DE68912582T2

DE68912582T2 - Anti-hiv-mittel.

Info

Publication number: DE68912582T2
Application number: DE68912582T
Authority: DE
Inventors: Kenji Meiji Institute Mizumoto; Masao Meiji Institute O Takami; Hajime Meiji Institute Tsunoo
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1989-01-09
Filing date: 1989-01-30
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2009-01-31
Also published as: KR910700067A; EP0406416A4; EP0406416B1; US5164486A; AU636104B2; DE68912582D1; WO1990007340A1; AU2937489A; KR0128098B1; EP0406416A1; OA09308A

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues Anti-HIV(Human- Immundefizienz-Virus)-Mittel.
Umfangreiche molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sind über HIV durchgeführt worden, seit das Virus, das HIV, als eine Ursache für das erworbene Immundefizienz-Syndrom (anschließend als AIDS bezeichnet) entdeckt worden ist. Diese Untersuchungen waren beim allmählichen Enthüllen des Virus selbst sowie des Mechanismus der Zellinfektion mit dem Virus erfolgreich. Von zwei Wegen, auf denen die Zellen mit dem Virus infiziert werden, wurde berichtet; ein Weg, auf dem in das Blut übertragenes HIV sich direkt mit den Ziel-T-Zellen vereinigt, und ein Weg, in dem sich Zellen, die mit HIV infiziert sind, mit nicht-infizierten Zellen verbinden, um große Zellen zu bilden [Weber, J.N. und Rice, R.A., Scientific American (Japanische Ausgabe), 18, Nr. 12, 88- 95 (1988)]. Zur Zeit sterben jedoch fast alle AIDS-Patienten mangels eines wirksamen AIDS-Heilmittels. Untersuchungen zur Entdeckung von Anti-HIV-Mitteln, die für die Behandlung von mit HIV infizierten AIDS-Patienten wirksam sind, werden weltweit durchgeführt.
Nur 3'-Azido-2',3'-didesoxythymidin (anschließend als AZT abgekürzt), ist bislang als Anti-HIV-Mittel auf dem Markt erhältlich [Mitsuya, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7096-7100 (1985)]. AZT hemmt jedoch als Nebenwirkung markant das Knochenmarkzellen-Wachstum und ist deshalb bei einer Langzeitverabreichung problematisch [Richmann, D.D. et al., New Eng. J. Med., 317, 185-191 (1987)].
AZT ist ein Derivat von 2',3'-Didesoxynukleosid. Als Anti-HIV- Verbindung mit einer ähnlichen Struktur ist derzeit 2',3'- Didesoxycytidin bekannt. Diese Verbindung wird in der klinischen Phase untersucht. Pyrimidinnukleosid-Derivate (Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 107924/1988) und Purinnukleosid- Derivate (Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 107936/1988) sind andere Verbindungen, die Derivate von 2',3,- Didesoxynukleosid sind.
Außer den oben erwähnten Verbindungen werden lösliches CD4 und Dextransulfat als vielversprechende Anti-HIV-Mittel-Kandidaten betrachtet, und klinische Tests mit diesen Verbindungen werden derzeit durchgeführt. CD4 ist ein Glykoprotein, das weit verbreitet vorhanden ist, insbesondere auf der Oberfläche von Helfer-T-Zellen, einem Hauptangriffsziel von HIV. Helfer-T- Zellen werden durch eine starke Bindung von CD4 mit einem Glykoprotein, das als gp120 bezeichnet wird und auf der Oberfläche von HIV-Teilchen vorhanden ist, mit HIV infiziert. Wenn ein lösliches CD4 einem Patienten verabreicht wird, wird gp120 durch dieses fremde CD4 besetzt. Dies hindert das HIV an der Bindung mit dem CD4, das auf der Oberfläche von Helfer-T- Zellen vorhanden ist, wodurch die Infektion von Helfer-T-Zellen mit HIV unmöglich gemacht wird.
Dextransulfat wird üblicherweise als Blutkoagulations-Inhibitor oder als Cholesterol-Senker verwendet. Die Verbindung hat seit der Entdeckung der Wirkung, die Infektion mit oder Replikation von HIV zu hemmen, viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen [Jpn. J. Cancer Res., 78, 1164-1168 (1987)]. Dextransulfat weist jedoch die Nebenwirkung auf, Leberstörungen zu verursachen. Zusätzlich macht es die Blutkoagulations-hemmende Fähigkeit, die Dextransulfat besitzt, unmöglich, diese Verbindung AIDS- Patienten mit Hämophilie zu verabreichen.

[Mittel für die Lösung der Probleme]

