DE69005800T2

DE69005800T2 - Verfahren zur herstellung von kleinen partikeln von biologisch aktiven molekülen.

Info

Publication number: DE69005800T2
Application number: DE69005800T
Authority: DE
Inventors: Henry Auer; Larry Brown; Wayne Gombotz; Michael Healy
Original assignee: Alkermes Inc
Current assignee: Alkermes Inc
Priority date: 1989-05-01
Filing date: 1990-05-01
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2010-05-02
Also published as: DE69005800D1; AU620253B2; EP0432232B1; WO1990013285A1; US6569458B1; ATE99546T1; CA2030551A1; JPH0739339B2; ES2062530T3; EP0432232A1; JPH04500527A; CA2030551C; DK0432232T3; AU5635990A

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Teilchen biologischer Moleküle bei niedrigen Temperaturen unter Ausnutzung von Ultraschallenergie.
Es ist häufig erwünscht, biologisch aktive Proteine oder sonstige Moleküle in eine polymere Matrix zur Verwendung bei der gesteuerten Arzneimittelabgabe oder auf sonstigen Anwendungsgebieten, die stabile, gleichförmige Materialdispersionen erfordern, einzuarbeiten. Eine Verminderung der Teilchengröße solcher Substanzen, insbesondere solcher mit biologischer Aktivität, z.B. von Proteinen, spielt eine erhebliche Rolle bei der Ausgestaltung von Arzneimittelrezepturen.
So sollten beispielsweise bei der Herstellung injizierbarer polymerer Mikrokügelchen für gesteuerte Arzneimittelabgabesysteme die Mikrokügelchen einen Durchmesser von 50 um oder weniger aufweisen. Um eine homogene Verteilung von Arzneimittelteilchen über die Mikrokügelchenmatrix hinweg zu erreichen, sollten die Teilchen weit geringere Durchmesser aufweisen als das Mikrokügelchen selbst. In einem solchen System untergebrachte Teilchen mit (noch) kleinerem Durchmesser haben eine (noch) zweckmäßigere Freigabekinetik zur Folge und können dazu beitragen, die aus diesen Systemen oftmals zu Anfang freigesetzte große Arzneimittelmenge ("Explosionseffekt") zu beseitigen. Durch Steuern der Teilchengröße biologischer Moleküle in einem Mittel zur kontrollierten Freigabe kann man auch die Freigabegeschwindigkeit des Arzneimittels aus diesen Systemen variieren (vgl. Brown und Mitarbeiter in "controlled Release of Insulin from Polymer Matrices" "Diabetes" 35, 684-691 (1986)).
Die meisten kleinteiligen Verbindungen zur Verwendung auf pharmazeutischen Anwendungsgebieten werden nach üblichen Techniken, z.B. durch Sprühtrocknen, Vermahlen, Zerreiben und Lyophilisieren und Sieben, hergestellt. Jede dieser Techniken vermag die Teilchengröße der interessierenden Materialien zu vermindern, die Durchmesser sind jedoch für eine gesteuerte Freigabe ermöglichende Mikrokügelchensysteme oftmals nicht klein genug. Diese Verfahren sind auch noch mit anderen Nachteilen behaftet. Durch Sprühtrocknen kann man die Teilchengröße auf 5 um oder weniger vermindern, biologisch aktive Proteine können jedoch bei dem Verfahren infolge Denaturierung an der Grenzfläche zwischen wäßriger Phase und Luft und durch Einwirkung der beim Verdampfen des Lösungsmittels erzeugten Wärme inaktiviert werden. Das Sprühtrocknen ist darüber hinaus ineffizient, wobei eine Menge Material infolge Haftenbleiben an der großen Oberfläche der Vorrichtung verloren geht.
Durch Vermahlen und Zerreiben lassen sich Teilchen mit Durchmessern von lediglich 5 um herstellen, zahlreiche Teilchen sind jedoch weit größer. Da man sowohl beim Vermahlen als auch Verreiben große Materialmengen benötigt, können diese Techniken nicht auf teure biologisch aktive Proteine, die oftmals lediglich in geringen Mengen erhältlich sind, angewandt werden. Auch beim Vermahlen und Zerreiben kann es zu einer Denaturierung von Proteinen kommen. Beim Sieben lyophilisierter Pulver erreicht man (lediglich) Teilchengrößen von etwa 70 um oder mehr.
Aus der GB-A-2 077 693 ist ein Emulgationsverfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen bekannt.
Der vorliegenden Erfindung lag folglich die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung kleinteiliger biologischer Moleküle zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von biologisch aktiven Molekülen in Teilchenform, die gleichmäßig in einer polymeren Matrix zur gesteuerten Freigabe der biologisch aktiven Substanz dispergiert werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung kleiner Teilchen biologisch aktiver Moleküle eines Durchmessers im Bereich von etwa 0,1 bis 10 um, die mehr als 70% bis 95% ihrer ursprünglichen biologischen Aktivität behalten, wobei die Ausbeute an den Teilchen der biologisch aktiven Moleküle 80% oder mehr beträgt. Die Technik läßt sich auch zur Verminderung der Teilchengröße bei Präparaten biologisch aktiver Moleküle, einschließlich von Makromolekülen, wie Proteinen, oder kleineren Molekülen, wie Steroiden, Aminosäuren oder synthetischen Arzneimitteln, unter Erhaltung der Aktivität der Moleküle heranziehen. Ferner läßt sich das Verfahren zur Verminderung der Teilchengröße anderer, nicht biologisch aktiver Moleküle, z.B. von Zuckern oder Mischungen dieser Moleküle mit Proteinen, durchführen.
