DE69229202T2

DE69229202T2 - Verfahren zur reinigung von menschlichem bcdf

Info

Publication number: DE69229202T2
Application number: DE69229202T
Authority: DE
Inventors: Masayo Date; Daisuke Ejima; Yutaka Sato; Yoshiyuki Takahara; Mayumi Watanabe
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1991-02-26
Filing date: 1992-02-25
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2012-02-26
Also published as: WO1992014832A1; DE69229202D1; EP0529086A4; US5610284A; JP3200850B2; EP0529086B1; EP0529086A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von menschlichem B-Zellendifferenzierungsfaktor (nachstehend als menschlicher BCDF bezeichnet), der sich für pharmazeutische Präparate eignet. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen von reinem menschlichem BCDF, der in Form von Arzneimitteln verwendbar ist und in bezug auf Reinheit und Sicherheit eine garantierte Beschaffenheit aufweist, aus Kulturbrühen eines Mikroorganismus, worin menschliche BCDF-DNA integriert ist.

Stand der Technik

Die cDNA von menschlichem BCDF, bei dem es sich um einen Faktor handelt, der menschliche B-Zellen zu Antikörper erzeugenden Zellen differenziert, wurde im Jahre 1986 kloniert (Nature, Bd. 324 (1986), S. 73). Später wurde diese Substanz als B-Zellen-Stimulationsfaktor-2 (BSF-2) oder Interleukin 6 (IL-6) bezeichnet. Insgesamt wurden folgende Eigenschaften ermittelt: Molekulargewicht: etwa 21 000; isoelektrischer Punkt: etwa 6,2. Ferner wurde berichtet, daß menschlicher BCDF verschiedene biologische Aktivitäten aufweist. Zu diesen Aktivitäten gehören medizinische Aktivitäten, wie eine Proliferationswirkung in bezug auf Blutstammzellen, eine Differenzierungswirkung in bezug auf deren Vorläuferzellen zu Blutplättchen und die Differenzierungswirkung in bezug auf B-Lymphozyten zu Antikörper erzeugenden Zellen. Somit wird eine Verwertung von menschlichem BCDF auf dem Arzneimittelgebiet erwartet, beispielsweise als Arzneimittel zum Ausgleichen einer Verminderung von Blutzellen aufgrund der Verwendung eines karzinostatischen Mittels oder aufgrund einer Knochenmarktransplantation, oder als medizinisches Präparat zur Verstärkung einer Impfstoffwirkung.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben bereits verschiedene Verfahren beschrieben, mit denen in einfacher und wirksamer Weise reiner menschlicher BCDF aus Kulturbrühen von menschlichem BCDF abgetrennt werden kann, wobei diese Brühen unter Einsatz von Escherichia coli, in das cDNA für menschlichen BCDF integriert ist, als Produktionswirt erhalten worden sind (vergl. JP-A-Hei-1-83094, JP-A-Hei-1-300898 und JP-A-Hei-2-186996). Diese Verfahren sind jedoch nicht immer zur Entfernung von Verunreinigungen geeignet, z. B. von Analogen von menschlichem BCDF, wobei diese Verunreinigungen im Verlauf der Untersuchung von Techniken zur Abtrennung von reinem menschlichem BCDF aus menschlichen BCDF-Kulturbrühen erkannt worden sind. Ferner reicht der gemäß diesen Verfahren erzielbare Reinigungsgrad zwar für Laboratoriumsuntersuchungen aus, ist aber für die Erzeugung von menschlichem BCDF, das zur Verwendung für Arzneimittelzwecke vorgesehen ist, noch nicht akzeptabel. Für menschlichen BCDF, der für Arzneimittel zu verwenden ist, ist es erforderlich, ein praxisgerechtes Reinigungsverfahren unter der Prämisse bereitzustellen, daß in großtechnischem Maßstab eine Arzneimittelgrundlage billig und mit einer für eine sichere Verabreichung an Menschen ausreichenden Reinheit erzeugt werden kann, die frei von irgendwelchen, für den menschlichen Körper schädlichen Substanzen ist.
Es ist allgemein bekannt, daß bei Erzeugung eines physiologisch aktiven Proteins unter Verwendung einer rekombinanten DNA in E. coli als Wirt Verunreinigungen mit einem analogen Protein, das sich partiell in der Primärstruktur vom natürlichen Typ unterscheidet, oder mit einem analogen Protein, das sich in bezug auf Disulfidverknüpfungen vom natürlichen Typ unterscheidet, auftreten können. Ferner können, wie es in Verbindung mit Interleukin-2 und Interferon bekannt ist, Fälle auftreten, bei denen ein erwünschtes Protein mit einer hochmolekularen Substanz verunreinigt ist, die als Ergebnis einer intermolekularen Assoziation durch eine nicht- kovalente Bindung entstanden ist, wobei normalerweise angenommen wird, daß das erwünschte Protein als ein Monomeres vorliegt. Ferner gibt es Fälle, bei denen ein Analoges als Ergebnis einer Spaltung oder partiellen Modifikation eines erwünschten Proteins oder als Ergebnis einer Variation eines erwünschten Proteins in bezug auf die Primärstruktur oder die Stereostruktur, die sich beim Reinigungsverfahren ergeben, gebildet wird. Diese Analogen bergen die Gefahr einer schädlichen Immunreaktion unter Bildung von unnötigen Antikörpern, wenn sie wiederholt dem menschlichen Körper verabreicht werden. Das Vorliegen von intermolekularen Aggregaten von menschlichem BCDF wurde erstmals von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung entdeckt, wie nachstehend ausgeführt wird. Daher war bisher noch kein Abtrennungsverfahren bekannt.
Ferner wurde bisher keine Kombination von Reinigungstechniken beschrieben, gemäß denen
(1) die Bildung von denaturierten Proteinen aus menschlichem BCDF auf ein Minimum beschränkt werden kann, wobei diese denaturierten Proteine eine Verringerung der physiologischen Aktivitäten von menschlichem BCDF hervorrufen können, und
(2) Proteine, die sich vom Mikroorganismus ableiten und für den menschlichen Körper schädlich sein können, entfernt werden können,
(3) wobei hochreiner menschlicher BCDF, der von exogenen Substanzen (z. B. Endotoxinen), die sich vom Mikroorganismus ableiten oder die im Verlauf des Reinigungsverfahrens hinzukommen, gesäubert werden kann, wobei sich diese Merkmale zusammen mit den vorerwähnten Techniken zur Entfernung der Analogen ergeben.
Lymphokine, wie menschlicher BCDF, wirken normalerweise in vitro bei einer geringen Konzentration von nur etwa einigen pg/ml, während aber für die Handhabung eines Lymphokins als medizinische Grundlage eine Handhabung in hohen Konzentrationen von etwa einigen mg/ml erwünscht ist. Die Gründe hierfür sind, daß (1) aufgrund der Tatsache, daß Toxizitätstests bei hohen Dosen durchgeführt werden können, eine sichere Bewertung des Lymphokins mit höherer Genauigkeit vorgenommen werden kann, (2) es bei Herstellung eines medizinischen Präparats aus einer Grundlage möglich ist, das Präparat leicht auf eine für die Verabreichung geeignete Konzentration einzustellen, selbst wenn verschiedene Hilfsstoffe zugesetzt werden, was wiederum bedeutet, daß es einfach ist, ein medi zinisches Präparat herzustellen, und 3) es aufgrund der Tatsache, daß das Reinigungsverfahren im Kleinmaßstab durchgeführt werden kann, es ermöglicht wird, die betreffenden Arbeitsweisen und Vorrichtungen zu vereinfachen. Lymphokine sind jedoch im allgemeinen stark hydrophob, so daß die Gefahr von intermolekularen Assoziierungen, Fällungen oder Denaturierungen mit zunehmender Konzentration ansteigt, so daß es bei der Reinigung von menschlichem BCDF erforderlich war, Reinigungsverfahren auszuarbeiten, die sich von den Bedingungen einer Reinigung unter geringer Konzentration, wie sie für die Züchtung von Zellen und dergl. angewandt wird, unterscheiden.
H. Yasueda et al., BIO/TECHNOLOGY, Bd. 8 (1990), S. 1036-1040, beschreiben ein Verfahren, bei dem reduzierter und aufgefalteter BCDF mehrere Stunden inkubiert wird, um eine Oxidation des durch den im Denaturierungspuffer vorhandenen Sauerstoff reduzierten Proteins zu bewirken. Jedoch führen diese Bedingungen nicht zu vollständig oxidiertem menschlichem BCDF-Protein. Um menschlichen BCDF vollständig zu oxidieren, wird die Lösung nach der Rückfaltung des denaturierten Polypeptids zusätzlich mehrere Stunden inkubiert.
EP-A-0 257 406 beschreibt ein Verfahren zur Rückfaltung von BCDF, wobei in einer ersten Stufe die Konzentration des denaturierenden Guanidin-hydrochlorids verringert wird, um das Protein rückzufalten, und in einer zweiten Stufe das reduzierte Protein oxidiert wird.

