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Diese Erfindung bezieht sich auf ein Adjuvans, umfassend einen
Koloniestimulierungsfaktor als aktiven Bestandteil, und ist für die
Verwendung in der Krebsimmuntherapie mit einem Immunaktivierungsmittel
bestimmt. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Adjuvans für die
Krebsimmuntherapie, welches, wenn es in Verbindung mit einem
Immunaktivierungsmittel verwendet wird, die Wirksamkeit des
Immunaktivierungsmittels vergrößert.
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Koloniestimulierungsfaktoren (im nachfolgenden als "CSFs"
bezeichnet) sind endogene Faktoren, die die Vermehrung und Differenzierung von
Granulozyten und Makrophagen fördern. Die CSFs wirken auf Stammzellen der
Knochenmarkgranulozyten- und Makrophagengruppen (GM-CFUs) und werden
beispielsweise als 1) G-CSF (Granulozyten CSF), welcher Bildung von
Granulozyten verursacht, 2) M-CSF (Makrophagen CSF), welcher Bildung von
monozyteren Makrophagen verursacht, und 3) GM-CSF, welcher Bildung sowohl von
Granulozyten wie auch Makrophagen bewirkt, klassifiziert. CSF, welcher zu
M-CSF gehört und nicht direkt auf die GM-CFUs einwirkt, aber auf
Monozyten im Blut wirkt, wodurch die Ausscheidung von GM-CSF gefördert wird und
indirekt die Vermehrung von Makrophagen und Granulozyten verursacht wird,
ist auch aus dem Urin des Menschen gereinigt worden (im nachfolgenden als
"CSF-HU" bezeichnet.
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Das Immunaktivierungsagens ist als Mittel für die Krebsimmuntherapie
verwendet worden, und spezifische Beispiele davon umfassen Picibanil
(OK-432), Krestin (PSK), Lentinan und Schizophyllan. Picibanil ist ein
Polysaccharid in Form eines trockenen Pulvers, welches durch
Lyophilisieren des Stammes Streptococcus piogenes A-III-Su, welcher zuvor mit
Penicillin (hergestellt von Chugai) behandelt wurde, hergestellt worden ist.
Krestin ist ein Heißwasserextrakt des Mycels von Criolus versicolor,
welches hauptsächlich ein proteinbindendes Polysaccharid enthält
(hergestellt von Kureha-Sankyo). Lentinan ist ein aus dem Fruchtkörper von
Leutinus ebodes extrahiertes beta-1,3-Glucan (hergestellt von
Ajinomoto-Morishita-Yamanouchi). Schizophyllan ist ein Polysaccharid,
welches beta-1,3-Glucan als Hauptkette und beta-1,6-Glucan als Nebenkette
enthält, aus dem Kulturmedium von Schizophyllum commune (GANN, 60,
137-144 (1969)) abstammt.
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Von den Wirkungsmechanismen eines derartigen
Immunaktivierungsagenses wird angenommen, daß es auf Lymphozyten wirkt, wodurch Ausscheidung
eines endogenen TNF (Tumornekrosefaktors) oder einer TNF-ähnlichen
Substanz verursacht wird und somit die in vivo TNF-Aktivität vergrößert wird
und als Ergebnis eine Antitumorwirkung erzeugt wird.
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Obwohl derartige Immunaktivierungsagenzien keine starken
Nebenwirkungen erzeugen und als Antitumoragenzien geeignet sind, ist ihre
Aktivität nicht so wirkungsvoll, und zufriedenstellende Wirkungen werden nicht
immer erhalten.
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Future Trends in Biotherapy ONCOL NURS FORUM; 14(6SUPPL): 38-40,
1987, beschäftigt sich mit der klinischen Verwendung biologischer
Reflexmodifikatoren als einzelner Agenzien und in Kombination mit anderen
pharmakologischen Agenzien wie beispielsweise antineoplastischen Mitteln zur
Stimulierung des Immunsystems. Picibanil, Krestin und Lentinan werden als
in der Erprobung befindliche Immunmodulatoren erwähnt. Von Lymphokinen
und Cytokinen wird auch erwähnt, daß sie eine Wirkung auf das Immunsystem
haben, einschließlich CSF, GM-CSF, G-CSF und M-CSF.
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In J. Pharm. Dyn., (1983), 6, 415-422 ist offenbart, daß
verschiedene Immunmodulatoren wie beispielsweise Picibanil eine Wirkung im Hinblick
auf eine Zunahme der Produktion des
Granulozyten/Makrophagen-Koloniestimulierungsfaktors in Kulturen aus Mausmilzzellen aufweisen.
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Als Ergebnis ihrer umfangreichen Untersuchungen im Hinblick auf eine
Zunahme der Aktivität von Immunaktivierungsagenzien haben die Erfinder
zum ersten Male festgestellt, daß die kombinierte Verwendung eines
Immunaktivierungsmittels und eines CSF die in vivo TNF-Aktivität vergrößert.
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Sie haben weiterhin festgestellt, daß CSFs die Antitumorwirkung von
Immunaktivierungsmitteln bemerkenswert vergrößern und daß deshalb diese
CSFs als Adjuvanzien bei der Krebsimmuntherapie mit
Immunaktivierungsmitteln geeignet sind, in anderen Worten ausgedrückt daß sie als
potenzierend wirkende Mittel für Immunaktivierungsagenzien geeignet sind. Die
vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieser Feststellungen
fertiggestellt worden.
(1) CSF
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Der in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendete CSF ist nicht
auf irgendeine besondere Art begrenzt sondern kann jedweder
Proteinfaktor,
der sich für die Förderung der Vermehrung und Differenzierung von
Granulozyten und Makrophagen eignet, sein.
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Als Beispiele derartiger CSFs können der bekannte G-CSF, M-CSF
(einschließlich CSF-HU) und GM-CSF unter anderem genannt werden. M-CSF wird
vorzugsweise bei der vorliegenden Erfindung verwendet.
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Die CSFs können beispielsweise durch Maßnahmen wie Reinigung aus
menschlichem Urin, Kultivierung von CSF-produzierenden Zellen oder
genetic engineering-Techniken hergestellt werden.