Die vorliegenden Erfinder haben umfangreiche Untersuchungen über die Entwicklung einer Verbindung, die als Anti-HIV-Mittel nützlich ist, durchgeführt. Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden, daß, wenn die Aminogruppe auf den Plasmaprotein- aufbauenden Aminosäureresten chemisch modifiziert wird, um deren Polarität von Positiv zu negativ zu verändern, das chemisch modifizierte Plasmaprotein HIV-infizierte Zellen und nicht-HIV- infizierte Zellen daran hindert, zu verschmelzen und demgemäß zu großen Zellen zusammenzuwachsen, was eine Denaturierung oder einen Tod der Zellen zur Folge hat, und dennoch ein derartiges chemisch modifiziertes Plasmaprotein die geringste in-vivo- und in-vitro-Toxizität aufweist. D.h., die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß das chemisch modifizierte Plasmaprotein als ausgezeichnetes Anti-HIV-Mittel verwendet werden könnte.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt die neue Verwendung eines Proteins, bei dem die Polarität der Aminogruppe der Aminosäurereste, die das Plasmaprotein aufbauen, chemisch zu einer negativen Einheit modifiziert ist, bei der Herstellung eines Anti-HIV-Mittels bereit.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den Unteransprüchen angegeben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Zahl lebender Zellen im Laufe der Zeit darstellt, gezählt mittels des MTT-Assays in einem gemischten Kultursystem, bei dem M-HSA oder DS einem gemischten Kultursystem von Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 auf eine Endkonzentration von 20 ug/ml (M-HSA) oder 50 ug/ml (DS) zugesetzt worden ist, um die Wirkung von M-HSA oder DS, die Denaturierung oder den Tod von Zellen aufgrund der Bildung großer Zellen zu hemmen, zu untersuchen.
Die Figuren 2(A) bis 2(D) sind Zeichnungen der Zellmorphologie in Kultursystemen von Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8, die mittels Mikroskopie am 4. Tag der Kultivierung beobachtet wurden. Fig. 2(A) ist eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium, worin Molt-4-Klon Nr. 8 allein kultiviert wurde. Fig. 2(B) ist eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium, worin Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 in Mischung ohne Zugabe einer Testprobe kultiviert wurden. Fig. 2(C) ist eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium, worin Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 in Mischung mit Zugabe von 20 ug/ml M-HSA der vorliegenden Erfindung kultiviert wurden. Fig. 2(D) ist eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium, worin Molt-4-HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 in Mischung mit Zugabe von 50 ug/ml DS kultiviert wurden.
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die IRs für M-HSA, S-HSA, M-BSA und DS bei verschiedenen Konzentrationen in einem Kulturnährmedium zeigt, in dem Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 in Mischung kultiviert wurden. Die IRs wurden aus der Messung der lebenden Zellen mittels des MTT-Assays am 4. Tag berechnet.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die IRs für M-HSA, HSA und DS bei verschiedenen Konzentrationen in einem Kulturnährmedium zeigt, in dem Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 in Mischung kultiviert wurden. Die IRs wurden aus der Messung der lebenden Zellen mittels des Trypan-Blau-Farbausschlußverfahrens am 4. Tag berechnet.
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die IRs für M-Ig, S-Ig, M-Tf, S-Tf, S-Fb und DS bei verschiedenen Konzentrationen in einem Kulturnährmedium zeigt, in dem Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 in Mischung kultiviert wurden. Die IRs wurden aus der Messung der lebenden Zellen mittels des MTT-Assays am 4. Tag berechnet.
Die Figuren 6(A) bis 6(D) sind Zeichnungen, die die mikroskopischen morphologischen Beobachtungen der Zellen im direkten T-Zell(Zellstamm Molt-4-Klon Nr. 8)-Infektionssystem mit HIV in Gegenwart von M-HSA oder M-cf am 4. Tag der Kultivierung zeigen. Fig. 6(A) stellt eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium dar, in dem Molt-4-Klon Nr. 8 allein kultiviert wurde. Fig. 6(B) ist eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium, in dem Molt-4-Klon Nr. 8 mit Zugabe einer Lösung, die nur HIV enthielt, kultiviert wurde. Fig. 6(C) ist eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium, in dem Molt-4-Klon Nr. 8 mit Zugabe einer Lösung, die HIV und 100 ug/ml M-HSA der vorliegenden Erfindung enthielt, kultiviert wurde. Fig. 6(D) ist eine Zeichnung von Zellen in einem Kulturnährmedium, in dem Molt-4-Klon Nr. 8 mit Zugabe einer Lösung, die HIV und 300 ug/ml M-Tf der vorliegenden Erfindung enthielt, kultiviert wurde.
Fig. 7 ist ein Diagramm, das IRs für M-HSA, M-Ig, M-Tf, S-Fb und DS im direkten T-Zell(Zellstamm Molt-4-Klon Nr. 8)- Infektionssystem mit HIV am 4. Tag der Kultivierung zeigt. IRs werden aus der Zahl lebender Zellen, gemessen durch das Trypan- Blau-Verfahren, berechnet.
Fig. 8(A) ist ein Diagramm, das die Wirkung von Maleyl- und Succinyl-modifizierten Plasmaproteinen auf normale Lymphozyten in einem in-vivo-System zeigt. Das Diagramm zeigt die Mengen an radioaktivem Thymidin, die am 3. Tag in die Kulturnährmedien aufgenommen wurden, in denen normale menschliche periphere Blutlymphozyten in Gegenwart von Maleyl-modifiziertem Human- Serumalbumin, Succinyl-modifiziertem Human-Serumalbumin oder nicht-modifiziertem Human-Serumalbumin kultiviert wurden. Fig. 8(B) ist ein Diagramm, das die Mengen an radioaktivem Thymidin zeigt, die am 3. Tag in die Kulturnährmedien aufgenommen wurden, in denen normale menschliche periphere Blutlymphozyten in Anwesenheit von PHA oder ConA kultiviert wurden.

