natriumcholat und kein Phenanthrolin zugegeben wurde, wodurch die Menge der neutralen Fette in der Probe auf 68,6 mg% geschätzt wurde.
Beispiel 6 (Bestimmung der freien Fettsäuren (wie Ölsäure) im Blutserum )
Zu jeweils 0.02 ml von äthanolischen Lösungen von 0, 250, 500 und 100 µEq/l Ölsäure (Öl) wurden 3 ml einer Pufferlösung (pH 6,75) mit den Reagenzien zur Verwendung bei den herkömmlichen Verfahren zum Be­ stimmen von freien Fettsäuren in biologischen Flüssig­ keiten, d.h. Azylcoenzym-A-Synthetase (0,4 U/ml), Azylcoenzym-A-Oxydase (5 U/ml), Peroxydase (5 U/ml), Adenosintriphosphat (4 µM), Koenzym A (0,5 µM), Farb­ bildner MMX (Warenzeichen der Fa. Kyowa-Medix Co.) (50 M) und Triton X-100 (0,1%), sowie Bilirubin- Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Myrothecium (0,1 U/ml), Natriumcholat (14 mM) und Natriumfluorid (2,5 mM) gegeben. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37° C 10 Minuten lang gehalten und ihre Absorptions­ fähigkeit wurde bei 660 nm gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Oleinsäure-Lösungen aufgetragen und so eine Eichkurve (Fig. 4) erhalten.
Dann wurden 0,02 ml einer Blutserumsprobe mit unbe­ kannter Konzentration der freien Fettsäure (und einer Gesamtbilirubinkonzentration von 10,8 mg%) der Reaktion in der beschriebenen Weise ausgesetzt und es wurde die Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktions­ mischungen gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit denen der Eichkurve nach Fig. 4 wurde die Konzentration der freien Fettsäure in der Probe zu 210 Eq/l als Ölsäure ermittelt. Als Kontrolltest wurde das beschriebene Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß keine Bilirubin-Oxydase, kein Natrium­ cholat und kein Natriumfluorid zugegeben wurde, wodurch die Menge freier Fettsäure in der Probe auf 182 Eq/l geschätzt wurde.
Beispiel 7 (Bestimmung von Phospholipiden - als Cholin­ chlorid - im Blutserum)
Zu jeweils 0.02 ml von wäßrigen Lösungen von 0, 150, 300, 450, 600 und 900 mg% Cholinchlorid (Pulver) wurden 3 ml einer 0,1 M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) mit den Reagenzien zur Verwendung bei dem üblichen Ver­ fahren zur Bestimmung von Phospholipiden in biologischen Flüssigkeiten, d.h. 4-Aminoantipyrin (0,4 mM), Phenol (15 mM), Phospholipase D (800 U/ml), Cholin-Oxydase (1 U/ml) und Peroxydase (2 U/ml), sowie die Bilirubin- Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Coprinus (0.05 U/ml), Natrium­ dodecylsulfat (2,5 mM) und Phenanthrolin (2,5 mM) zu­ gesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37° C 20 Minuten lang gehalten und ihre Absorptions­ fähigkeit bei 500 nm wurde gemessen. Die gemessenen Werte wurden dann gegen die jeweiligen Konzentrationen der Cholinchloridlösungen zum Erhalt einer Eichkurve (Fig. 5) aufgetragen.
Dann wurden 0,02 ml einer Blutserumsprobe mit unbe­ kannter Phospholipidkonzentration (und einer Gesamt­ bilirubinkonzentration von 14,1 mg%) in der beschrie­ benen Weise der Reaktion ausgesetzt, und die Absorp­ tionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischungen gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit denen der Eichkurve nach Fig. 5 wurde die Konzentra­ tion der Phospholipide in der Probe zu 277 mg% als Cholinchlorid ermittelt. Als Kontrolltest wurde dieses Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß keine Bili­ rubin-Oxydase, kein Natriumdodecylsulfat und kein Phenanthrolin zugegeben wurde, wodurch die Menge der Phospholipide in der Probe auf 262 mg% geschätzt wurde.

Claims (3)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer physiologischen Komponente aus der Gruppe Glukose, Cholesterin, neutrale Fette, freie Fettsäuren, Phospholipide und Harnsäure, die alle in menschlichem Blutserum enthalten sind, unter Verwendung von Reagenzien einschließlich eines oxidierenden Enzyms, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Verfahrensschritte:
  • a) Reagierenlassen der Reagenzien mit jeder Lösung der physiologischen Komponenten unterschiedlicher Konzentration, wobei die Reagenzien unter Anwendung des herkömmlichen Verfahrens zur Bestimmung der genannten Komponenten in Gegenwart von Bilirubin-Oxydase aus Mikroorganismen der Gattung Myrothecium oder der Gattung Coprinus und in Gegenwart von zumindest einem Additiv aus einer Verbindung aus der Gruppe Natriumcholat Taurocholsäure, Natriumdodecylsulfat, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und Sulfosalicylsäure, eine Eichkurve hervorbringen, welche die Beziehung zwischen der photometrischen Absorptionsfähigkeit jeder Reaktionsmischung und der Konzentration der genannten Komponente aufzeigt.
  • b) Unterwerfen eines Blutserums mit einer unbekannten Konzentration der genannten Komponente der Reaktion in derselben Weise wie unter a), um die Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung zu messen, und
  • c) Berechnen der Konzentration genannter Komponente in dem Blutserum durch Vergleich des in Schritt b) gemessenen Wertes mit denen der Eichkurve.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine Verbindung aus der Gruppe Natriumfluorid, Phenanthrolin und Hydroxylamin dem Reaktionssystem beigegeben wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das oxidierende Enzym, das in den Reagenzien zum Bestimmen der Komponente nach dem herkömmlichen Verfahren enthalten ist, ein Glied aus der Gruppe Glukose-Oxydase, Cholesterin-Oxydase, Harnstoff-Oxydase, Acylcoenzym-A-Oxydase, Cholin-Oxydase und Glycerol-3-Phosphat-Oxydase ist.
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