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Insbesondere können unter anderem erwähnt werden: der im US-Patent
4,275,056 offenbarte CSF (im nachfolgenden als "CSF (i)" bezeichnet);
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der in JP-A-63-54398 offenbarte CSF (im nachfolgenden als "CSF (ii)"
bezeichnet) (der hier verwendete Ausdruck "JP-A" bedeutet "eine
ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung");
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der in JP-A-63-290900 offenbarte CSF (im nachfolgenden als
"CSF (iii)" bezeichnet); und
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der in JP-A-63-250400 offenbarte CSF (im nachfolgenden als
"CSF (iv)" bezeichnet).
(i) CSF (i)
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Der CSF (i) ist ein Glycoprotein mit den nachfolgenden
physiko-chemischen Eigenschaften:
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(a) Molekulargewicht: 75.000-90.000, gemessen mit Hilfe des
Gelfiltrationsverfahrens;
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(b) Löslichkeit: Er ist in Wasser löslich, leicht löslich in
Chloroform und unlöslich in Ethylalkohol und Aceton;
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(c) Spezifische Drehung: [α]20D = 0 ± 40 (0,25 %ige wäßrige
Lösung);
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(d) pH: 5,0-6,0 für 1 Gew.-%ige wäßrige Lösung;
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(e) Isoelektrischer Punkt: pH 4,7 ± 0,2;
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(f) Temperaturstabilität: Eine 1 Gew.-%ige wäßrige Lösung
verliert bei 30-minütigem Erwarmen bei 60ºC ± 0,5ºC ihre Fähigkeit, die
Differenzierung und Vermehrung menschlicher Granulozyten zu fördern;
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(g) Elektrophorese: Sein mit Hilfe von Elektrophorese auf einem
Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel bestimmtes Molekulargewicht beträgt
85.000;
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(h) Infrarotabsorption: Er weist die folgenden charakteristischen
Absorptionen (cm&supmin;¹) auf:
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3600-3200 (stark), 1700-1600 (stark), 1550 (mittelmäßig),
1430-1380 (mittelmäßig), 1150-1000 (breit);
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(i) Farbreaktionen: Positive Zuckerfarbreaktionen bei der
alpha-Naphthol-Schwefelsäurereaktion, Indol-Schwefelsäurereaktion,
Anthron-Schwefelsäurereaktion und Phenol-Schwefelsäurereaktion. Positive
Peptidbindungs- und Aminosäure-Farbreaktionen bei der
Lowry-Folid-Reaktion und bei der Ninhydrinreaktion nach Hydrolyse mid Salzsäure;
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(j) Bestandteilbeildende Aminosäuren in dem Proteinrest: Prolin,
Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin,
Methionin, Isoleucin, Leucin, Thyrosin, Phenylalanin, Lysin, Histidin,
Tryptophan und Arginin;
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(k) Farbe und Erscheinungsbild: beinahe weiß und amorph;
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(l) Bestandteilbildende Kohlehydrate in dem Zuckerrest: neutrale
Kohlehydrate (als Glukose) 10,0-13,0 Gew.-%, Sialsäuren 3,0-7,0 Gew.-%,
Aminozucker nicht mehr als 1 Gew.-%;
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(m) Anteile an Protein und Kohlehydrat: Protein 75-85 Gew.-%,
Zucker 13,0-20,0 Gew.-%);
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(n) Elementaranalyse:
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Kohlenstoff: 32,4-47,3 %
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Wasserstoff: 5,7- 7,8 %
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Stickstoff: 90,6-14,3 %
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Schwefel: nicht mehr als 0,2 %;
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(o) Er wirkt auf menschliche Markzellen und fördert die
Differenzierung und Vermehrung von Granulozyten.
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In den US-Patenten 4,275,056 und 4,230,697 und in GB-A-2 016 477
sind einige Verfahren zum Herstellen des Glycoproteins offenbart. Ein
Herstellungsbeispiel ist im nachfolgenden dargestellt.
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Insbesondere kann beispielsweise ein Verfahren zum Erhalten von
CSF (i) genannt werden, welches umfaßt: Inkontaktbringen von menschlichem
Urin mit einem siliziumhaltigen Adsorbens, Eluieren der adsorbierten
aktiven Substanz mit einer wäßrigen Alkalilösung, Konzentrieren mit einem
Neutralsalz, Sammeln der sich ergebenden Niederschlagsfraktion,
Entfernung von Substanzen mit einem geringeren Molekulargewicht als 10&sup4; aus
der Fraktion, Lösen der auf diese Weise erhaltenen Fraktion, die
Substanzen mit einem Molekulargewicht von 10&sup4; oder mehr in einer anorganischen
Puffersalzlösung enthält, Inkontaktbringen der Lösung mit einem
Kationenaustauscher unter Entfernung von Verunreinigungen durch Adsorption auf
dem Ionenaustauscher, Inkontaktbringen der Abfluß- oder Eluatlösung mit
einem Anionenaustauscher, Eluieren der auf dem Ionenaustauscher
adsorbierten aktiven Substanz mit einer anorganischen Salzlösung mit der
Konzentration von 0,1 bis 0,3 Mol/l, Aufbringen des erhaltenen Eluats auf
eine mit einem hochvernetzten Polymergel mit einem
Wasserabsorptionsvermögen von 10 bis 20 ml/g gepackten Säure, Entwickeln der aktiven Substanz
in dem Eluat mit einer Puffersalzlösung mit einer Konzentration von 0,05
bis 0,1 Mol/l, Sammeln der Fraktionen mit einem relativen Elutionsvolumen
von 1,11-1,60, Inkontaktbringen der auf diese Weise gesammelten
Fraktionen mit einem glycophilen Adsorbens bei pH 6,0-8,0, Eluieren der aktiven
Substanz mit einer Pufferlösung (pH 6,0-8,0), der 1,0-2,0 M Salz
hinzugefügt wurde, welche 20-100 mM Zucker enthält, präparative Elektrophorese
des Eluats bei pH 7,0-9,0, Eluieren der aktiven Substanz mit einer
verdünnten Salzlösung und Gewinnen des aktiven Bestandteils.
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Die aktive Substanz kann, falls erforderlich, bei 50-70ºC und einem
pH-Wert von 5-9 etwa 8-30 h wärmebehandelt werden.