Beste Art und Weise der Durchführung der Erfindung

Vom Menschen abstammendes Plasmaprotein, wie Human-Serumalbumin, Human-Immunglobulin, Human-Transferrin und Human-Fibrinogen werden unter dem Gesichtspunkt der Antigenität als wünschenswert angesehen. Außer diesen Proteinen können in der vorliegenden Erfindung Kälber-Plasmaproteine als Plasmaprotein verwendet werden, das chemisch zu modifizieren ist.
Dicarbonsäureanhydride, vorzugsweise Maleinsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid und dergleichen, können als Chemikalien angeführt werden, die die Aminogruppe der aufbauenden Aminosäurereste von Positiv in negativ überführen.
Da es der Zweck der chemischen Modifizierung ist, ein Plasmaprotein zu erhalten, das eine HIV-Aktivität aufweist, kann die chemische Modifizierung durch Umsetzen des Plasmaproteins und der Chemikalien zur Modifizierung in einer schwach alkalischen Lösung bei etwa Raumtemperatur durchgeführt werden, und jegliche Bedingungen können verwendet werden, solange die Aminogruppe der das Plasmaprotein aufbauenden Aminosäurereste carboxyliert werden können, z.B. durch Maleyl- oder Succinyl- Modifizierung, und ihre elektrische Ladung von positiv in negativ überführt werden kann. Es gibt keine strengen Begrenzungen bezüglich der Zahl und des primären Strukturorts der zu modifizierenden Aminosäuren. Es sollte verstanden werden, daß, selbst wenn ein Teil von funktionellen Gruppen außer den Aminogruppen in der Nebenkette als Ergebnis einer Nebenreaktion chemisch modifiziert wird, ein derarig chemisch modifiziertes Plasmaprotein innerhalb den Bereich der vorliegenden Erfindung fällt, solange das resultierende Produkt eine Anti-HIV-Wirkung aufweist. Wenn Carbonsäureanhydrid verwendet wird, weist die modifizierte Stelle eine Struktur auf, die durch -NHCORCOO&supmin;, worin R eine organische Gruppe darstellt, dargestellt wird.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in größerer Einzelheit beschrieben.
Zur Erläuterung der Verfahren zur Herstellung des chemisch modifizierten Plasmaproteins dieser Erfindung ist ein Beispiel für eine Maleyl-Modifizierung von Butler, P. J. G. und Hartley, B. S. [Method Enzymol., 25, 191-199 (1972)] vorgeschlagen worden, und ein Succinyl-Modifizierungsverfahren ist von Habeeb, A. F. S. A. et al. [Biochim. Biophys. Acta, 29, 587 (1958)] vorgeschlagen worden. Speziell kann ein Maleyl-modifiziertes Plasmaprotein durch Behandlung eines Plasmaproteins mit Maleinsäureanhydrid in schwach alkalischer Lösung hergestellt werden, und ein Succinyl-modifiziertes Plasmaprotein kann durch Behandlung eines Plasmaproteins mit Bernsteinsäureanhydrid in schwach alkalischer Lösung hergestellt werden.
Maleyl- oder Succinyl-modifizierte Plasmaproteine hemmen ausgeprägt die Bildung großer Zellen durch das Binden von HIV, das in das Blut übertragen wurde, an die Zielzellen und durch die Verschmelzung von HIV-infizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen.
Eine zu verabreichende Dosis von Maleyl- oder Succinyl- modifiziertem Plasmaprotein, das die wirksame Komponente des Anti-HIV-Mittels dieser Erfindung ist, schwankt in Abhängigkeit vom Grad der Symptome, dem Alter, des Geschlechts und der Fähigkeit des Subjekts, ein chemisch modifiziertes Plasmaprotein aufzunehmen. Für erwachsene Patienten liegt die Dosis im allgemeinen bei 10 ug bis 10 g pro Tag, und diese Dosierung kann einmal oder über mehrere verabreichungen täglich verabreicht werden. Das Anti-HIV-Mittel dieser Erfindung kann entweder einzeln oder zusammen mit einem oder mehreren Anti-HIV-Mitteln verabreicht werden.
Die intravenöse Injektion wird normalerweise als Verabreichungsverfahren angewendet.
Die Injektionflüssigkeit kann gemäß einem herkömmlichen Verfahren unter wie erforderlicher Verwendung üblicherweise bekannter Träger oder Adjuvantien, wie beispielsweise pH- Puffern, Löslichkeitsvermittlern, Konservierungsmitteln und Stabilisatoren, hergestellt werden.
Die Herstellung des chemisch modifizierten Plasmaproteins dieser Erfindung wird am Beispiel von Maleyl-modifiziertem Human- Serumalbumin erläutert.

HERSTELLUNGSBEISPIEL

Das von Butler et al. [Butler, P. J. G. und Hartley, B. S; Method Enzymol., 25, 191-199 (1972)] vorgeschlagene Verfahren wurde verwendet.
300 mg Human-Serumalbumin (Nr. A 8763, hergestellt von Sigma Co.) wurden in 30 ml 0,2 M Na&sub2;B&sub4;O&sub7;-Lösung, die mit Salzsäure auf pH 8,5 eingestellt war, gelöst. Maleinsäureanhydridpulver wurde zu 30 ml dieser Lösung auf eine Endkonzentration von 0,1 M dazugegeben, während Na&sub2;CO&sub3;-Pulver dazugegeben wurde, um den pH der Lösung bei 8,5 oder größer aufrecht zu erhalten. Alle diese Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde bei 4ºC zweimal mit 3 l 0,1 M NaHCO&sub3;, einmal mit 3 l gereinigtem Wasser, dann zweimal mit 3 l 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3; gründlich dialysiert.
Nach der Dialyse wurde die dialysierte innere Lösung unter Verwendung eines Lyophilisators (Space Seva Delux 75035, hergestellt von Labconca Co.) lyophilisiert, um die Zielprobe von Maleyl-modifiziertem Human-Serumalbumin (anschließend als M- HSA bezeichnet) in gepulverter Form zu erzeugen.
Eigenschaften des so erzeugten M-HSA waren wie folgt:

(1) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des M-HSA-Endprodukts, gemessen durch 8% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, betrug 66 000.