Offenbarung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Reinigungsverfahren bereitzustellen, das in effizienter Weise in großtechnischem Maßstab die Herstellung einer hochreinen, stabilen und stark konzentrierten menschlichen BCDF-Lösung ermöglicht, die frei ist von verunreinigenden Proteinen oder Endotoxinen, die sich vom erzeugenden Wirt ableiten, von Verunreinigungen, die im Reinigungsverfahren erzeugt werden, und von menschlichen BCDF-Analogen, wie Varianten, die sich bezüglich der Primärstruktur unterscheiden, oder Aggregaten (hochmolekularen Substanzen), die von menschlichem BCDF abgeleitet sind.
Als Ergebnis intensiver Untersuchungen zur Lösung dieser Aufgabe haben die Erfinder in dem Bestreben zur Reinigung von menschlichem BCDF in bakteriellen Zellen, die durch Massenkultur von E. coli mit einem integrierten menschlichen BCDF- Gen erhalten worden sind, ein großtechnisch anwendbares Reinigungsverfahren zur Reinigung von menschlichem BCDF aufgefunden, dessen hoher Reinigungsgrad eine Verabreichung an den Menschen ermöglicht, wobei sich das Verfahren insbesondere folgender Stufen bedient: (1) Stufen zur Durchführung einer Solubilisierung (Extraktion) unter Verwendung eines hochkonzentrierten Proteindenaturierungsmittels und einer Oxidationsreaktion und Rückfaltung, (2) Stufen zur Entfernung von bakteriellen Zellproteinen, Endotoxinen, Primärstruktur-Varianten von menschlichem BCDF und dergl. unter Anwendung von Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (nachstehend als Umkehrphasen-HPLC bezeichnet) und (3) Stufen zur Entfernung von Proteindenaturierungsmittel, organischen Lösungsmitteln und molekularen Aggregaten von menschlichem BCDF unter Anwendung eines Gelfiltrationsverfahrens. Die Erfindung wurde auf der Basis dieser Befunde fertiggestellt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reinigen von reduziertem menschlichem BCDF, welches folgende Schritte umfaßt:
(i) Lösen von menschlichem BCDF in Guanidin-hydrochlorid und Einstellen der Guanidin-hydrochlorid-Konzentration auf 4 bis 7 M,
(ii) Unterziehen des menschlichen BCDF einer Oxidationsreaktion in Anwesenheit von 0,002 bis 0,5 mM reduziertem Glutathion und 0,002 bis 0,5 mM oxidiertem Glutathion und
(iii) Unterziehen der Lösung von menschlichem BCDF einer Rückfaltungsreaktion unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Reinigen von reduziertem menschlichem BCDF, welches folgende Schritte umfaßt:
(i) bis (iii) gemäß den vorstehenden Ausführungen,
(iv) Durchführen einer Ionenaustauschchromatographie-Behandlung, welche das Aufgeben der Lösung von menschlichem BCDF auf eine Chromatographiesäule, die mit einem Gelträger gefüllt ist, der als Ligand einen Ionenaustauscher auf der Grundlage eines Polysaccharids, Dextrans oder synthetischen Polymers hat, und dann Durchführen der Elution mit einem Elutionsmittel umfaßt, dessen Salzkonzentration verändert wird, wobei der menschliche BCDF gereinigt wird,
(v) Durchführen einer chromatographischen Behandlung mit einer reversen Phase durch Durchleiten der Lösung von menschlichem BCDF durch eine Säule, die mit einem chromatographischen Träger mit einer reversen Phase gefüllt ist, der als Ligand eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen aufweist und der eine Porengröße von 250 Å oder mehr hat, wobei der menschliche BCDF gereinigt wird, und
(vi) Durchführen einer Gelfiltrationschromatographie-Behandlung durch
(a) ein erstes Durchleiten einer 5 bis 50 mM Pufferlösung einer organischen Säure oder eines Salzes davon, die 5 bis 50% eines aus der aus Acetonitril, Ethanol und Propanol bestehenden Gruppe ausgewählten organischen Lösungsmittels enthält, durch eine Gelfiltrationschromatographiesäule,
(b) Aufgeben der Lösung von menschlichem BCDF auf die Säule und Durchleiten der Pufferlösung unter Gewinnung einer Lösung von menschlichem BCDF,
(c) ein zweites Durchleiten einer 3 bis 20 mM Pufferlösung eines Alkalimetallsalzes einer aus der aus Essigsäure, Ameisensäure und Zitronensäure bestehenden Gruppe ausgewählten organischen Säure, wobei die Pufferlösung kein organisches Lösungsmittel enthält, durch die Säule und
(d) Aufgeben der Fraktion von menschlichem BCDF, die in (b) erhalten wurde, auf die Säule und Durchleiten der in (c) beschriebenen Pufferlösung unter Gewinnung einer Lösung von menschlichem BCDF, die kein organisches Lösungsmittel enthält.
Nachstehend wird die Erfindung ausführlich erläutert.
Ein Beispiel für ein erfindungsgemäß zu reinigendes Ausgangsmaterial ist eine menschliche BCDF-Kulturbrühe, die durch Züchten eines Mikroorganismus mit integriertem menschlichem BCDF-Gen, beispielsweise durch in E. coli integriertes menschliches BCDF-Gen, erhalten worden ist. Üblicherweise liegt menschlicher BCDF in einer menschlichen BCDF-Kulturbrühe in Form von unlöslichen Granalien innerhalb der Mikroorganismenzellen vor. Derartige menschliche BCDF-Granalien können als Ausgangsmaterial verwendet werden. Der Großteil eines derartigen menschlichen BCDF liegt in reduzierter Form vor, wobei die vier Cystein-Komponenten (44,50,73,83Cys) die freie Thiolstruktur aufweisen und keine Disulfidbrücken bilden.
Nachstehend wird die Stufe des Lösens von menschlichem BCDF, der in Form von unlöslichen Granalien vorliegt, beschrieben. Gemäß einem herkömmlichen Verfahren werden unlösliche menschliche BCDF-Granalien gegebenenfalls nach Suspendieren in destilliertem Wasser mit einer relativ geringen Drehzahl zentrifugiert, um anhaftende Verunreinigungen abzuwaschen. Die erhaltenen Pellets werden in einer EDTA-Lösung von geringer Konzentration (1-10 mM) suspendiert. Anschließend wird die reduzierte Form von menschlichem BCDF in einer hochkonzentrierten (z. B. 6 M) Lösung von Guanidin-hydrochlorid als Proteindenaturierungsmittel in Lösung gebracht, so daß man eine menschliche BCDF-Lösung mit einer endgültigen Konzentration an menschlichem BCDF von 1,0-3,0 mg/ml erhält. Gegebenenfalls kann Harnstoff oder dergl. als Proteindenaturierungsmittel zugesetzt werden. Die Suspension wird langsam 1-4 Stunden bei 10-35ºC und vorzugsweise bei 20-28ºC gerührt, wobei der pH-Wert bei oder unter 5,5-6,0 gehalten wird. Üblicherweise weist natürlicher menschlicher BCDF im Molekül vier Cysteinreste (44,50,73,83Cys) auf, wobei diese vier Reste zwei intramolekulare Disulfidbrücken (&sup4;&sup4;Cys-&sup5;&sup0;Cys und &sup7;³Cys- &sup8;³Cys) bilden. Da, wie vorstehend erwähnt, der Großteil der Cysteinreste in gelöstem menschlichem BCDF in der freien Thiolstruktur vorliegt, ist es erforderlich, wie vorstehend beschrieben, eine Oxidationsreaktion und eine Behandlung zur Rückfaltung vorzunehmen.
Die Stufe der Oxidationsreaktion und der Rückfaltungsbehandlung wird nachstehend beschrieben, wobei zunächst die charakteristischen Merkmale dargelegt werden.
Wie vorstehend erwähnt, weist natürlicher menschlicher BCDF intramolekulare Disulfidbrücken auf, während menschlicher BCDF, das innerhalb von Zellen eines Mikroorganismus, wie E. coli, erzeugt und angereichert worden ist, im reduzierten Zustand (Thiolform) und in Form von unlöslichen Aggregaten (Einschlußkörper) vorliegt. Um daher dieses Produkt in menschlicher BCDF der natürlichen Art umzuwandeln, ist die Bildung von intramolekularen Disulfidbrücken und der natürlichen Stereostruktur (vor der Denaturierung vorliegende ursprüngliche Struktur höherer Ordnung) erforderlich. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung der Oxidationsreaktion und der Rückfaltungsbehandlung ist dadurch gekennzeichnet, daß menschlicher BCDF zunächst in einem vollständig denaturierten und reduzierten Zustand einer Oxidationsreaktion in einer hochkonzentrierten Guanidin-hydrochlorid-Lösung mit einem Gehalt an Glutathion unterworfen wird, um in perfekter Weise intramolekulare Disulfidbrücken in den monomeren Molekülen des menschlichen BCDF zu bilden, wobei die oxidierte Form von menschlichem BCDF entsteht. Ferner ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß anschließend das Guanidin-hydrochlorid durch Gelfiltration entfernt wird, wodurch sich die Stereostruktur von menschlichem BCDF von natürlicher Art ergibt. Die erfindungsgemäßen Behandlungsstufen sind gegenüber einer herkömmlichen Oxidationsreaktion und Rückfaltungsbehandlung insofern vorteilhaft, als die für diese Stufe erforderliche Zeitspanne kürzer ist, so daß eine Verringerung der Ausbeute an menschlichem BCDF aufgrund einer Fällung im Reaktionsverlauf verhindert werden kann, und insofern, als ein Anstieg der Flüssigkeitsmenge aufgrund einer Verdünnung und dergl. auf ein Minimum beschränkt oder ganz vermieden werden kann.
