DE69415684T2

DE69415684T2 - Verfahren zur herstellung von mikrospharen mit einer wirbelschichtstufe

Info

Publication number: DE69415684T2
Application number: DE69415684T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey L. San Carlos Ca 94070 Cleland; Andrew J. San Mateo Ca 94401 Jones; Michael Frank San Francisco Ca 94122 Powell
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1993-10-22
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1999-06-10
Anticipated expiration: 2014-10-14
Also published as: EP0724433B1; DK0724433T3; EP0724433A1; JP3841309B2; ATE175110T1; JPH09504026A; CA2172508A1; AU8017494A; CA2172508C; WO1995011009A1; DE69415684D1; UY23846A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen, das Wirbelschichttrocknung umfaßt.

BESCHREIBUNG DES HINTERGRUNDES UND DES STANDES DER TECHNIK

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen bereit, worin die Mikrokügelchen in einer Wirbelschicht getrocknet werden. In den Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung kann jede Art von Wirkstoff eingekapselt sein, wie z. B. Antigene, Adjuvantien, Peptide, Polypeptide, Hormone, Antibiotika usw. Polymermatrices zum Ausbilden von Mikrokügelchen werden in der Literatur beschrieben. Die US-A-4.917.893 und 4.652.441 offenbaren eine Mikrokapsel, die durch Herstellung einer Wasser-in-Öl-Emulsion erzeugt wird, die eine innere wäßrige Schicht, die ein wasserlösliches Arzneimittel enthält, eine Arzneimittel-Rückhaltesubstanz und eine Ölschicht umfaßt, die eine Polymersubstanz enthält; die innere oder wäßrige Schicht ist auf eine Viskosität von nicht weniger als etwa 5.000 Centipoise eingedickt oder verfestigt. Die resultierende Emulsion wird Trocknung in Wasser unterzogen. Die US-A- 4.954.298 offenbart die Herstellung von Mikrokapseln durch Herstellung einer Wasserin-Öl-Emulsion, die aus einer wasserslöslichen, arzneimittelhältigen Lösung als innere wäßrige Phase und einer polymerhältigen Lösung als Ölphase besteht, Dispergieren der Emulsion in einer wäßrigen Phase und Unterziehen der resultierenden Wasser-in-Öl-in- Wasser-Emulsion einer Trocknung in Wasser, wobei die Viskosität der für die Herstellung der Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion verwendeten Wasser-in-Öl-Emulsion auf etwa 150 bis 10.000 Centipoise eingestellt wird.
Die Mikrokügelchen nach dem Stand der Technik sind typischerweise durch Vakuumtrocknung oder Lyophilisierung getrocknet worden. Diese Verfahren sind zeitaufwendig und führen oft zu Beeinträchtigungen oder "Reißen" der so getrockneten Mikrokügelchen.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Trocknen von Mikrokügelchen bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Trocknungsverfahren für Mikrokügelchen bereitzustellen, welches das zur Trocknung erforderliche Zeitausmaß und das Ausmaß an Beeinträchtigung der Mikrokügelchen verringert.
Diese und andere Ziele werden Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen bereit, worin die Mikrokügelchen in einer Wirbelschicht getrocknet werden. In den Mikrokügelchen gemäß vorliegender Erfindung kann jede Art von Wirkstoff, wie z. B. Antigene, Adjuvantien, Peptide, Polypeptide, Hormone, Antibiotika usw. eingekapselt sein. Eine bevorzugte Polymermatrix zur Bildung der Mikrokügelchen gemäß vorliegender Erfindung ist Poly(D-L-lactid-co-glykolid), es kann aber jeder beliebige Polyester verwendet werden. Die Mikrokügelchen gemäß vorliegender Erfindung werden vorzugsweise nach einem Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionsverfahren gebildet. Der Trocknungsschritt gemäß vorliegender Erfindung verringert die lange Zeitspanne, die traditionellere Verfahren zum Trocknen erfordern, und verringert das Ausmaß an Beeinträchtigung der Mikrokügelchen.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Einkapseln eines Wirkstoffs in Mikrokügelchen, folgendes umfassend:
(a) Auflösung eines Polymers in einem organischen Lösungsmittel, um eine Lösung zu bilden;
(b) Zugabe von Wirkstoff zur Lösung (a), um ein Polymer-Wirkstoff-Gemisch zu bilden, das eine erste Emulsion oder Suspension umfaßt;
(c) Zugabe des Gemischs aus Schritt (b) zu einem Emulgierbad, um Mikrokügelchen zu bilden, die eine zweite Emulsion umfassen;
(d) Härtung der Mikrokügelchen aus Schritt (c), um gehärtete Mikrokügelchen zu bilden, die eingekapselten Wirkstoff umfassen; und
(e) Trocknung der Mikrokügelchen aus Schritt (d) in einer Wirbelschicht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die einen Wirkstoff einkapselnde Mikrokügelchen umfaßt, worin die Mikrokügelchen in einer Wirbelschicht getrocknet sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Polylactid- Mikrokügelchen, welches das Trocknen der Mikrokügelchen in einer Wirbelschicht umfaßt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Schema, das das Gesamterosionsverfahren für Polylactid-(PLGA-)Mikrokügelchen darstellt. PLGA-Mikrokügelchen werden typischerweise vor der Verabreichung hydratisiert. VWasser hydrolysiert die Esterbindungen im PLGA-Rückgrat, wie im Schemaausschnitt gezeigt, was im Lauf der Zeit zu einer Gesamterosion des Polymers führt. Die Hydrolyserate hängt vom Wassergehalt der Mikrokügelchen, der Lösungsmittelumgebung (z. B. pH) und der Temperatur ab. Die Anzahl an Spaltungen im Polymerrückgrat, die erforderlich sind, um eine Fragmentierung der Mikrokügelchen herbeizuführen, hängt vom Molekulargewicht des Polymers ab.
Fig. 2 ist ein modifiziertes Schema von Miller et al. (J. Biomed. Mater. Res. 11: 711-719, 1977), das die in vivo-Abbaurate für PLGA-Polymere darstellt: Die X-Achse stellt den relativen Anteil von entweder Lactid oder Glykolid für jedes PLGA dar. Die langsamsten Abbauraten für ein bestimmtes Polymer-Molekulargewicht treten beim Polymilchsäure- (PLA-) oder Polyglykolsäure-(PGA-)System auf. Die rascheste Abbaurate wurde mit PLGA erreicht, das den gleichen Molanteil an Lactid und Glykolid enthält. Die Halbwertszeit in vivo bis zum vollständigen Abbau wurde durch Histologiestudien an Ratten gemessen.
Fig. 3 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen unter Verwendung eines Doppelemulsionsverfahrens darstellt. PLGA-Polymere mit unterschiedlichem Molekulargewicht wurden Methylenchlorid zugegeben und auflösen gelassen.
Eine Lösung von MN rgp120 oder rhGH (menschlichem Wachstumshormon) wurde dann unter Homogenisierung in das Methylenchlorid eingespritzt. Die homogenisierte Lösung wurde einer Polyvinylalkohol-(PVA-)Lösung zugegeben. Die PVA-Lösung wurde für einige Versuche mit Methylenchlorid gesättigt (1,5 Vol.-%). Die PVA- und Polymerlösungen wurden in einem 1-Liter-Fermenter vermischt, um die fertige Wasser-in-Ölin-Wasser-Emulsion zu bilden. Die resultierenden Mikrokügelchen wurden dann in das Härtungsbad übergeführt, das einen Wasserüberschuß enthielt, um das verbleibende Methylenchlorid zu extrahieren. Die gehärteten Mikrokügelchen wurden dann gewaschen und durch Lyophilisierung oder Stickstoff bei niedriger Temperatur (5ºC) (Wirbelschicht) oder Vakuumtrocknung getrocknet, um fertige Mikrokügelchen zur Analyse in vivo und in vitro herzustellen. Die kursiv angeführten Punkte sind die Variablen für jeden Verfahrensschritt.
Fig. 4 ist ein Schema, das ein Airlift-(Wirbelschicht-)Trocknungssystem zur Stickstofftrocknung von PLGA-Mikrokügelchen zeigt. (a) Aufschlämmung aus einer Diafiltrationseinheit wird in die Kammer gepumpt, wobei sich der obere Kolben (b) über dem Einlaß befindet. Der obere Kolben wird dann abwärts bewegt, und die überschüssige Flüssigkeit wird durch Zufuhr von Stickstoff über den oberen Einlaß (c) hinausgedrückt. Der Luftstrom wird dann umgelenkt, um die Mikrokügelchen durch Spülen mit Stickstoff über den unteren Einlaß zu suspendieren (d) und den Stickstoff über den oberen Einlaß (c) abzugeben. Nach vollständiger Trocknung (1 bis 2 Tage) wird das trockene Pulver entfernt, indem ein Sammelgefäß (Seitenarmkolben, nicht gezeigt) am Auslaß angeord net wird, der obere Koben (b) über den Auslaß bewegt wird und Stickstoffdruck auf den unteren Einlas (d) ausgeübt wird, während am Sammelgefäß ein Vakuum angelegt wird. Alternativ dazu kann der Trockner so konstruiert sein, daß beide Kolben in Position verschweißt sind und der obere Kolben über dem Einlaß für die Aufschlämmung angeordnet ist. Nach dem Einpumpen der Aufschlämmung wird der Aufschlämmungsauslaß- Seitenarm während der Trocknung mit einem Ventil verschlossen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