Das Verfahren zur Verminderung der Teilchengröße dieser Verbindungen umf aßt zwei Hauptstufen. In der ersten Stufe werden die betreffenden Moleküle in einem Lösungsmittel gelöst und in ein eine niedrige Temperatur aufweisendes verflüssigtes Gas zerstäubt. Danach wird das flüssige Gas verdampft, wobei Lösungsmittel und das interessierende Material enthaltende gefrorene kugelige Teilchen zurückbleiben. Das Lösungsmittel wird aus den gefrorenen Kügelchen durch Lyophilisieren entfernt, wobei poröse Kügelchen mit Durchmessern im Bereich von 10 bis 60 um entstehen. Diese Kügelchen können, wenn größere Teilchen gewünscht werden, so wie sind, verwendet werden. Werden kleinere Teilchen gewünscht, können sie in einem nicht-Lösungsmittel suspendiert und mit Ultraschall oder auf sonstige mechanische Weise behandelt werden, um die Kügelchen zu kleineren Teilchen mit Durchmessern im Bereich von etwa 0,1 bis 10 um aufzubrechen. Die porösen kugeligen Teilchen oder die kleineren Teilchen können in Polymer- oder Arzneimittelträger-Lösungsmittel-Lösungen suspendiert und zur Verwendung in Arzneimittelabgabesystemen eingeschlossen bzw. untergebracht werden, da sich die Teilchen durch die Matrix hindurch homogen dispergieren lassen. Auf diese Weise erreicht man eine reproduzierbare und steuerbare Freigabekinetik.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt in schematischer Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Herstellung poröser Kügelchen biologischer Moleküle;
Fig. 2 zeigt in schematischer Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Herstellung kleiner Teilchen biologischer Moleküle aus den porösen Kügelchen gemäß Fig. 1;
Fig. 3 zeigt in grafischer Darstellung die Beziehung zwischen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichten Teilchengröße von Meerrettichperoxidase (um) und der Beschallungsdauer (s) mit Ultraschall;
Fig. 4 zeigt in grafischer Darstellung die Beziehung zwischen der mittleren Größe (um) von Dextranteilchen und der Dextrankonzentration in Lösung (% g/v), wenn die Teilchen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden;
Fig. 5 zeigt die Spektren des zweiten Absorptionsderivats in Bezug auf die Wellenlänge von frischem Hämoglobin, von im Rahmen des erfindungsgemäßen Teilchenverkleinerungsverfahrens behandeltem Hämoglobin und von in 6 M Guanidiniumchlorid denaturiertem Hämoglobin.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Zahlreiche bekannte Verfahren zur Herstellung kleiner Teilchen biologischer Moleküle liefern entweder (nur) Teilchen großen Durchmessers, führen zu einem gewissen Materialverlust oder bedingen einen signifikanten Verlust an biologischer Aktivität. Im Gegensatz dazu kann man im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren die Größe von teilchenförmigen biologischen Molekülen unter Erhaltung von mehr als 70% ihrer ursprünglichen biologischen Aktivität und üblicherweise von mehr als 90-95% der biologischen Ausgangsaktivität, und unter Erhaltung von 80% oder mehr des Ausgangsmaterials vermindern.
Im Rahmen dieses Verfahrens einsetzbare Substanzen sind beispielsweise Proteine, Kohlenhydrate, z.B. natürliche oder synthetische Polysaccharide und Zucker, Nucleotide und sonstige biologisch aktive anorganische und organische Moleküle eines breiten Molekulargewichtsbereichs. Representative Beispiele biologisch wertvoller Polypeptide sind unter anderem Nucleoproteine, Glykoproteine und Lipoproteine. Zahlreiche Proteinklassen eignen sich zum Einsatz im Rahmen dieses Verfahrens. Hierzu gehören Antikörper, Enzyme, hormonell aktive Polypeptide, Immunmodulatoren, wie Lymphokine, Monokine und Cytokine, wachstumsregulierende Proteine, Blutproteine und Antigene für virale, bakterielle und parasitische Impfstoffe. Beispiele für sonstige biologische Moleküle, die im Rahmen dieses Verfahrens einsetzbar sind, sind Steroide, Lipide, synthetische und natürlich vorkommende Arzneimittel sowie Aminosäuren.
Das Verfahren ist schematisch in Figs. 1 und 2 dargestellt.
Wie aus Fig. 1 hervorgeht, wird das biologisch aktive Molekül zunächst in einem Lösungsmittel zur Bildung einer Lösung 10 einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1-25% (g/v) gelöst. Das Lösungsmittel muß lyophilisierbar sein. Es kann aus reinem Wasser bestehen oder auf einen speziellen pH-Wert oder eine spezielle Ionenstärke gepuffert sein. Das Lösungsmittel kann auch organischer Natur sein. Die Lösung kann einen einzigen Molekültyp, Mischungen aus 2 oder mehreren Molekültypen, Mischungen aus biologisch aktiven Molekülen und Stabilisatoren oder irgendeine Kombination derselben enthalten. Zur weitestgehenden Verminderung der Teilchengröße bestimmter Moleküle sollte das Molekül in einem Medium suspendiert werden, in dem nicht nur das Lösungsmittel, sondern auch die Puffersalze unter den Lyophilisierungsbedingungen flüchtig sind. Beispiele für durch Lyophilisieren entfernbare flüchtige Puffer sind Ammoniumbicarbonat und sonstige Ammoniumsalze.
