DE2902136A1

DE2902136A1 - Interferon und es enthaltende zubereitungen

Info

Publication number: DE2902136A1
Application number: DE19792902136
Authority: DE
Inventors: Kaname Sugimoto; Shokichi Yuen
Original assignee: HAYASHIBARA KEN
Current assignee: HAYASHIBARA KEN
Priority date: 1978-01-22
Filing date: 1979-01-19
Publication date: 1979-08-09
Also published as: CA1135186A; NO790195L; NO152976C; FR2414920A1; DE2902136C2; DK25579A; NL192086C; FI790188A; NL192086B; DK153848B; AU4334579A; IT1116493B; FI66428C; ES477060A1; GB2016015B; US4276282A; FR2414920B1; SE436969B; AU533201B2; IT7947712A0

Description

NACHQSRESOHT [

BOETERS·"
PATENTA rf VV ALTE

MONCHEN-HAMBURQ 2902136

• 3* 19* Januar 1979

DIPL.-CH-EM. DR. HANS Cr. BOETEHS RUMrOKOiVHfAiiiifl AO

* BOETERS Λ RAFFAY · RUMFOROSTH. .to · popp MÜNCHEIvr B · SOOO MÖNCHEN B

Deutsches Patentamt capi_-tNaviNCENzv.RAFFAv

HAMBURG

ihr zeichen: 53-005-368

_onnn .... , VOUR REFERENCE:

8000 München

UNSER ZEIGHENr: OUR REFERENCE:

Hayashibara & Äshida P 050 179

BETRIFFT:
RE:

1} Ken Hayashibara,, Okayama, Japan 2) Shin Ashida, Hyogo_T Japan

Interferon und es enthaltende Zubereitungen

Die Erfindung betrifft Interferon und Zubereitungen mit einem Gehalt an Interferon zur Verhütung und Behandlung von Krankheiten, die auf Interferon ansprechen«

Wie in "Interferon" (1975) Kodansha, Ltd., Tokyo (Shigeyasu Kobayashi), "Interferon and Its Clinical Potential" (1976) William Heinemann Medical Books, Ltd., London (D.A.J. Tyrrell) und in "Protein, Nucleic Acid und Enzyme", Bd 21, Nr. 4 (197&) Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo beschrieben ist, ist "Interferon" ein Ausdruck, der eine Substanz bezeichnet, die eine eiweißartige Substanz ist. und die intrazellulär oder extrazellulär in bzw. von lebenden Zellen induziert wird, wenn man die Zellen Interferonauslösern (inducers) aussetzt, wie z.B einem Virus, einem Bakterium, Protozoen, Rickettzien, einer Nukleinsäure, einem Endotoxin oder Polysaccharid, und die eine Aktivität aufweist, unspezifisch die Vermehrung verschiedener Viren in den Zellen zu hemmen.

Aufgrund der Aktivität sieht man Interferon als ein vielversprechendes Vorbeugungstnittel und therapeutisches Mittel bei Viruskrankheiten an, seit es aufgefunden wurde.

BADORIGItMAL 9 0 9832/0562 ,_/₂

TELEFON :CO8S»3 2 2 67 Ot . TELEGRAMME: BOEPATENT MÜNCHEN

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In letzter Zeit setzte man auf exe Verwertung von Interferon als Arzneimittel große Hoffnungen, weil man festgestellt hatte, daß es eine Antitumor-Aklivitut sowohl bei nicht durcli Virusbedingtem (nonviral) als auch bei Virustumor aufweist.

Weil Interferon artspezifisch ist, ist nur Interferon, das man aus lebenden menschlichen Zellen gewonnen hat, zur Vorbeugung und Therapie menschlicher Krankheiten wirksam.

Üblicherweise verwendete man Leukozyten als lebende menschliche Zellen zur Herstellung von Interferon. Leukozyten erhält man durch Abtrennung aus frischem Blut, aber ihre Erhaltung und ihr Nachschub in großer Menge und bei geringen Kosten sind außerordentlich schwierig.

