DE68923723T2

DE68923723T2 - Modifizierter humaner G-CSF.

Info

Publication number: DE68923723T2
Application number: DE68923723T
Authority: DE
Inventors: Makoto Morimoto; Masami Okabe; Motoo Yamasaki; Yoshiharu Yokoo
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2009-04-01
Also published as: AU620385B2; EP0335423A2; HU211935A9; HK59396A; CA1340810C; AU3234189A; DE68923723D1; EP0335423A3; ES2075005T3; GR3017188T3; AU1703292A; ATE126235T1; AU640567B2; EP0335423B1; LV11692A; LV11692B; DE68923723T3; ES2075005T5; EP0335423B2; HU211958A9

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein chemisch modifiziertes hG-CSF- Polypeptid, das aus einer chemischen Modifizierung wenigstens einer Aminogruppe in einem Polypeptidmolekül mit Aktivität von humanem Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (human granulocyte colony stimulating factor; nachstehend kurz als hG- CSF bezeichnet) resultiert, und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen modifizierten Polypeptids.

Hintergrund der Erfindung

hG-CSF ist ein Polypeptid, das für die Proliferation und Differenzierung von hämatopoietischen Stammzellen für die Bildung verschiedener Blutzellen essentiell ist und die Aktivität besitzt, hauptsächlich die Vervielfachung von Granulozyten, und insbesondere von Neutrophilen, zu fördern. Obwohl Neutrophile eine lebenswichtige solle für den Schutz eines lebenden Körpers gegen Infektionen spielen, haben sie eine kurze Lebensdauer und müssen ständig durch die konstante Vervielfachung und Differenzierung von Vorläuferzellen ersetzt werden. Therapien, die in den letzten Jahren bei proliferativen Tumoren üblicherweise praktiziert wurden, inhibieren auch die Proliferation der Vorläuferzellen von Neutrophilen, mit dem Ergebnis, daß sie die Fähigkeit von Tumorpatienten, Infektionen zu widerstehen, supprimieren, was eine ernste Nebenwirkung darstellt. hG-CSF fördert die Vervielfachung von Neutrophilen. Es wird erwartet, daß er somit diese Nebenwirkung abschwächt und gleichzeitig prophylaktische und therapeutische Wirkungen gegenüber Infektionen ausübt. Weiterhin hat hG-CSF die Fähigkeit, in vitro die Differenzierung kultivierter Leukämiezellen zu induzieren, und ist somit potentiell als Arzneimittel für die Behandlung von Leukämie verwendbar. Das erfindungsgemäße chemisch modifizierte hG-CSF-Polypeptid besitzt hG-CSF-Aktivität, die jene des bekannten hG-CSF übertrifft, und es wird erwartet, daß es wertvoll als Arzneimittel sein wird.
Infolge rekombinanter DNA-Technologie, die sich in den letzten Jahren schnell entwickelt hat, sind die Gene für Proteinfaktoren, die an der Proliferation und Differenzierung von Blutzellen beteiligt sind, eines nach dem anderen isoliert worden. Diese Faktoren werden nun mittels verschiedener Techniken des genetic engineering unter Verwendung mikrobieller oder animaler Zellen hergestellt.
Nagata et al. isolierten hG-CSF-cDNA aus der humanen Squamösen Zellinie CHU-II, bestimmten ihre DNA-Sequenz und berichteten über ihre Expression in COS-Zellen (Nagata et al., Nature (1986) , 319:415). Darüber hinaus isolierten Souza et al. cDNA aus der humanen zystischen Krebszellinie 5637, bestimmten ihre DNA-Sequenz und berichteten über ihre Expression in Escherichia coli (Souza et al., Science (1986), 232:61).
Es wurde berichtet, daß bei Verabreichung des so erhaltenen hG-CSF an den Körper eine dauerhafte Wirkung nur durch wiederholte hG-CSF-Verabreichung sichergestellt werden kann und daß eine Unterbrechung zu einem schnellen Nachlassen der gewünschten Wirkung führt (Journal of Experimental Medicine (1987), 165:941-948). Dies liegt wahrscheinlich an der kurzen Lebensdauer von hG-CSF im Blut.
Für Enzyme, wie Asparaginase (Inada, Y. et al. , Trends in Biotechnology (1986), 4:68-73), Arginase (Savoca, K.V. et al., Biochemica et Biophysica Acta (1979), 578:47-53), Batroxobin (Nishimura, H. et al., Life Science (1983), A3:1467-1473) etc., wurde gefunden, daß chemische Modifizierung mit Polyethylenglykol zu einer erhöhten Verweildauer im Blut und zu abgeschwächter Antigenizität führt.
In EP-A-0 251 717 wird ein chemisch modifiziertes Inselaktivierendes Protein (islet-activating protein; IAP) offenbart. Das modifizierte Produkt wird durch Umsetzen von IAP mit einer Triazinverbindung der Formel
erhalten, worin R für eine Schutzgruppe steht, die eine Hydroxylgruppe schützt, 1 für einen ganzzahligen Wert von 7 bis 700 steht, p für 1 oder 2 steht und X für ein Halogenatom steht.
Als Arzneimittel wird ein Protein im allgemeinen in lyophilisierter Form verwendet. Während und/oder nach Lyophilisierung besteht ein Problem darin, daß das Protein physiologischen oder chemischen Veränderungen unterworfen ist, z.B. Assoziation, Polymerisation und Oxidation aufgrund externer Faktoren wie Temperatur, Feuchtigkeit, Sauerstoff und ultraviolettes Licht. Solche Veränderungen führen oft zum Abbau der Aktivität des Proteins. Zur Überwindung des oben genannten Problems wurden während der Lyophilisierung Proteinstabilisatoren untersucht. Die Stabilisatoren für hG-CSF sind beispielsweise in GB-A-2193631 und in JP-A-63-146829 (die hier verwendete Bezeichnung "JP-A" bedeutet eine ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung") beschrieben.
Bei Verwendung von hG-CSF als Arzneimittel ist es wünschenswert, daß hG-CSF stabil ist und lange nach Verabreichung im Blut verbleibt, daß seine Antigenizität abgeschwächt ist und daß er während und/oder nach Lyophilisierung für den praktischen Gebrauch stabil ist. Einen hG-CSF mit diesen Eigenschaften gab es jedoch nicht, und folglich kein Verfahren zu seiner Herstellung.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Polypeptid mit Aktivität von hG-CSF bereitzustellen, das ausgezeichnete Stabilität und eine lange Lebensdauer im Blut zeigt.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß dann, wenn wenigstens eine Aminogruppe in einem Polypeptid mit Aktivität von hG-CSF chemisch modifiziert ist, das resultierende Polypeptid im Vergleich zum nicht-modifizierten Polypeptid länger im Blut und während und/oder nach Lyophilisierung stabil bleibt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein modifiziertes Polypeptid mit Aktivität von hG-CSF bereit, das durch Substitution von wenigstens einer Aminogruppe eines Polypeptids mit Aktivität von hG-CSF mit einer Gruppe der Formel
erhältlich ist, worin
R&sub1; für eine Alkyl- oder Alkanoylgruppe steht;
n für einen gegebenenfalls variablen, positiven, ganzzahligen Wert steht;
X für O, NH oder S steht;
steht, [worin R&sub3; für OH, Cl, O-(CH2CH2O)n-R&sub1; steht, worin R&sub1; und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, Y fehlt oder für Z- (CH2)pCO steht, worin Z für O, S oder NH steht und p für einen gegebenenfalls variablen, positiven, ganzzahligen Wert steht]; oder für (CO)m-(CH2)lCO steht, worin m für 0 oder 1 steht; und 1 für einen gegebenenfalls variablen, positiven, ganzzahligen Wert steht.