Die Lösung 10 wird dann zerstäubt. Die gebildeten Tröpfchen werden unter Verwendung irgendeiner beliebigen Vorrichtung 14, z.B. mittels Ultraschalldüsen, Druckdüsen, pneumatischen Düsen und Drehdüsen, in ein eine niedrige Temperatur aufweisendes verflüssigtes Gas 12 gesprüht. Das verflüssigte Gas 12 kann aus flüssigem Argon (-185,6ºC), flüssigem Stickstoff (-195,8ºC), flüssigem Sauerstoff (-182,9ºC) oder irgendeinem anderen flüssigen Gas, das zu einem augenblicklichen Gefrieren der zerstäubten Teilchen zu gefrorenen Teilchen 15 führt, bestehen.
Beim Eintritt in das kalte verflüssigte Gas gefrieren die Tröpfchen augenblicklich. Das verflüssigte Gas 12 wird durch Verdampfen bei einer Temperatur, bei der das Lösungsmittel gefroren bleibt, entfernt, wobei gefrorene Tröpfchen von Lösungsmittel und biologisch aktiven Molekülen 16 zurückbleiben. Das gefrorene Lösungsmittel wird aus den Tröpfchen 16 durch Lyophilisieren entfernt, wobei poröse Kügelchen 18 entstehen. Diese Kügelchen können je nach der zu ihrer Zerstäubung verwendeten Technik in ihrem Durchmesser variieren, in der Regel besitzen sie jedoch Durchmesser im Bereich von etwa 10 bis 90 um.
Diese Technik eignet sich besonders gut für Proteine. Bei Verwendung flüchtiger Puffersalze besteht der nach dem Lyophilisieren der gefrorenen Tröpfchen der proteinhaltigen Lösung zurückbleibende einzige Feststoff aus dem Protein selbst, mit Poren in dem Raum, der ursprünglich von dem flüchtigem Puffer beigesetzt war. Diese Poren vermindern weitestgehend eine Kohäsion proteinhaltiger Teilchen und gestatten eine Zerkleinerung der Proteinteilchen zu kleinen Stücken.
Die porösen Kügelchen 18 können ohne Weiterbehandlung benutzt werden, wenn etwas größere Teilchendurchmesser gewünscht werden. Die porösen Kügelchen eignen sich zur Bildung polymerer Arzneimittelabgabeformen. Werden sie in einem Polymer/Lösungsmittel-System, in dem die Kügelchen 18 nicht löslich sind, suspendiert, erhält man eine stabile Suspension 22 der Kügelchen 18. Die Wahl der zum Suspendieren der porösen Kügelchen verwendbaren nicht-Lösungsmittel hängt von der Natur der die Kügelchen bildenden Moleküle sowie dem Polymer/Lösungsmittel-System ab. Beispiele für nicht-Lösungsmittel für Proteine sind Aceton, Ethylacetat, Methylenchlorid, Chloroform und Tetrahydrofuran. Das nicht-Lösungsmittel für die porösen Kügelchen muß ein Lösungsmittel für das Polymer darstellen. Beispiele für Polymer/Lösungsmittel-Lösungen, in dem Proteine nicht löslich sind, sind Poly(milchsäure)/Methylenchlorid, Poly(milch-co-glykolsäure)/Ethylacetat und Ethylen/Vinylacetat-Mischpolymer/Methylenchlorid. Solche Suspensionen lassen sich in eine gesteuerte Freigabe ermöglichende Systeme in Form injizierbarer Mikrokügelchen oder implantierbarer Matrices überführen. Diese Systeme können biologisch auslaugbar oder nicht-auslaugbar sein.
Die porösen Teilchen können auch in Elixieren zur medizinischen Behandlung, Aerosolsprays zur Abgabe in die Lunge oder auf das Nasenepithel, Suppositorien, Tabletten und transdermalen Abgabesystemen untergebracht werden.
Wie aus Fig. 2 hervorgeht, läßt sich die Größe der porösen Kügelchen 18 weiter vermindern, indem man die Kügelchen 18 in einem nicht-Lösungsmittel 20, wie Ethanol, Aceton, Methylenchlorid oder Ethylacetat oder in irgendeinem anderen Lösungsmittel, in dem die Moleküle nicht löslich sind, suspendiert und auf die Suspension 22 Ultraschallenergie oder Energie aus sonstigen zerteilenden Energiequellen (Homogenisierung) verschieden lange unter kontinuierlichem Kühlen einwirken läßt, um die porösen Kügelchen aufzubrechen. In der Regel ist es nicht zweckmäßig, auf die Teilchen mehr Energie einwirken zu lassen als für die Herstellung eines speziellen Teilchendurchmessers erforderlich ist. Je länger die Suspension 22 Ultraschallenergie ausgesetzt wird, desto kleiner wird die Größe der Teilchen 24. Dieses Verfahren führt zu einer Verminderung der Größe der Teilchen 18 unter Bildung von Teilchen 24 eines Durchmessers im Bereich von etwa 0,1 bis 10 um.
Durch (geeignete) Wahl eines nicht-Lösungsmittels für die Moleküle in den Teilchen, das ein Lösungsmittel für ein spezielles Polymer darstellt, läßt sich diese Stufe zur Herstellung gleichförmiger Dispersionen kleiner Teilchen in Polymerlösungen zum anschließenden Einschluß oder zur anschließenden Einkapselung der Teilchen in eine polymere Matrix variieren.
Die Teilchen 24 werden dann aus der beschallten Suspension 26 in dem Fachmann bekannter Weise, z.B. durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Sieben, entfernt. Wurde die Teilchengröße in einem Polymer/Lösungsmittel-System verkleinert, können die Teilchen beispielsweise in die Form von Mikrokügelchen gebracht oder zu Tabletten, Elexieren, Aerosolsprays, Suppositorien oder transdermalen Verabreichungsformen verarbeitet werden. Dies geschieht nach dem Fachmann bekannten Verfahren.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Herstellung von Meerrettichperoxidaseteilchen mit Durchmessern von weniger als 5 um als Funktion der Beschallungsdauer mit Ultraschall.