A. DEFINITIONEN

Die Begriffe "Polylactid" und "PLGA", wie hierin verwendet, werden austauschbar verwendet und bezeichnen ein Polymer von nur Milchsäure, ein Polymer von nur Glykolsäure, ein Gemisch solcher Polymere, ein Copolymer von Glykolsäure mit Milchsäure, ein Gemisch solcher Copolymere, oder ein Gemisch solcher Polymere und Copolymere. Eine bevorzugte Polymermatrix zur Bildung der Mikrokügelchen gemäß vorliegender Erfindung ist Poly(D-L-lactid-co-glykolid).
Der Begriff "Wirkstoff", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Verbindung von Interesse, die in Mikrokügelchen gemäß vorliegender Erfindung eingekapselt ist, wie z. B. eine therapeutische oder biologische Wirksubstanz. Beispiele für Wirkstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Liganden, Antigene, Adjuvantien, Hormone, Antibiotika, Enzyme usw.. "Wirkstoff" ist nicht auf ein einzelnes Mittel beschränkt, sondern kann auch eine Vielzahl von Wirkstoffen, wie z. B. Kombinationen von Antigenen, Kombinationen von Antigen(en) und Adjuvantien usw., umfassen.
Der Begriff "Einkapselung", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren zur Formulierung eines Wirkstoffs zu einer Zusammensetzung, die zur gesteuerten Freisetzung des Wirkstoffs dient. Beispiele für Einkapselungsmaterialien, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, umfassen ein beliebiges Einkapselungsmaterial, vorzugsweise Polyester, insbesondere Polymere, die hierin als "Polylactide" oder "PLGA" bezeichnet werden.
"Wirbelschicht", wie hierin verwendet, bezeichnet allgemein eine Schicht aus körnigen Teilchen, durch weiche hindurch ein Gasstrom langsam nach oben strömt, so daß sich die Poren und Kanäle mit einer weiteren Zunahme der Gasgeschwindigkeit vergrößern und die Teilchen sich weiter voneinander entfernen. In dieser Definition enthalten sind Wirbelschicht- oder Festbettkonfigurationen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Aufschlämmungs- und Rieselreaktorsysteme. In der Wirbelschicht verwendete Gase sind vorzugsweise Stickstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid, aber es kann jedes trockene Gas verwendet werden, welches das Entfernen von Wasser und/oder anderer Lösungsmittel erleichtert. Die Methodik zur Konstruktion eines Wirbelschicht- oder Festbettsystems ist nach dem Stand der Technik bekannt, ebenso wie Beispiele für Wirbelschichtsysteme, die sich zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen (siehe beispielsweise Perry & Chilton (Chemical Engineers' Handbook, R. H. Perry & C. H. Chilton, Hrsg., 5. Auflage, S. 4-20-4-40, 5-52-5-55, 1973).
Der Begriff "Exzipient", wie hierin verwendet, bezeichnet einen nicht-therpeutischen Träger, der einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugegeben wird, die pharmazeutisch annehmbar, d. h. in den eingesetzten Dosen und Konzentrationen für den Empfänger nicht-toxisch ist. Geeignete Exzipienten und deren Formulierung werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., 1980, Mack Publishing Co., Oslo, et al., Hrsg., beschrieben.
Mit dem Begriff "organisches Lösungsmittel", wie hierin verwendet, ist jedes Lösungsmittel gemeint, das Kohlenstoffverbindungen enthält. Beispiele für organische Lösungsmittel umfassen halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, Ester, Alkohole und Ketone, wie beispielsweise Methylenchlorid, Ethylacetat, ein Gemisch aus Ethylacetat und Benzylalkohol oder Aceton, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Ethanol.
"Polypeptid", wie hierin verwendet, bezeichnet allgemein Peptide und Proteine, die zumindest etwa zwei Aminosäuren aufweisen.
Der Begriff "trocken" oder "trocknen", wie hierin verwendet, bezeichnet das Entfernen von Wasser in ausreichendem Ausmaß, um ein Endprodukt mit weniger als 20 Gew.-% Restfeuchtigkeit bereitzustellen.
Der Begriff "härten", wie hierin in bezug auf Mikrokügelchen verwendet, bezeichnet die Extraktion von überschüssigem organischem Lösungsmittel aus der Polymerphase.