Das Ausgangspolypeptid mit Aktivität von hG-CSF kann jedes Polypeptid mit Aktivität von hG-CSF sein, z.B. ein Polypeptid mit der in Tabelle 1a dargestellten Aminosäuresequenz, ein Polypeptid, das durch Ersetzen wenigstens eines Aminosäurerests der in Tabelle 1a dargestellten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure erhältlich ist, z.B. die in Tabelle 1b dargestellten hG-CSF-Derivate oder ein Polypeptid, dem 1 bis 11 Aminosäurereste am N-Terminus der in Tabelle 1a dargestellten Aminosäuresequenz fehlen. Neben den oben genannten Polypeptiden können auch die in EP-A-0 243 153, EP-A-0 237 545 und WO-A- 8701132 beschriebenen hG-CSF-Derivate verwendet werden. Tabelle 1a (X = H oder Met) Tabelle 1b hG-CSF-Derivate Position Substitution (eine Azainosäure von * Keine Substitution
Bei den erfindungsgemäß zu verwendenden chemischen Modifizierungsgruppen handelt es sich bei den als Schutzgruppen für das terminale Sauerstoffatom genannten Alkyl- und Alkanoylgruppen um C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-Alkylgruppen (z.B. eine Methyl-, Ethyl-, Propylgruppe etc.) und C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-Alkanoylgruppen (z.B. eine Formyl-, Acetyl-, Propionylgruppe etc.).
Der positive, ganzzahlige Wert n ist nicht größer als 500 und steht vorzugsweise für 7 bis 230. Der positive, ganzzahlige Wert 1 ist nicht größer als 100 und steht vorzugsweise für 0 bis 6. Der positive, ganzzahlige Wert p steht für einen Wert von 1 bis 18, vorzugsweise 1 bis 6. Das Molekulargewicht der genannten chemischen Modifizierungsgruppe beträgt nicht mehr als 30.000 und liegt vorzugsweise im Bereich von 300 bis 20.000.
Der erfindungsgemäße chemisch modifizierte hG-CSF wird z.B. durch Kondensation von hG-CSF mit einem Halogenid der Formel (II)
hergestellt, worin R&sub1;, n, X und R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, oder durch Kondensation von hG-CSF mit einer Carbonsäure der Formel (III)
worin R&sub1;, n, X, m und 1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, oder mit einer Carbonsäure der Formel (IV)
worin R&sub1;, n, Z, X, R&sub3; und p die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Das Halogenid der Formel (II) kann durch Kondensation der Verbindung worin R&sub1;, n und X die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, mit Cyanurchlorid hergestellt werden (Matsushima, A. et al., Chemistry Letters (1980), 773-776; Abuchowski, A. et al., Journal of Biological Chemistry (1977), (12) 252: 3578-3581). Dieses Halogenid ist reaktiv und kann deshalb direkt mit einem Polypeptid mit Aktivität von hG-CSF umgesetzt werden.
Die Carbonsäure der Formel (III) kann hergestellt werden, indem die Verbindung
worin R&sub1;, n und X die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, zur Einführung einer Carboxylgruppe einer dehydratisierenden Kondensation mit einer Carboxylgruppe einer Alkandicarbonsäure oder einer Reaktion mit einer halogenierten Monocarbonsäure unterzogen wird, oder einer Oxidationsreaktion ihrer terminalen Hydroxylgruppe, um letztere zu einer carboxylgruppe umzuwandeln. Diese Carbonsäure ist nicht reaktiv und muß deshalb vor Gebrauch aktiviert werden. Die Aktivierung der Carbonsäure kann z.B. erreicht werden, indem man sie z.B. mit N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, 1- Hydroxybenzotriazol, p-Nitrophenol oder dergleichen in einen aktiven Ester, mit Isobutylchlorameisensäureester, Ethylchlorameisensäureester oder dergleichen in ein gemischtes Anhydrid, oder mittels eines halogenierenden Mittels wie Thionylchlorid in ein Säurehalogenid umwandelt. Alle der oben angegebenen Verfahren sind beschrieben, z.B. in Peptide Gosei (Peptide Synthesis; Nobuo lzumiya et al., Maruzen).
Die Carbonsäure der Formel (IV) kann durch Kondensation des Halogenids der Formel (II) mit der Verbindung HZ-(CH2)pCO2H,
worin Z und p die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, hergestellt werden. Diese Carbonsäure der Formel (IV) sollte, wie auch jene der Formel (III), vor Gebrauch aktiviert werden.
Der erfindungsgemäße chemisch modifizierte hG-CSF wird vorzugsweise durch Kondensation von hG-CSF mit der Carbonsäure der Formel (V)
hergestellt, worin R&sub1;, n und X die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, Z für O, S oder NH steht und p für einen gegebenenfalls variablen, positiven, ganzzahligen Wert steht.
Zu diesem Polypeptid mit Aktivität von hG-CSF wird das oben genannte Halogenid oder die aktive Carbonsäureverbindung in einem Anteil (Molverhältnis) entsprechend dem 2- bis 100fachen der Menge an in dem Polypeptidmolekül vorliegenden Aminogruppen zugegeben, und das Gemisch wird bei einer Temperatur von 4 bis 37ºC, vorzugsweise 4 bis 10ºC, und bei einem pH von 7 bis 10 1 Stunde bis 2 Tage, vorzugsweise 1 bis 24 Stunden, reagieren gelassen, wobei der gewünschte chemisch modifizierte hG-CSF produziert wird.
Die Reaktionsprodukte von hG-CSF oder einem Derivat davon mit dem Halogenid der Formel (II) und den Carbonsäuren der Formeln (III) und (IV) werden nachstehend als chemisch modifizierte hG-CSF (II), (III) bzw. (IV) bezeichnet.
Der Grad der chemischen Modifizierung kann festgestellt werden, indem man mit Trinitrobenzolsulfonsäure die Stärke der Abnahme an freien Aminogruppen quantifiziert oder eine Mobilitätsänderung von chemisch modifiziertem hG-CSF mittels Natriumdodecylsulfat (SDS) -Polyacrylamid-Gelelektrophorese kontrolliert.
Der chemisch modifizierte hG-CSF oder ein Derivat davon wird als Arzneimittel, d.h. als eine injizierbare Lösung, verwendet, die durch Lösen in Wasser oder einem geeigneten Puffer und Durchführen einer Filter-Sterilisation hergestellt wird. Wenn der erfindungsgemäße modifizierte hG-CSF lyophilisiert ist, wird das lyophilisierte Produkt ebenfalls in Wasser oder einem geeigneten Puffer gelöst und mittels Filter sterilisiert, um eine injizierbare Lösung herzustellen.
Die Bedingungen bei der Lyophilisierung sind nicht speziell eingeschränkt. Im allgemeinen wird die Lyophilisierung durch Einfrieren bei -50ºC oder weniger für 1 bis 5 Stunden, Trocknen bei -20ºC bis 0ºC für 24 bis 48 Stunden bei einem verminderten Druck von 50 bis 150 mTorr, und weiteres Trocknen bei 10 bis 30ºC für 16 bis 24 Stunden bei einem verminderten Druck von 50 bis 100 mTorr durchgeführt.
Das Präparat aus chemisch modifiziertem hG-CSF oder einem Derivat davon kann Additive, wie pharmazeutisch akzeptable Träger, Vehikel, Stabilisatoren oder adsorptionsverhindernde Mittel, enthalten. Der erfindungsgemäße modifizierte hG-CSF wird an einen Erwachsenen im allgemeinen in einer Menge von 0,1 bis 500 ug, vorzugsweise von 0,5 bis 200 ug, 1 bis 7-mal pro Woche verabreicht. Die Dosis schwankt je nach Art der Erkrankung und Symptom des Patienten.
Bei dem erfindungsgemäßen modifizierten hG-CSF sind 1 bis 3 Moleküle eines Polyethylenglykol (PEG)-Derivats an jedes Molekül gebunden (nachstehend als Mono-, Di- bzw. Tri- Typ von hG-CSF bezeichnet). Das oben beschriebene modifizierte hG-CSF-Präparat kann ein Gemisch aus dem Mono-, Di- und Tri-Typ von hG-CSF sein, oder diese modifizierten hG- CSF-Typen können getrennt voneinander verwendet werden.
Die Bestimmung der Proteinmenge wird erfindungsgemäß mittels folgender Testverfahren durchgeführt.