250 mg des Enzyms Meerrettichperoxidase (HRP) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) wurden in 10 ml 0,05 M Phosphatpufferlösung eines pH-Werts von 7,2 gelöst. Die Lösung wurde durch eine Ultraschalldüse (SonoTek Corp., Modell 8700-60MS) in einen Behälter mit gerührtem flüssigem Stickstoff zerstäubt. Der die gefrorenen zerstäubten Kügelchen enthaltende flüssige Stickstoff wurde dann in einen eine Temperatur von -80ºC aufweisenden Gefrierschrank überführt, bis der flüssige Stickstoff verdampft war. Dies geschah in 1-2 h. Die gefrorenen Proteinkügelchen wurden dann mindestens 12 h zur Herstellung poröser Teilchen in eine Lyophilisiervorrichtung (Virtis Company Inc., Modell 10-MR-TR) überführt. Nach dem Lyophilisieren wurde der Durchmesser der HRP-Kügelchen durch Lichtmikroskopie bestimmt. Er lag im Bereich von 25 bis 35 um.
50 mg der lyophilisierten Mikrokügelchen wurden in 5 ml 100%iger ethanolischer Lösung suspendiert und in einem Eiswasserbad auf 0ºC gekühlt. Unter kontinuierlichem Kühlen wurden die porösen HRP-Teilchen unterschiedlich lange mittels einer Ultraschallsonde (Virtis Company Inc., Vir-Sonic 300) behandelt. Proben wurden mittels eines Analysegeräts für kleine Teilchen (Leeds and Northrup, Mikrotrac Modell 7995) auf den Teilchendurchmesser hin analysiert. Fig. 3 zeigt den als Funktion der Beschallungsdauer mit Ultraschall aufgetragenen mittleren Teilchendurchmesser. Nach 100 s war die Teilchengröße auf unter 5 um vermindert.
Nach dem Lyophilisieren und nach der Beschallung mit Ultraschall wurde die Aktivität der HRP bestimmt. Die zur Bestimmung der Enzymaktivität benutzte Methode beruht auf der Geschwindigkeit der 0xidation von p-Anisidin und ist in ihren Einzelheiten in "The Worthington Enzyme Manual" Worthington, D.D. (Herausgeber), Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ. S. 254 (1988) beschrieben. Die HRP behielt nach jeder Stufe des Teilchengrößenverminderungsverfahrens 90% oder mehr ihrer Ausgangsaktivität. Dies belegt, daß das Teilchengrößenverminderungsverfahren die Aktivität von HRP nur minimal beeinträchtigt.