(2) Löslichkeit

In Wasser löslich.

(3) UV-Absorptionsvermögen

Die Substanz wies eine größere UV-Absorbanz in der Nähe von 250 nm als nicht-modifiziertes Human-Serumalbumin (anschließend als HSA bezeichnet) auf.
Man fand durch Berechnung aus der Menge der nicht-modifizierten Aminogruppen unter Verwendung von unbehandeltem HSA als Kontrolle, daß der Maleyl-Modifikationsgrad von M-HSA 90% war. Das Verfahren von Fields [Fields, R.; Methods Enzymol., 25, 464- 468 (1972)] wurde für die Messung der Menge der Aminogruppen verwendet.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mittels Beispielen beschrieben. Alle nachstehenden Beispiele basieren auf in-vitro- Systemen unter Verwendung von kultivierten Zellen, da in-vivo- Experimente, die ein Anti-HIV-Mittel verwenden, wegen der Abwesenheit geeigneter Tiere, die durch HIV infiziert werden, schwierig waren.
Zelltypen, das Assayverfahren, die Reagenzien und das Verfahren zur Bewertung der Anti-HIV-Wirkungen verschiedener chemisch modifizierter Plasmaproteine, die in den Beispielen verwendet werden, werden zuerst erklärt.
Die in den Beispielen 1-3 verwendeten Zellstämme waren menschliche akute Leukämiezellen Molt-4. Sie schlossen HIV- infizierte Zellen Molt-4/HIV [Yamamoto, N. et al., Int. J. Cancer, 36, 445-451 (1985)] und Molt-4-Klon Nr. 8, der für HIV hochempfänglich ist [Yamamoto, N. et al., J. Virol., 57, 1159- 1162 (1986)], ein. Diese Zellstämme wurden von Dr. Naoki Yamamoto des Medical Department der Yamaguchi University bereitgestellt.
Die verwendete Kulturflüssigkeit war 10%ige (Vol./Vol.) Rinderfetusserum-Lösung von RPMI-1640 ("Kulturflüssigkeit" wird auch manchmal in dieser Beschreibung als "Kulturmedium" bezeichnet).
Normale Zellkulturbedingungen (Luft:CO&sub2; = 95:5; Temperatur: 37ºC) wurden zum Kultivieren der Zellen verwendet.
Die Zahl der lebenden Zellen in einer Kulturmischung von Molt- 4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 wurde gemäß dem MTT[3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid]-Assay ["Immunologicyl Experimental Procedure XIII" (herausgegeben von der Japan Immunology Association), Seiten 4477-4482] oder dem Trypan-Blau-Farbausschlußverfahren gemessen. Die Zahl der lebenden Zellen in einem direkten Infektionssystem von Molt-4- Klon Nr. 8 mit HIV wurde ebenfalls durch das gleiche Verfahren gemessen.
Die Zahl der lebenden Zellen durch das Trypan-Blau- Farbausschlußverfahren wurde wie folgt berechnet. Eine Trypan- Blau-physiologische Kochsalz-Mischlösung wurde durch Mischen von 4 Volumina 0,2%iger Trypan-Blau-Lösung und 1 Volumen 5fach physiologischem Kochsalzwasser hergestellt. Dann wurde ein gleiches Volumen der Trypan-Blau-physiologischen Kochsalz- Mischlösung und der in den Beispielen verwendeten Zellsuspension gemischt, und die Zahl der mit dem Pigment nicht angefärbten Zellen wurde unter Verwendung eines Blutzellenzählers gezählt.
Human-Serumalbumin (Nr. A 8763), Human-Immunglobulin G (Nr. G 4386), Human-Transferrin (Nr. T 0519), Human-Fibrinogen (Nr. F 3879) und Rinderserumalbumin (Nr. A 7638) waren von Sigma Chemical Co. Die Zahlen in den Klammern weisen auf die Sigma- Produktnummern hin. Zusätzlich wurde Dextransulfat (Nr. D 0768; durchschnittliches Molekulargewicht: 5000, hergestellt von Sigma) als bekanntes Anti-HIV-Mittel zum Vergleich verwendet.
Die Aktivitäten von chemisch modifizierten Plasmaproteinen und Dextransulfat (nachstehend als "Testprobe" oder "Arzneistoff" bezeichnet) wurden mittels des von den Proben erreichten Hemmverhältnisses (nachstehend als "IR" bezeichnet) der Zelldenaturierung oder des Zelltods, die bzw. der durch Bildung großer Zellen verursacht wurde, bewertet. Hier ist IR durch die folgende Gleichung definiert:
IR = [A-B]/[C-B] x 100 (%)
worin A der durch den MTT-Assay oder das Trypan-Blau- Farbausschlußverfahren bei dem Molt-4/HIV - Molt-4-Klon Nr. 8- Mischkultursystem, dem eine Testprobe zugesetzt wurde, gemessene Wert ist; B ist der Wert, der durch den MTT-Assay oder das Trypan-Blau-Farbausschlußverfahren bei dem Molt-4/HIV - Molt-4- Klon Nr. 8-Mischkultursystem gemessen wurde, dem kein Arzneistoff zugesetzt wurde; und C zeigt den Wert an, der durch den MTT-Assay oder das Trypan-Blau-Farbausschlußverfahren bei der unabhängigen Kultur von Molt-4-Klon Nr. 8 gemessen wurde.