Nachstehend wird die Stufe der Oxidationsreaktion ausführlich beschrieben. Eine Lösung von solubilisiertem menschlichem BCDF kann gegebenenfalls mit einer Guanidin-hydrochlorid-Lösung verdünnt werden, wobei aber empfohlen wird, die Guanidin-hydrochlorid-Konzentration auf 4-7 M und vorzugsweise auf 5,0-6,0 M einzustellen. Liegt die Guanidin-hydrochlorid-Konzentration unter 4 M, so wird das menschliche BCDF in geringeren Ausbeuten gewonnen, was selbstverständlich nicht bevorzugt ist. Die Konzentration an menschlichem BCDF unterliegt keinen speziellen Beschränkungen, sofern das menschliche BCDF gelöst ist. Sie kann im Bereich von 0,1-2,0 mg/ml und vorzugsweise von 0,5-0,8 mg/ml gewählt werden. Was die pH-Bedingungen zur Ermöglichung der Dissoziation der Thiolgruppen betrifft, ist es empfehlenswert, eine basische Substanz, beispielsweise eine wäßrige Natriumhydroxidlösung, zuzusetzen, um den pH-Wert auf 6,5-9,0 und vorzugsweise auf 8,0-8,6 einzustellen. Unter diesen Bedingungen wird die Oxidationsreaktion von menschlichem BCDF unter langsamem Rühren bei einer Temperatur von 10-35ºC und vorzugsweise von 20-28ºC für eine Zeitspanne von 3-24 Stunden und vorzugsweise von 10- 15 Stunden durchgeführt, wobei eine vollständige Bildung von intramolekularen Disulfidbrücken der natürlichen Art erfolgt, wodurch man menschlichen BCDF in der oxidierten Form erhält. Aus den Untersuchungen unter Einsatz von ¹³C-NMR ist in bezug auf partiell reduzierter menschlicher BCDF (beispielsweise das Produkt, bei dem &sup7;³Cys und &sup8;³Cys verbunden sind, während &sup4;&sup4;Cys und &sup5;&sup0;Cys unverknüpft bleiben) festzustellen, daß sich eine intramolekulare Disulfidbrücke (Oxidation) innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne bildet, wenn der pH-Wert 6,5 oder mehr beträgt, während eine langsame Bildung einer intramolekularen Disulfidbrücke stattfindet (obgleich das menschliche BCDF relativ stabil ist), wenn der pH-Wert nicht mehr als 5 beträgt, wobei eine intramolekulare Disulfidbrücke der natürlichen Art (oxidierte Form von menschlichem BCDF) entsteht.
Um ferner die Bildung der natürlichen Disulfidbrücke innerhalb einer kürzeren Zeitspanne zu erreichen, werden reduziertes und oxidiertes Glutathion in einer geeigneten Kombination (jeweils in einer Konzentration von 0,002-0,5 mM) zugegeben. Die Zugabe einer zu großen Menge an Glutathion (insbesondere wenn dessen Konzentration 1 mM oder mehr für reduziertes Glutathion und 0,1 mM oder mehr für oxidiertes Glutathion beträgt) ist unerwünscht, da dabei ein Hybrid-Disulfid entsteht, bei dem menschlicher BCDF und Glutathion direkt mit einer Disulfidbrücke verbunden sind. Die zunehmende Bildung der intramolekularen Disulfidbrücke in menschlichem BCDF läßt sich durch die Variation der Retentionszeit eines Chromatogramms durch Umkehrphasen-HPLC (beispielsweise unter Verwendung von "214TP54R" der Fa. VydacR) bestätigen. Die auf diese Weise vorläufig gereinigte BCDF-Lösung ist bei niederen Temperaturen von 3-10ºC für mindestens 1 Woche stabil.
Anschließend muß eine Stufe durchgeführt werden, bei der der menschliche BCDF einer Rückfaltung unterworfen wird, wobei das in der vorherigen Stufe verwendete Guanidin-hydrochlorid weitgehend entfernt wird. Für diese Stufe ist eine Flüssigchromatographiebehandlung, insbesondere eine Gelfiltrationschromatographiebehandlung, wirksam. Als chromatographischer Träger können Polysaccharide, Dextran, deren chemisch modifizierte Derivate oder synthetische Polymere mit einem fraktionierten Molekulargewicht von 5000 oder weniger verwendet werden. Zu typischen Beispielen für Träger gehören "Sephadex G-25"R (der Fa. PharmaciaR Inc.), "Cellulofine GH- 25R" (der Fa. Chisso Co., Ltd.R), "Toyopearl HW-40R" (der Fa. Tosoh Co., Ltd.R) und "Cellulose CW-35R" (der Fa. Tosoh Co., Ltd.R), wobei aber keine Beschränkung hierauf besteht. Ein chromatographischer Träger wird in eine Säule gepackt und mit einer Pufferlösung äquilibriert. Als Pufferlösung für die Äquilibrierung können eine 5-50 mM Essigsäure- oder Ameisensäure-Pufferlösung (pH-Wert 4,0-5,8) im Hinblick auf die nächste Stufe eingesetzt werden. Als Gegenkationen können Natriumionen, Kaliumionen, Ammoniumionen und dergl. verwendet werden. Ein derartiger Träger, der mit einer solchen Pufferlösung äquilibriert worden ist, wird zusammen mit der in der vorherigen Stufe erhaltenen Lösung von menschlichem BCDF in einer Menge von 0,15-0,24 ml pro 1 ml des Trägers aufgesetzt. Der Entwicklungs- und Elutionsvorgang wird unter Verwendung einer derartigen Pufferlösung durchgeführt, wobei eine Fraktion von menschlichem BCDF erhalten wird. Wenn bei diesem Vorgang Verunreinigungen (Proteine, Glykoproteine, Glykolipide und dergl., die aus bakteriellen Zellen stammen) eben falls aus einer Lösung von menschlichem BCDF entfernt werden sollen, um eine höhere Reinigungswirkung zu erzielen, sollte ein geeigneter chromatographischer Träger gewählt werden und die Konzentration oder der pH-Wert einer derartigen Äquilibrierungspufferlösung in geeigneter Weise gesteuert werden. Wenn beispielsweise "Sephadex G-25R" als chromatographischer Träger verwendet wird und eine 5-15 mM und vorzugsweise 8-10 mM Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,7-5,3 und vorzugsweise von 4,9-5,1 als Äquilibrierungspufferlösung verwendet wird, zeigen die Verunreinigungen eine relativ starke Affinität für den Träger. Infolgedessen kann die Fraktion von menschlichem BCDF besser vom Guanidin-hydrochlorid und den Verunreinigungen abgetrennt werden.
Ein auf diese Weise durch eine Gelfiltrationschromatographiestufe erhaltener menschlicher BCDF weist die intramolekulare Disulfidverknüpfung und die Stereostruktur von natürlichem BCDF auf. Seine Proteinreinheit, bestimmt durch Umkehrphasen-HPLC für Analysezwecke und SDS-PAGE, beträgt mehr als 80% und üblicherweise mehr als 90%. Ferner handelt es sich bei der Fraktion von menschlichem BCDF um eine saubere Lösung, die im wesentlichen frei von Niederschlägen ist und unter aseptischen Bedingungen bei niedrigen Temperaturen von 3-10ºC mindestens 10 Tage stabil bleiben kann. Der Reaktionsfortschritt bei der Stufe der Oxidationsreaktion und der Rückfaltungsbehandlung läßt sich durch ¹³C-NMR-Messung von menschlichem BCDF bestätigen, bei dem Carbonyl-Kohlenstoffatome einer Aminosäure, wie Cystein oder Phenylalanin, selektiv mit ¹³C markiert sind.
Zur Herstellung von menschlichem BCDF von medizinischer Qualität aus einer auf diese Weise erhaltenen Lösung von menschlichem BCDF ist es wesentlich, eine weitere Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasen-HPLC durchzuführen, wobei die noch verbleibenden Verunreinigungen, insbesondere von mikrobiellen Zellen abgeleitete Proteine, Endotoxin und Primärstruktur-Varianten von menschlichem BCDF beseitigt werden können. Der Ausdruck "Primärstruktur-Varianten" von menschlichem BCDF, der hier verwendet wird, bezieht sich auf menschlichen BCDF, bei dem die Peptidbindungen teil weise getrennt sind oder die Aminosäurebestandteile teilweise oxidiert sind. Es wird angenommen, daß ein derartiger menschlicher BCDF üblicherweise im Verlauf der Züchtung und/oder bei der Stufe der Solubilisierung gebildet wird.
Aufgrund der Durchführung einer Reinigungsbehandlung durch Ionenaustauschchromatographie ist es insbesondere möglich, im wesentlichen sämtliche Verunreinigungen und Endotoxine, die in menschlichem BCDF enthalten sind, zu entfernen. Bei dem einzusetzenden Ionenaustauscher kann es sich um einen Kationenaustauschchromatographieträger oder einen Anionenaustauschchromatographieträger handeln.
Als ein derartiger Kationenaustauschchromatographieträger kann man ein beliebiges Gel verwenden, das als Liganden einen schwach sauren oder stark sauren Kationenaustauscher aufweist, dessen Grundlage ein Polysaccharid, ein Dextran, ein synthetisches Polymeres oder dergl. ist. Zu typischen Beispielen für derartige Träger gehören "CM Sepharose FFR" (von der Fa. Pharmacia Inc. R) und "CM Cellulofine C-500R" (von der Fa. Chisso Co., Ltd.R). Ein Träger wird in eine Säule gepackt, die mit Essigsäure- oder Ameisensäure-Pufferlösung (pH-Wert 4,5-5,5) äquilibriert ist. Anschließend wird eine Lösung von menschlichem BCDF (Protein in einer Menge von 1-10 mg pro 1 ml Träger) aufgesetzt, wobei der menschliche BCDF adsorbiert wird. Danach wird ein Waschvorgang mit der Äquilibrierungspufferlösung durchgeführt. Sodann wird der adsorbierte menschliche BCDF eluiert, wobei man die Äquilibrierungspufferlösung verwendet und einen Konzentrationsgradienten eines Salzes, wie Natrium-, Kalium- oder Ammoniumchlorid oder eines Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalzes von Essigsäure oder Ameisensäure zusetzt. Beispielsweise wird die Elution unter Verwendung einer 10 mM Natriumacetat-Äquilibrierungspufferlösung (pH-Wert 5,0) und einer 0,5 M Natriumacetat-Pufferlösung (pH-Wert 5,0) und einer 0,5 M Natriumacetat- Pufferlösung (pH-Wert 5,5) durchgeführt, wobei der Anteil des letztgenannten Bestandteils allmählich erhöht wird (lineare Gradientenelution). Ein derartiges Elutionsmittel kann in einer Gesamtmenge von etwa dem 10-fachen der Säulenkapazität eingesetzt werden. Der pH-Wert einer Essigsäure- oder Amei sensäure-Pufferlösung, die als Elutionsmittel zu verwenden ist, kann um 0,5-1,0 höher sein als der Wert einer Äquillbrierungspufferlösung. Bei einem auf diese Weise erhaltenen menschlichen BCDF handelt es sich um menschlichen BCDF der natürlichen Art. Die Proteinreinheit dieser Fraktion beträgt mindestens 95% und üblicherweise mehr als 98%. Der Endotoxingehalt beträgt nicht mehr als 0,5 Endotoxineinheiten (EU) pro 1 mg Protein.