Beispiel 2

Herstellung von Zinkinsulinteilchen mit Durchmessern von weniger als 4 um.

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung einer Lösung Zinkinsulin (American International Chemical, Inc., Natick, MA) in 1,05 M Citrat-Phosphat-Puffer eines pH-Werts von 5,2 wiederholt. Der mittlere Teilchendurchmesser nach 5minütiger Beschallung betrug 3,2 ± 2,5 um.

Beispiel 3

Herstellung von Katalaseteilchen mit Durchmessern von weniger als 5um.

Die Maßnahmen des Beispiels 1 wurden unter Verwendung von Katalase (Sigma Chemical Co.) wiederholt. Der mittlere Teilchendurchmesser nach 5minütiger Beschallung betrug 4,5 ± 3,3 um.

Beispiel 4

Herstellung von Superoxiddismutaseteilchen mit Durchmessern von weniger als 3 um.

Die Maßnahmen des Beispiels 1 wurden unter Verwendung von Superoxiddismutase (America International Chemicals, Inc.) wiederholt. Der mittlere Teilchendurchmesser nach 5minütiger Beschallung betrug 2,7 ± 2,1 um.
Nach dem Lyophilisieren und nach der Beschallung mit Ultraschall wurde die Aktivität der SOD bestimmt. Die zur Bestimmung der Enzymaktivität benutzte Methode beruht auf der Fähigkeit von SOD zur Hemmung der Reduktion von Nitroblautetrazolium durch das Superoxidanion. Dieser Test wird in seinen Einzelheiten von Winterbourne und Mitarbeitern in "The Estimation of Red Cell Superoxide Dismutase Activity" "J. Lab. Clin. Med." 85, 337 (1975) beschrieben. Nach dem Lyophilisieren besaß die SOD 94% ihrer ursprünglichen Aktivität. Nach der Beschallung mit Ultraschall besaß die SOD 91% ihrer ursprünglichen Aktivität. Dies zeigt, daß das Teilchengrößenverminderungsverfahren die Aktivität von SOD nur minimal beeinflußt.

Beispiel 5

Herstellung von Heparinteilchen mit Durchmessern von weniger als 7 um.

Die Maßnahmen des Beispiels 1 wurden unter den angegebenen Bedingungen wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß das verwendete Makromolekül aus in entionisiertem Wasser gelöstem Heparin (Diosinth Inc.) bestand. Der mittlere Teilchendurchmesser nach 5minütiger Beschallung betrug 6,9 ± 4,0 um.

Beispiel 6

Herstellung von Hämoglobinteilchen mit Durchmessern von weniger als 2 um.

Die Maßnahmen des Beispiels 2 wurden unter Verwendung von Rinderhämoglobin (Sigma Chemical Co.) wiederholt. Der mittlere Teilchendurchmesser nach 5minütiger Beschallung betrug 1,8 ± 1,3 um.

Beispiel 7

Herstellung von Hämoglobinteilchen mit Durchmessern von weniger als 2 um unter Verwendung von flüssigem Argon.