Die Verwendung von lebenden Zellen, die man durch Einimpfen von etablierten menschlichen Zellen in Nährmedien und ihre Kultivierung in vitro erhalten hatte, wurde auch zur Herstellung von Interferon versucht. Die Methoden, in vitro sind jedoch im großen Maßstab und bei geringen Kosten undurchführbar, weil sie den Nachteil haben, daß sie eine große Menge menschliches Serum benötigen und eine unstabile Vermehrung, eine geringe Vermehrungsgeschwindigkeit und eine niedrige Zellkonzentration ergeben.

Daher wurde die technische Erzeugung von Interferon, das zur Vorbeugung und/oder Therapie menschlicher Krankheiten geeignet ist, bisher nicht verwirklicht.

Es wurden daher intensive Untersuchungen zur Entwicklung einer leicht anwendbaren technischen Erzeugungsmethode von Interferon und über die Möglichkeiten des Produktes bei der Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten unternommen, die auf Interferon ansprechen.

Erfindungsgemäß wurde folgendes festgestellt: Wenn ram statt etablierte menschliche Zellen in ein Kulturmedium in vitro einzuimpfen und darin zu kultivieren etablierte menschliche Zellen auf andere warmblütige Tiere transplantiert oder die Zellen in eine Diffusionskammer einimpft, die Zellen darin vermehrt, wäh-

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rend man die Tiere die Zellen Mit ihren nährenden Körperflüssigkeiten versorgen läßt, und in vivo oder in vitro die erhaltenen Zellen der Wirkung eines Interferonauslösers aussetzt, or/.ougL man leicht eine große Menge von Interferon. Erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, daß das Interferon, das erfindungsgemäß erhalten wurde, eine wirksame und überlegene Zubereitung zur Verhütung und Behandlung von Krankheiten ist, die auf Interferon ansprechen.

Im Vergleich zu üblichen Methoden, die man zur Vermehrung von Zellen in vitro anwendet, haben die erfindungsgemäßen Verfahren den Vorteil, daß sie kein oder viel weniger Nährmedium erfordern, das mit teurem menschlichem Serum ergänzt werden muß, daß die Vermehrung der etablierten Zellen leichter aufrecht erhalten werden kann, und daß man eine höhere Interferon-Aktivität erzielen kann. Insbesondere kann man etablierte menschliche Zellen leicht in den Körpern anderer warmblütiger Tiere vermehren, indem man entweder die Zellen in die Körper transplantiert, oder eine Diffusionskammer, die die Zellen enthält, einem Tier einimpft fozw.-6etZ"fc,d3i man auf übliche Weise füttert, während man das Tier die Zellen mit seiner nährenden Körperflüssigkeit versorgen läßt. Im Vergleich zu den üblichen Methoden in vitro weist die Erfindung ferner den zusätzlichen Vorteil auf, daß etablierte menschliche Zellen sich stabiler und rascher vermehren, und daß man eine größere Erzeugung von Zellen und eine höhere Ausbeute an Interferon pro Zelle erzielen kann.

Man kann beliebige etablierte menschliche Zellen verwenden, sofern sie sich leicht vermehren können, wenn man sie auf die Körper anderer warmblütiger Tiere transplantiert. Beispielsweise kann man etablierte normale menschliche Zellen, wie z.B. OUMS-20-Zellen, OUMS-25-Zellen, IIEF-Zellen, IIUF-2-Zellen oder WI-38-Zellen (beschrieben in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd₀ 20, Nr₀ 6, S_e 6l6 bis 6*13 (1975) von Kyoritsu Shuppan Co₀, Ltd_o , Tokyo) und etablierte Zellen, die man aus menschlichen Tumor= zellen gewonnen hat, wie Z₀B₀ Namalva·= Zellen (beschrieben in "Journal of Clinical Microbiology", Bd₀ I₉ S₀ Il6 bis 117 (1975)), BALL-I=Ze11en, TALL-l=ZelXen, NALL-I=Ze11en (beschrieben in

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"Nature", Dd. 267, S. 843 bis okk (1977) von Isao Miyoshi) und JIJL-Ze 11 en (beschrieben in "Cancer", Bd. 4O, Nr. 6 (1977) von Isao Miyoshi) erfinduiigsjveinäß verwenden.