Testverfahren 1

Das Verfahren von Lowry (Lowry, O.H. et al., Journal of Biological Chemistry (1951), 193:265).

Testverfahren 2

Das Verfahren von Laemmli (Laemmli, U.K., Nature (1970), 227:680), bei dem nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eince Bestimmung mittels eines Chromatoscanners (CS-930, Shimadzu) folgt.
Die Bestimmung der hG-CSF-Aktivität wurde erfindungsgemäß auf folgende Weise durchhgeführt. 8 bis 12 Wochen alten männlichen C3H/He-Mäusen (bezogen vom Shizuoka Laboratory Animal Center) wurden unter aseptischen Bedingungen Myelozyten aus dem Oberschenkelknochen entommen und in α-Minimum Essential Medium (Flow Laboratories; nachstehend kurz als α-MEM bezeichnet) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) suspendiert. Die Zellsuspension (etwa 5x10&sup7; Zellen; 1,5 ml) wurde auf eine Nylonwollesäule (Nylon Fiber 146-04231, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 0,3g) gegeben und in einem Inkubator in 5% CO&sub2; bei 37ºC 90 Minuten inkubiert. Dann wurde auf 37ºC vorgewärmtes α-MEM über die Säule gegeben, wobei Myelozyten, die nicht an der Nylonwolle adsorbiert worden waren, im Durchfluß erhalten wurden. Diese Zellfraktion wurde einmal mit α-MEM gewaschen und auf eine spezifische Konzentration eingestellt.
Anschließend wurde gemäß dem Verfahren von Okabe et al. (Okabe, T. et al., Cancer Research (1986), 44:4503-4506) der Test auf Kolonie-bildende Aktivität bezüglich hämatopoietischer Knochenmarkszellen durchgeführt. Entsprechend wurden 0,2 ml der nach dem oben genannten Verfahren hergestellten Myelozyten (2x10&sup6; Zellen/ml) zu einem Gemisch aus 0,2 ml α-MEM, 0,4 ml FBS und 0,2 ml sich verdoppelnder Probenverdünnungen gegeben. Das enstandene Gemisch wurde weiter mit einem gleichen Volumen (1,0 ml) einer 0,6%-igen Lösung von Agar (Difco, gereinigter Agar Nr. 0560-01) gemischt, die auf 42ºC gehalten worden war, und eine Menge von 0,5 ml des entstandenen Gemisches wurde in eine Multidish-Platte mit 24 Näpfchen (Nunc, Nr. 143982) verteilt (5x10&sup4; Zellen/Näpfchen; n=3). Die Platte wurde 7 Tage bei 37ºC in einem Inkubator in 5% CO&sub2; gehalten und die Anzahl der Kolonien, die aus 40 oder mehr Zellen bestanden, unter dem Mikroskop (Olympus X40) gezählt. Nach der Zählung der Kolonien wurde jede Kolonie vorsichtig auf einen Glasträger überführt, 30 Sekunden mit Aceton/Formalin fixiert und zur Identifizierung einer Esterase-Doppelfärbung nach dem Verfahren von Kubota et al. (Kubota, K. et al., Experimental Hematology (1980), 8:339-344) unterzogen.
Die Wirksamkeit jeder Probe wurde anhand der Zählwerte für sich verdoppelnde Verdünnungen im Koloniebildungstest wie folgt berechnet. Der Aktivitätswert, der die Hälfte des maximalen Koloniebildungswerts des als Standard verwendeten G-CSF ergab, wurde als 50 Einheiten definiert. Dieser Wert wurde mit dem Verdünnungsfaktor jeder Probe, und zur Umwandlung in Aktivität pro Einheit ml, mit 20 multipliziert, um die Wirksamkeit (Einheiten) der Probe zu erhalten. Die spezifische Aktivität (Einheiten/mg) wurde in Wirksamkeit pro Gewicht (mg) an Protein ausgedrückt.
Die folgenden Beispiele, Referenzbeispiele und experimentellen Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne jedoch den Schutzumfang der Erfindung zu limitieren.