Die Maßnahmen des Beispiels 6 wurden unter den angegebenen Bedingungen wiederholt, wobei jedoch die Hämoglobinlösung vor dem Lyophilisieren in flüssiges Argon gesprüht wurde. Der mittlere Teilchendurchmesser nach sminütiger Beschallung betrug 3,6 ± 2,8 um.

Beispiel 8

Herstellung von HRP-Teilchen mit Durchmessern von weniger als 5 um als Funktion des pH-Werts.

Die Maßnahmen des Beispiels 1 wurden unter den angegebenen Bedingungen wiederholt, jedoch mtt der Ausnahme, daß zum Auflösen der HRP drei verschiedene Puffer unterschiedlicher pH-Werte verwendet wurden, nämlich ein Citrat/Phosphat-Puffer eines pH-Werts von 5,2, ein Phosphatpuffer eines pH-Werts von 7,2 und ein Tris-Puffer eines pH-Werts von 9,1. Die lyophilisierten Teilchen wurden 5 min lang beschallt, worauf ihre Teilchengröße bestimmt wurde. Diese ist in Fig. 1 dargestellt. Tabelle 1: Teilchengröße von beschallter HRP als Funktion des Puffer-pH-Werts. Puffer pH-Wert Teilchengröße (um)

Beispiel 9

Herstellung von Dextranteilchen mit Durchmessern von weniger als 5 um als Funktion der anfänglichen Dextrankonzentration.

Die Maßnahmen des Beispiels 1 wurden unter Verwendung von Dextran (Sigma Chemical Co., Molekulargewicht: 40 200) in Konzentrationen von 20, 10, 5, 1, 2,5 bzw. 0,5% wiederholt. Die Teilchengrößen dieser Proben wurde nach dem Suspendieren in 100%igem Ethanol und Sminütiger Beschallung mit Ultraschall bestimmt.
Fig. 4 zeigt die mittlere Teilchengröße des Dextrans als Funktion der Konzentration der zur Herstellung der Makromolekülkügelchen jeweils verwendeten Dextranlösung. Die Ergebnisse zeigen, daß die kleinsten Teilchen bei Verwendung 0,5-5%iger Dextranlösungen erhalten werden.

Beispiel 10

Herstellung von Superoxiddismutase/Dextran-Teilchen mit Durchmessern von weniger als 7 um.

125 mg SOD und 125 mg Dextran wurden in einer 0,05 M Citrat/Phosphat-Pufferlösung eines pH-Werts von 5,2 gelöst. Die wäßrige Lösung wurde in der in Beispiel 1 geschilderten Weise in flüssigen Stickstoff zerstäubt. Der mittlere Teilchendurchmesser nach 5minütiger Beschallung betrug 6,9 ± 6,5 um.

Beispiel 11

Herstellung von Hämoglobinteilchen mit Durchmessern von weniger als 4 um unter Verwendung von Ammoniumbicarbonat als Pufferkomponente.

In 5 ml 0,05 M Ammoniumbicarbonat gelöste 125 mg Rinderhämoglobin wurden durch Versprühen und Lyophilisieren entsprechend Beispiel 1 in Teilchen überführt. Aufnahmen der Teilchen mit einem Abtastelektronenmikroskop (SEM) zeigten Kügelchen mit einem äußeren Film und einein schwammigen Inneren mit Größendurchmessern im Bereich von 15-70 um. Eine lediglich Ammoniumbicarbonat enthaltende Vergleichslösung wurde ebenfalls entsprechend Beispiel 1 versprüht und lyophilisiert. Die Abwesenheit irgendeines festen Rückstands nach dem Lyophilisieren zeigte die Flüchtigkeit des Puffersalzes unter den eingehaltenen Bedingungen.
Die Hämoglobinteilchen wurden in Ethylacetat suspendiert und durch Beschallung mit Ultraschall unter Kühlen mit Hilfe eines Eisbades verkleinert. Wurde die Teilchengröße der erhaltenen Teilchen unter Verwendung eines Mikrotrac-Analysegeräts für kleine Teilchen von Leeds & Northrup bestimmt, zeigte es sich, daß der mittlere Teilchendurchmesser 3 7 ± 2,8 um betrug. Aufnahmen der beschallten Teilchen mit Hilfe eines Abtastelektronenmikroskops zeigte flache unregelmäßige Plättchen mit Längen in der Größenordnung von 1,0 um bei einer Dicke von 0,1 um.