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(ii) CSF (ii)
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Der CSF (ii) ist ein Glycoprotein mit den nachfolgenden
Eigenschaften:
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(a) Molekulargewicht: etwa 70.000, gemessen mit Hilfe des
Gelfiltrationsverfahrens;
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(b) Isoelektrischer Punkt: pH etwa 4,7;
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(c) N-terminate Aminosäurensequenz:
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(In der zuvor genannten Sequenz bedeutet "-", daß der fragliche
Aminosäurerest nicht identifiziert werden kann.)
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(d) Er wirkt auf Markzellen und fördert die Differenzierung und
Vermehrung von Granulozytenserienstammzellen;
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(e) Anteile an Protein und Kohlehydrat: Kohlehydratgehalt etwa
13-20 %.
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Ein Verfahren zum Herstellen des CSF (ii) ist beispielsweise in
JP-A-63-54398 offenbart. Insbesondere kann das nachfolgende Verfahren
beispielhaft genannt werden.
A. Ausgangsmaterial
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Eine Losung mit Aktivität in bezug auf Human-CSF, welche von
menschlichem Urin oder dergleichen, insbesondere von menschlichem Urin, aus
teilweiser Reinigung auf eine spezifische CSF-Aktivität von mindestens
etwa 1.000-3.000 Einheiten/A280 (Absorption bei 280 nm) stammt, kann
verwendet werden. Die teilweise Reinigung kann mit Hilfe eines bekannten
Verfahrens, beispielsweise des in dem US-Patent 4,275,506 beschriebenen
Verfahrens (Reinigung durch Behandlung mit einem siliziumhaltigen
Adsorbens, einem Kationenaustauscher und einem Anionenaustauscher und
Gelfiltration) oder mittels des in JP-A-59-58629 beschriebenen Verfahrens
(Reinigung mittels Konzentrierung, Erwärmen und Behandlung mit
Polyethylenglykol (PEG) und einem Anionenaustauscher) durchgeführt werden.
Reinigung und Isolierung
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Die Reinigung und Isolierung kann durch Aussetzen des teilweise
gereinigten CSF einer Kombination aus PEG-Fraktionierung,
Ethanolfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, hydrophober
Chromatographie und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
durchgeführt werden.
(iii) CSF (iii)
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Der CSF (iii) ist ein monomeres Glycoprotein und hat die folgenden
Eigenschaften:
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(a) Molekulargewicht: etwa 70.000, bestimmt mit Hilfe des
Gelfiltrationsverfahrens; etwa 34.000, bestimmt mit Hilfe von SDS-PAGE
(Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektrophorese) unter
nichtreduzierenden wie auch reduzierenden Bedingungen;
(b) N-terminale Aminosäurensequenz:
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(In der zuvor aufgeführten Sequenz bedeutet "X", daß der fragliche
Aminosaurerest bis jetzt noch nicht identifiziert worden ist).
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(c) Er wirkt auf Markzellen und fördert die Differenzierung und
Vermehrung von Granulozytenserienstammzellen.
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Ein Verfahren zum Herstellen des CSF (iii) ist beispielsweise in
JP-A-63-290900 offenbart.
(iv) CSF (iv)
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Der in JP-A-63-250400 beschriebene CSF (iv) ist ein Glycoprotein mit
den nachfolgenden physiko-chemischen Eigenschaften:
(a) Molekulargewicht:
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Er ist ein aus zwei identischen Untereinheiten zusammengesetztes
Homodimer und sein mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-
Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmtes Molekulargewicht beträgt
70.000-90.000 Daltons. Das Molekulargewicht der aus der Dissoziation mit
einem Reduktionsmittel resultierenden Untereinheit, welche keine
biologische Aktivität zurückbehält, beträgt gemäß Bestimmung mit SDS-PAGE
35.000-45.000 Daltons.
(b) Aminosäurensequenz der Untereinheit:
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Das Untereinheitsprotein, das das Homodimer bildet, hat die im
nachfolgenden dargestellte Aminosaurensequenz, die 214-238 Aminosäurereste
behält. Der 122ste und 140ste Aminosäure-(Asparagin)Rest hat eine
typische N-Glycosidbindungsstelle, die durch Asparagin (Asn)-X-threonin
(Thr)/Serin (Ser) darstellbar ist, wobei X ein beliebig gewählter
Aminosäurerest ist.
Untereinheitsaminosäurensequenz:
(c) Isoelektrischer Punkt:
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Der mit Hilfe von Polyacrylamidgel-isoelektrischer Fokussierung und
isoelektrischer Fokussierung mit Hilfe des Sucrosedichtegradienten
bestimmte isoelektrische Punkt (pI) ist 3,1-3,7.
(d) Zuckerkettenbildende Monosaccharide:
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Die folgenden zuckerkettenbildenden Monosaccharide sind mit Hilfe
von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie im Anschluß an Hydrolyse
identifiziert worden: Mannose, Galactose, N-Acetylglucosamin,
N-Acetylgalactosamin und N-Acetylneuraminsäure.
(e) Zirkulardichroismusspektrum
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Das mit Hilfe eines Zirkulardichroismusdispersionsmeters
aufgezeichnete ferne Ultraviolett CD-Spektrum hat Minimumpeaks bei den Wellenlängen
208 und 222 nm, die anzeigen, daß eine alpha-Helixstruktur enthalten ist.
(f) Warmestabilitat:
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Die biologische Aktivität geht selbst bei 60-minütigem Erwärmen bei
60 ± 0,5ºC nicht verloren.
(g) Infrarotabsorption:
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Das Infrarotabsorptionsspektrum zeigt die nachfolgenden
charakteristischen Absorptionen (cm&supmin;¹): 3250, 2900, 1640, 1520, 1410, 1180, 1120,
1040.
(h) Physiologische Aktivität:
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Er besitzt koloniestimulierende Aktivität gegenüber
Monozyten-Makrophagen-Serienzellen des Säugers.