Beispiel 1

56 mg der in Referenzbeispiel 1 hergestellten Chlorverbindung wurden zu 3 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 10, gegeben, der 186 ug/ml hG-CSF mit der in Tabelle 1a dargestellten Aminosäuresequenz enthielt. Die Reaktion wurde 24 Stunden bei 4ºC unter Rühren durchgeführt.
Die nicht-umgesetzte Chlorverbindung wurde mittels Ultrafiltration entfernt (Cutoff-Molekulargewicht 30.000). Anschließend wurde Reversed-Phase-HPLC mittels YMC-Pack AM-3120DS (Kurita Industries, Ltd.) und eines linearen Gradienten von 0 bis 70% Acetonitril durchgeführt. Das chemisch modifizierte hG-CSF-Polypeptid wurde in der Fraktion von etwa 50% Acetonitril eluiert (Ausbeute 30 ug, prozentuale Ausbeute 5%). Mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde bestätigt, daß dieses chemisch modifizierte hG-CSF- Polypeptid pro Molekül einen Chlorverbindungs-Rest aufwies. Die Reinheit war höher als 90%.

Beispiel 2

240 mg des in Referenzbeispiel 2 hergestellten aktiven Esters wurden zu 50 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, gegeben, der 570 ug hG-CSF mit der in Tabelle 1a dargestellten Aminosäuresequenz enthielt. Die Reaktion wurde 6 Stunden bei 4ºC unter Rühren durchgeführt.
Nach Zugabe von 50 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer/0,7 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, wurde das Reaktionsgemisch bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde über eine Butyl-Toyopearl 650M (Tosoh)-Säule (2,2 cm x 26 cm) gegeben, die mit 10 mM Tris- HCl/0,35 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann gewaschen, indem 100 ml 10 mM Tris-HCl/0,35 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde über sie gegeben wurden. Anschließend wurde mittels eines linearen Gradienten von 200 ml 10 mM Tris-HCl/0,35 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, bis 200 ml 10 mM Tris-HCI-Puffer, pH 8,0, bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde eine Elution durchgeführt. Die gewünschte Verbindung wurde in Fraktionen eluiert, die 50 bis 130 mM Ammoniumsulfat entsprachen. Diese Fraktionen wurden gesammelt (130 ml), einer Ultrafiltration unterzogen (Cutoff-Molekulargewicht 10.000; YM10-Membran, Amicon) und auf 7 ml konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde bei einer Flußrate von 120 ml/Stunde über eine sephacryl S-200-Säule (2,8 cm x 70 cm) (Pharmacia) gegeben, die mit 10 mM Phosphatpuffer/physiologische Salzlösung (PBS), pH 7,2, äquilibriert worden war, gefolgt von PBS mit derselben Flußrate. Das chemisch modifizierte hG-CSF- Polypeptid vom Tri-Typ wurde in Fraktionen eluiert, die 150 bis 160 ml PBS entsprachen (Ausbeute 2 mg, prozentuale Ausbeute 7%). Die modifizierten hG-CSF-Polypeptide vom Diund Mono-Typ wurden anschließend in Fraktionen von 165 bis 185 ml PBS (Ausbeute 1,5 mg; prozentuale Ausbeute 5%) und 190 bis 210 ml PBS (Ausbeute 4,5 mg; prozentuale Ausbeute 16%) eluiert. Mittels SDS-Polyacrylamid-Geielektrophorese wurde bestätigt, daß beim hG-CSF-Polypeptid vom Mono-Typ ein Molekül, beim hG-CSF vom Di-Typ zwei Moleküle und beim hG-CSF vom Tri-Typ drei Moleküle der Polyethylenglykolderivatisierten Carbonsäure an jedes Molekül hG-CSF gebunden worden waren. Die Reinheit jedes Polypeptids betrug nicht weniger als 90%.

Beispiel 3

54 mg des in Referenzbeispiel 2 erhaltenen aktiven Esters wurden zu 10 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 9, gegeben, der das in Referenzbeispiel 3 erhaltene hG-CSF-Derivat enthielt (570 ug/ml). Die Reaktion wurde 10 Stunden bei 4ºC unter Rühren durchgeführt.
Der nicht-umgesetzte aktive Ester und sein Zerfallsprodukt wurden mittels einer YM30- Ultrafiltrationsmembran (Amicon) entfernt. Anschließend wurde unter Verwendung derselben Membran die innere Flüssigkeit durch 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, ersetzt. Die verbliebene Flüssigkeit wurde bei einer Flußrate von 10 ml/Stunde über eine DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh)-Säule (1,7 cm x 4,4 cm) gegeben, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann gewaschen, indem 20 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, bei einer Flußrate von 5 ml/Stunde über sie gegeben wurden. Anschließend wurde mittels eines linearen Gradienten von 50 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, bis 10 mM Tris-HCl/0,4 M NaCl, pH 8, bei einer Flußrate von 5 ml/Stunde eine Elution durchgeführt. Das chemisch modifizierte hG-CSF-Polypeptid wurde in Fraktionen eluiert, die 100 bis 120 mm NaCl entsprachen (Ausbeute 0,85 mg; prozentuale Ausbeute 15%). Mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurde bestätigt, daß in dem erhaltenen Polypeptid ein Molekül der Polyethylenglykol-derivatisierten Carbonsäure an ein Molekül des hG-CSF-Derivats gebunden worden war. Die Reinheit dieses Polypeptids betrug nicht weniger als 90%.