Beispiel 1 (Hemmwirkung von chemisch modifiziertem Albumin auf die Bildung großer Zellen in einem gemischten Kultursystem von HIV-infizierten Zellen/nicht- HIV-infizierten Zellen)

Es ist bekannt, daß gemischtes Kultivieren von Molt-4/HIV- und Molt-4-Klon Nr. 8-Zellen eine rasche Erzeugung von vielkernigen großen Zellen zur Folge hat, gefolgt vom Tod der vielkernigen großen Zellen [Yamamoto, N. et al., J. Virol., 57, 1159-1162 (1986)]. Ein Experiment wurde zur Bestätigung der Aktivität von M-HSA und Succinyl-modifiziertem Serumalbumin (nachstehend als "S-HSA" bezeichnet), dieses Phänomen zu hemmen, durchgeführt.
Die verwendeten Proben waren M-HSA, S-HSA und Maleyl- modifiziertes Rinderserumalbumin (nachstehend als "M-BSA" bezeichnet). Zusätzlich wurde nicht-modifiziertes HSA als Kontrolle verwendet, und Dextran (nachstehend als "DS" bezeichnet) wurde als repräsentative Probe von bekannten Anti- HIV-Mitteln verwendet. Diese Proben wurden zusammengegeben, um verschiedene Konzentrationen bei Molt-4/HIV - Molt-4-Klon Nr. 8- Mischkultursystemen zu erzeugen, um die Hemmwirkung der Proben zu beobachten.
Mikrotiterplatten mit 96 oder 24 Vertiefungen wurden für das gemischte Kultivieren der Zellstämme Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 verwendet. Die Kultur wurde für jeden Stamm bei einer Konzentration von 0,5 x 10&sup5;/ml und 2,0 x 10&sup5;/ml durchgeführt. Als Kontrollen wurden ein System, dem kein Anti-HIV-Mittel zugesetzt war, und ein System, das nur Molt-4-Klon Nr. 8-Zellen enthielt, kultiviert.
Im Verlauf der Zellkultivierung wurden die Wirkungen von Anti- HIV-Mitteln, die die Zelldenaturierung und den Zelltod, verursacht durch Bildung großer Zellen, hemmten, im Laufe der Zeit durch den MTT-Assay gemessen. Die Zellmorphologie wurde mit einem Mikroskop beobachtet. Die Ergebnisse werden in den Figuren 1, 2(A) bis 2(D), 3 und 4 gezeigt.
Fig. 1 zeigt die Wirkung von M-HSA oder DS in einem gemischten Kultursystem, dem M-HSA oder DS auf eine Endkonzentration von 20 ug/ml (M-HSA) oder 50 ug/ml (DS) zugesetzt waren, die Denaturierung oder den Tod, verursacht durch Bildung großer Zellen, im Laufe der Zeit zu hemmen. Lebende Zellen wurden mittels des MTT-Assays gezählt. In der Figur stellen die Linien, die leere Quadrate verbinden, die Zahl der lebenden Zellen im Kulturnährmedium dar, das nur den Mol-4-Klon Nr. 8-Zellstamm enthält, die Linie, die ausgefüllte Dreiecke verbindet, stellt diejenigen im Kulturnährmedium dar, denen weder M-HSA noch DS zugesetzt worden war, die Linien, die die ausgefüllten Rhomboide verbindet, stellt diejenigen im Kulturnährmedium dar, denen 20 g/ml M-HSA zugesetzt worden war, und die Linie, die die leeren Rhomboide verbindet, stellt diejenigen im Nährmedium dar, denen 50 ug/ml DS zugesetzt worden war. Der IR für M-HSA war 86% am 3. Tag und 88% am 4. Tag, und der IR für DS war 76% und 78% am 3. bzw. 4. Tag.
Die Figuren 2(A) bis 2(D) sind Zeichnungen der Zellmorphologie, die mikroskopisch am 4. Tag des Kultivierens beobachtet wurden. Wie aus diesen Zeichnungen klar wird, wurden große agglomerierte Zellen, die denaturiert waren und starben, in dem gemischten Kultursystem der Stämme Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 beobachtet [Fig. 2(B)], wohingegen die Zellen in dem Nährmedium, in dem nur der Molt-4-Klon Nr. 8-Zellstamm kultiviert wurde, am Leben waren [Fig. 2(A)]. Im Gegensatz dazu wurde die die Denaturierung zu großen Zellen oder deren Tod hemmende Wirkung in dem Kulturnährmedium beobachtet, dem 20 ug/ml M-HSA zugesetzt waren [Fig. 2(C)]. Eine ähnliche Wirkung wurde auch in dem Kulturnährmedium, dem 50 ug/m1 DS zugesetzt waren, erkannt [Fig. 2(D)].
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die IRs für M-HSA, S-HSA, M-BSA und DS bei verschiedenen Konzentrationen (500 ug/ml, 100 ug/ml, 20 ug/ml und 4 ug/ml für M-HSA, S-HSA und M-BSA und 100 ug/ml und 50 ug/ml für DS) zeigt. Lebende Zellen wurden mittels des MTT- Assays gezählt.
Wie in Fig. 3 gezeigt, waren die IRs für M-HSA 102% bei 500 ug/ml, 95% bei 100 ug/ml, 88% bei 20 ug/ml und 77% bei 4 ug/ml; die IRs für S-HSA waren 95% bei 500 ug/ml, 89% bei 100 ug/ml, 84% bei 20 ug/ml und 73% bei 4 ug/ml; und die IRs für M-BSA waren 106% bei 500 ug/ml, 87% bei 100 ug/ml, 88% bei 20 ug/ml und 72% bei 4 ug/ml. Andererseits waren im Fall von DS die IRs 79% bei 100 ug/ml und 78% bei 50 ug/ml.
Fig. 4 ist ein ähnliches Diagramm wie das in Fig. 3 gezeigte und wurde hergestellt, um die Ergebnisse der IRs, die im MTT-Assay in Fig. 3 erhalten wurden, zu bestätigen. In diesem Experiment wurden die IRs für M-HSA (bei Konzentrationen von 500 ug/ml, 100 g/ml, 20 ug/ml und 4 ug/ml), HSA (bei 500 ug/ml) und DS (bei 100 ug/ml und 50 ug/ml) aus den Ergebnissen des Assays am 4. Tag durch das Trypan-Blau-Farbausschlußverfahren berechnet. Die IRs für M-HSA waren 91% bei 500 ug/ml, 80% bei 100 ug/ml, 75% bei 20 g/ml und 35% bei 4 ug/ml; die IRs für DS waren 84% bei 100 g/ml und 64% bei 50 ug/ml. Im Gegensatz dazu wurde eine die Denaturierung zu großen Zellen oder deren Tod hemmende Wirkung von HSA selbst bei der Konzentration von 500 ug/ml kaum erkannt.
Aus den obigen Experimenten erkannte man, daß M-HSA, S-HSA, MBSA und DS konzentrationsabhängig eine die Denaturierung zu großen Zellen oder deren Tod hemmende Wirkung aufwiesen. Auch fand man, daß M-HSA, S-HSA und M-BSA eine größere die Denaturierung zu großen Zellen oder deren Tod hemmende Wirkung bei einer niedrigeren Konzentration, z.B. 20 ug/ml, als DS aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurde eine geringe die Denaturierung zu großen Zellen oder deren Tod hemmende Wirkung mit nicht-modifiziertem HSA erkannt.