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Ein typisches Verfahren zum Herstellen des CSF (iv) umfaßt
Einstellen von menschlichem Urin auf einen pH-Wert von 8-9, wodurch Fällung von
unlöslichem Material bewirkt wird, Entsalzen des Überstandes mit Hilfe
einer Ultrafiltrationsmembran, mindestens 200-faches Konzentrieren
desselben, Einstellen des Konzentrats auf einen pH-Wert von 6,5-7,5,
10-stündiges Erwärmen desselben bei 60ºC, Entfernen des sich ergebenden
Niederschlags mit Hilfe von Zentrifugation, Ermöglichung der Adsorption
der aktiven Substanz auf einem Anionenaustauscher, Eluieren desselben mit
0,2 bis 0,4 M Puffer, Gelfiltration des Eluats in 1 bis 4 M Puffer,
Gewinnen der Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 70.000 oder mehr,
Ermöglichung der Adsorption dieser Fraktionen auf einem hydrophoben
anziehenden Material, Eluieren der aktiven Substanz mit 0,5 bis 1 M Puffer,
Aussetzen des Eluats einer
Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Gelfiltration, Gewinnen der Fraktionen mit einem Molekulargewicht von
70.000-150.000 Daltons, Einstellen der Fraktionen auf einen pH-Wert von 1
bis 2, Aussetzen derselben einer Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeits
chromatographie und Eluieren des aktiven Bestandteils. Der auf diese
Weise erhaltene CSF hat eine derartige Reinheit, daß er eine spezifische
Aktivitat von etwa 100.000 bis 20.000.000 Einheiten/mg Protein aufweist.
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Die mit Hilfe der zuvor beschriebenen Verfahren erzeugten CSFs
werden aseptisch in Phiolen lyophilisiert und darin in Pulverform
verschlossen. Es wird auch empfohlen, daß eine waßrige, Humanserumalbumin (als
CSF-Stabilisator) und eine Aminosaure oder einen Zucker (als
Auflösungshilfe) enthaltende L6sung den CSFs unter Erhalt von Endkonzentrationen
von 1 bis 10 G/V-%, bzw. 0,1 bis 5 G/V-% bzw. 1 bis 10 G/V-% vor
Lyophilisierung hinzufügt wird, und daß die Mischungen steril filtriert und
anschließend unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert werden.
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Bei der biologischen Aktivitätsmessung wurde die Koloniebildung von
Mausmarkzellen in vitro als Aktivitätsmeßparameter verwendet. Somit
wurden 0,1 ml einer Probe, die mit 20 % fetalem Kalbserum erganzt und auf
eine Glycoproteinkonzentration von 10 % eingestellt war, McCoy's 5A
Medium, welches 0,3 % Agar und 7,5 x 10&sup4; Mausmarkzellen enthielt, in eine
Plastikkulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben, wobei das
Gesamtvolumen mit Mccoy's 5A Medium, welches 0,3 % Agar enthielt, auf
1 ml eingestellt wurde, und der Schaleninhalt wurde bei 37ºC 7 Tage in
feuchter Luft, welche 5 % Co&sub2; enthielt, inkubiert. Anschließend wurden
die aus 50 oder mehr Zellen bestehenden Zellaggregate als Kolonien unter
einem umgekehrten Mikroskop gezahlt.
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Eine Kolonie wird als eine Einheit betrachtet.
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Gemäß der Praxis der Erfindung können diejenigen Peptidfragmente der
Glycoproteine oder die Derivate derartiger Fragmente, welche
Granulozytendifferenzierung und Vermehrung fördernde Aktivität aufweisen, auch als
aktive Bestandteile verwendet werden. Die Fragmentierungsmaßnahmen können
beispielsweise Zuckereliminierung durch Behandlung mit einem bekannten
Enzym oder abbauende Fragmentierungsbehandlung sein. Es können auch mit
Hilfe von genetic engineering gestaltete Peptidfragmente mit Granulozyten
Differenzierung und Vermehrung fördernder Aktivität verwendet werden.
(2) Immunaktivierungsmittel
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Das gemäß der Praxis der Erfindung zu verwendende
Immunaktivierungsmittel ist nicht auf irgendeine besondere Spezies beschränkt,
vorausgesetzt, daß es als Immunaktivierungsmittel im Hinblick auf eine Zunahme
der TNF-Aktivität durch Wirkung auf Monozyten, Granulozyten und
Lymphozyten wirkt, und somit eine Antitumorwirkung erzeugt.
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Spezifische Beispiele sind unter anderem Picibanil (OK-432), Krestin
(PSK), Lentinan und Schizophyllan (SPG).
(3) Dosis und Dosierung
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Die CSFs werden beispielsweise in Form von Lösungen in
physiologischer Kochsalzlösung für die Injektion oder destilliertem Wasser für die
Injektion, welche eine CSF-Konzentration von 10³ bis 10&sup6; Einheiten/ml
aufweisen, durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion
oder intravenöse Tropfinfusion, etc. verabreicht.
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Die Dosis betragt im allgemeinen 1.000 bis 150.000 Einheiten/kg
Körpergewicht einmal oder mehrere Male pro Tag, kann aber in Abhängigkeit
von dem Symptom geeignetermaßen vergrößert oder verringert werden.
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Das Immunaktivierungsagens kann gemäß der vom Hersteller empfohlenen
Dosierung verabreicht werden. Picibanil kann intramuskulär, subkutan,
intravenös, etc. in einer Dosis von 1 bis 10 KE mehrere Male pro Woche
verabreicht werden. Krestin kann oral in einer Dosis von 3 g pro Tag in
einigen unterteilten Dosierungen verabreicht werden. Die empfohlene
Dosierung in bezug auf Lentinan betragt 2 mg pro Woche per intravenöser
Injektion oder intravenoser Tropfinfusion.
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Die CSFs und das Immunaktivierungsagens können gleichzeitig oder
getrennt verabreicht werden.
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Bei gleichzeitiger Verwendung von CSF und dem Immunaktivierungsagens
ist festgestellt worden, daß die in vivo TNF-Aktivität im Vergleich zur
alleinigen Verwendung des Immunaktivierungsagenses zunimmt, und deshalb
kann der CSF verwendet werden, um die TNF-Antitumorwirkung zu vergrößern.
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Man nimmt deshalb an, daß die vorliegende Erfindung sich in der
Krebsimmuntherapie sehr eignet.