Beispiel 4

300 mg des in Referenzbeispiel 2 hergestellten aktiven Esters wurden zu 50 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, gegeben, der 570 ug/ml des in Referenzbeispiel 3 erhaltenen hG-CSF- Derivats enthielt. Die Reaktion wurde 6 Stunden bei 4ºC unter Rühren durchgeführt.
Nach Zugabe von 50 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer/0,7 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, wurde das Reaktionsgemisch bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde über eine Butyl-Toyopearl 650M (Tosoh)-Säule (2,2 cm x 26 cm) gegeben, die mit 10 mM Tris- HCl/0,35 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann gewaschen, indem 100 ml 10 mM Tris- HCl/0,35 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde über sie gegeben wurden. Anschließend wurde mittels eines linearen Gradienten von 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, und 400 ml 0,35 M bis 0 M Ammoniumsulfat bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde eine Elution durchgeführt. Die gewünschte Verbindung wurde in Fraktionen eluiert, die 50 bis 150 mM Ammoniumsulfat entsprachen. Diese Fraktionen wurden gesammelt (150 ml), einer Ultrafiltration unterworfen (Cutoff- Molekulargewicht 10.000; YM10-Membran, Amicon) und auf 10 ml konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde bei einer Flußrate von 120 ml/Stunde über eine Sephacryl S-200 (Pharmacia)-Säule (2,8 cm x 70 cm) gegeben, die mit PBS äquilibriert worden War, gefolgt von PBS mit derselben Flußrate. Das chemisch modifizierte hG-CSF-Polypeptid vom Tri-Typ wurde in Fraktionen eluiert, die 150 bis 160 ml PBS entsprachen (Ausbeute 1,5 mg; prozentuale Ausbeute 5%). Die modifizierten hG-CSF-Polypeptide vom Di- und Mono-Typ wurden anschließend in Fraktionen von 165 bis 185 ml (Ausbeute 3 mg; prozentuale Ausbeute 11%) und 190 bis 210 ml (Ausbeute 4 mg; prozentuale Ausbeute 14%) eluiert. Mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurde bestätigt, daß beim Polypeptid vom Mono-Typ ein Molekül, beim Polypeptid vom Di-Typ zwei Moleküle und beim Polypeptid vom Tri-Typ drei Moleküle der Polyethylenglykol-derivatisierten Carbonsäure an jedes Molekül hG-CSF gebunden worden waren. Die Reinheit jedes Polypeptids betrug nicht weniger als 90%.

Beispiel 5

800 mg des in Referenzbeispiel 4 hergestellten aktiven Esters wurden zu 100 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, gegeben, der 300 ijg/ml des in Referenzbeispiel 3 erhaltenen hG-CSF-Derivats enthielt. Die Reaktion wurde 24 Stunden bei 4ºC unter Rühren durchgeführt.
Nach Zugabe von 100 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer/0,7 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, wurde das Reaktionsgemisch bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde über eine Butyl-Toyopearl 650M (Tosoh)-Säule (2,2 cm x 26 cm) gegeben, die mit 10 mM Tris- HCl/0,35 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann gewaschen, indem 100 ml 10 mM Tris- HCl/0,35 M Ammoniumsulfat, pH 8,0, bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde über sie gegeben wurden. Anschließend wurde mittels eines linearen Gradienten von 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, und 400 ml 0,35 M bis 0 M Ammoniumsulfat bei einer Flußrate von 100 ml/Stunde eine Elution durchgeführt. Die gewünschte Verbindung wurde in Fraktionen eluiert, die 0 bis 250 mM Ammoniumsulfat entsprachen. Diese Fraktionen wurden gesammelt (250 ml), einer Ultrafiltration unterworfen (Cutoff- Molekulargewicht 10.000; YM1O-Membran, Amicon) und auf 10 ml konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde bei einer Flußrate von 160 ml/Stunde über eine Sephacryl S-200 (Pharmacia)-Säule (5,6 cm x 40 cm) gegeben, die mit PBS äquilibriert worden war, gefolgt von PBS mit derselben Fluß rate. Das chemisch modifizierte hG-CSF-Polypeptid vom Tri-Typ wurde in Fraktionen eluiert, die 360 bis 400 ml PBS entsprachen (Ausbeute 2,1 mg; prozentuale Ausbeute 7%). Die modifizierten hG-CSF-Polypeptide vom Di- und Mono-Typ wurden anschließend in Fraktionen von 420 bis 450 ml (Ausbeute 1,5 mg; prozentuale Ausbeute 5%) und 500 bis 530 ml (Ausbeute 1,5 mg; prozentuale Ausbeute 5%) eluiert. Mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurde bestätigt, daß beim Polypeptid vom Mono-Typ ein Molekül, beim Polypeptid vom Di-Typ zwei Moleküle und beim Polypeptid vom Tri-Typ drei Moleküle der Polyethylenglykol-derivatisierten Carbonsäure an jedes Molekül hG-CSF gebunden worden waren. Die Reinheit jedes Polypeptids betrug nicht weniger als 90%.

Beispiel 6

Herstellung eines Lyophilisierungsproduktes aus chemisch modifiziertem hG-CSF und dessen Lagerungsstabilität
In gleicher Weise wie in Beispiel 2 wurde der hG-CSF mit dem in Referenzbeispiel 2 hergestellten aktiven Ester umgesetzt. Der nicht-umgesetzte Ester und sein Zerfallsprodukt wurden mittels einer YM30- Ultrafiltrationsmembran (Amicon) entfernt. Anschließend wurde unter Verwendung derselben Membran die innere Flüssigkeit durch 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, der 1 M NaCl enthielt, ersetzt. Die entstandene Lösung, die 200 ug/ml des gewünschten modifizierten hG-CSF-Derivats enthielt, wurde einer Lyophilisierung unterzogen.
Die Lyophilisierung wurde durch Überführen der hG-CSF- Lösung in Glasampullen, Einfrieren der Ampullen auf -50ºC oder weniger für 2 Stunden, Trocknen bei -20ºC für 24 Stunden bei einem verminderten Druck von 100 mTorr und weiteres Trocknen für 24 Stunden bei einem verminderten Druck von 80 mTorr durchgeführt. Als Kontrolle wurde ein Lösungsgemisch von hG-CSF und Polyethylenglykol in gleicher Weise wie oben angegeben lyophilisiert. Jedes Lyophilisierungsprodukt wurde bei 65ºC stehen gelassen, und in bestimmten zeitlichen Intervallen wurde eine Probe genommen. Das als Probe genommene Lyophilisierungsprodukt wurde in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, gelöst, um gemäß dem oben beschriebenen Verfahren die G-CSF-Restaktivität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Die Restaktivität bedeutet die Aktivität relativ zur Aktivität vor Lyophilisierung und ist gemäß folgender Gleichung definiert:
Restaktivität (%) = Aktivität nach Lagerung über bestimmte zeitliche Intervalle/Aktivität vor Lyophilisierung x 100 Tabelle 2: Lagerungsstabilität von lyophilisiertem, chemisch modifizierten hG-CSF (65&sup0;c) Restaktivität (%) nach bestimmten zeitlichen Intervallen Probe Tage Chemisch modifizierter Anmerkungen: Gewichsteile PEG Gewichtsteil hG-CSF