8. ALLGEMEINE VERFAHREN

Im allgemeinen wird die Mikroeinkapselung eines Antigens oder Adjuvans nach der kurz in Fig. 3 dargelegten Vorschrift durchgeführt. Zusammenfassend wird PLGA mit dem gewünschten Verhältnis zwischen Lactid und Glykolid (etwa 100 : 0 bis 0 : 100 Gew.-%, mehr bevorzugt etwa 65 : 35 bis 35 : 65, am meisten bevorzugt etwa 50 : 50) wird zunächst in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, oder Ethylacetat mit oder ohne Benzylalkohol oder Aceton bis zur gewünschten Konzentration (im allgemeinen etwa 0,05 bis 1,0 g/ml, vorzugsweise etwa 0,3 bis 0,6 g/ml) aufgelöst. Eine konzentrierte Antigen- oder Adjuvanslösung (beispielsweise typischerweise zumindest 0,1 mg/ml für Polypeptide, vorzugsweise mehr als etwa 100 mg/ml, beispielsweise abhängig vom Polypeptidtyp und der gewünschten Kernbeladung) wird dann geeigneterweise (etwa mit einer 25 Gauge-Nadel) in die Polymerlösung eingespritzt, während mit etwa 15.000 bis 25.000 U/min homogenisiert wird. Trockenes Antigen oder Adjuvans kann anstelle von wäßrigem Antigen oder Adjuvans verwendet werden. Nach dem Homogenisieren (im allgemeinen etwa 0,5 bis 5 min. mehr bevorzugt 1 min) wird die Emulsion dem Reaktionskessel (Emulgierbad) oder statischen Mischer (nicht dargestellt) zugeführt, um eine zweite Emulsion zu bilden. Das Emulgierbad ist typischerweise eine Polyvinylalkohollösung, gegebenenfalls einschließlich von Ethylacetat. Der Reaktionskessel wird mit hoher Geschwindigkeit (im allgemeinen etwa 1.700 bis 2.500 U/min) durchgemischt, um kleine Mikrokügelchen (etwa 20 bis 100 mm mittlerer Durchmesser) zu erzeugen. Die zweite Emulsion wird nach einer ausreichenden Zeitspanne, im allgemeinen etwa 0,5 bis 10 min. vorzugsweise etwa 1 min. zu einem Härtungsbad überge führt und für einen geeigneten Zeitraum, im allgemeinen etwa 1 bis 24 h, vorzugsweise etwa 1 h, leicht durchmischen gelassen. Wenn die Härtung abgeschlossen ist, werden die Mikrokügelchen vorfiltriert (beispielsweise mit einem 150 mm Sieb), aufkonzentriert und diafiltriert. Die Diafiltration erfolgt geeigneterweise in einer Amicon-Rührzelle (2.500 ml), vorzugsweise etwa mit einem 16 oder 20 um-Filter. Die Mikrokügelchen werden gewaschen, typischerweise mit etwa 1 bis 10 l, vorzugsweise etwa 15 l, vorfiltriertem Wasser und typischerweise mit etwa 1 bis 100 l, mehr bevorzugt 15 l, 0,1% Tween 20. Die fertigen Mikrokügelchen werden aus dem Filter entfernt und in Wasser resuspendiert und in Phiolen abgefüllt, vorzugsweise etwa 500 ml/Phiole in 3 cm³-Phiolen. Die Mikrokügelchen können dann getrocknet werden. Trocknen umfaßt Verfahren wie Lyophilisierung, Vakuumtrocknung und Wirbelschichttrocknung.
Drei andere beispielhafte Verfahren können eingesetzt werden, um Mikrokügelchen herzustellen. Beim ersten Verfahren wird eine Lösungsmittel-Verdampfungstechnik eingesetzt. Ein fester oder flüssiger Wirkstoff wird einem organischen Lösungsmittel zugesetzt, welches das Polymer enthält. Der Wirkstoff wird dann im organischen Lösungsmittel emulgiert. Diese Emulsion wird dann auf eine Oberfläche aufgespritzt, um Mikrokügelchen zu erzeugen, und das restliche organische Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt. Das zweite Verfahren umfaßt ein Phasentrennungsverfahren, das oft als Koazervation bezeichnet wird. Eine erste Emulsion aus wäßrigem oder festem Wirkstoff, dispergiert in organischem Lösungsmittel, welches das Polymer enthält, wird einer Lösung aus Nicht-Lösungsmittel, üblicherweise Silikonöl, zugegeben. Durch den Einsatz von Lösungsmitteln, die das Polymer nicht auflösen (Nicht-Lösungsmittel), aber das organische Lösungsmittel extrahieren, das zum Auflösen des Polymers verwendet wird (z. B. Methylenchlorid oder Ethylacetat), wird das Polymer dann aus der Lösung ausgefällt und bildet Mikrokügelchen, wenn der Vorgang während des Mischens auftritt. Beim dritten Verfahren wird eine Beschichtungstechnik eingesetzt. Eine erste Emulsion, die den Wirkstoff, dispergiert in einem organischen Lösungsmittel mit dem Polymer, umfaßt, wird mittels einer Luftsuspensions-Beschichtungsvorrichtung behandelt, wodurch die fertigen Mikrokügelchen erhalten werden.
Die Abbaurate für die Mikrokügelchen gemäß vorliegender Erfindung wird teilweise durch das Verhältnis zwischen Lactid und Glykolid im Polymer und das Molekulargewicht des Polymers bestimmt. Polymere mit unterschiedlichem Molekulargewicht (oder Eigenviskosität) können gemischt werden, um ein gewünschtes Abbauprofil zu ergeben.
Die Mikrokügelchen gemäß vorliegender Erfindung können in jeder gewünschten Größe in einem Bereich von etwa 0,1 bis hin zu über etwa 100 mm Durchmesser hergestellt werden, indem Verfahrensparameter, wie z. B. Rührgeschwindigkeit, Volumen des im zweiten Emulsionsschritt verwendeten Lösungsmittels, Temperatur, Konzentration des Polymers/der Polymere und Eigenviskosität des Polymers/der Polymere variiert werden.
Die Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung können ein Konservierungsmittel, einen oder mehrere Puffer, mehrere Exzipienten, wie z. B. Polyethylenglykol (PEG) zusätzlich zu Trehalose oder Mannit oder ein nichtionogenes Tensid, wie z. B. Tween- Tensid, enthalten. Nichtionogene Tenside umfassen Polysorbate, wie z. B. Polysorbat 20 oder 80, und die Poloxamere, wie z. B. Poloxamer 184 oder 188, Pluronic/Polyole und andere Ethylenoxid/Propylenoxid-Blockcopolymere usw.. Es werden Mengen eingesetzt, die wirksam eine stabile, wäßrige Formulierung ergeben, üblicherweise im Bereich von etwa 0,1% (w/v) bis etwa 30% (w/v).
Der pH der Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung beträgt allgemein etwa 5 bis 8, vorzugsweise etwa 6,5 bis 7,5. Geeignete Puffer zur Erreichung dieses pH sind je nach gewünschtem pH beispielsweise Phosphat-, Tris-, Citrat-, Succinat-, Acetat- oder Histidinpuffer. Vorzugsweise liegt der Puffer im Bereich von etwa 2 mM bis etwa 100 mM.
Beispiele für geeignete Konservierungsmittel für die Formulierung sind Phenol, Benzylakohol, Methakresol, Methylparaben, Propylparaben, Benzalkoniumchlorid und Benz ethoniumchlorid. Bevorzugte Konservierungsmittel sind etwa 0,2 bis 0,4º/0 (w/v) Phenol und etwa 0,7 bis 1% (w/v) Benzylalkohol, obwohl die Art des Konservierungsmittels und der Konzentrationsbereich nicht entscheidend sind.
Im allgemeinen können die Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung andere Komponenten in Mengen enthalten, die die Herstellung stabiler Formen nicht beeinträchtigen, und in Mengen, die sich für die wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichung eignen. Beispielsweise können andere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einen Teil der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bilden. Diese umfassen beispielsweise Salze, verschiedene Verdicker, zusätzliche Puffermittel, Geliermittel, Antioxidantien, Colösungsmittel und dergleichen; spezifische Beispiele dafür umfassen Tris(hydroxymethyl)aminomethan- Salze ("Tris-Puffer") und Dinatriumedetat.
Die Mikrokügelchen werden zusammen mit allen erforderlichen Kofaktoren in pharmazeutisch annehmbare, sterile, isotonische Formulierungen eingebracht und werden gegebenenfalls zusammen mit allen erforderlichen Cofaktoren auf herkömmliche Weise verabreicht, wie nach dem Stand der Technik bekannt. Mikrokügelchen-Formulierungen werden typischerweise als ein trockenes Pulver gelagert.
Weitere Details der Erfindung sind in den folgenden Beispielen zu finden, die den Schutzumfang der Erfindung näher definieren. Alle hierin genannten Verweise sind in ihrer Gesamtheit ausdrücklich durch Verweis hierin eingeschlossen.