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Die nachfolgenden Testbeispiele und Arbeitsbeispiele
veranschaulichen die Erfindung in weiteren Details, aber sie begrenzen keineswegs den
Umfang der Erfindung.
Testbeispiel 1 (Toxizität)
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Das in dem nachfolgenden Beispiel 1 dargestellte Glycoprotein wurde
im Hinblick auf akute Toxizität in männlichen C57BL-Mäusen mit Hilfe des
Verfahrens von Richard et al. (Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics, Band 90, Seite 99, 1949) untersucht.
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Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Intraperitoneale Verabreichung
Intravenöse Verabreichung
Subkutane Verabreichung
Einheiten/kg
Testbeispiel 2
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Induktion der TNF-Aktivitat durch eine gemischte Kultur aus
Monozyten und PICIBANIL (OK-432) plus CSF
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(1) Monozyten wurden aus heparinisiertem pheripheralem Blut mit
Hilfe der Ficoll-Hypague-Gradientenzentrifugation abgetrennt, und es
wurde eine Monozytensuspension (3,25 x 10&sup6; Zellen/10 ml) unter Verwendung
von mit RPMI ergänztem 10 %igem Humanalbumin hergestellt.
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(2) Zu der Monozytensuspension wurden gleichzeitig 0,01 KE/ml
Picibanil und in Beispiel 4 erhaltener, von menschlichem Urin
abstammender CSF (bis zu der in Tabelle 2 dargestellten spezifischen
Konzentration) gegeben.
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(3) Es wurde 72 h in einer 5 %igen CO&sub2;-Atmosphäre bei 37ºC
inkubiert.
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(4) Der Überstand wurde im Hinblick auf TNF-Aktivität in
festgesetzten Zeitintervallen untersucht. Die TNF-Aktivität wurde durch
Messen der zellzerstörenden Aktivität gegenüber L929-Zellen im Hinblick
auf die Absorption von Kristallviolett bestimmt. Die auf diese Weise
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Additive
TNF-Aktivität (TNF Einheiten/ml)
CSF (Einheiten/ml)
PICIBANIL (KE/ml)
Anmerkung: 1 KE entspricht 2,8 mg Picibaniltrockenpulver.
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Aus den in Tabelle 2 dargestellten Daten wurde festgestellt:
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(1) daß CSF selbst keine TNF-Aktivitatsexpression bewirkt (ND = nicht
nachgewiesen;
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(2) daß die TNF-Aktivitat durch die kombinierte Verwendung von PICIBANIL
und dem CSF vergrößert wird; und
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(3) daß wenn sowohl PICIBANIL wie auch CSF in Kombination verwendet
werden, die TNF-Aktivität für eine lange Dauer beibehalten wird.
Mittlerweile ist festgestellt worden, daß die CSFs keinen Einfluß
auf die Monozytenzahl haben.
Beispiel 1
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Frischer, von gesunden Menschen gesammelter Urin (400 l) wurde mit
10 %igem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 eingestellt, und
anschließend wurde das unlösliche Material mittels Zentrifugation mit einer
kontinuierlichen Zentrifuge bei 15.000 Umdrehungen pro Minute unter
Kuhlen bei 0ºC entfernt.
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Der auf diese Weise erhaltene Uberstand wurde mit 10 %iger Salzsäure
auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und anschließend auf eine mit
Kieselgel gepackte Saule (10 x 80 cm) gebracht. Die auf dem Kieselgel
adsorbierte Fraktion wurde mit 40 l 5 %igem Ammoniakwasser eluiert.
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Das erhaltene Eluat wurde mit 1 N Schwefe1säure auf einen pH-Wert
von 7,5 eingestellt, pulveriges Ammoniumsulfat wurde bis zu 70 %iger
Sättigung
hinzugegeben man ließ die sich ergebende Mischung über Nacht bei
0ºC stehen, und der sich ergebende Niederschlag wurde mittels Filtration
gesammelt.
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Der Niederschlag wurde in 2 l 5 %igem Ammoniakwasser gelöst, die
Losung wurde in einen Dialyseschlauch (Visking) gebracht und gegen 0,05 M
Fhosphatpuffer (pH 6,5) bis zu einem zufriedenstellenden Ausmaß
dialysiert, der gleiche wie zuvor erwähnte Puffer wurde zu dem Dialysat unter
Herstellung eines Gesamtvolumens von 10 l gegeben, und das verdünnte
Dialysat wurde durch eine CM Sephadex C-50-Ionenaustauschersäule
(4,0 x 40 cm), die zuvor mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,5) aquilibriert
worden war, zum Zwecke der Adsorption von Verunreinigungen auf dem
Ionenaustauscherharz gegeben.
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Das Eluat (10 l) wurde in einem Diaflo-Hohlfaserkonzentrator (Amicon
Model DO-30) konzentriert, das Konzentrat wurde gegen 0,1 M
Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0) uber Nacht bei 5ºC auf die gleiche Weise, wie
zuvor beschrieben, dialysiert, und der gleiche Puffer wurde für eine
Einstellung des Gesamtvolumens auf 3 l zu dem Dialysat gegeben. Auf diese
Weise wurde die glycoproteinhaltige, rohe, wäßrige Losung erhalten.
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Diese Losung wurde auf eine DEAE-Cellulosesaule (4,0 x 40 cm), die
zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert und aktiviert worden war,
gegeben. Nach ausreichendem Waschen der Saule mit 0,1 M
Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0) wurde mit 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0), welcher
0,3 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Fraktionen mit Granulozyten
Differenzierung und Vermehrung fördernder Aktivität wurden gesammelt und
gegen 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0) dialysiert.
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Das erhaltene Dialysat wurde wiederum auf eine DEAE-Cellulosesäule
(4,0 x 40 cm), die zuvor mit dem gleichen Puffer aquilibriert und
aktiviert worden war, gegeben. Die Elution wurde mit Hilfe der
Linear-Konzentrations-Gradienten-Elutions-Technik mit 0,1 bis 0,3 M Natriumchlorid
durchgeführt, Fraktionen mit Granulozyten Differenzierung und Vermehrung
fördernder Aktivität wurden gesammelt, pulveriges Ammoniumsulfat wurde zu
diesen Fraktionen (vereinigt) bis 70 %iger Sättigung hinzugefügt und der
sich ergebende Niederschlag wurde gesammelt, in einer geringen Menge von
0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0) gelost und gegen den gleichen
Puffer unter Erhalt eines Dialysats dialysiert.