Beispiel 7

Herstellung eines Lyophilisierungsproduktes aus chemisch modifiziertem hG-CSF und dessen Lagerungsstabilität
In gleicher Weise wie in Beispiel 4 wurde das hG-CSF- Derivat mit dem in Referenzbeispiel 2 hergestellten aktiven Ester umgesetzt, und eine Lösung des chemisch modifizierten hG-CSF-Derivats wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 6 erhalten. Die Lyophilisierung wurde wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Jedes Lyophilisierungsprodukt wurde für 7 Tage bei 37ºC stehen gelassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt: Tabelle 3: Lagerungsstabilität von chemisch modifiziertem hG-CSF (37ºC, 7 Tage) Probe Restaktivität (%) hG-CSF-Derivat mit PEG Chemisch modifiziertes Anmerkungen: Gewichtsteile PEG pro Gewichtsteil hG-CSF

Referenzbeispiel 1

Herstellung von 2,4-Bis (O-methoxypolyethylenglykol)-6-chlor-s-triazin

20 g Monomethoxypolyethylenglykol mit einem durchschnitt-lichen Molekulargewicht von 4.000 (Nippon Oil and Fats) wurden in 100 ml trockenem Toluol gelöst, das 10 g wasserfreies Natriumcarbonat enthielt. Die Lösung wurde 30 Minuten auf 110ºC erhitzt. Anschließend wurden 500 mg Cyanurchlorid zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden auf 110ºC erhitzt. Der Reaktionsrückstand wurde abfiltriert, gefolgt von einer Zugabe von 300 ml Petrolether, um eine Ausfällung herbeizuführen. Der Niederschlag wurde mit mehreren Teilen Petrolether gewaschen, wobei 10 g 2,4-Bis(O- methoxypoly-ethylenglykol)-6-chlor-s-triazin gewonnen wurden (Ausbeute 50%).

Referenzbeispiel 2

Synthese von Monomethoxypolyethylenglykolsuccinyl-N-hydroxysuccinimidester

20 g sorgfältig entwässertes Monomethoxypolyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5.000 (Union Carbide) und 2 g Bernsteinsäureanhydrid wurden zu 50 ml trockenem Toluol gegeben, und das Gemisch wurde 5 Stunden bei 150ºC refluxiert. Das Toluol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand durch Zugabe von 30 ml Methylenchlorid sorgfältig gelöst. Dazu wurden 400 ml trockener Ethylether gegeben, um eine Ausfällung herbeizuführen. Der Niederschlag wurde aus Methylenchlorid/Ethylether (Volumenverhältnis = 1:3) umkristallisiert, wobei 10 g succinyliertes Monomethoxypolyethylenglykol erhalten wurden (Ausbeute etwa 50%). Dieses succinylierte Produkt (3,3 g) und 100 mg N-Hydroxysuccinimid wurden in 5 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, gefolgt von Zugabe unter Eiskühlung von 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Das Gemisch wurde dann 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Nebenprodukt Dicyclohexyl-harnstoff (DCU) wurde abfiltriert, und dein Filtrat wurde Ethylether zugegeben, um eine Ausfällung herbeizuführen. Der entstandene Niederschlag wurde aus Methylenchlorid/Ethylether (Volumenverhältnis = 1:3) umkristallisiert, wobei 2,5 g Monomethoxypolyethylenglykol-succinyl-N- hydroxysuccinimidester gewonnen wurden (Ausbeute 72%).

Referenzbeispiel 3

Ein hG-CSF-Derivat, das der in Tabelle 1a dargestellten Aminosäureseguenz entspricht, jedoch Alanin anstelle des Threonins an Position 1, Threonin anstelle des Leucins an Position 3, Tyrosin anstelle des Glycins an Position 4, Arginin anstelle des Prolins an Position 5 und Serin anstelle des Cysteins an Position 17 enthält, wurde nach folgendem Verfahren hergestellt.
Escherichia coli-Bakterien W3110 str A (Escherichia coli ECfBD2B, FERM BP-1479), die ein Plasmid pCfBD28 trugen, das eine für das oben genannte hG-CSF-Derivat kodierende DNA enthält, wurden 18 Stunden bei 37ºC in LG-Medium (hergestellt durch Lösen von 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 1 g Glucose in 1 l Wasser und Einstellen der Lösung auf pH 7 mit NaOH) kultiviert. Ein Anteil von 5 ml dieser Kultur wurde in 100 ml MCG-Medium (0,6% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,5% NaCl, 0,5% Casaminosäuren, 1 mM MgSO&sub4; und 4 ug/ml Vitamin B&sub1;; pH 7,2) überimpft, das 25 ug/ml Tryptophan und 50 ug/ml Ampicillin enthielt, und 4 bis 8 Stunden bei 30ºC inkubiert. Anschließend wurden 10 ug/ml 3ß-Indolacrylsäure (nachstehend kurz als IAA bezeichnet; ein Tryptophaninducer) zugegeben, und die Inkubation wurde über einen weiteren Zeitraum von 2 bis 12 Stunden fortgesetzt. Die erhaltene Kultur wurde 10 Minuten bei 8.000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die dann mit 30 mM Nacl/30 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gewaschen wurden. Die gewaschenen Zellen wurden in 30 ml der gleichen Pufferlösung wie oben suspendiert und einem Schallaufschluß unterzogen (Cell Disruptor 200 Sonifier der Branson Sonic Power company, Ausgangsreglerstufe 2; 10 Minuten). Die Suspension aufgeschlossener Zellen wurde 30 Minuten bei 9.000 U/bin zentrifugiert, um den zellulären Rückstand zu sammeln. Aus diesem zellulären Rückstand wurde das hG-CSF-Derivat extrahiert, gereinigt, in Lösung gebracht und mittels des Verfahrens von Marston et al. (Marston, F.A.O. et al., Bio/Technology (1984), 2:800) rekonstituiert.

Referenzbeispiel 4

Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters (IVb) von 2,4- Bis (o-methoxypolyethylenglykol)-6-(3-carboxypropylamino)-s-triazin (IVa)

Die in Referenzbeispiel 1 erhaltene Chloridverbindung (500 mg) wurde in 9 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Diese Lösung wurde zu 1 ml wasserfreiem Dimethylamid gegeben, das 10 mg γ-Aminobuttersäure und 28 ul Triethylamin enthielt, und das erhaltene Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Trocknen des Gemisches unter vermindertem Druck wurden zur Trennung 30 ml Methylenchlorid und 15 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 10, zugegeben.
Die obere Schicht wurde mit 2N HCl auf pH 1 eingestellt, und für eine zweite Trennung wurden 30 ml Methylenchlorid zugegeben. Die untere Schicht wurde fraktioniert, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und einer Filtration unterzogen. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei 150 mg der carbonsäure (IVa) erhalten wurden (prozentuale Ausbeute 30%). Die so erhaltene Carbonsäure (IVa; 150 mg) und N-Hydroxysuccinimid (3 mg) wurden in 1 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, gefolgt von Zugabe von 6 mg DCC unter Eiskühlung. Das Gemisch wurde dann für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Nebenprodukt DCU wurde abfiltriert, und dem Filtrat wurde Ethylether zugegeben, um eine Ausfällung herbeizuführen. Der so gebildete Niederschlag wurde mittels Filtration gesaminelt und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 100 mg des gewünschten Esters (IVb) erhalten wurden (prozentuale Ausbeute 67%).