BEISPIELE

1. MATERIALIEN UND VERFAHREN

a. Materialien

Poly(D-L-lactid-co-glykolid) (PLGA) wurde sowohl von Boehringer Ingelheim (BI) als auch Medisorb Technologies International L. P. (MTI) erstanden. PLGA mit 12 kD und 100 kD wurde von BI erhalten und PLGA mit 18 kD und 100 kD wurde von MTI erhal ten. Die Polymerzusammensetzungen waren entweder 50 : 50, 65 : 35 oder 75 : 25 Lactid : Glykdlid. Die 10%-ige Polyvinylalkohollösung (PVA Airvol 205, Air Products) wurde hergestellt, indem fester PVA in warmem Wasser (etwa 80ºC) gelöst wurde. Die fertige PVA-Lösung wurde mit 0,22 um Millipak-Filtern von Millipore filtriert. Methylchlorid (technische Reinheit) wurde von Baxter S/P käuflich erworben.
MN rgp120 (Chargen-Nr. Y16531/G90557) wurde zur Gänze zu 2,3 mg/ml Protein in 20 mM Tris, 0,120 M NaCl, pH 7,4 von Genentech, Inc, zugesetzt. Es wurde mit einem Amicon-Rührzellen-Konzentrator unter Verwendung einer YM 30.000 MW-Cutoff Membran bei 4ºC auf eine Endkonzentration von 154 mg/ml eingeengt und bei 2 bis 8ºC gelagert.
Lyophilisiertes QS21 (etwa 80% Reinheit, Chargen-Nr. D1949) wurde von Cambridge Biotech (Cambridge, MA) zur Verfügung gestellt. QS21 wurde in 200 mg/ml hergestellt, indem das lyophilisierte QS21-Pulver in 50% Ethanol/lNasser gelöst wurde. QS21 wurde in 50%-igem Ethanol mit 20% Tween 20 gelöst und damit versucht, die Einkapselungseffizienz und die Freisetzungsrate zu erhöhen. Die QS21-Lösungen wurden am selben Tag, an dem die Einkapselung erfolgte, hergestellt und verwendet.
rhGH wurde zur Gänze von Genentech., Inc. mit 5-10 mg/ml Protein in 10 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7, erhalten. Das Protein wurde mit einem 0,22 um-Filter abfiltriert, jeweils 20 ml in 100 cm³-Phiolen abgefüllt und lyophilisiert, um ein trockenes Pulver herzustellen. Das lyophilisierte Protein wurde mit 5 mM Kaliumphosphatpuffer, 2,5 mg/ml Trehalose, pH 8, auf 10 mg/ml Protein rekonstituiert. Das Protein wurde dann mit einem 0,22 um-Filter abfiltriert, jeweils 20 ml in 100 cm³-Phiolen gefüllt und wieder lyophilisiert, um ein trockenes Pulver herzustellen. Dieses fertige Pulver wurde mit 5 mM Kaliumphosphatpuffer mit pH 8 auf 400 mg/ml rhGH rekonstituiert. Diese rhGH-Lösung enthielt 100 mg/ml Trehalose und etwa 100 mM Kaliumphosphat, pH 8.

b. Mikroeinkapselung

Die Herstellung von rgp120-Mikrokügelchen wurde mittels Doppelemulgierung Wasserin-Öl-in-Wasser (WOW) durchgeführt, wie oben allgemein erörtert. Im speziellen betrugen die PLGA-Konzentrationen in Methylenchlorid 0,3 oder 0,6 g/ml, und die erste Emulsion wurde mit 15.000 U/min und 0 bis 1ºC in einem Wasserbad homogenisiert. Nach 1-minütiger Homogenisierung wurde die erste Emulsion (10 ml) zu 900 ml 10%- iger PVA-Lösung zugegeben, die 1,5% Methylenchlorid enthielt, und mit hoher Geschwindigkeit (800 bis 2.500 U/min) 1 min lang in einem Reaktionskessel (2 bis 8ºC) emulgiert. Um die Einkapselungseffizienz zu verbessern, wurde die zweite Emulsion ebenfalls mit 10%-igem PVA durchgeführt, der kein Methylenchlorid enthielt, und die Temperatur der zweiten Emulsion wurde auf 0 bis 3% gehalten. Um die niedrigere Temperatur zu erreichen, wurde das Ethylenglykol im Kühlmantel des Reaktionskessels auf -15ºC gehalten. Die zweite Emulsion wurde dann zum Härtungsbad übergeführt, das 12 l vorfiltriertes Wasser (MilliQ-Wassersystem, Millipore Corp.) mit 2 bis 8ºC enthielt. Die Mikrokügelchen wurden 1 h lang härten gelassen. Die gehärteten Mikrokügelchen wurden auf etwa 1,5 l eingeengt und gegen 15 l vorfiltriertes Wasser, gefolgt von 15 l 0,1% Tween 20 diafiltriert. Die Amicon-Rührzelle (2,5 l) wurde je nach der gewünschten Teilchengröße mit unterschiedlichen Filtersystemen betrieben. Nach dem Waschen wurden die Mikrokügelchen bis zur Trockene eingeengt. Die konzentrierten Mikrokügelchen wurden unter Verwendung eines Zellschabers aus dem Filter entfernt und in vorfiltriertem Wasser auf etwa 0,5 gm/ml resuspendiert.
QS21 wurde in 50%-igem Ethanol mit und ohne Tween 20 gelöst, wie oben beschrieben. Wie bei den rgp120-Lösungen wurde die QS21-Lösung in die Polymerphase eingespritzt. Bei den Mikrokügelchen-Präparaten, die sowohl rgp120 als auch QS21 enthielten, wurde die rgp120-Lösung nach der QS21-Lösung in die Polymerphase eingespritzt, um die potentielle Wechselwirkung zwischen rgp120 und dem Ethanol in der QS21-Lösung zu verringern. Die Mikroeinkapselung von QS21 wurde unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, wie oben für rgp120 beschrieben.
Die Mikroeinkapselung von rhGH in PLGA wurde durchgeführt, indem ein Doppel- emulsions-Wasser-in-Öl-in-Wasser (W/O/W)-System eingesetzt wurde, wie in Fig. 3 dargestellt. Das Polymer wurde dem organischen Lösungsmittel (Methylenchlorid oder Ethylacetat) zugegeben, und dann wurde die Lösung auf 1ºC abgekühlt. Die Lösung wurde mit 7.000 U/min homogenisiert, während die Lösung auf 1ºC gehalten wurde. Die Proteinlösung (Wasserphase) wurde dann nahe des Kopfes des Homogenisators, der mit 7.000 U/min arbeitete, innerhalb von 30 bis 60 s in die Polymerphase eingespritzt. Die Homogenisierung wurde ein weiter Minute lang fortgesetzt und die primäre Emulsion gebildet. Die 6%-ige PVA-Lösung (mit oder ohne Methylenchlorid) wurde auf 0 bis 3ºC abgekühlt und mit einer konstanten Geschwindigkeit (1.800-2.500 U/min) gerührt. Die primäre Emulsion wurde dann nahe dem unteren Rührflüge) in die PVA- Lösung eingebracht (mittels Metallinjektor, Stickstoffdruck oder peristaltischer Pumpe) und die sekundäre Emulsion erzeugt. Das Emulgieren wurde eine weitere Minute lang fortgesetzt. Die Doppelemulsion wurde dann zum Härtungsbad übergeführt, das mit einer konstanten Geschwindigkeit gerührt und auf 2 bis 8ºC gehalten wurde. Die Mikrokügelchen wurden unter konstantem Rühren 1 h lang bei SOG härten gelassen. Der Inhalt des Härtungsbades wurde durch ein 150 um-Sieb und in den Haltetank entleert. Die Mikrokügelchen wurden dann eingeengt und in einer 2,5 l-Amicon-Rührzelle (versehen mit einem 25 um-Sieb) gewaschen. Mehrere Zyklen mit geringen und großen Volumina der Naschlösung in der Rührzelle wurden durchgeführt, um für effiziente Entfernung von Mikrokügelchen zu sorgen, die kleiner als 25 um waren. Die gewaschenen Mikrokügelchen wurden durch Waschen des 25 um-Filters mit etwa 100 ml 0,1% Tween 20 gewonnen, in einem 250 ml-Becherglas gesammelt und bei 5ºC etwa 1 h lang absetzen gelassen. Der Überstand, der kleine Mikrokügelchen enthielt, die sich nicht absetzten, wurde durch Absaugen entfernt, und die verbleibenden Mikrokügelchen wurden zum Trocknen vorbereitet. Bei einigen Versuchen wurden die Schritte des Härtungsbades und des Waschens durch ein Wirbelstromfiltrationssystem ersetzt. Die Doppelemulsion wurde in ein Härtungsbad gegossen, das 6 l MilliQ-Wasser enthielt, und zu einem Wirbelstrom-Filtrationssystem geleitet. Der Inhalt wurde durch den Feedeinlaß gepumpt und über eine rotierende 25 um-Patronenmembran geleitet. Mikro kügelchen unter 25 um traten durch die Membran hindurch (Permeat), während der Rest der Mikrokügelchen zur weiteren Härtung und Filtration in das Härtungsbad zurückgeleitet wurde. An das Härtungsbad wurde eine konstante Zufuhr an frischem Wasser (oder 0,1% Tween 20) abgegeben, und der Flüssigkeitsspiegel wurde beibehalten. Am Ende dieses Verfahrens wurden die Mikrokügelchen gesammelt, durch ein 150 um-Sieb filtriert und absetzen gelassen, wonach der Überstand entfernt wurde. Die fertigen Mikrokügelchen wurden dann getrocknet.