Beispiel 2 (hemmende Wirkung anderer chemisch modifizierter Plasmaproteine auf die Bildung großer Zellen in einem gemischten Kultursystem mit HIV-infizierten Zellen - nicht-HIV-infizierten Zellen)

Um die Anti-HIV-Wirkung von anderen chemisch modifizierten Plasmaproteinen außer dem chemisch modifizierten Serumalbumin von Beispiel 1 zu zeigen, wurden Experimente durchgeführt, in denen IRs auf der Basis des MTT-Assays berechnet wurden und morphologische Beobachtungen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt wurden, um die hemmende Wirkung auf die Bildung großer Zellen in dem gemischten Kultursystem der Zellstämme Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 nachzuweisen.
Die verwendeten Testproben waren Maleyl- oder Succinyl- modifizierte Plasmaproteine, d.h. Maleyl-modifiziertes Immunglobulin G (nachstehend als M-Ig bezeichnet), Succinyl- modifiziertes Globulin (nachstehend als S-Ig bezeichnet), Maleyl-modifiziertes Transferrin (nachstehend als M-Tf bezeichnet) und Succinyl-modifiziertes Transferrin (nachstehend als S-Tf bezeichnet) und Succinyl-modifiziertes Fibrinogen (nachstehend als F-Fb bezeichnet). Zusätzlich wurde DS als repräsentative Probe von bekannten Anti-HIV-Mitteln verwendet. Diese Proben wurden zu Molt-4/HIV - Molt-4-Klon Nr. 8- Mischkultursystemen in verschiedenen Konzentrationen gegeben, um die hemmende Wirkung der Proben zu beobachten.
Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurde für das gemischte Kultivieren der Zellstämme Molt-4/HIV und Molt-4-Klon Nr. 8 verwendet. Die Zahl der verwendeten Zellen und die Kulturbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1. Als Kontrollen wurden ein System, dem kein Anti-HIV-Mittel zugesetzt worden war, und ein System, das nur Molt-4-Klon Nr. 8-Zellstamm enthielt, kultiviert. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Am 4. Tag nach Beginn des Kultivierens wurde der MTT-Assay durchgeführt, und eine mikroskopische Beobachtung (Vergrößerung: x 100) wurde an der Zellmorphologie durchgeführt.
Fig. 5 zeigt die IRs von M-Ig, S-Ig, M-Tf, S-Tf, S-Fb und DS bei verschiedene Konzentrationen, berechnet aus der Zahl der Zellen, die durch den MTT-Assay am 4. Tag bestimmt wurde.
Wie in Fig. 5 gezeigt, waren die IRs für M-Ig 70% bei 40 ug/ml, für S-Ig 91% bei 600 ug/ml, für M-Tf 110% bei 300 ug/ml, für S- Tf 104% bei 180 ug/ml, für S-Fb 65% bei 170 ug/ml und für DS 103% bei 100 ug/ml.
Die obigen Ergebnisse belegen, daß Maleyl- oder Succinyl- modifizierte Plasmaproteine, die kein Maleyl- oder Succinyl- modifiziertes Albumin sind, die Denaturierung zu großen Zellen oder deren Tod hemmende Wirkung aufweisen.
Die morphologischen Veränderungen der Zellen in den gewünschten Kulturnährmedien, die jeweils die obige Testprobe enthielten, wurden mikroskopisch beobachtet, wobei die Wirkung der Proben gefunden wurde, die Erzeugung großer Zellen zu verhindern (die Ergebnisse sind in den Figuren nicht gezeigt).
Auf der Grundlage der Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 wird angenommen, daß verschiedene Plasmaproteine, bei denen die Polarität der Aminogruppe der Aminosäurereste mit Dicarbonsäureanhydrid chemisch modifiziert wird, wirksam die HIV-Infektion hemmen.