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Anschließend wurden 20 ml dieses Dialysats auf einer
Sephadex G-150-Saule (4,0 x 60 cm), die zuvor mit 0,1 M
Tris-Hydrochloridpuffer
(pH 7,0) äquilibriert worden war, entwickelt, Fraktionen mit einem
Elutionskoeffizienten (Ve/Vo) von 1,11-1,45 wurden gesammelt und gegen
destilliertes Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde unter Erhalt von
etwa 500 mg eines Pulver lyophilisiert.
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Anschließend wurden 200 mg des zuvor beschriebenen Pulvers in 0,02 M
Phosphatpuffer (pH 7,0), welcher 1,0 M Natriumchlorid enthielt, gelost,
die Losung wurde auf eine Säule, die 100 ml Concanavalin A-Sepharose 4B
(Fine Chemical Laboratories) enthielt, die zuvor mit dem gleichen Puffer
aquilibriert worden war, gegeben, die Säule wurde ausreichend mit 0,02 M
Phosphatpuffer (pH 7,0), welcher 1,0 M Natriumchlorid enthielt,
gewaschen, anschließend wurde mit 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), welcher
50 mM alpha-Methyl-D-glucosid und 1,0 M Natriumchlorid enthielt, eluiert,
Fraktionen mit Granulozyten Differenzierung und Vermehrung fördernder
Aktivität wurden gesammelt und gegen destilliertes Wasser dialysiert, und
das Dialysat wurde lyophilisiert.
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Weiterhin wurden etwa 50 mg des auf diese Weise erhaltenen
Lyophilisatpulvers in 1 ml 0,125 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 6,8), welcher 10 %
Glycerin enthielt, gelöst, und es wurde auf einem 8 %igen Acrylamidgel
(pH 8,9; 25 mm x 100 mm) in einer praparativen Elektrophoresevorrichtung
(LKB Model Unifork 900) bei einem elektrischen Strom von 10 mA
Elektrophorese durchgeführt, während Kühlwasser durch die Vorrichtung geleitet
wurde.
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Eine Fraktion mit einer relativen Beweglichkeit von 0,46 wurde mit
0,025 M Tris-Glycinpuffer (pH 8,3) gewonnen und gegen destilliertes
Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde unter Erhalt von etwa 10 mg eines
Glycoproteins, welches gemäß der Praxis der Erfindung verwendbar ist,
lyophilisiert.
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Das zuvor beschriebene Verfahren wurde unter Erhalt von etwa 1 g des
Glycoproteins wiederholt. Zu 1 g des auf diese Weise erhaltenen
gereinigten Glycoproteins wurden 10 ml Wasser für die vollständige Auflösung des
Glycoproteins hinzugegeben, und der pH-Wert wurde durch Hinzufügen von 10
%igem waßrigen Natriumhydroxid auf 6,8 eingestellt.
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Die Losung wurde anschließend 10 h bei 60ºC erwärmt, dann mit
Eiswasser rasch abgekühlt und zehnfach durch Hinzufügen von sterilisiertem
Wasser verdünnt, die Verdünnung wurde mit einer
Filtrationssterilisationsvorrichtung, die mit einem Membranfilter (Porengröße 0,45 u)
(Millipore) versehen war, filtersterilisiert, und das Filtrat wurde
aseptisch
in 1 ml-Portionen in Glasfläschchen, die zuvor 2 h bei 180ºC mit
Trockenluft sterilisiert worden waren, verteilt, der Inhalt der
Glasfläschchen wurde aseptisch lyophilisiert, und die Glasfläschchen wurden
verschlossen. Auf diese Weise wurden etwa 97 Glasfläschchen erhalten, von
denen jedes 1 mg des wärmebehandelten Glycoproteins enthielt. Das
gereinigte Glycoprotein wies eine spezifische Aktivität von 1 x 10&sup7;
Einheiten/mg Protein auf.
Beispiel 2
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Aus 1000 l frischem Urin, welcher von gesunden Menschen gesammelt
wurde, wurden 2,5 l einer glycoproteinhaltigen, rohen, waßrigen Lösung
auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Zu dieser wäßrigen
Lösung wurden 25 l 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0) gegeben, und die
Mischung wurde ausreichend gerührt und anschließend wiederum auf etwa
1/25 in einem Diaflo-Hohlfaser-Hochgeschwindigkeits-Konzentrator
konzentriert. Anschließend wurden 5 l 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0 und
5 l einer DEAE-Cellulosedispersion (enthaltend 200 g DEAE auf
Trockenbasis), welche zuvor mit 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0)
äquilibriert worden war, zu dem Konzentrat gegeben, die Mischung wurde 30 min
gerührt und man ließ sie anschließend stehen, und die Cellulose wurde
mittels Absaugfiltration gesammelt. Zu dieser mittels Filtration
gesammelten Cellulose wurden 10 l 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0) zum
Waschen gegeben, und diese Cellulose wurde wiederum durch Saugfiltration
gesammelt, mit 10 l 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0), welcher
0,05 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und mittels Saugfiltration
gesammelt. Zu der auf diese Weise abfiltrierten Cellulose wurden 10 l 0,1 M
Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0), welcher 0,3 M Natriumchlorid enthielt,
gegeben, und eine glycoproteinhaltige Fraktion wurde durch Rühren der
Mischung aus dieser DEAE-Cellulose eluiert. Das Eluat wurde durch
wiederholte Verdünnung mit destilliertem Wasser und Konzentrierung unter
Verwendung einer
Diaflo-Hohlfaser-Hochgeschwindigkeitskonzentrationsvorrichtung (Model DC-30) entsalzt, und anschließend unter Erhalt von etwa 15 g
eines Pulvers lyophilisiert. Das auf diese Weise erhaltene
Lyophilisatpulver wurde in 150 ml destilliertem Wasser gelöst, die Lösung wurde auf
eine Sephadex G-150-Säule (6,0 x 80 cm), die zuvor mit 0,1 M
Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, gegeben, und
glycoproteinhaltige Fraktionen, die einem Elutionskoeffizienten von 1,11-1,60
entsprachen, wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden ausreichend gegen
destilliertes Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde unter Verwendung
einer Diaflo-Hohlfaser-Konzentrationsvorrichtung (Model DC2) unter Erhalt
von 100 ml eines Konzentrats, welches etwa 9 g eines rohen Glycoproteins
enthielt, konzentriert. Zu diesem Konzentrat wurde 0,1 M Zitronensäure-
Natriumphosphatpuffer gegeben, der pH-Wert wurde auf 6,1 eingestellt, die
Losung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wärmebehandelt,
filtersterilisiert, in 2,5 ml-Portionen in Glasfläschchen unter aseptischen
Bedingungen verteilt und unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert, und
die Glasfläschchen wurden verschlossen. Auf diese Weise wurden 40
Glasfläschchen, von denen jedes etwa 3,8 mg des wärmebehandelten
Glycoproteins enthielt, erhalten. Das gereinigte Glycoprotein hatte eine
spezifische Aktivität von 1 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.