c. Trocknungsverfahren

Es wurden drei verschiedene Trocknungsverfahren eingesetzt, um die Mikrokügelchen zu trocknen: Lyophilisierung, Vakuumtrocknung und Wirbelschichttrocknung unter Verwendung des in Fig. 4 gezeigten Systems oder einer 5 ml-Amicon-Rührzelle. Lyophilisierung und Vakuumtrocknung erfolgten, indem eine wäßrige Suspension der Mikrokügelchen in 3 ml-Phiolen mit ventiliertem Stöpsel gefüllt wurde. Zur Lyophilisierung wurden die Suspensionen 4,75 h lang bei -55ºC eingefroren, gefolgt von Erwärmen auf -20ºC. Bei -20ºC wurde 12 h lang ein Vakuum von 250 mTorr angelegt. Nach dem Abschluß des Entfernungsschritts des Wasser-Hauptanteils (primäre Trocknung) wurden die Proben auf 20ºC erwärmt und 6 h lang unter einem Vakuum von 250 mTorr gehalten. Vakuumtrocknung erfolgte, indem die Phiolen in einen abgedichteten Exsikkator bei 2 bis 8ºC angeordnet und eine Woche lang ein Vakuum angelegt wurde, um eine Restfeuchtigkeit von < 20% zu erzielen. Zur Wirbelschichttrocknung wurde eine Suspension der fertigen Mikrokügelchen dem Airlifttrockner (aus Fig. 4) oder einer Rührzelle zugeführt und die Restflüssigkeit durch Anlegen eines leichten (etwa 2 psi) Stickstoffdrucks an die Säule (Stickstoffstrom abwärts) entfernt. Nachdem die Restflüssigkeit entfernt worden war, wurde der Stickstoffstrom durch den Airlifttrockner oder die Amicon- Rührzelle nach oben gelenkt, um die Mikrokügelchen zu suspendieren. Die Stickstoffleitung wurde an einen Vorfilter (0,22 um) für die Rührzelle und eine Entwässerungssäule mit Vorfiltern für den Airlifttrockner angeschlossen. Ein Wasserbad wurde an den Mantel des Airlifttrockners angeschlossen, um das System auf 5ºC zu halten. Die Trocknung in der Amicon-Rührzelle erfolgte in einem 2 bis 8ºC kalten Raum.

d. Mikrokügelchen-Beladung

Der Proteingehalt der MN rgp120-PLGA- und rhGH-PLGA-Mikrokügelchen wurde wie folgt ermittelt. Getrocknete Mikrokügelchen (10 bis 20 mg) wurden 1 ml 1 n NaOH zugegeben und durch Schütteln bei Raumtemperatur für 2 bis 16 h auflösen gelassen. Standards von MN rgp120 oder rhGH wurden hergestellt, indem 5 n NaOH den Stammlösungen jedes Proteins (1,5 mg/ml MN rgp120; 5 mg/ml rhGH) zugegeben wurden, um eine 1 n NaOH-Lösung zu ergeben. In 1 n NaOH wird Tyrosin entprotoniert, was zu einer beträchtlichen Verschiebung des Absorptionsmaximums führt, und daher hat in 1 n NaOH gelöstes Protein ein anderes Absorptionsspektrum als natives Protein in Puffer bei neutralem pH. Standardlösungen, die verschiedene Konzentrationen an MN rgp120 oder rhGH in 1 n NaOH enthielten, wurden verwendet, um die verschobenen Absorptionsmaxima des Proteins und den Extinktionskoeffizienten bei dieser Wellenlänge zu bestimmen. Der Extinktionskoeffizient für MN rgp120 in 1 n NaOH betrug bei 284 nm 1,39 cm&supmin;¹(mg/ml)&supmin;¹. Der Extinktionskoeffizient für rhGH in 1 n NaOH betrug bei 294 nm 1,114 cm&supmin;¹(mg/ml)&supmin;¹.
Die von den Mikrokügelchen freigesetzte Proteinmenge wurde mit dem Pierce Chemical Co. BCA Protein Assay bestimmt. Es wurden sowohl lyophilisierte als auch "nasse" Mikrokügelchen analysiert. "Nasse" Mikrokügelchen wurden als Mikrokügelchen definiert, die von der Diafiltrationszelle entfernt und ohne zusätzliche Bearbeitung in Freisetzungsmedium suspendiert wurden. Die freigesetzte Proteinmenge wurde dann verwendet, um den Prozentsatz an aus den Mikrokügelchen freigesetztem MN rgp120 oder rhGH (Prozent der Gesamtmenge), auf Basis der Masse an Mikrokügelchen in der Freisetzungsvorrichtung, die Proteinbeladung der Mikrokügelchen und das Volumen des Freisetzungsmediums (20 mg Mikrokügelchen in 300 ul1 10 mM Hepes, 100 mM NaCl, 0,02 Gew.-% Tween 20, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,4) zu berechnen.
Die in den PLGA-Mikrokügelchen eingekapselte Menge an QS21 wurde ermittelt, indem die Mikrokügelchen bei Raumtemperatur über Nacht in 1 n NaOH gelöst wurden.
Die vollständig gelösten Lösungen wurden mit 6 n HCl neutralisiert. Die Proben wurden dann auf eine SEC-Säule, TSK G3000SW XL (0,78 · 30 cm), äquilibriert in 0,4 m KPO&sub4;, pH 7,0, aufgespritzt. Die Säulenlaufbedingungen waren die gleichen wie jene, die für die SEC-Analyse von rgp120 eingesetzt wurden. Da QS21 in 1 n NaOH abgebaut wird, enthielten die Chromatographen für die SEC-Analyse mehrere Peaks. Um die Gesamtmenge an QS21 zu quantifizieren, wurden die Peakflächen, die QS21 und dessen Abbauprodukten entsprachen, bei der Bestimmung der Kernbeladung verwendet. Als Standards wurden bekannte Mengen an QS21 zu Placebo-Mikrokügelchen zugegeben und dann mit 1 n NaOH behandelt. SEC-Analyse wurde an den Standards durchgeführt, und die Peakflächen aus den Standards wurden eingesetzt, um die Menge an QS21 in jeder Probe zu berechnen.
Aus Mikrokügelchen freigesetztes QS21 wurde mittels 5 um YMC C4 (0,46 · 25 cm) RP-HPLC mit 1 ml/min Strömungsgeschwindigkeit und Detektion bei 214 nm quantifiziert. Ein linearer Gradient von 25 auf 75% an Lösung B (Lösung A: 0,1% TFA in Wasser; Lösung B: 0,1% TFA in 90% Acetonitril) wurde innerhalb von 15 min laufen gelassen. QS21-Vergleiche wurden ebenfalls laufen gelassen. Bei der RP-HPLC-Analyse eluierte der rgp120-Peak vor dem QS21-Peak daher sorgt dieses Verfahren für die gleichzeitige Quantifizierung von aus den Mikrokügelchen freigesetztem QS21 und rgp120.