Beispiel 3 (hemmende Wirkung von Maleyl- oder Succinyl- modifizierten Plasmaproteinen bei der Hemmung von Störungen in Molt-4-Klon Nr. 8-Zellen, die mit HIV infiziert sind)

In den Beispielen 1 und 2 wurde eine Hemmwirkung von Maleyl- oder Succinyl-modifizierten Plasmaproteinen bezüglich des Infektionsweges, bei dem HIV-infizierte Zellen sich mit nichtinfizierten Zellen verbinden, um zu großen Zellen zu agglomerieren, gezeigt. In diesem Beispiel wurden Experimente durchgeführt, um die Hemmwirkung von Maleyl- oder Succinyl- modifizierten Plasmaproteinen mit Bezug auf den anderen Infektionsweg, d.h. die Infektion durch die direkte Bindung von Helfer-T-Zellen mit HIV, zu zeigen.
Die verwendeten Proben waren M-HSA, M-Tf, M-Ig und S-Fb, und DS wurde als Kontrolle verwendet. Der Molt-4-Klon Nr. 8-Stamm wurde als Helfer-T-Zellen, die mit HIV zu infizieren waren, verwendet.
Eine Lösung, die HIV enthielt, wurde durch 4tägiges Kultivieren des HIV-erzeugenden Zellstamms Molt-4/HIV, Auftrennen des Überstands aus der Kulturnährlösung mittels Zentrifugation und Unterwerfen des Überstands einer Filtration unter Verwendung von 0,45 um Filterpapier (hergestellt von Millipore Co.) hergestellt.
Der Zellstamm Molt-4-Klon Nr. 8 wurde in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen geimpft, 2,3 x 10&sup4; Zellen/150 ul Kulturflüssigkeit für jede Vertiefung. 50 ul der HIV-Lösung und der oben erwähnten Testproben oder von DS wurden zu jeder Vertiefung gegeben, und das Kultivieren wurde 4 Tage lang durchgeführt. Nach Beendigung des Kultivierens wurden eine mikroskopische morphologische Beobachtung und Messung der Zahl der Zellen mittels des Trypan-Blau-Farbausschlußverfahrens durchgeführt.
Die Figuren 6(A) bis 6(D) zeigen Zeichnungen der mikroskopischen (Vergrößerung: x 100) morphologischen Beobachtungen der Zellen. Wie aus diesen Zeichnungen klar wird, wurden große, agglomerierte Zellen, die als Ergebnis der HIV-Infektion denaturiert waren und starben, in dem Kultursystem des Stamms Molt-4-Klon Nr. 8 beobachtet, dem nur HIV zugesetzt worden war [Fig. 6(B)], wohingegen die Zellen in dem Nährmedium, in dem nur der Molt-4-Klon Nr. 8-Zellstamm kultiviert worden war, am Leben waren [Fig. 6(A)]. Im Gegensatz dazu wurde ein die HIV- induzierte Denaturierung zu großen Zellen oder deren Tod hemmender Effekt in dem Kulturnährmedium beobachtet, dem M-HSA [Fig. 6(C)] oder M-Tf [Fig. 6(D)] zugesetzt worden war.
Fig. 7 ist ein Diagramm, daß die IRs zeigt, die aus der Zahl der lebenden Zellen berechnet wurde, welche durch das Trypan-Blau- Farbausschlußverfahren gemessen wurde. Die IRs für M-HSA waren 58% bei 100 ug/ml, für M-Ig 67% bei 40 ug/ml, für M-Tf 56% bei 300 ug/ml, für S-Fb 59% bei 170 ug/ml und für DS 64% bei 100 ug/ml.
Die obigen Ergebnisse werden als Nachweis angesehen, daß Maleyl- oder Succinyl-modifizierte Plasmaproteine auch bei der direkten Infektion von Helfer-T-Zellen mit HIV eine Hemmwirkung aufweisen.

Beispiel 4 (Wirkung von Maleyl- oder Succinyl-modifizierten Serumproteinen auf normale Lymphozyten in einem in-vitro-System)