Andererseits kann als ein derartiger Anionenaustauschchromatographieträger ein beliebiges Gel verwendet werden, das als Liganden einen schwach basischen oder stark basischen Anionenaustauscher enthält, dessen Grundlage ein Polysaccharid, ein Dextran, ein synthetisches Polymeres oder dergl. ist. Zu Beispielen für derartige Träger gehören "DEAE-Sepharose FFR" (von der Fa. Pharmacia Inc. R) und "DEAE Cellulofine A-500R" (von der Fa. Chisso Co., Ltd.R). Ein Träger wird in eine Säule gepackt, die mit einer Pufferlösung mit einer Pufferwirkung bei einem pH-Wert von 7,5-10,0 (wie Tris-Diethanolamin) äquilibriert ist. Anschließend wird eine Lösung von menschlichem BCDF (in einer Menge von 1-10 mg Protein pro 1 ml Träger) aufgesetzt. Sodann wird in ausreichendem Maße mit einer Äquilibrierungspufferlösung gewaschen.
Bei einer auf diese Weise zu behandelnden Lösung von menschlichem BCDF handelt es sich vorzugsweise um eine Lösung, die durch Zugabe einer Äquilibrierungspufferlösung zu einer Lösung von menschlichem BCDF, die kein Denaturierungsmittel enthält, unter Einstellung des pH-Werts auf 8,5-9,5 hergestellt worden ist.
Anschließend wird der menschliche BCDF mit einer Äquilibrierungspufferlösung eluiert, wobei ein Salz, beispielsweise ein Chlorid, wie Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, in Form eines Gradienten zugesetzt wird. Beispielsweise wird eine Elution durchgeführt, indem man eine 50 mM Tris-hydrochlorid- Äquilibrierungspufferlösung (pH-Wert 8,5) und eine wäßrige 0,5 mM Natriumchloridlösung verwendet, wobei der Anteil des letztgenannten Bestandteils allmählich erhöht wird (lineare Gradientenelution). Ein derartiges Elutionsmittel kann in einer Gesamtmenge von etwa dem 10-fachen der Säulenkapazität verwendet werden. Bei einem auf diese Weise erhaltenen menschlichen BCDF handelt es sich selbstverständlich um menschlichen BCDF der natürlichen Art. Die Proteinreinheit dieser Fraktion beträgt mindestens 90%. Der Endotoxingehalt beträgt nicht mehr als 50 EU pro 1 mg Protein.
Eine durch diese Kationen- oder Anionenaustauschchromatographiebehandlung erhaltene Lösung von menschlichem BCDF kann bei aseptischer Aufbewahrung bei niedrigen Temperaturen von 3-10ºC mindestens 1 Monat stabil bleiben.
Anschließend eignet sich die Umkehrphasen-HPLC-Behandlung zur Entfernung der verbleibenden Verunreinigungen, Endotoxine und Primärstruktur-Varianten von menschlichem BCDF. Als Träger für die Umkehrphasen-HPLC kann ein Träger verwendet werden, der einen Liganden mit einer Alkylgruppe von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder dergl. aufweist und dessen Grundlage ein Kieselgel oder ein synthetisches Polymeres mit einer Porengröße von 250 Å oder mehr ist. Zu Beispielen für derartige Träger gehören "214 TP 1022R" (von der Fa. VydacR) und "YMC AP-803R" (von der Fa. Yamamura Kagaku Kenkyusho, Ltd.R). Andere Träger können ebenfalls verwendet werden.
Als Elutionsmittel wird eine Kombination aus einer wäßrigen 0,01-1,0% Lösung von Trifluoressigsäure, Heptafluorbuttersäure, Essigsäure oder Ameisensäure sowie einem Natriumsalz davon als Ionenpaarreagenz, wobei der pH-Wert der Lösung auf 2,0-5,5 eingestellt ist, und einem organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril, Ethanol, Propanol oder dergl., das 0,01-1,0% eines derartigen Ionenpaarreagenz enthält, empfohlen. Ferner ist es erwünscht, daß eine durch Umkehrphasen- HPLC zu behandelnde Lösung von menschlichem BCDF in geeigneter Weise mit destilliertem Wasser und dergl. versetzt wird, um die Salzkonzentration in der Lösung in ausreichendem Maße zu verringern, um eine endgültige Salzkonzentration von weniger als 100 mM herzustellen. Der pH-Wert wird durch Zugabe eines derartigen Ionenpaarreagenz auf 2,0-5,5 und vorzugsweise auf 3,0-3,5 eingestellt. Nach Aufsetzen der Lösung von menschlichem BCDF auf den Chromatographieträger in einer Menge von 1-4 mg Protein pro 1 mg Chromatographieträger wird menschlicher BCDF mit höherer Reinheit abgetrennt, indem man eine Elution mit einem Elutionsmittel durchführt, dessen Konzentration an organischem Lösungsmittel allmählich durch gradientenartige Veränderung des Elutionsmittels erhöht wird. Da der Abtrennwirkungsgrad, mit dem von menschlichem BCDF Verunreinigungen, wie verunreinigende Bestandteile, Endotoxine und Primärstruktur-Varianten abgetrennt werden, in starkem Maße insbesondere durch die Konzentration des Ionenpaarreagenz und den pH-Wert beeinflußt werden, ist es ratsam, die optimalen Bedingungen je nach dem Gehalt an diesen Verunreinigungen auszuwählen.
Ein durch kombinierte Anwendung dieser Ionenaustauschchromatographiebehandlung erhaltener menschlicher BCDF weist einen Proteinreinheitsgrad von mindestens 99% (durch SDS- PAGE-Analyse werden keine Verunreinigungen entdeckt) und einen Endotoxingehalt von nicht mehr als 0,1 EU pro 1 mg Protein auf. Ferner bleibt ein auf diese Weise erhaltener menschlicher BCDF bei Aufbewahrung unter aseptischen Bedingungen bei niedrigen Temperaturen von 3-10ºC mindestens 1 Woche stabil.
Da eine durch die Umkehrphasen-HPLC-Stufe erhaltene Fraktion von menschlichem BCDF einen gewissen Anteil an organischem Lösungsmittel enthält, ist eine Stufe zur Entfernung des organischen Lösungsmittels erforderlich. Die Erfinder haben jedoch festgestellt, daß dann, wenn das organische Lösungsmittel einfach zu entfernen ist, eine intermolekulare Assoziation von menschlichem BCDF unter Bildung von Aggregaten von menschlichem BCDF ablaufen kann, was wiederum eine beträchtliche Verringerung der Ausbeute an monomerem menschlichem BCDF bedeutet. Durch das GPC-LALLS-Verfahren (A. C. Ouano, Journal of Polymer Science, Bd. 12 (1974), S. 1151- 1162) wurde festgestellt, daß ein derartiges menschliches BCDF-Aggregat vorwiegend in der dimeren Form vorliegt. Es wird angenommen, daß die monomeren Moleküle im Aggregat durch nicht-kovalente Bindungen, die vorwiegend auf einer hydrophoben Wechselwirkung beruhen, assoziiert sind.
Da menschlicher BCDF in einer Fraktion von menschlichem BCDF, die durch die Umkehrphasen-HPLC-Stufe erhalten worden ist, durch Zugabe einer geeigneten Menge eines organischen Lösungsmittels einer reversiblen Veränderung zwischen einer Assoziation und Dissoziation unterliegt, ist eine spezielle Technik zur Entfernung des organischen Lösungsmittels erforderlich. Als Verfahren zur Entfernung des organischen Lösungsmittels kommen üblicherweise die Gelfiltrationschromatographie, Membrandialyse, Ultrafiltration, Einengung unter vermindertem Druck Gefriertrocknung und Phasentrennung durch Abkühlung in Frage (vergl. JP-A-Hei-1-83094). Jedoch können eine Einengung unter vermindertem Druck und eine Gefriertrocknung nicht angewandt werden, da ein Einsatz dieser Verfahren zu einer Bildung von derartigen Aggregaten von menschlichem BCDF in einer Menge von 60-80% führt.
Erfindungsgemäß wird die Gelfiltrationschromatographie als Verfahren zur Entfernung des organischen Lösungsmittels eingesetzt. Sie kann gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren der vorstehend erwähnten Verfahren angewandt werden. Bei dem in dieser Stufe zu verwendenden Gelfiltrationschromatographieträger kann es sich um den gleichen Chromatographieträger handeln, der bei der vorstehend erläuterten Behandlungsstufe zur Rückfaltung verwendet wird. Ein derartiger Träger wird in eine Säule gepackt. Eine Lösung von menschlichem BCDF, die ein organisches Lösungsmittel enthält, wird sodann aufgesetzt. Ein Laufmittel mit einem Gehalt an einem organischen Lösungsmittel wird über die Säule geleitet, wobei die Menge des im Laufmittel enthaltenen organischen Lösungsmittels stufenweise oder linear verringert wird, wodurch eine Lösung von menschlichem BCDF, die frei von dem ursprünglich enthaltenen organischen Lösungsmittel ist, erhalten wird. Somit ist es erfindungsgemäß möglich, die Bildung von Aggregaten von menschlichem BCDF auf ein Minimum zu beschränken, indem man allmählich das organische Lösungsmittel aus einer Lösung von menschlichem BCDF, die ein organisches Lösungsmittel enthält, entfernt.
Nachstehend wird das Verfahren genauer beschrieben.
Eine Säule, die mit dem Gelfiltrationschromatographieträger gepackt ist, wird mit einer 5-50 mM-Pufferlösung einer organischen Säure, wie Essigsäure oder einem Salz davon, die 5-50% und vorzugsweise 7-15% eines organischen Lösungsmit tels, wie Acetonitril, Ethanol oder Propanol, enthält, äquilibriert. Anschließend wird eine Lösung von menschlichem BCDF mit einem Gehalt an einem organischen Lösungsmittel in einer Menge von 0,15-0,24 ml pro ml des Trägers aufgesetzt. Die Elution wird durchgeführt, indem man über die Säule eine derartige Pufferlösung als Laufmittel leitet, um eine Fraktion von menschlichem BCDF zu gewinnen. Anschließend wird die mit dem Gelfiltrationschromatographieträger gepackte Säule auf ähnliche Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, mit einer 3-20 mM Pufferlösung eines Alkalimetallsalzes einer organischen Säure, wie Essigsäure, Ameisensäure oder Zitronensäure, mit einem pH-Wert von 3,5-7,5 und vorzugsweise von 4,0-5,5, die kein organisches Lösungsmittel enthält, äquilibriert. Sodann wird die bei der vorherigen Gelfiltrationschromatographiebehandlung erhaltene Fraktion von menschlichem BCDF in einer Menge von 0,15-0,34 ml pro 1 ml des Trägers aufgesetzt. Als Laufmittel wird eine derartige Pufferlösung verwendet.