2. ERGEBNISSE

a. Auswirkung des Trocknens auf Initial Burst und Qualität der Mikrokügelchen

Um die Korrelationen zwischen Initial Burst, Polymer und Tocknungstechnik zu untersuchen, wurden Trocknungsversuche an mehreren Mikrokügelchen-Präparaten durchgeführt. Die bei diesen Untersuchungen eingesetzten Trocknungstechniken waren Lyophilisierung, Vakuumtrocknung und Wirbelschichttrocknung. Die Menge an anfänglich freigesetztem Protein (1 h Inkubation) aus mit jeder dieser Techniken getrockneten Mikrokügelchen würde mit dem Initial Burst (1 h) von Mikrokügelchen verglichen, die unmittelbar nach der Herstellung (naß) analysiert wurden.
Ein zur Verringerung der Mikrokügelchen-Trocknungszeit verwendetes Verfahren war Lyophilisierung, die üblicherweise nur 1 bis 2 Tage erfordert. Lyophilisierung oder Vakuumtrocknung der PLGA-Formulierungen mit niedrigem Molekulargewicht führte zu einer 1,5- bis 9fachen Zunahme des Initial Burst. wäßrige Proteintröpfchen, die an oder nahe der Oberfläche der Mikrokügelchen eingekapselt waren, verursachen vermutlich den Initial Burst aus diesen Mikrokügelchen. Wenn die Viskosität der ersten Emulsion erhöht wird, ist ein Koaleszieren der während der Homogenisierung gebildeten wäßrigen Tröpfchen weniger wahrscheinlich. Daher setzen kleine Tröpfchen an oder nahe der Oberfläche insgesamt weniger Protein für Mikrokügelchen frei, die das gleiche Gesamtvolumen an Wasser enthalten. Um die Viskosität der ersten Emulsion zu erhöhen, kann die PLGA-Konzentration im Methylenchlorid angehoben werden. Durch Erhöhen der PLGA (12 kd)-Konzentration von 0,3 auf 0,6 g/ml wurde der Initial Burst von lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Mikrokügelchen von mehr als 50% auf 30 bis 50% verringert. Anfängliche Mikrokügelchen, die mit 0,3 g/ml 12 kD (50 : 0 Lactid : Glykolid) PLGA in der ersten Emulsion erzeugt wurden, bekamen nach der Lyophilisierung auch Risse und brachen. Während der Lyophilisierung werden die Mikrokügelchen gefroren, und das überschüssige Wasser wird durch Sublimation entfernt. Die Bildung von Eiskristallen innerhalb der Mikrokügelchen kann zu Rißbildung oder vollständigem Brechen der Mikrokügelchen führen. Die Stabilität der wäßrigen Tröpfchen kann erhöht werden, indem die Viskosität der ersten Emulsion durch Temperaturreduktionen erhöht wird und indem das überschüssige Methylenchlorid aus der zweiten Emulsion entfernt wird, was eine raschere Bildung von Mikrokügelchen bewirkt. Wenn die Verfahrensbedingungen so modifiziert wurden, daß sie beide dieser Änderungen umfaßten, brachen die Mikrokügelchen nach dem Lyophilisieren oder Vakuumtrocknen nicht oder bekamen Risse, sondern wiesen einen starken Initial Burst (mehr als 65º/a) auf. Es ist wahrscheinlich, daß der starke Initial Burst aus der Instabilität der ersten Emulsion resultiert, die innerhalb der Mikrokügelchen eingekapselt ist. Mehr wäßrige Tröpfchen können sich an der Oberfläche ansammeln, wenn das Polymer auf über 2 bis 8ºC erwärmt wird, und daher für den starken Initial Burst sorgen, der bei den intakten Mikrokügelchen beobachtet wurde.
Im Gegensatz dazu verursachte Lyophilisierung keine Rißbildung oder Brechen von Mikrokügelchen, die entweder mit einem Gemisch im gleichen Massenanteil an PLGA mit hohem und niedrigem Molekulargewicht oder PLGA mit hohem Molekulargewicht allein erzeugt wurden, wenn sie bei niedriger Temperatur ohne überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion erzeugt wurden. Diese Mikrokügelchen-Präparate zeigten keinen starken Initial Burst (weniger als 30%, Tabelle 1). Außerdem zeigten mit dem PLGA mit hohem Molekulargewicht erzeugte Mikrokügelchen nach der Lyophilisierung oder Vakuumtrocknung (Tabelle 1) einen viel geringeren Initial Burst. Weder das Gemisch aus Polymer mit hohem und niedrigem Molekulargewicht im gleichen Massenverhältnis noch die Polymerpräparate mit hohem Molekulargewicht zeigten eine Korrelation Zwischen Proteinbeladung und Initial Burst für Beladungen im Bereich von 1,8 bis 3,9 Gew.-%. Bei einer sehr geringen Proteinbeladung (0,5 Gew.-%) wiesen unter den gleichen Bedingungen erzeugte Mikrokügelchen einen stark verringerten Initial Burst auf. Weil der Initial Burst durch die Diffusion von Protein aus den Mikrokügelchen reguliert wird, hängt die Freisetzungsrate (Initial Burst) von der Konzentrationsdifferenz zwischen der Gesamtlösung und dem hydratisierten, zugänglichen Protein (Oberflächenprotein) auf. Die Proteinmenge an der Oberfläche ist ebenfalls verringert, weil die Proteinkonzentration in den wäßrigen Tröpfchen verringert ist. Tabelle 1: Auswirkungen des Trocknungsverfahrens auf den Initial Bursta
a Mikrokügelchen wurden hergestellt, wie unter "Materialien und Verfahren" beschrieben (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml gp 120 Proteinlösung/ml Methylenchlorid, verringerte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion). b Alle Präparate hatten eine Einkapselungseffizienz von über 95%
c Mikrokügelchen wurden unmittelbar nach der Herstellung ohne Trocknung analysiert.
d Lyophilisierung wurde mit dem folgenden Zyklus durchgeführt: 4,75 h bei -55ºC, 12 h bei -20ºC und 250 mTorr, und 6 h bei 20ºC und 250 mTorr.
e Wirbelschichttrocknung erfolgte, indem entweder in einem Wirbelschichtsystem (siehe Fig. 4) oder in einer Amicon-Rührzelle, wo der Stickstoffstrom nach oben gerichtet war, Stickstoff durch die Mikrokügelchen auf einem 20 um-Sieb geleitet wurde.
f Ein Massenverhältnis 50 : 50 zwischen PLGA mit geringem und mit hohem Molekulargewicht wurde eingesetzt, um diese Mikrokügelchen herzustellen.
g Die Werte für den Initial Burst aus diesen Mikrokügelchen waren sehr niedrig und schwer zu messen. Daher sind diese Werte nur auf ± 1% genau (z. 2 ± 1% Initial Burst).