DNA-Syntheseaktivität wurde unter Verwendung von radioaktivem Thymidin ([³H]-Thymidin) als Aufnahmemarker gemessen, um die Wirkung von chemisch modifiziertem HSA dieser Erfindung auf normale menschliche periphere Blutlymphozyten zu untersuchen.
Lymphozyten wurden aus normalem menschlichem peripherem Blut unter Verwendung von Fycoll Pack (Farmacia Co.) fraktioniert. Das vorstehend erwähnte Kulturmedium wurde zu den Lymphozytenfraktionen gegeben. Die Lymphozyten wurden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen geimpft, 4,0 x 10&sup5; Zellen/200ul Kulturmedium pro Vertiefung.
Eine M-HSA-, S-HSA- oder HSA-Lösung wurde dann auf eine Endkonzentration von 16 ug/ml, 32 ug/ml, 63 ug/ml, 125 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml, 1000 ug/ml bzw. 5000 ug/ml zu jeder Mikroplatte gegeben. Um die Auswirkung von chemisch modifizierten Proteinen auf Lymphozyten mit der Lymphozytenblastogenese von Mitogenen zu vergleichen, wurden Mikrotiterplattensysteme hergestellt, denen anstelle der obigen Testproben Phytohämagglutinin (nachstehend als "PHA" bezeichnet) auf eine Endkonzentration von 5 ug/ml oder Concanavalin A (nachstehend als "ConA" bezeichnet) auf eine Endkonzentration von 10 ug/ml zugesetzt wurde. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator (37ºC) in einer Atmosphäre mit einem Luft/CO&sub2;-Verhältnis von 95/5 60 Stunden lang kultiviert. 0,5 uCi radioaktives Thymidin (hergestellt von Amersham Co.) wurden zu jeder Vertiefung gegeben, und das Kultivieren wurde weitere 12 Stunden fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen unter Verwendung einer Erntevorrichtung auf Glasfaser- Filterpapier geerntet. Das Filterpapier wurde getrocknet und die Radioaktivität (Einheit: cpm) wurde unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszählers gemessen. Zellen, die durch Zugabe von PBS anstelle der Testproben oder Mitogene kultiviert wurden, dienten als Kontrolle.
Die Ergebnisse werden in den Figuren 8(A) und 8(B) gezeigt. In Fig. 8(A) wurde gezeigt, daß durch S-HSA bei der Konzentration von 5000 ug/ml ein gewisser Grad von DNA-Synthese-hemmender Wirkung vorhanden war, aber keine derartige Wirkung durch S-HSA bei Konzentrationen von 16-1000 ug/ml. Sowohl M-HSA als auch HSA zeigten keine DNA-Synthese-hemmende Wirkung bei Konzentrationen von 16-5000 ug/ml.
Eine leichte Lymphozytenblastogenese wurde in den Zellen, die M- HSA enthielten, beobachtet. Der Grad war ungefähr 1/10 der Werte von PHA oder ConA, die in Fig. 8(B) gezeigt werden.
Die obigen Ergebnisse zeigten keine toxische Natur von Maleyl- modifiziertem HSA und Succinyl-modifiziertem HSA auf menschliche Lymphozyten während der Interphase (G0-Phase) des Zellzyklus.

Beispiel 5 (Akuter Toxizitätstest)

Ein akuter Toxizitätstest der chemisch modifizierten Plasmaproteine dieser Erfindung wurde durch intravenöse Injektion von M-HSA in Mäuse durchgeführt.
Da man annahm, das M-HSA ein wenig toxisches Material war, wurde die technisch maximal mögliche Menge von M-HSA, 3,92 g/kg, in diesem Test verabreicht.
Speziell wurden 3,92 g/kg M-HSA jeder von 5 männlichen DBA/2- Mäusen (bezogen von Japan Charles River Co., Ltd.), die 24,4 bis 28,9 g wogen, intravenös verabreicht, und die allgemeinen Zustände und Veränderungen im Körpergewicht der Mäuse wurden beobachtet. Als Ergebnis wurde keine Abnormalität beobachtet.
Es wird angenommen, daß die gleichen Ergebnisse mit allen Produkten, die durch Maleyl- oder Succinyl-Modifizierung von Plasmaproteinen erzeugt wurden, erhalten werden und daß alle Maleyl-modifizierten Plasmaproteine sowie Succinyl-modifizierten Plasmaproteine sicher sind.

Industrielle Anwendung der Erfindung

Wie aus den Beispielen 1 - 5 offensichtlich wird, hemmen mit Dicarbonsäureanhydrid modifizierte Plasmaproteine, die die wirksamen Komponenten des Anti-HIV-Mittels dieser Erfindung sind, die Bildung großer Zellen in gemischten Kulturen von HIV- infizierten Zellen und nicht-infizierten Zellen sowie die direkte Infektion von Helfer-T-Zellen mit HIV. Sie haben selbst bei hoher Konzentration keinen Einfluß auf die DNA-Synthese. Sie werden aufgrund der Tatsache, daß sie keine Abnormalität in akuten Toxizitätstests aufweisen, auch als sehr sichere Materialien angesehen.
Aus dem obigen folgt, daß man erwartet, daß mit einem Dicarbonsäureanhydrid modifizierte Plasmaproteine bei der Behandlung von HIV-infizierten Patienten anwendbar sind.

Claims

1. Verwendung eines Proteins, bei dem die Polarität der Aminogruppe des Aminosäurerestes, der das Plasmaprotein aufbaut, chemisch in eine negative Einheit abgeändert ist, bei der Herstellung eines Anti-HIV-Mittels.

2. Verwendung eines Plasmaproteins, bei dem die Aminogruppe des aufbauenden Aminosäurerestes durch ein Dicarbonsäureanhydrdid modifiziert ist, bei der Herstellung eines Anti-HIV-Mittels.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin das Dicarbonsäureanhydrid Maleinsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Plasmaprotein aus einer menschlichen oder Rinder-Quelle herstammt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das Plasmaprotein ein Mitglied ist, das aus Human-Serumalbumin, Human-Immunglobulin, Human-Transferrin, Human-Fibrinogen und Rinderserumalbumin ausgewählt ist.