Beispiel 3
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Von gesunden Menschen gesammelter Urin (200 l) wurde auf pH 8,5
eingestellt, der sich ergebende Niederschlag wurde mittels Filtration
entfernt, und das Filtrat wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran
konzentriert und entsalzt (Amicon; H10x50; abgetrenntes Molekulargewicht:
50.000 Daltons). Das Konzentrat wurde anschließend auf einen pH-Wert von
7,0 eingestellt und bei 60ºC in einem hermetisch geschlossenen Gefäß 10 h
zum Zwecke der Sterilisation erhitzt. Anschließend wurde der sich
ergebende Niederschlag mittels Zentrifugation (5000 x g, 30 min) entfernt,
und der Überstand wurde mit DEAE-Cellulose, die mit 0,02 M Phosphatpuffer
(pH 7,2) äquilibriert worden war, zum Zwecke der Adsorption gemischt.
Nach Waschen der DEAE-Cellulose mit 0,02 M Phosphatpuffer und
anschließend 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,2), der mit 0,05 M Natriumchlorid
ergänzt worden war, wurde durch Behandeln der DEAE-Cellulose mit 0,25 M
Phosphatpuffer, dem Natriumchlorid (pH 7,2) hinzugefügt worden war,
eluiert. Das Eluat wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran (Amicon;
HIP10) konzentriert und anschließend unter Verwendung von Sephacryl S-300
(Pharmacia, 4 x 80 cm) mit einem Puffer (pH 7,2), der mit 1 M
Ammoniumsulfat ergänzt worden war, gelfiltriert. Die einem
Molekulargewichtsbereich von 70.000-150.000 Daltons entsprechenden Fraktionen, die bei der
zuvor beschriebenen Gelfiltration erhalten worden waren, wurden vereinigt
und auf eine Phenyl-Sepharose 4B-Säule (Pharmacia, 2 x 20 cm), die mit
dem zuvor beschriebenen Puffer, welcher mit 1 M Ammoniumsulfat ergänzt
worden war, zum Zwecke der Adsorption gegeben. Es wurde mit einem Puffer
(pH 7,2), der mit 0,5 M Ammoniumsulfat erganzt worden war, eluiert. Das
Eluat wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran (Asahi Chemical Industry,
NM-3) konzentriert, und das Konzentrat wurde einer
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von TSKG-3.000SW-Saulen (Tesoh
Corporation, 4 x 600 mm x 2) unter Erhalt einer Fraktion mit einem
Molekulargewichtsbereich von 70.000-150.000 Daltons ausgesetzt. Diese
Fraktion wurde wiederum konzentriert und einer
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, welche mit einer Umkehrphasen Hi-Pore RP-304 (Bio-Rad, 4 x
150 mm) Säule mit einem linearen Acetonitrilkonzentrationsgradienten
(0 bis 100 % pH 2,0) durchgeführt wurde, ausgesetzt. Das Elutionsmittel
enthielt 0,1 M Trifluoressigsaure. Auf diese Weise wurde ein gereinigter
CSF, welcher eine spezifische Aktivität von 1,4 x 10&sup8; Einheiten pro
Milligramm Protein aufwies, eluiert.
Beispiel 4
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CSF wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 isoliert und
gereinigt, jedoch mit der Ausnahme, daß
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit TSKG-3.000SW (Tosoh Corporation, HLC-837) und Phenyl-5pw
(Tosoh Corporation) anstelle der Behandlungen mit Sephacryl S-300 und
Phenyl-Sepharose 4B ausgeführt wurde. Der sich ergebende CSF wies eine
spezifische Aktivitat von 1,5 x 10&sup8; Einheiten/mg Protein auf.
Beispiel 5
(1) Physikochemische Eigenschaften des CSF
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Die physikochemischen Eigenschaften des in Beispiel 3 erhaltenen CSF
wurden wie im nachfolgenden aufgeführt bestimmt.
a) Molekulargewicht
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Das mit Hilfe von
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese in Abwesenheit eines Reduktionsmittels mit Hilfe des Verfahrens von
Laemmli (Nature, Band 227, Seiten 680-685, 1970) bestimmte
Molekulargewicht betrug 70.000-90.000 Daltons.
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Die mit Hilfe des gleichen Verfahrens aber im Anschluß an eine
Reduktion mit 0,2 M Mercaptoethanol durchgeführte
Molekulargewichtsbestimmung ergab, daß der CSF in Untereinheiten dissoziiert worden war, von
denen jede ein Molekulargewicht von 35.000-45.000 Daltons aufwies.
b) Aminosäurensequenz des Untereinheitsproteins
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Der gereinigte CSF wurde im Hinblick auf die NH&sub2;-terminale
Aminosäurensequenz auf konventionelle Weise mit einem
Dampfphasenaminosäurensequenzierer analysiert. Der gereinigte CSF wurde anschließend mit 6 M
Guanidin denaturiert und mit Monojodessigsäure alkyliert und nach
Entsalzen
einer Verdauung mit Trypsin mit anschließender Zersetzung mit
Bromcyan ausgesetzt. Das Trypsin-Verdauungs-Bromcyan-Zersetzungsprodukt
(Peptidmischung) wurde mit
Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Vydac C-18 fraktioniert. Die abgetrennten
Peptidfraktionen wurden jeweils mit einem
Dampfphasenaminosäurensequenzierer zur Bestimmung der Aminosäurensequenz jedes Peptidfragments
analysiert. Basierend auf den Aminosäuresequenzen der entsprechenden Trypsin-
Verdauungs-Bromcyan-Zersetzungsprodukt-Peptidfragmente und der
Basensequenz der von den Erfindern klonierten mRNA wurde die primäre
Aminosäurenstruktur des Untereinheitsproteins bestimmt. Die Ergebnisse des
Sequenzierens sind in Tabelle 3 dargestellt.