Beispiel 12

Herstellung von Hämoglobinteilchen mit Durchmessern von weniger als 7 um unter Durchführung einer Homogenisierung

Ein Teil der gemäß Beispiel 11 erhaltenen kugeligen Hämoglobinteilchen wurde durch Suspendieren derselben in Ethylacetat und Homogenisieren derselben unter Verwendung eines Homogenisators (Brinkmann Instruments Co., Schweiz) anstelle einer Beschallung mit Ultraschall zerkleinert.
Eine Teilchengrößenanalyse der erhaltenen zerkleinerten Teilchen ergab eine Größenverteilung der wirksamen Durchmesser nach 80 s Homogenisieren von 7 2 ± 3,7 um. Nach 300 s Homogenisieren betrug die Teilchendurchmessergrößenverteilung 6,6 ± 3,7 um.
Die homogenisierten Hämoglobinteilchen wurden 7 Tage lang in Ethylacetat gelagert, worauf das Lösungsmittel abdekantiert und das Hämoglobin unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Der erhaltene Feststoff wurde in 0,2 M Natriumphosphat eines pH-Werts von 7,7 gelöst. Seine Hämabsorption wurde mit derjenigen von frisch gelöstem Rinderhämoglobin sowie von in 6 M Guanidiniumchlorid denaturiertem Hämoglobin verglichen. Der Vergleich erfolgte unter Verwendung eines Diodenfeldspektralfotometers von Hewlett Packard. Zur Betonung der spektralen Merkmale wurde für jede Probe das zweite Absorptionsderivat in Bezug auf die Wellenlänge hergestellt. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 5. Die Spektren belegen, daß die Proben von frischem Hämoglobin und von nach dem hierin beschriebenen Verfahren behandeltem Hämoglobin identisch sind und sich erheblich von der Kurve für denaturiertes Hämoglobin unterscheiden. Dies zeigt, daß das Teilchenverminderungsverfahren keine signifikanten Änderungen im Proteinmolekül herbeiführt.

Beispiel 13

Herstellung von Meerrettichperoxidaseteilchen mit Durchmessern von weniger als 3 um unter Verwendung von Ammoniumbicarbonat als Pufferkomponente.

In der in Beispiel 11 für Hämoglobin beschriebenen Weise wurden gefrorene Meerrettichperoxidaseteilchen hergestellt und durch Beschallung mit Ultraschall zerkleinert. Die Größenverteilung der effektiven Durchmesser der erhaltenen Teilchen betrug 2,8 ± 2,2 um. Die HRP- Teilchen behielten, nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren getestet, während des Verfahrens 90% ihrer Aktivität.

Beispiel 14

Herstellung von Rinderserumalbuminteilchen mit Durchmessern von weniger als 2 um unter Verwendung von Ammoniumbicarbonat als Pufferkomponente.

Rinderserumalbumin (BSA) wurde in 0, 4, 20 bzw. 100 mg Ammoniumbicarbonat/ml Wasser in einer Konzentration von 25 mg BSA/ml suspendiert, worauf in der in Beispiel 1 für Hämoglobin beschriebenen Weise Proteinteilchen hergestellt wurden. Bei Betrachtung unter einem Lichtmikroskop zeigte es sich, daß die aus BSA-Lösungen in 100 mg Ammoniumbicarbonat/ml Lösung hergestellten BSA-Teilchen extrem fadenförmige, luftige Proteinstränge enthielten. Die aus BSA in anderen Ammoniumbicarbonatlösungen hergestellten Teilchen erschienen auch fadenförmig, sie waren jedoch dichter.
Die aus 100 mg Ammoniumbicarbonat/ml hergestellte Probe wurde in Ethylacetat suspendiert und durch Beschallen mit Ultraschall zerkleinert. Das erhaltene Präparat zeigte eine Größenverteilung, bei der mehr als 60% der Teilchen einen Durchmesser von weniger als 1,7 um aufwiesen. Unter dem Lichtmikroskop waren in der Tat sämtliche Teilchen kleiner als 1 um.

Beispiel 15

Herstellung von Glycinteilchen mit Durchmessern von weniger als 3,5 um.

In entionisiertem Wasser wurde eine 2,5%ige Lösung von Glycin (EM Science) zubereitet. Diese wurde zur Herstellung von gefrorenen Teilchen einer Ultraschallbehandlung unterworfen. Letztere wurden entsprechend Beispiel 1 lyophilisiert. Bei der Betrachtung unter einem Lichtmikroskop waren poröse Teilchen eines mittleren Durchmessers von 24,4 ± 14,6 um erkennbar. Diese porösen Teilchen wurden durch 4minütiges Beschallen mit Ultraschall zerkleinert, wobei Teilchen eines mittleren Durchmessers von 3,2 ± 1,9 um erhalten wurden. Dieses Beispiel belegt die Brauchbarkeit dieses Verfahrens zur VermLnderung der Teilchengröße niedrigmolekularer Verbindungen, wie Glycin (75.07 Dalton).