b. Vergleich von Trocknungsverfahren

In getrennten Versuchen wurden Mikrokügelchen unter verschiedenen Verfahrensbedingungen hergestellt und auf die Auswirkungen der Trocknungsbedingungen auf den Initial Burst analysiert. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen eine beständige Senkung des Initial Burst, wenn lyophilisierte oder vakuumgetrocknete Mikrokügelchen mit Mikrokügelchen verglichen werden, die mit Stickstoff in einer Wirbelschicht getrocknet werden. Tabelle 3 beschreibt die in Tabelle 2 eingesetzten Verfahrensbedingungen. Bei diesen Versuchen wurde das Verfahren bei niedriger Temperatur (1ºC für die erste Emulsion; 3ºC für die zweite Emulsion) durchgeführt, und die Proteinformulierung war 400 mg/ml rhGH, 100 mg/ml Trehalose, 100 mM Kaliumphosphat, pH 8. Tabelle 2: Auswirkungen des Trocknungsverfahrens auf Initial Burst von rhGH-PLGA- Mikrokügelchen, hergestellt nach dem Wasser-in-Öl-in-bWasser-Doppelemulsionsverfah- ren
a Mikrokügelchen wurden in Freisetzungsmedien 1 h lang inkubiert, und die freigesetzte Proteinmenge wurde gemessen (% Freisetzung = 1000/0 · (Masse Proteinfreisetzung/Gesamtmasse in den Mikrokügelchen)).
b Mikrokügelchen wurden unmittelbar nach der Herstellung ohne Trocknung analysiert
c Lyophilisierung wurde mit dem folgenden Zyklus durchgeführt: 4,75 h bei -55ºC, 12 h bei -20ºC und 250 mTorr und 6 h bei 20% und 250 mTorr
d Vakuumtrocknung erfolgte, indem teilweise verstöpselte Phiolen in einen Exsikkator gestellt und bei 2-8ºC ein Vakuum angelegt wurde
e Wirbelschichttrocknung erfolgte, indem entweder in einem Wirbelschichtsystem (siehe Fig. 4) oder in einer Amicon-Rührzelle, wo der Stickstoffstrom nach oben gerichtet war, Stickstoff durch die Mikrokügelchen auf einem 20 um-Sieb geleitet wurde.
f Mikrokügelchen wurden unter mehreren verschiedenen Verfahrensbedingungen hergestellt, und die Buchstaben (A-F) bezeichnen die in Tabelle 3 angeführten Bedingungen.
g ND bedeutet "nicht bestimmt" Tabelle 3: Verfahrensbedingungen für rhGH-PLGA-Mikrokügelchen aus Tabelle 2
a Polyvinylalkohol wurde in vorfiltriertem Wasser (MilliQ-Wasser, Millipore) gelöst. Wenn Ethylacetat als Lösungsmittel verwendet wurde, enthielt die PVA-Lösung 10% Ethylacetat. Methylenchlorid wurde der PVA-Lösung für diese Präparate nicht zugegeben.,
b Die zur Herstellung der zweiten Emulsion (Wasser-in-Öl-in-Wasser) verwendete Mischvorrichtung war entweder ein statischer Mischer (SM) oder ein Fermenter (F).
c Das Polymer wurde entweder in Ethylacetat (EtAc) oder in Methylenchlorid (MeCl&sub2;) gelöst.
d 5% Aceton wurden der Ethylacetat/PLGA-Lösung zugegeben, um das Auflösen des PLGA zu erleichtern.
Tabelle 4 liefert ähnliche Daten für festes menschliches Wachstumshormon. Die lyophilisierte Ausgangsproteinformulierung (Trehalose, rhGH und Phosphat) wurde nach einem Schnellgefrierverfahren hergestellt, das zur Bildung kleiner fester Teilchen führte. Mikrokügelchen wurden durch Auflösen von 4 g PLGA (0,21 dl/g) in 10 ml Ethylacetat und Zugabe von entweder 500 mg (e) oder 750 mg (f) lyophilisiertem rhGH hergestellt. Das Gemisch wurde dann mit 7.000 U/min 90 s lang bei 1ºC homogenisiert. Die PLGA-Phase wurde dann mit 15 ml/min zum Einlaß eines statischen Mischers gepumpt, während eine 9%-ige PVA-Lösung, die 10% Ethylacetat enthielt, mit 2 l/min zum gleichen Einlaß gepumpt wurde. Der Auslaß des statischen Mischers war an einen Rühr- tank (Härtungsbad) angeschlossen, der 12 I vorfiltriertes Wasser enthielt. Nach 1 h im Härtungsbad wurden die Mikrokügelchen mit einem 150 um-Sieb abfiltriert und dann mit einem 20 um-Sieb und 60 l 0,1% Tween bei 2-8% diafiltriert. Die fertigen Mikrokügelchen wurden dann wie in der Tabelle angegeben getrocknet. Tabelle 4: Auswirkungen des Trocknungsverfahrens auf den Initial Burst von rhGH- PLGA-Mikrokügelchen, hergestellt nach dem Feststoff-in-Öl-in-Wasser-Emulsionsverfah- ren
a Mikrokügelchen wurden in Freisetzungsmedien 1 h lang inkubiert, und die freigesetzte Proteinmenge wurde gemessen (% Freisetzung = 100% x (Masse Proteinfreisetzung/Gesamtmasse in den Mikrokügelchen)).
b Mikrokügelchen wurden unmittelbar nach der Herstellung ohne Trocknung analysiert.
c Lyophilisierung wurde im folgenden Zyklus durchgeführt: 4,75 h bei -55%, 12 h bei 20% und 250 mTorr, und 6 h bei 20% und 250 mTorr
d Wirbelschichttrocknung erfolgte, indem entweder in einem Wirbelschichtsystem (Fig. 4) oder in einer Amicon-Rührzelle, in der der Stickstoffstrom aufwärts gerichtet ist, Stickstoff durch die Mikrokügelchen auf einem 20 um-Sieb geleitet wird.
e 500 mg hGH wurden der ersten Emulsion zugegeben
f 750 mg hGH wurden der ersten Emulsion zugegeben
Tabelle 5 zeigt ähnliche Daten für MN rgp120, das nach dem Doppelemulsionsverfahren eingekapselt wurde. Mikrokügelchen wurden durch Lösen von 3 g PLGA in 10 ml Methylenchlorid hergestellt. 1 ml MN rgp120 wurde in die PLGA-Lösung eingespritzt, während mit 15.000 U/min homogenisiert wurde. Nach dem Einspritzen wurde die Emulsion 1 min lang homogenisiert. Das PLGA bestand aus einem Massenverhältnis von 50 : 50 an 0,21 dl/g (48 : 52 Lactid/Glykolid) und 0,76 dl/g (48 : 52 Lactid/Glykolid) von BI (e) oder 0,24 dl/g (50 : 50 Lactid/Glykolid) und 0,75 dl/g (51 : 49 Lactid/Glykolid) von MTI (f). Das erste Emulgieren wurde bei 1ºC durchgeführt. Die erste Emulsion wurde einem gut durchmischten Fermenter zugegeben, der 900 ml 9%-ige PVA-Lösung bei 3ºC enthielt. Nach Durchmischen für 1 min wurde die zweite Emulsion zu 12 l vorfiltriertem Wasser mit 2 bis 8ºC zugegeben und 1 h lang härten gelassen. Die Mikrokügelchen wurden dann mit einem 150 um-Sieb abfiltriert und dann mit einem 20 um- Sieb und 30 l 0,1 0% Tween bei 2 bis 8ºC diafiltriert. Die fertigen Mikrokügelchen wurden dann wie in der Tabelle angegeben getrocknet. Tabelle 5: Auswirkungen des Trocknungsverfahrens auf den Initial Burst von MN rgp120-PLGA-Mikrokügelchen, hergestellt nach dem Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppel- emulsionsverfahren
a Mikrokügelchen wurden in Freisetzungsmedien 1 h lang inkubiert, und die freigesetzte Proteinmenge wurde gemessen (% Freisetzung = 100% x (Masse Proteinfreisetzung/Gesamtmasse in den Mikrokügelchen)).
b Mikrokügelchen wurden unmittelbar nach der Herstellung ohne Trocknung analysiert.
c Lyophilisierung wurde mit dem folgenden Zyklus durchgeführt: 4,75 h bei -55%, 12 h bei 20ºC und 250 mTorr und 6 h bei 20% und 250 mTorr.
d Wirbelschichttrocknung erfolgte, indem entweder in einem Wirbelschichtsystem ('siehe Fig. 4) oder in einer Amicon-Rührzelle Stickstoff, bei der Stickstoffstrom nach oben gelenkt wurde, durch die Mikrokügelchen auf einem 20 um-Sieb geleitet wurde. Tabelle 6 liefert ähnliche Daten für Mikrokügelchen, die das Adjuvans QS21 und MN gp120 einkapseln. Mikrokügelchen wurden hergestellt, indem 3 g PLGA in 10 ml Methylenchlorid gelöst wurden. 0,5 ml MN rgp120 (Charge 1 : 76 mg; Charge 2 : 56 mg) und 0,5 ml QS21 (Charge 1 : 94 mg; Charge 2 : 105 mg) wurden in die PLGA-Lösung eingespritzt, während mit 15.000 U/min homogenisiert wurde. Nach dem Einspritzen wurde die Emulsion 1 min lang homogenisiert. Das PLGA bestand aus 50 : 50 Massenverhältnis an 12 kD (75 : 25 Lactid : Glykolid) und 100 kD (75 : 25 Lactid : Glykolid) von BI (Charge 1) oder 12 kD (0,21 dl/g; 48 : 52 Lactid/Glykolid) und 100 kD (0,76 dl/g; 48 : 52 Lactid : Glykolid) von BI (Charge 2). Das erste Emulgieren wurde bei 1ºC durchgeführt. Die erste Emulsion wurde einem gut gemischten Fermenter zugeführt, der 900 ml einer 9%-igen PVA-Lösung bei 3ºC enthielt. Nach dem Mischen für 1 Minute wurde die zweite Emulsion zu 12 (vorfiltriertem Wasser bei 2 bis 8ºC zugegeben und 1 h lang härten gelassen. Die Mikrokügelchen wurden dann mit einem 150 um-Sieb abfiltriert und dann mit einem 20 um-Sieb und 30 I 0,1% Tween bei 2 bis 8ºC diafiltriert. Die fertigen Mikrokügelchen wurden dann wie in der Tabelle angegeben getrocknet. Tabelle 6: Auswirkungen des Trocknungsverfahrens auf Initial Burst von QS21/MN rgp120-PLGA-Mikrokügelchen, hergestellt nach dem Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppel- emulsionsverfahren
a Mikrokügelchen wurden in Freisetzungsmedien 1 h lang inkubiert, und die freigesetzte Menge an Protein oder QS21 wurde gemessen (% Freisetzung = 100% x (freigesetzte Masse/Gesamtmasse in den Mikrokügelchen)).
b Mikrokügelchen wurden unmittelbar nach der Herstellung ohne Trocknung analysiert
c Lyophilisierung wurde mit dem folgenden Zyklus durchgeführt: 4,75 h bei -55%, 12 h bei 20% und 250 mTorr und 6 h bei 20% und 250 mTorr
d Vakuumtrocknung erfolgte, indem teilweise verstöpselte Phiolen in einen Exsikkator eingebracht und bei 2 bis 8% ein Vakuum angelegt wurde.
e Wirbelschichttrocknung erfolgte, indem entweder in einem Wirbelschichtsystem (siehe Fig. 4) oder in einer Amicon-Rührzelle, wo der Stickstoffstrom aufwärts gerichtet war, Stickstoff durch die Mikrokügelchen auf einem 20 um-Sieb geleitet wurde
f ND = nicht bestimmt
g Der Initial Burst für diese Probe wurde bewertet, indem die kumulative Freisetzung über die ersten beiden Tage gemessen wurde, da eine beträchtliche Freisetzung an den Tagen 1 und 2 erfolgte. Es gab eine minimale Freisetzung (weniger als 2%) von Tag 2 bis 10.
Tabelle 7 liefert ähnliche Daten für Mikrokügelchen, die das Adjuvans QS21 einkapseln. Mikrokügelchen wurden hergestellt, indem 3 g PLGA (0,53 dl/g; 50 : 50 Lactid/Glykolid; MIT) in 10 ml Methylenchlorid gelöst wurden. 600 ul QS21 (200 mg/ml in 50% Ethanol) wurde in die PLGA-Lösung eingespritzt, während mit 15.000 U/min homogenisiert wurde. Nach dem Einspritzen wurde die Emulsion 1 min lang homogenisiert. Dieses erste Emulgieren wurde bei 1ºC durchgeführt. Die erste Emulsion wurde dann mit 5 ml/min in den Einlaß eines statischen Mischers gepumpt, während eine 9%-ige PVA- Lösung, die 10% Ethylacetat (3%) enthielt, mit 1,5 l/min in den gleichen Einlaß gepumpt wurde. Der Auslaß des statischen Mischers wurde an einen Rührtank (Härtungsbad) angeschlossen, der 12 l vorfiltriertes Wasser enthielt. Nach einer Stunde im Härtungsbad wurden die Mikrokügelchen mit einem 150 um-Sieb abfiltriert und dann mit einem 20 um-Sieb und 30 (0,1% Tween bei 2 bis 8ºC diafiltriert. Die fertigen Mikro- kügelchen wurden dann wie in der Tabelle angegeben getrocknet. Tabelle 7: Auswirkungen des Trocknungsverfahrens auf den Initial Burst von QS21- PLGA-Mikrokügelchen, hergestellt nach dem Wasser-in-Ol-in-Wasser-Doppelemulsions- verfahren
a Mikrokügelchen wurden in Freisetzungsmedium 1 h lang inkubiert, und die freigesetzte Menge an QS21 gemessen (% Freisetzung = 100% x (Masse QS21 Freisetzung/Gesamtmasse in den Mikrokügelchen))
b Mikrokügelchen wurden unmittelbar nach der Herstellung ohne Trocknung analysiert
c Lyophilisierung wurde mit dem folgenden Zyklus durchgeführt: 4,75 h bei -55ºC, 12 h bei 20ºC und 250 mTorr, und 6 h bei 20ºC und 250 mTorr
d Wirbelschichttrocknung erfolgte, indem entweder in einem Wirbelschichtsystem (siehe Fig. 4) oder in einer Amicon-Rührzelle, wo der Stickstoffstrom aufwärts gerichtet war, Stickstoff durch die Mikrokügelchen auf einem 20 um-Sieb geleitet wurde.