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Die Sequenz von der NH&sub2;-terminalen Aminosäure (Glutaminsäure) bis
zur 149sten Aminosaure (Glutaminsäure) ist identisch mit der von CSF-1,
welche ein bekannter CSF ist, aber die Sequenz von der 150sten bis zur
214ten - 238sten Aminosäure (65-89 Aminosäuren) unterscheidet sich
ziemlich von derjenigen des bekannten CSF.
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Als COO-terminale Aminosaure wurde Prolin als 214te Aminosäure und
Lysin als 238ste Aminosäure in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht des
Untereinheitsproteins nachgewiesen. Die 122ste und 140ste Aminosäure
(Asparagin) haben jeweils eine typische N-Glycosidbindungsstruktur der
Formel Asn-X-Ser/Thr (X ist eine beliebige Aminosäure), und man nimmt an,
daß diese Stellen Stellen der Zuckerkettenbindung sind.
Tabelle 3: Aminosäuresequenz der Untereinheit
c) Isoelektrischer Punkt
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Der mit Hilfe von Polyacrylamidgel isoelektrischer Fokussierung und
isoelektrischer Fokussierung mit Hilfe des Sucrosedichtegradienten
bestimmte isoelektrische Punkt (pI) ist 3,1-3,7.
d) Zuckerkettenbildende Monosaccharide
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Die bestandteilbildenden Monosaccharide, die in den an das
Polypeptid gebundenen Zuckerketten enthalten sind, wurden mit Hilfe von
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie im Anschluß an Hydrolyse zum Zwecke
der Freigabe analysiert. Aldosen und Sialsäuren wurden auf einer
Anionenaustauschersäule und Hexosamine auf einer Kationenaustauschersäule
fraktioniert, Elution wurde mit Hilfe der
Boratpufferkonzentrationsgradientenelutionstechnik durchgeführt. Die Bestandteile wurden anschließend
einer Nachsäulenmarkierung mit Cyanacetamid oder Arginin ausgesetzt und
mit Hilfe des Fluoreszenzverfahrens identifiziert. Die in dem CSF-Molekül
enthaltenen Zuckerketten sind variierbar, waren schwer quantitativ zu
bestimmen, obwohl Mannose, Galactose, N-Acetylglucosamin,
N-Acetylgalactosamin und N-Acetylneuraminsäure als bestandteilbildende Monosaccharide
identifiziert wurden.
e) Zirkulardichroismus(CD)-Spektrum.
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Das CD-Spektrum im fernen Ultraviolettbereich wurde unter Verwendung
eines Zirkulardichroismusdispersionsmeters (JASCO Model J-600) gemessen.
Es wurden Minimumpeaks bei den Wel1enlängen 208 nm und 222 nm beobachtet.
Es wird deshalb angenommen, daß die Sekundärstruktur des CSF eine
alpha-Helixstruktur enthält.
f) Wärmestabilität
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Der CSF wurde in einem verdünnten Puffer (pH 7,0) auf eine
Konzentration von 1 ug/ml gelost und die Losung wurde 60 min bei 60 ± 0,5ºC
erwärmt und anschließend im Hinblick auf Koloniestimulierungsaktivität
(hier im nachfolgenden später erwähnt) geprüft. Es wurde beinahe keine
Aktivitätsabnahme beobachtet.
g) Infrarotabsorptionsspektrum
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Das Infrarotabsorptionsspektrum des CSF in Form eines
lyophilisierten Pulvers wurde mit Hilfe des Transmissionsverfahrens (KBr Fenster)
unter Verwendung eines Fourier-Transformations-Infrarotspektrophotometers
(Nocolet Model SDXC) bestimmt.
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Der CSF zeigt starke Absorption bei 1650 cm&supmin;¹, 1201 cm&supmin;¹ und
1133cm&supmin;¹ und mittlere Absorption bei 1537 cm&supmin;¹, 1432 cm&supmin;¹ und
1068 cm&supmin;¹.
(2) Biologische Eigenschaften des CSF
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Die Koloniestimulierungsaktivität des in Beispiel 3 erhaltenen CSF
wurde mit Hilfe eines Verfahrens, das Koloniebildung von Mausmarkzellen
auf einem Einzelschichtweichagargel umfaßt, bestimmt. So wurde die
CSF-Probe mit 1 ml McCoy's 5A Medium, welches 0,3 % Agar, 20 % fötales
Kalbsserum (FCS) und 1 x 10&sup5; Mausmarkzellen enthält, gemischt. Es wurde
7 Tage unter einem Strom 7,5 % CO&sub2;-haltiger Luft bei 37ºC inkubiert.
Anschließend wurden die aus 50 oder mehr Zellen bestehenden Zellaggregate
als Kolonien angesehen und gezahlt. Die Koloniestimulierungsaktivität
wurde in Einheiten ausgedrückt. Eine Einheit wurde als die Menge CSF
definiert, die für die Bildung einer Kolonie erforderlich ist. Die
spezifische Aktivitat wurde als Anzahl der Kolonien (Einheiten), die pro
Milligramm CSF Protein gebildet sind, ausgedrückt. Als Ergebnis wurde
festgestellt, daß der CSF eine spezifische Aktivität von 1,4 x 10&sup8; Einheiten
pro Milligramm Protein aufweist. Die gebildeten Kolonien wurden mit
Hämatoxylin-Eosin zum Zwecke der morphologischen Klassifizierung gefärbt. Es
wurde so festgestellt, daß mindestens 95 % der gebildeten Kolonien
Monozyten-Makrophagenkolonien waren.