Beispiel 16

Herstellung von Testosteronteilchen aus 1,4-Dioxan mit Durchmessern von weniger als 5 um.

Die Maßnahmen des Beispiels 1 wurden unter Verwendung einer 2,5%igen Lösung von Testosteron (Sigma Chemical Co.) in 1,4-Dioxan wiederholt. Die erhaltenen Teilchen besaßen einen mittleren Durchmesser von 5,4 ± 2,9 um, was die Wirksamkeit des Verfahrens zur Herstellung kleiner Steroidteilchen in organischen Lösungsmitteln belegt.

Beispiel 17

Herstellung einer stabilen Suspension von porösen BSA- Teilchen.

1,994 g Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma Chemical Co.) wurden in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst, durch eine Ultraschalldüse in flüssigen Stickstoff zerstäubt und lyophilisiert. Der Teilchendurchmesser der porösen Kügelchen reichte von 20-30 um.
Proben dieser BSA-Teilchen wurden in einer 10%igen (g/v) Lösung von Ethylen/Vinylacetat (USI Chemicals Co.) in Methylenchlorid suspendiert, wobei Mischungen mit 5, 10 bzw. 20 Gew.-% Protein erhalten wurden. In sämtlichen Fällen erhielt man stabile BSA-Suspensionen. Das BSA setzte sich im Laufe der Zeit nicht am Boden ab. Vermutlich diffundiert das Lösungsmittel in die porösen Teilchen und setzt die Teilchendichte mit derjenigen der Polymer/Lösungsmittel-Lösung ins Gleichgewicht.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung poröser Teilchen biologisch aktiver Moleküle eines Durchmessers von 0,1-10 um durch

Bereitstellen einer Lösung biologisch aktiver Moleküle, ausgewählt aus der Gruppe Kohlenhydrate, Polysaccharide, Nucleotide, anorganische Verbindungen, organische Moleküle, Polypeptide, Nucleoproteine, Glycoproteine und Lipoproteine, in einem durch Lyophilisieren entfernbaren Lösungsmittel;

Zerstäuben der Lösung in ein in einem Gefäß befindliches verflüssigtes Gas zur Herstellung von biologisch aktive Moleküle in Kombination mit dem Lösungsmittel enthaltenden gefrorenen Teilchen;

Entfernen des Gases aus dem die gefrorenen Teilchen enthaltenden Gefäß;

Entfernen des Lösungsmittels aus den Teilchen durch Lyophilisieren zur Herstellung poröser Teilchen;

Suspendieren der porösen Teilchen in einem nicht-Lösungsmittel für die biologisch aktiven Moleküle;

Zerkleinern der Teilchensuspension bis zur Gewinnung von Teilchen eines Durchmessers von 0,1 bis 10 um;

Entfernen der Teilchen aus dem nicht-Lösungsmittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gas aus der Gruppe Stickstoff, Argon und Sauerstoff ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem zusätzlich der Lösung zur Einstellung ihres pH-Werts oder ihrer Ionenstärke ein Puffer zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei zum Puffern der Lösung beim Lyophilisieren entfernbare Salze verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Lösung durch eine Ultraschalldüse zerstäubt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem weiterhin die porösen Teilchen in einer Polymer/Lösungsmittel-Lösung, ausgewählt aus der Gruppe Poly(milchsäure) /Methylenchlorid, Poly(milch-co-glykolsäure)/Ethylacetat und Ethylen-Vinylacetat/Methylenchlorid, suspendiert werden.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem weiterhin die Teilchen in einer polymeren Matrix eingekapselt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die auf die Anwesenheit der biologisch aktiven Moleküle zurückzuführende biologische Aktivität in den 0,1 bis 10 um großen Teilchen mehr als 70% der biologischen Aktivität in der Lösung der biologisch aktiven Moleküle beträgt und wobei die Aktivität in jedem Falle in Bezug auf die Menge der vorhandenen biologisch aktiven Moleküle bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die porösen Teilchen zusätzlich eine polymere Matrix umfassen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die polymere Matrix der porösen Teilchen aus Poly(milchsäure), Poly(milch-coglykolsäure), Ethylen-Vinylacetat, Copolymeren oder Mischungen derselben gebildet ist.