Testbeispiel 1

Spezifische Aktivität und wachstumsfördernde Aktivität bezüglich NFS6O-Maus-Leukämiezellen des chemisch modifizierten hG-CSF (III)

In gleicher Weise wie in Beispiel 3 wurde das hG-CSF- Derivat mit dem aktiven Ester umgesetzt, und der nichtumgesetzte Ester und sein Zerfallsprodukt wurden mittels einer Ultrafiltrationsmembran entfernt. Anschließend wurde unter Verwendung derselben Membran wie oben die innere Flüssigkeit durch PBS ersetzt, und die G-CSF-Aktivität und die wachstumsfördernde Aktivität bezüglich NFS60-Zellen (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (1985), 82:6687) des chemisch modifizierten hG-CSF-Derivats in der verbliebenen Flüssigkeit wurden untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Probe Spezifische Aktivität (Einheit/mg Protein) Wachstumfördernde Aktivität hg-CSF-Derivat Chemisch modifiziertes
Aus den oben angegebenen Ergebnissen ergibt sich eindeutig, daß das chemisch modifizierte hG-CSF-Derivat CSF- Aktivität gegenüber Maus-Knochenmarksstammzellen behalten hatte. Es ist ebenfalls klar, daß das gleiche Derivat eine wachstums-fördernde Wirkung auf NFS6O-Zellen hatte, die bekannt-lich G-CSF-abhängiges Wachstum zeigen.

Testbeispiel 2

Leukocyten (Granulozyten)-Zahl-erhöhende Wirkung

Der gleiche, wie in Testbeispiel 1 verwendete, chemisch modifizierte hG-CSF (III) wurde C3H/He-Mäusen (männlich, n=3) entweder einmal oder einmal pro Tag an 6 aufeinanderfolgenden Tagen subkutan verabreicht. In bestimmten zeitlichen Intervallen wurden Blutproben entnommen und die weißen Blutzellen (WBC) im peripheren Blut gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 (einmalige Verabreichung) und Tabelle 6 (wiederholte Verabreichung) dargestellt. Tabelle 5: Der Zeitverlauf der WBC-Zahl nach einmaliger Verabreichung (s.c.) WBC (% der Normalkontrolle) Blutprobenentnahmeintervall (Std.) Probe a) Dosis (ug/Maus) hG-CSF-Derivat Chemisch modifiziertes Anmerkungen: a) Es wurde das gleiche Gewicht an hG-CSF- Protein verabreicht. **) P< (Students t-Test) Tabelle 6: Der Zeitverlauf der WBC-Zahl bei wiederholter Verabreichung über 6 Tage (s.c.) WBC (% der Normalkontrolle) Blutprobenentnahrneintervall (Tag) Probe a) Dosis (ug/Maus/Tag) hG-CSF-Derivat Chemisch modifiziertes Anmerkungen: a) Es wurde das gleiche Gewicht an hG-CSF- Protein verabreicht. *) P< **) ***) (Students t-Test)
Bei einmaliger Verabreichung wurde 8 Stunden nach Verabreichung ein Anstieg auf die WBC-Höchstwerte beobachtet. Während jedoch im Falle des hG-CSF-Derivats danach der Zählwert innerhalb von 48 Stunden nach Verabreichung auf den Normalwert absank, wurde im Falle des chemisch modifizierten hG-CSF-Derivats sogar noch nach 48 Stunden eine deutliche Erhöhung der WBC-Zahl beobachtet.
Bei wiederholter Verabreichung, insbesondere in der Gruppe mit niedriger Dosis, zeigte das chemisch modifizierte hG-CSF-Derivat im Vergleich zum hG-CSF-Derivat eine deutliche Leukocytenzahl-erhöhende Wirkung.

Testbeispiel 3

Zeitverlauf der plasmakonzentration

Das, wie in Testbeispiel 1 verwendete, chemisch modifizierte hG-CSF-Derivat wurde C3H/He-Mäusen (männlich, n=3) entweder einmal oder einmal pro Tag an 6 aufeinanderfolgenden Tagen subkutan verabreicht. In bestimmten zeitlichen Intervallen wurde eine Blutprobe entnommen und die plasmakonzentration an G-CSF bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 (einmalige Verabreichung) und Tabelle 8 (wiederholte Verabreichung) dargestellt. Bei einigen Experimenten wurde eine einzelne Dosis des gleichen chemisch modifizierten hG-CSF-Derivats intravenös verabreicht (Tabelle 9). Tabelle 7: Einmalige Verabreichung (s.c.) b) Plasmakonzentration (Einheiten/ml Plasma x) Blutprobenentnahmeintervall Probe a) Dosis (ug/Maus/Tag)) hG-CSF-Derivat Chemisch modifiziertes Anmerkungen: a) Es wurde das gleiche Gewicht an G-CSF- Protein verabreicht. b) Berechnet aus der wachstumsfördernden Aktivität bezüglich NFS Zellen (halbmaximal = U) Tabelle 8: Wiederholte Verabreichung (s.c.) b) c) Plasmakonzentration (Einheiten/ml Plasma x) Blutprobenentnahmeintervall (Tag) Probe a) Dosis (ug/Maus/Tag)) hG-CSF-Derivat Chemisch modifizier Anmerkungen: a) Es wurde das gleiche Gewicht an G-CSF- Protein verabreicht. b) Obere Reihe: Stunde nach VerabreichungUntere Reihe: Plasmakonzentration Stunden nach Verabreichung c) Berechnet aus der wachstumsfördernden Aktivität bezüglich NFS -Zellen (halbmaximal = U) d) NT.: Nicht getestet e) -: Unterhalb der Nachweisgrenze Tabelle 9: Einmalige Verabreichung (i.v.)
Während im Falle einmaliger subkutaner Verabreichung die plasmakonzentration des hG-CSF-Derivats nach 1 Stunde einen Höchstwert erreichte und anschließend schnell absank, zeigte die des chemisch modifizierten hG-CSF-Derivats 5 bis 7 Stunden nach Verabreichung eine graduelle Erhöhung und behielt sogar nach 24 Stunden ein vergleichsweise hohes Niveau bei (Tabelle 7). Andererseits zeigte das hG-CSF- Derivat bei wiederholter subkutaner Verabreichung 1 Stunde nach Verabreichung eine höhere plasmakonzentration, nach 24 Stunden jedoch eine niedrigere Menge, und konnte am Tag 3 nicht mehr nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu war das chemisch modifizierte hG-CSF-Derivat sogar nach 24 Stunden nachweisbar, und seine Konzentration war höher, als die des hG-CSF-Derivats.
Wie in Tabelle 9 dargestellt, ergab das chemisch modifizierte hG-CSF-Derivat bei intravenöser Verabreichung deutlich höhere plasmakonzentrationen.