Eine Fraktion von menschlichem BCDF, die durch eine derartige zweistufige Gelfiltrationschromatographiebehandlung nach einem stufenweisen Programm erhalten worden ist, weist den gleichen Grad an Proteinreinheit wie die bei der Umkehrphasen-HPLC-Stufe erhaltene Fraktion von menschlichem BCDF auf. Der Gehalt an Aggregaten von menschlichem BCDF beträgt nicht mehr als 10% und üblicherweise nicht mehr als 5%. Diese Fraktion von menschlichem BCDF bleibt bei Aufbewahrung unter aseptischen Bedingungen bei niedrigen Temperaturen von 3-10ºC für mindestens 1 Woche stabil.
Dagegen wird bei Anwendung einer Gelfiltrationschromatographiebehandlung, bei der ein Gelfiltrationschromatographieträger direkt mit einem Laufmittel (Pufferlösung), das kein organisches Lösungsmittel enthält, äquilibriert worden ist, anschließend eine Lösung von menschlichem BCDF, die ein organisches Lösungsmittel enthält, aufgesetzt wird und schließlich ein derartiges Laufmittel allein über die Säule geleitet wird, mehr als 40% des menschlichen BCDF in assoziierter Form erhalten, und zwar unabhängig vom pH-Wert des Laufmittels und der Art des verwendeten Salzes einer organischen Säure. Diese Behandlung ist daher für die Reinigung der Elutionsprodukte aus der Umkehrphasen-Chromatographiesäule ungeeignet. Selbst wenn jedoch eine Lösung von menschlichem BCDF einer einstufigen Gelfiltrationschromatographiebehandlung unterworfen worden ist, kann aber die Bildung von Aggregaten von menschlichem BCDF in wirksamer Weise verhindert werden, indem man den Gelfiltrationschromatographieträger mit einer Pufferlösung einer organischen Säure oder eines Salzes davon, die ein organisches Lösungsmittel, wie Acetonitril, Ethanol oder Propanol, gemäß den vorstehenden Angaben enthält, äquilibriert und anschließend die Menge des organischen Lösungsmittels in einem derartigen Laufmittel in Form eines stufenweisen oder linearen Gradientenprogramms verringert.
Wenn es erwünscht ist, menschlichen BCDF weiter zu konzentrieren und/oder geringe Mengen an Zersetzungsprodukten von menschlichem BCDF, die während der Lagerung einer von organischem Lösungsmittel durch Gelfiltration befreiten Lösung von menschlichem BCDF gebildet worden sind, zu entfernen, wird ggf. eine Kationenaustauschchromatographiebehandlung empfohlen. Dabei wird ein Gel, das als Liganden einen schwach sauren oder stark sauren Kationenaustauscher aufweist, bei dessen Grundlage es sich um ein Polysaccharid, ein Dextran oder ein synthetisches Polymeres, wie "cm Sepharose FFR" (der Fa. Pharmacia Inc.R) oder "cm Cellulofine C-500R" (der Fa. Chisso Corp.R), handelt, in eine Säule gepackt und mit 15-20 mM Pufferlösung (pH-Wert 4,0-5,5) eines Natrium- oder Kaliumsalzes von Essigsäure, Ameisensäure oder Zitronensäure äquilibriert. Sodann wird eine Fraktion von menschlichem BCDF, die in der vorstehenden stufe erhalten worden ist, in einer Menge von 10-30 mg Protein pro 1 ml des Chromatographieträgers aufgesetzt. Anschließend wird der nicht-adsorbierte Anteil gründlich mit einer Äquilibrierungspufferlösung ausgewaschen. Sodann wird der menschliche BCDF vorzugsweise einer Gradientenelution unterworfen, indem man ein Salz, wie Natriumchlorid, zu der Äquilibrierungspufferlösung nach und nach bis zum Erreichen einer Konzentration von 10-500 mM zusetzt. Alternativ wird der menschliche BCDF vorzugsweise mit einer 5-20 mM und insbesondere einer 8-15 mM Natriumcitrat-Puffer lösung mit einem pH-Wert von 6,0-6,7 und vorzugsweise von 6,4-6,6 eluiert, wobei ein Salz, wie Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 30-100 mM und vorzugsweise von 40-60 mM anstelle des erstgenannten Elutionsmittels zugesetzt wird. Insbesondere erweist sich das letztgenannte Elutionsverfahren als wirksam zur Erzielung einer hochkonzentrierten Lösung von menschlichem BCDF, ohne daß der Anteil an Aggregaten von menschlichem BCDF erhöht wird. Menschlicher BCDF weist eine Sequenz (¹&sup4;&sup0;Asp-¹&sup4;¹Pro) auf, die unter sauren Bedingungen zu einer Spaltung neigt. Wenn es während der Lagerung zu einer derartigen Spaltung gekommen ist, kann das Spaltungsprodukt durch dieses Behandlungsverfahren entfernt werden. Die Reinheit des auf diese Weise erhaltenen menschlichen BCDF nimmt zu, da der Anteil an diesem Spaltungsprodukt verringert wird. Die Konzentration läßt sich in erheblichem Maße auf einen Wert von 3-8 mg/ml erhöhen.
Gelegentlich kann in einer Lösung von menschlichem BCDF, die einer Behandlung zur Entfernung eines organischen Lösungsmittels unterworfen worden ist, oder in einer Lösung von menschlichem BCDF, die durch Einengen einer derartigen Lösung durch Kationenaustauschchromatographiebehandlung erhalten worden ist, eine geringe Menge an Aggregaten von menschlichem BCDF verbleiben. In einem derartigen Fall können diese Aggregate durch Abtrennung entfernt werden, indem man die Lösung einer Gelfiltrationschromatographiebehandlung unterwirft. Für eine derartige Behandlung wird ein Gelfiltrationsträger verwendet, bei dessen Grundlage es sich um ein Dextran, eine mit Dextran vernetzte Agarose, ein hydrophiles Kieselgel oder ein synthetisches Polymeres, wie "Sephacryl S-200R" und "Superdex 75R" (beide von der Fa. Pharmacia Inc. R) sowie "TSK G- 2000SWR" (von der Fa. Tosoh Co., Ltd.R), handelt. Ein derartiger Träger wird mit 5-100 mM und vorzugsweise 10-20 mM einer Pufferlösung eines Natrium- oder Kaliumsalzes von Zitronensäure, Phosphorsäure oder einem Gemisch davon mit einem auf 5-8 und vorzugsweise auf 6,0-7,0 eingestellten pH-Wert äquilibriert. Anschließend wird eine Lösung von menschlichem BCDF, die durch eine Behandlung zur Entfernung eines organischen Lösungsmittels oder eine anschließende Kationenaus tauschchromatographiebehandlung erhalten worden ist, in einer Menge von 0,01-0,5 ml pro 1 ml des Trägers aufgesetzt. Das Chromatogramm wird mit einer Äquilibrierungspufferlösung entwickelt, wodurch reines monomerer menschlicher BCDF, von dem Aggregate von menschlichem BCDF abgetrennt worden sind, erhalten werden kann. Gelegentlich weist menschlicher BCDF eine starke Hydrophobizität auf und besitzt häufig eine Affinität für einen Gelfiltrationschromatographieträger. Wenn daher ein Salz, wie Natriumchlorid, zur Einstellung des osmotischen Drucks zugesetzt wird, erfolgt diese Zugabe vorzugsweise nach der vorerwähnten Stufe.
Bei einer Lösung von menschlichem BCDF (Konzentration 0,1-5 mg/ml), die durch folgende Kombinationsbehandlung
(i) Stufe der Oxidationsreaktion einer solubilisierten Lösung von menschlichem BCDF und Rückfaltungsbehandlung,
(ii) Stufe einer Ionenaustauschchromatographiebehandlung und einer Umkehrphasen-HPLC-Behandlung und
(iii) Stufe der Entfernung des organischen Lösungsmittels durch Gelfiltrationschromatographie
zur Abtrennung von reinem menschlichem BCDF aus einer durch Züchten eines Mikroorganismus mit einem integrierten menschlichem BCDF-Gen erhaltenen Kulturbrühe von menschlichem BCDF er- halten worden ist, wird mit SDS-PAGE unter Anwendung der Sil- berfärbung keine Bande, die Verunreinigungen zuzuschreiben ist, nachgewiesen, während bei Umkehrphasen-HPLC, bei Ionen- austausch-HPLC und bei Gelfiltrations-HPLC ein einziger Peak auftritt. Dieser menschliche BCDF wird durch ¹³C-NNR und dergl. als menschlicher BCDF des natürlichen Typs identifiziert. Ferner beträgt die Konzentration an von den Mikroorganismen abgeleiteten Proteinen in einer derartigen Lösung von men- schlichem BCDF nicht mehr als einige ppm, gemessen durch Western-Blotting unter Verwendung eines auf übliche Weise hergestellten polyklonalen anti-Escherichia coli- Protein-Antikörpers als von einem Mikroorganismus (z. B. E. coli) abgeleitetem Antigen-Protein oder einer partiell gereinigten Version davon, und durch Enzym-Immunoassay (ELISA) unter Verwendung eines derartigen Antikörpers. Ferner beträgt der Endotoxingehalt nicht mehr als 0,1 EU (üblicherweise nicht mehr als 0,01 EU) pro 1 mg des menschlichem BCDF. Die vorstehend beschriebene hohe Qualität zeigt, daß ein gemäß dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren erhaltener menschlichem BCDF als Bestandteil in pharmazeutischen Präparaten, die für therapeutische Zwecke einzusetzen sind, verwendbar ist. Die erhaltene Lösung von menschlichem BCDF kann zu einem stabilen pharmazeutischen Präparat verarbeitet werden, indem man die Lösung sofort, nach dem Einfrieren oder nach einer Lagerung bei niedrigen Temperaturen einer geeigneten Präparationsstufe unterwirft.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein Chromatogramm der Umkehrphasen-HPLC-Analyse eines solubilisierten menschlichen BCDF, bei dem die Disulfidbindung im reduzierten Zustand vorliegt.
Fig. 2 ist ein Chromatogramm der Umkehrphasen-HPLC-Analyse eines menschlichen BCDF des natürlichen Typs, bei dem die korrekte intramolekulare Disulfidbindung durch Rückfaltung gebildet worden ist.
Fig. 3 ist ein Chromatogramm einer Gelfiltrationschromatographiestufe zur Reinigung einer konzentrierten Lösung von menschlichem BCDF.
Fig. 4 ist ein Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramm eines gereinigten menschlichen BCDF.
Fig. 5 ist ein Ionenaustausch-HPLC-Chromatogramm eines gereinigten menschlichen BCDF.
Fig. 6 ist ein Gelfiltrations-HPLC-Chromatogramm eines gereinigten menschlichen BCDF.

Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele konkret beschrieben.

Beispiel 1

Escherichia coli HB 101/pBSF2-SD7 AJ 12448 (FERM P- 10758, FERM BP-3753), mit integrierter, für menschlichen BCDF kodierender DNA wurde in einem synthetischen Medium gezüchtet. Dabei wurde menschlicher BCDF in den Bakterienzellen durch den mit Indolacrylsäure (IAA) induzierten Tryptophan- Promotor in voluminöser Beschaffenheit in Form von unlösli chen Granalien angereichert (gemäß dem in JP-A-Hei-3-53884 beschriebenen Verfahren).
Eine Suspension der Granalien (10 mM EDTA, 1,6 Liter) wurde gemäß einem üblichen Verfahren hergestellt (d. h. das in JP-A-Sho-61-257931 beschriebene Verfahren). Die Suspension wurde mit einer solchen Menge an Guanidin-hydrochlorid versetzt, daß die endgültige Konzentration 6 M betrug, und 4 Stunden bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von etwa 5,5 gerührt. Dabei wurde menschlicher BCDF solubilisiert.
Der menschliche BCDF wurde mit einer Umkehrphasen-HPLC- Säule (214TP54R der Fa. VydacR, 4,6 mm φ · 250 mm) gemäß der Darstellung in Fig. 1 analysiert (die gleichen Bedingungen wurden nachstehend für die Umkehrphasen-HPLC angewandt). Die analytischen Bedingungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Analytische HPLC-Bedingungen

Säule: VydacR "241TP54R"
Elutionsmittel A: 0,1% TFA (Trifluoressigsäure)
Elutionsmittel B: 0,1% TFA und 80% Acetonitril
Elutionsprogramm: 1 ml/min (Elution mit einem linearen Gradienten)
Anschließend wurde eine 6 M Guanidin-hydrochlorid-Lösung in einer solchen Menge zugegeben, daß die Konzentration an menschlichem BCDF 0,7 mg/ml betrug. Anschließend wurde der pH-Wert auf 8,5 eingestellt, indem man Tris-hydrochlorid in einer einer Endkonzentration von 10 mM entsprechenden Menge und eine geringe Menge einer Natriumhydroxidlösung zugab. Die erhaltene Lösung wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur mäßig gerührt, um den menschlichen BCDF in ein Produkt mit einer intramolekularen Disulfidbindung umzuwandeln. Der bei Umkehrphasen-HPLC-Analyse (gleiche analytische Bedingungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden) beobachtete Peak von menschlichem BCDF war bezüglich der Retentionszeit um 2 Minuten ver ringert, verglichen mit dem Peak von menschlichem BCDF unmittelbar nach der Extraktion (Fig. 2).
Ein Anteil von 2,4 Liter der vorstehenden Lösung wurde auf eine "Sephadex G-25"R-Säule (25,2 cm φ · 25 cm, der Fa. Pharmacia Inc. R), die mit 10 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH-Wert 5,0) äquilibriert worden war, aufgesetzt. Sodann wurde die Entwicklung mit der Pufferlösung durchgeführt. Man erhielt 2,9 Liter einer Fraktion von menschlichem BCDF. Die Reinheit des menschlichen BCDF betrug 92%. 88% des eingesetzten Proteins wurden gewonnen.
Auf eine "CM Sepharose FFR"-Säule (11,3 cm φ · 9 cm der der Fa. Pharmacia Inc. R), die mit der Pufferlösung äquilibriert worden war, wurden 4,5 Liter der durch Wiederholung des Vorgangs erhaltenen Fraktion von menschlichem BCDF aufgesetzt. Anschließend wurde mit 1 Liter Pufferlösung gewaschen. Die Elution wurde unter Verwendung der Pufferlösung und einer 0,5 M Natriumacetat-Pufferlösung (pH-Wert 5,5) durchgeführt. Bei diesem Elutionsvorgang wurde der Anteil der letztgenannten Pufferlösung nach und nach erhöht (lineare Gradientenelution, Strömungsgeschwindigkeit = 10 ml/min. Die Gesamtmenge des verwendeten Elutionsmittels betrug das 10-fache des Säulenfassungsvermögens. Auf diese Weise wurde eine Fraktion von menschlichem BCDF erhalten. Die Reinheit an menschlichem BCDF betrug etwa 98%. 75% des eingesetzten Proteins wurden gewonnen. Der Endotoxingehalt betrug nicht mehr als 0,3 EU/mg des menschlichen BCDF (gemessen mit der LAL-Testpackung "Toxicolor SystemR" der Fa. Seikagaku Kogyo KKR).
Eine 100 ml-Portion (260 ml menschlicher BCDF) der erhaltenen Fraktion von menschlichem BCDF wurde mit 200 ml destilliertem Wasser verdünnt, um die Salzkonzentration auf 1/3 des ursprünglichen Werts zu verringern. Anschließend wurde eine wäßrige 2 N Ameisensäurelösung tropfenweise zugegeben, um den pH-Wert der Lösung von menschlichem BCDF auf 3,5 einzustellen. Die erhaltene Lösung von menschlichem BCDF wurde mit einer solchen Menge an Acetonitril versetzt, daß die Endkonzentration 10% betrug. Sodann wurde mäßig 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule "214TP1022R" der Fa. VydacR, 22 mm φ · 250 mm), die mit einer 0,5% Natriumformiat-Pufferlösung (pH-Wert 4,0) äquilibriert worden war, wurde die Lösung von menschlichem BCDF aufgesetzt. Anschließend wurde eine Elution mit einem linearen Gradienten (Strömungsgeschwindigkeit 9 ml/min mit einer Elutionspufferlösung (B), die durch Zugabe von Acetonitril zur vorstehenden Pufferlösung in einer solchen Menge, daß die endgültige Acetonitrilkonzentration 60% betrug, durchgeführt, wobei 63 ml einer Fraktion von menschlichem BCDF (190 mg menschlicher BCDF) erhalten wurden. Nach Wiederholung der vorstehenden Reinigungsbehandlung war die Reinheit an menschlichem BCDF höher als 99% (gemessen durch Umkehrphasen- HPLC, SDS-PAGE). Der Endotoxingehalt betrug nicht mehr als 0,01 EU/mg des menschlichen BCDF. 75% des aufgesetzten menschlichen BCDF konnten gewonnen werden.
Anschließend wurden 63 ml der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Fraktion von menschlichem BCDF auf eine "Sephadex G-25R"-Säule (9 cm φ · 5 cm, der Fa. Pharmacia Inc.R), die mit einer Pufferlösung aus 20 mM Essigsäure und 10% Acetonitril äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Entwicklung wurde mit einer Pufferlösung unter Erhalt von 150 ml einer Fraktion von menschlichem BCDF durchgeführt. Die Säule wurde sodann mit einer Pufferlösung (pH-Wert 4,5) von 5 mM Natriumacetat äquilibriert. 75 ml der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Fraktion wurden aufgesetzt. Die Entwicklung wurde mit der Pufferlösung durchgeführt. Man erhielt 85 ml einer Fraktion von menschlichem BCDF. Als Ergebnis dieses zweistufigen Gelfiltrationsverfahrens wurden 70% des aufgesetzten menschlichen BCDF gewonnen. Das Acetonitril wurde aus der Lösung entfernt. Die Menge der bei dem Verfahren gebildeten Aggregate von menschlichem BCDF betrug etwa 5%.
Anschließend wurden auf eine "CM Sepharose FFR"-Säule (5 cm φ · 2,5 cm, der Fa. Pharmacia Inc.R), die mit 20 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH-Wert 4,5) äquilibriert worden war, 1,3 Liter der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Gesamtfraktion von menschlichem BCDF aufgesetzt. Die Säule wurde mit 100 ml Pufferlösung gewaschen. Das gesamte BCDF wurde einmal mit einer Pufferlösung (pH-Wert 6,5) aus 10 mM Zitronensäure und 50 mM Natriumchlorid eluiert, wodurch man 110 ml einer konzentrierten Fraktion mit menschlichem BCDF erhielt (750 mg menschlicher BCDF). Der Anteil der Aggregate von menschlichem BCDF betrug nicht mehr als 5%. 75% des aufgesetzten menschlichen BCDF wurden gewonnen. Die Konzentration an menschlichem BCDF war auf 6,8 mg/ml gestiegen.
Ferner wurde eine Portion von 70 ml der in der vorstehenden Stufe erhaltenen konzentrierten Lösung von menschlichem BCDF auf eine "Superdex 75R"-Säule (6 cm φ · 60 cm der Fa. Pharmacia Inc. R), die mit einer 10 mM Natriumcitrat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Entwicklung wurde mit der Pufferlösung durchgeführt. Man erhielt 70 ml einer monomeren Fraktion von menschlichem BCDF (300 mg gereinigter menschlicher BCDF) (durch den schraffierten Bereich in Fig. 3 gekennzeichnet).
Dieser gereinigte menschliche BCDF zeigte jeweils einen einzigen Peak bei der Umkehrphasen-HPLC-Analyse, bei der Ionenaustausch-HPLC-Analyse und bei der Gelfiltrations-HPLC- Analyse (vergl. die Figg. 4,5 und 6) sowie eine einzige Bande bei SDS-PAGE (Silberfärbung). Die Bedingungen für diese HPLC-Analysen sind in Tabelle 2 (a)-(c) aufgeführt.