Claims

1. Verfahren zum Einkapseln eines Wirkstoffs in Mikrokügelchen, umfassend:

(a) Auflösen eines Polymers in einem organischen Lösungsmittel, um eine Lösung zu erhalten;

(b) Zugeben von Wirkstoff zur Lösung (a), um ein Polymer-Wirkstoff-Gemisch zu erhalten, das eine erste Emulsion oder Suspension umfaßt;

(c) Zugeben des Gemisches von Schritt (b) zu einem Emulgierungsbad, um Mikrokügelchen zu bilden, die eine zweite Emulsion umfassen;

(d) Härten der Mikrokügelchen von Schritt (c), um gehärtete Mikrokügelchen zu bilden, die eingekapselten Wirkstoff umfassen; und

(e) Trocknen der Mikrokügelchen von Schritt (d) in einer Wirbelschicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das organische Lösungsmittel Methylenchlorid, Ethylacetat oder ein Gemisch von Ethylacetat und Benzylalkohol oder Aceton ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Emulgierungsbad eine Polyvinylalkohol-Lösung umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Polyvinylalkohol-Lösung Ethylacetat enthält.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Wirkstoff ein trockener Feststoff oder wäßrig ist und ein Antigen oder ein Adjuvans ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Wirbelschicht ein System umfaßt, in dem ein Trockengas über nasse Mikrokügelchen geleitet wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Polymer ein Polyester ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Polyester Poly(D-L-Lactid-co-glycolid) ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Wirkstoff ein Polypeptid ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Polypeptid menschliches Wachstumshormon oder gp120 ist.

11. Verfahren zur Herstellung von Polylactid-Mikrokügelchen, umfassend das Trocknen der Mikrokügelchen in einer Wirbelschicht.

12. Zusammensetzung, die Mikrokügelchen umfaßt, die durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche erhalten werden können.