Testbeispiel 4

Spezifische Aktivität und wachstumsfördernde Aktivität bezüglich NFS60-Maus-Leukämiezellen des chemisch modifizierten hG-CSF-Derivats (III)

(1) Der in Beispiel 2 erhaltene chemisch modifizierte hG- CSF (III) wurde in gleicher Weise wie in Testbeispiel 1 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10 Probe Spezifische Aktivität (Einheit/mg Protein) Wachstumfördernde Aktivität Unmodifizierter hG-CSF (III)-Mono-Typ (III)-Di-Typ (III)-Tri-Typ
(2) Zusätzlich wurden die in Beispiel 4 bzw. 5 erhaltenen chemisch modifizierten hG-CSF (III) und (IV) wie oben angegeben getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11 Probe Spezifische Aktivität (Einheit/mg Protein) Wachatumfördernde Aktivität Unmodifizierter hG-CSF (III)-Mono-Typ (III)-Di-Typ (III)-Tri-Typ (IV)-Mono-Typ (IV)-Di-Typ (IV)-Tri-Typ

Testbeispiel 5

Leukozyten (Granulozyten)-Zahl-erhöhende Wirkung

(1) Der in Beispiel 2 erhaltene chemisch modifizierte hG- CSF (III) wurde BALB/c-Mäusen (männlich, n=3; Kontrollgruppe, n=4) in einer Menge von 2,5 ug pro Tier verabreicht. In bestimmmten zeitlichen Intervallen wurde eine Blutprobe entnommen, und die WBC im peripheren Blut wurden gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12: Zeitverlauf der WBC-Zahl bei einmaliger Verabreichung (s.c.) WBC (% der Normalkontrolle) Blutprobenentnahmeintervall (Std.) Probe Unmodifizierter hG-CSF (III)-Mono-Typ (III)-Di-Typ (III)-Tri-Typ
(2) In gleicher Weise wie oben angegeben wurden die in Beispiel 4 bzw. 5 erhaltenen chemisch modifizierten hG-CSF (III) und (IV) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 13: Zeitverlauf der WBC-Zahl bei einmaliger Verabreichung (s.c.) WBC (% der Normalkontrolle) Blutprobenentnahmeintervall (Std.) Probe Unmodifizierter hG-CSF (III)-Mono-Typ (III)-Di-Typ (III)-Tri-Typ (IV)-Mono-Typ (IV)-Di-Typ (IV)-Tri-Typ
Der chemisch modifizierte hG-CSF und die chemisch modifizierten hG-CSF-Derivate dieser Erfindung erzeugen demnach eine Verstärkung der die Zahl der peripheren Leukozyten (Granulozyten) erhöhenden Wirkung bei verbesserter Stabilität und Verweildauer im Blut und können somit in vorteilhafter Weise in klinischen Medikamenten, z.B. einem Leukozytenwachstum-fördernden Mittel, verwendet werden.

Claims

1. Modifiziertes Polypeptid mit Aktivität von humanem Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (hG-CSF), umfassend ein Polypeptid mit hG-CSF-Aktivität, wobei wenigstens eine Aminogruppe davon mit einer Gruppe der Formel

substituiert ist, worin

R&sub1; für eine Alkyl- oder Alkanoylgruppe steht;

n für einen gegebenenfalls variablen, positiven- ganzzahligen Wert steht;

X für O, NH oder S steht;

steht, [worin R&sub3; für OH, Cl, O-(CH2CH2O)n-R1 steht, worin R&sub1; und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, Y fehlt oder für Z-(CH2)pCO steht, worin Z für O, S oder NH steht und p für einen gegebenenfalls variablen, positiven&sub1; ganzzahligen Wert steht]; oder für (CO)m-(CH2)1CO steht, worin m für 0 oder 1 steht; und 1 für einen gegebenenfalls variablen, positiven, ganzzahligen Wert steht.

2. Modifiziertes Polypeptid nach Anspruch 1, worin R&sub1; für eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-Alkyl- oder -Alkanoylgruppe steht.

3. Modifiziertes Polypeptid nach Anspruch 1, worin n für einen positiven, ganzzahligen Wert steht, der nicht größer als 500 ist.

4. Modifiziertes polypeptid nach Anspruch 1, worin 1 für einen positiven,ganzzahligen Wert steht, der nicht größer als 100 ist.

5. Modifiziertes Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Gruppe der Formel (I) ein Molekulargewicht von nicht mehr als 30000 besitzt.

6. Pharmazeutisches Mittel, umfassend ein modifiziertes Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

7. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 6, enthaltend das modifizierte Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in lyophilisierter Form.

8. Verfahren zur Herstellung eines chemisch modifizierten hG-CSF gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Kondensation von hG-CSF mit einem Halogenid der Formel (II)

worin R&sub1;, n, X und R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen; oder

die Kondensation von hG-CSF mit einer Carbonsäure der Formel (III)

worin R&sub1;, n, X, m und l die oben angegebenen Bedeutungen besitzen; oder mit einer Carbonsäure der Formel (IV)

worin R&sub1;, n, Z, X, R&sub3; und p die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, umfassend die Kondensation von hG-CSF mit einer Carbonsäure der Formel (V)

worin R&sub1;, n und X die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, Z für O, S oder NH steht und p für einen gegebenenfalls variablen, positiven, ganzzahligen Wert steht.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Halogenid oder die aktive Carbonsäureverbindung zum Polypeptid in einem Anteil (Molverhältnis) entsprechend dem 2- bis 100-fachen der Menge an in dem Polypeptidmolekül vorliegenden Aminogruppen zugibt und das Gemisch bei einer Temperatur von 4 bis 37ºC, vorzugsweise 4 bis 10ºC, und bei einem pH von 7 bis 10 1 Stunde bis 2 Tage, vorzugsweise 1 bis 24 Stunden, reagieren läßt, wobei der gewünschte chemisch modifizierte hG-CSF produziert wird.

11. Verwendung von wenigstens einem modifizierten Polypeptid nach Anspruch 1 bis 5 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels mit Leukozytenwachstum-fördernder Aktivität.