Tabelle 2

Analytische HPLC-Bedingungen

(a) Bedingungen für die Umkehrphasen-HPLC (menschlicher BCDF: 25 ug)
Säule: "214TP54R" (4,6 mm φ · 250 mm, der Fa. VydacR)
Elutionsmittel A: 0,05% Tetrafluorbuttersäure
B: 0,05% Tetrafluoressigsäure und 80% Acetonitril
Elutionsprogramm: 1 ml/min (Elution mit einem linearen Gradienten)
(b) Bedingungen für die Ionenaustausch-HPLC Säule: "TSK SpNPRR" (4,6 mm φ · 3,5 mm, der Fa. TosohR) Elutionsmittel A: 0,01 M Natriumacetat, pH-Wert 5,0
B: 0,5 M Natriumacetat, pH-Wert 5,5
Elutionsprogramm: 1 ml/min (Elution mit einem linearen Gradienten)
(c) Bedingungen für die Gelfiltrations-HPLC (gereinigter menschlicher BCDF: 250 ug (100 ul))
Säule: "Superdex 75 HRR" 10/30 (1 cm φ · 30 cm, der Fa. PharmaciaR)
Elutionsmittel 10 mM Zitronensäure und 8,7 mM Phosphorsäure, pH-Wert 7,0 (eingestellt mit einer Natriumhydroxidlösung), Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min
In Fig. 5 ist der Peak bei etwa 0,5 Minuten auf einen Injektionsschock und der Peak bei etwa 6,37 Minuten auf im Verlauf der Analyse gebildete Aggregate zurückzuführen. Ferner ist in Fig. 6 der Peak bei etwa 19 Minuten auf das Salz in der Probe zurückzuführen.
Durch Western-Blotting unter Verwendung eines polyklonalen anti-Escherichia coli-Antikörpers wurde keine auf Verunreinigungen zurückzuführende Bande nachgewiesen. Ferner ergab der Enzym-Immunoassay unter Verwendung des Antikörpers, daß die Einschlußmenge an von E. coli abgeleitetem Protein nicht mehr als einige ppm betrug, was zeigt, daß Protein nur in einem sehr geringen Ausmaß eingeschlossen war. Der Endotoxingehalt, bestimmt durch den LAL-Test, betrug nicht mehr als 0,01 EU/mg menschlicher BCDF. Die Gesamtausbeute an menschlichem BCDF beim vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren betrug 15%.
Das Reinigungsverfahren dieses Beispiels ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

Beispiel 2

An einer auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhaltenen Lösung von solubilisiertem menschlichem BCDF (20 ml) wurde eine Oxidationsreaktion und eine Rückfaltungsbehandlung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit folgenden Ausnahmen durchgeführt: Die Konzentration an menschlichem BCDF wurde fest eingestellt (0,7 mg/ml oder 0,17 mg/ml), während die Guanidin-hydrochlorid-Konzentration auf 2-6 M oder 0,6 M eingestellt wurde und die Konzentrationen des reduzierten Glutathions und des oxidierten Glutathions auf 10-0 mM bzw. 1-0 mM eingestellt wurden. Unter diesen Bedingungen wurde die Oxidationsreaktion durchgeführt, wonach sich eine Gelfiltrationschromatographiebehandlung anschloß. Die Bedingungen der Gelfiltration sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

Gelfiltrationsbedingungen

Säule: 2,6 cm φ · 18 cm (96 ml)
Träger: "Sephadex G-25R" (der Fa. Pharmacia Inc.R)
Laufmittellösung: 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0
Nachweis: Absorption (280 nm)
Probenvolumen: 20 ml
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 5 Gelfiltrationschromatographiebehandlung
*: Die Ausbeute bedeutet den Anteil des gebildeten menschlichen BCDF vom natürlichen Typ nach Ablauf von 15 Stunden nach Beginn der Oxidationsreaktion und der Annahme, daß die Menge des menschlichen BCDF vom reduzierten Typ zu Beginn der Oxidationsreaktion 100% beträgt.
**: Die Bestätigung der Bildung der Disulfidbindung erfolgte durch Umkehrphasen-HPLC (gleiche analytische Bedingungen wie im Fall von Fig. 1.
Anmerkung: Die Konzentrationen an menschlichem BCDF betrugen bei den vorstehend beschriebenen Oxidationsbedingungen (1)-(5) durchweg 0,7 mg/ml.
Unter den Bedingungen gemäß (3) in Tabelle 5 lief die Oxidationsreaktion rasch ab (die Reaktion war innerhalb von 3-6 Stunden beendet), und die Ausbeute an menschlichem BCDF war hoch, jedoch waren bei den gebildeten Disulfidbindungen Disulfidgemische mit Glutathion enthalten. Unter den Bedingungen gemäß (4) in der Tabelle verlief zwar die Oxidationsreaktion langsamer, (10-15 Stunden waren für die Beendigung der Reaktion erforderlich) als unter den Bedingungen gemäß (3), jedoch war die Ausbeute an menschlichem BCDF hoch und die gebildeten Disulfidbindungen entsprachen nur dem natürlichen Typ. Unter den Bedingungen gemäß (5) in Tabelle 5 war zwar die Ausbeute an menschlichem BCDF hoch, es wurde aber ein dimerer menschlicher BCDF gebildet, wobei einige Prozent des menschlichen BCDF intermolekulare Disulfidbindungen aufwiesen. Wie aus (6) in der Tabelle ersichtlich ist, konnte ohne eine ausreichend hohe Guanidin-hydrochlorid-Konzentration menschlicher BCDF nicht mit hohem Wirkungsgrad gewonnen werden, selbst wenn die Konzentration an menschlichem BCDF auf 0,17 mg/ml verringert wurde. Dies ist auf eine Umfällung des als Ausgangsprodukt verwendeten, solubilisierten menschlichen BCDF (reduzierter Typ von menschlichem BCDF, der im wesentlichen keine Disulfidbindungen aufwies) zuzuschreiben. Im übrigen stieg die Verringerung der Fällungsfraktion weiter an, wenn die Konzentration an menschlichem BCDF zunahm.
Es wurde somit festgestellt, daß bei Verwendung einer hohen Konzentration an Guanidin-hydrochlorid und einer niedrigen Konzentration an Thioldisulfidreagenz die Bildung einer gemischten Glutathion-Disulfidbindung oder einer intermolekularen Disulfidbindung von menschlichem BCDF verhindert werden kann, wobei sich menschlicher BCDF vom natürlichen Typ in hoher Ausbeute erhalten läßt.
In diesem Zusammenhang wurde die Bildung der Disulfidbindung durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Die Bestätigung der Bildung der gemischten Disulfidbindung erfolgte durch Nachweis der Zunahme des durch Massenspektroskopie (MS) gemessenen Molekulargewichts. Die Bestätigung für Aggregate von menschlichem BCDF unter Bildung von intermolekularen Disulfidbindungen wurde durch das SDS- PAGE-Verfahren (unter nicht-reduzierenden Bedingungen) durchgeführt.

Beispiel 3

Gemäß einem in der Literatur beschriebenen Verfahren (Uchida et al., Journal of Biomolecular NMR, Bd. 1 (1991), S. 49-64) wurden zwei Arten von markiertem menschlichem BCDF hergestellt, wobei als Nährstoff die Aminosäure Cystein (Cys) bzw. die Aminosäure Phenylalanin (Phe), die in der Primärstruktur von menschlichem BCDF weit verbreitet ist, deren Carbonylkohlenstoffatome mit ¹³C markiert sind, verwendet wurden. Die Produkte wurden jeweils gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 gereinigt.
Um eine Rückfaltung zur intramolekularen Disulfidbindung von menschlichem BCDF zu erreichen, wurden 0,04 ml 100 mM Dithiothreit (DTT) zu 10 ml der erhaltenen Fraktion von menschlichem BCDF gegeben, wobei die intramolekulare Disulfidbindung von menschlichem BCDF reduziert wurde (bestätigt durch Umkehrphasen-HPLC). Sodann wurde die Lösung mit Salzsäure auf den pH-Wert 5 eingestellt und über eine "Sephadex G-25R"-Säule, die mit 6 M Guanidin-hydrochlorid äquilibriert war, zur einwandfreien Entfernung des DTT gegeben. Die erhaltene Fraktion von menschlichem BCDF wurde mit 6 M Guanidinhydrochlorid verdünnt, um die Konzentration an menschlichem BCDF auf 0,7 mg/ml zu verringern. Anschließend wurde erneut die Oxidationsreaktion und Rückfaltungsbehandlung unter den Bedingungen gemäß (4) in Tabelle 5 vorgenommen. Die Struktur höherer Ordnung im erhaltenen menschlichen BCDF wurde durch ¹³C-NMR festgestellt. Das ¹³C-NMR-Spektrum der Gerüstcarbonylkohlenstoffatome des Proteins kann als wertvoller Index für die Struktur höherer Ordnung von Proteinmolekülen in einer Lösung dienen.
Bezüglich der beiden Arten von markiertem menschlichem BCDF ergab sich kein Unterschied im ¹³C-NMR-Spektrum zwischen dem gemäß diesem Beispiel gereinigten Produkt und einem ebenfalls gemäß diesem Beispiel gereinigten und einer anschließenden Rückfaltungsbehandlung unterworfenen Produkt. Die Produkte ergaben jeweils nur die Signale, die den jeweiligen Aminosäureresten (4 für Cys und 7 für Phe) entsprachen. Es wurde somit bestätigt, daß ein erfindungsgemäß gereinigtes Produkt und ein zusätzlich einer Rückfaltung unterworfenes Produkt von menschlichem BCDF die gleiche und eine gleichmäßige Struktur höherer Ordnung aufweisen.
Die Pufferlösung für jede der beiden Arten von markiertem menschlichem BCDF wurde durch eine 0,1 M Boratpufferlösung (pH-Wert 8,5) ersetzt. Die Lösung von menschlichem BCDF wurde in einer zu einem Molekül des markierten menschlichen BCDF äquivalenten Menge an DTT versetzt und 30 Minuten stehengelassen. Anschließend wurde das ¹³C-NNR-Spektrum geprüft. Es wurde festgestellt, daß aus einem Vergleich zwischen den ¹³C-NNR-Spektren des oxidierten Typs und des reduzierten Typs (einschließlich des partiell reduzierten Typs) des mit Cys¹³C markierten menschlichen BCDF auf die Anwesenheit oder die Abwesenheit und auf den Zustand der Disulfidbindung geschlossen werden kann. Ebenso kann darauf durch einen Vergleich zwischen den Spektren von menschlichem BCDF, bei dem &sup7;³Cys und &sup8;³Cys auf der C-endständigen Seite doppelt durch ¹³C-¹&sup5;N-Doppelmarkierung markiert sind, geschlossen werden. Aufgrund dieser Befunde wurde festgestellt, daß ein partiell reduzierter Typ von menschlichem BCDF, bei dem &sup7;³Cys und &sup8;³Cys verknüpft sind und &sup4;&sup4;Cys und &sup5;&sup0;Cys in einem nicht-verknüpften Zustand vorliegen, innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne einer intramolekularen Disulfidverknüpfung (Oxidation) bei einem pH-Wert über 6,5 unterliegt, während bei einem pH-Wert von nicht mehr als 5 trotz des Vorliegens von relativ stabilem BCDF die intramolekulare Disulfidverknüpfung nur langsam stattfindet.
Was die Oxidation und Rückfaltung von menschlichem BCDF betrifft, so bestehen Bedenken bezüglich einer unzureichenden Oxidationsreaktion oder Rückreduktion. Es wurde jedoch festgestellt, daß bei der Durchführung der Oxidationsreaktion und der Rückfaltungsbehandlung unter den Bedingungen gemäß (4) in Tabelle 5 kein partiell reduzierter Typ von menschlichem BCDF gebildet wird.

Beispiel 4

Aus der Fraktion von menschlichem BCDF

(Acetonitrilgehalt 45-55%), die durch Umkehrphasen-HPLC in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde das organische Lösungsmittel in der Fraktion durch Vakuumkonzentration, Gefriertrocknung und Gelfiltration unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen entfernt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Der Acetonitrilgehalt in sämtlichen Fraktionen von menschlichem BCDF, die durch Gelfiltration erhalten worden waren, betrug nicht mehr als 1%.

Tabelle 6

Entfernung des organischen Lösungsmittels

Entfernungsbedingungen für das organische Lösungsmittel Menge an gebildeten Aggregaten von menschlichem BCDF*

(1) Vakuumeinengung 60-80%
(2) Gefriertrocknung 60-80%
(3) Gelfiltration (einstufige Behandlung) 0,1% Trifluoressigsäure, pH-Wert 1,8 50-60%
(4) Gelfiltration (einstufige Behandlung) 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,5 40-50%
(5) Gelfiltration (einstufige Behandlung) 10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 6,0 40-50%
(6) Gelfiltration (einstufige Behandlung) 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 8,0 40-50%
(7) Gelfiltration (zweistufige Behandlung) 20 mM Essigsäure und 10% Acetonitril (1. Stufe), 5 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,5 (2. Stufe) < 5%
* Die Menge der gebildeten Aggregate von menschlichem BCDF wurde durch Kationenaustausch-HPLC bestätigt (gleiche Analysenbedingungen wie im Fall von Fig. 5). Es wurde durch das GPC-LALLS-Verfahren bestätigt, daß es sich bei den Aggregaten von menschlichem BCDF um ein Dimeres aufgrund einer nicht-kovalenten Bindung von menschlichem BCDF handelte.
Die übrigen Bedingungen zur Entfernung des organischen Lösungsmittels sind, soweit sie nicht in Tabelle 6 enthalten sind, in Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7

Bedingungen zur Entfernung des organischen Lösungsmittels

(a) Vakuumeinengungsbedingungen ((1) in Tabelle 6)
Vorrichtung: Zentrifugalverdampfer "RD-31R" (der Fa. Yamato Science Co., Ltd.)
Vakuum: 2 Torr
Erwärmung: 40ºC/40 min
Probenmenge: 5 ml
(b) Gefriertrocknungsbedingungen ((2) in Tabelle 6) Vorrichtung: "Modell TD-3R" (der Fa. FTS System Co., Ltd.)
Vakuum: 10 mTorr
Erwärmung: 5ºC/15 Std.
Probenmenge: 5 ml Probe wurden in ein Fläschchen mit 10 ml gegeben.
(c) Gelfiltrationsbedingungen ((3)-(7) in Tabelle 6) Säule: 2,6 cm φ · 18 cm (96 ml)
Träger: "Sephadex G-25R" (der Fa. PharmaciaR)
Entwicklungslösung: in Tabelle 6 aufgeführt
Nachweis: Absorption (280 nm)
Probe: 14,4 ml ((3)-(6) und 1. Stufe von (7)), 21,0 ml (2. Stufe von (7))
Durch die vorstehenden Befunde wurde bestätigt, daß die Bildung von Aggregaten von menschlichem BCDF in überraschender Weise durch stufenweise Verringerung des organischen Lösungsmittels beim Gelfiltrationsverfahren unterdrückt werden konnte.

Gewerbliche Verwertbarkeit

Gemäß dem beanspruchten Verfahren läßt sich menschlicher BCDF, das durch Züchtung eines Mikroorganismus mit einem integrierten Gen für menschlichen BCDF erzeugt worden ist, in wirksamer Weise auf einen Reinheitsgrad gereinigt werden kann, der die Verwendung des BCDF für therapeutische Zwecke ermöglicht. Ferner läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren in großtechnischem Maßstab durchführen und ist daher gewerblich verwertbar.

Claims

1. Verfahren zum Reinigen von reduziertem menschlichen BCDF, welches folgende Schritte umfaßt:

(i) Lösen von menschlichem BCDF in Guanidinhydrochlorid und Einstellen der Guanidinhydrochlorid-Konzentration auf 4 bis 7 M,

(ii) Unterziehen des menschlichen BCDF einer Oxidationsreaktion in Anwesenheit von 0,002 bis 0,5 mM reduziertem Glutathion und 0,002 bis 0,5 mM oxydiertem Glutathion und

(iii) Unterziehen der Lösung von menschlichem BCDF einer Rückfaltungsreaktion unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration an menschlichem BCDF in der Oxidationsreaktionslösung 0,5 bis 0,8 mg/ml und der pH-Wert 8,0 bis 8,6 ist.

3. Verfahren zum Reinigen von menschlichem BCDF gemäß Anspruch 1 oder 2, welches zusätzlich folgende Schritte umfaßt:

(iv) Durchführen einer Ionenaustauschchromatographie- Behandlung, welche das Aufgeben der Lösung von menschlichem BCDF auf eine Chromatographiesäule, die mit einem Gelträger gefüllt ist, der als Ligand einen Ionenaustauscher auf der Grundlage eines Polysaccharids, Dextrans oder synthetischen Polymers hat, und dann Durchführen der Elution mit einem Elutionsmittel umfaßt, dessen Salzkonzentration verändert wird, wobei der menschliche BCDF gereinigt wird,

(v) Durchführen einer chromatographischen Behandlung mit einer reversen Phase durch Durchleiten der Lösung von menschlichem BCDF durch eine Säule, die mit einem chromatographischen Träger mit einer reversen Phase gefüllt ist, der als Ligand eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und der eine Porengröße von 250 A oder mehr hat, wobei der menschliche BCDF gereinigt wird, und

(vi) Durchführen einer Gelfiltrationschromatographie-Behandlung durch

(a) ein erstes Durchleiten einer 5 bis 50 mM Pufferlösung einer organischen Säure oder eines Salzes davon, die 5 bis 50% eines aus der aus Acetonitril, Ethanol und Propanol bestehenden Gruppe ausgewählten organischen Lösungsmittels enthält, durch eine Gelfiltrationschromatographiesäule,

(b) Aufgeben der Lösung von menschlichem BCDF auf die Säule und Durchleiten der Pufferlösung unter Gewinnung einer Lösung von menschlichem BCDF,

(c) ein zweites Durchleiten einer 3 bis 20 mM Pufferlösung eines Alkalimetallsalzes einer aus der aus Essigsäure, Ameisensäure und Zitronensäure bestehenden Gruppe ausgewählten organischen Säure, wobei die Pufferlösung kein organisches Lösungsmittel enthält, durch die Säule und

(d) Aufgeben der Fraktion von menschlichem BCDF, die in (b) erhalten wurde, auf die Säule und Durchleiten der in (c) beschriebenen Pufferlösung unter Gewinnung einer Lösung von menschlichem BCDF, die kein organisches Lösungsmittel enthält.

4. Verfahren zur Reinigung von menschlichem BCDF gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lösung mit dem gelösten menschlichen BCDF durch Lösen von menschlichem BCDF in einer Kulturbrühe mit menschlichem BCDF, die durch Kultivierung eines Mikroorganismus mit einem darin integrierten menschlichen BCDF-Gen erhalten wurde, hergestellt wird.