Erfindungsgemäß kann man ein beliebiges warmblütiges Tier verwenden, wenn etablierte menschliche Zellen sich darin leicht vermehren können; beispielsweise Geflügel, z.B. Küken oder Tauben, oder Säugetiere, z.B. Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, llind, Pferd, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Hamster, gewöhnliche Maus und nackte Maus.

Weil die Tiere dazu neigen, unerwünschte Immunreaktionen zu bewirken, wenn man die etablierten menschlichen Zellen in sie transplantiert, bevorzugt man insbesondere Tiere in möglichst unausgewachs< nor Form, nämlich als Ei, Embryo, Fettis oder neugeborenes oder ,junges Tier, und nützt die Immunparalysis aus.

Vor der Transplantation der Zellen kann man das Tier vorbehandeln, und zwar entweder durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Gamma-Strahlen bei 200 bis 6OO rem, oder mit einem Antiserum oder einem immunsuppressiven Mittel, und die Immunreaktioneii unterdrücken.

Nackte Mäuse sind als warmblütiges Tier vorteilhaft, weil sie keine oder wenige Immunreaktionen bewirken, und weil man etablierte menschliche Zellen in sie ohne Vorbehandlungen transplantieren und in ihnen rasch vermehren kann.

Die Vermehrung etablierter menschlicher Zellen kann man ferner stabilisieren, indem man die Zellen ztierst in Hamster transplantiert und danach in nackte Mäuse transplantiert, wo man Interferon mit erhöhter Aktivität induziert.

In diesem Fall transplantiert man die vermehrten Zellen weiter von einem Körper eines warmblütigen Tiers auf den Körper eines weiteren Tiers der gleichen Art, Gattung, Klasse oder Ordnung, mit Ausnahme des Menschen» Etablierte menschlich© Zellen kann

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man auf einen beliebigen Teil eines Tierkörpers transplantieren, sofern sie sich leicht darin vermehren; beispielsweise intravenös, intraperitonal, subkutan oder in eine Allantoishöhluug.

Statt die etablierten menschlichen Zellen direkt in Tierkörpern zu vermehren, kann man etablierte menschliche Zellen in Diffusionskammern verschiedener Form und Größe einimpfen und darin vermehren, welche mit Filtermembranen (Poren mit ca. 10~■ bis 10~ m Durchmesser)versehen sind, beispielsweise Membranfiltern, Ultrafilternoder Ilohlf iebern (hollow fiber), und die Kammern an tierischen Körpern, beispielsweise intraperitonal anbringen, während man die Tiere die Zellen mit ihren nährenden Körperfliissigkeiten versorgen läßt.

Gegebenenfalls kann man etablierte menschliche Zellen in der Diffusionskammer vermehren, während man die nährende Körperflüssigkeit des warmblütigen Tiers in das und aus dem Nährmedium in der Kammer zirkulieren läßt und die Zellen mit der Nährflüssigkeit versorgen läßt. Wenn man also die Kammer an einem Tierkörper anbringt, kann man den Vermehrungszustand der Zellen durch die Kammerwand beobachten, und man kann die Anzahl der Zellen pro Tier weiter steigern, ohne unnötig die Tiere zu töten, indem man nacheinander die Kammer entfernt, die Zellen in eine weitere Kammer einimpft, welche frisches Nährmedium enthält, und indem man die letztere Kammer an den gleichen Tieren befestigt.

Die Methode der Diffusionskammer hat den zusätzlichen Vorteil, daß man beliebige warmblütige Tiere, mit Ausnahme des Menschen, zur Vermehrung der etablierten menschlichen Zellen verwenden kann, daß man keine Vorbehandlung zur Unterdrückung der Immunreaktionen benötigt, und daß man etablierte menschliche Zellen, die sich in der Kammer vermehrt haben, leicht ohne Verunreinigung durch tierische Zellen gewinnen kann, weil die menschlichen Zellen nicht direkt mit tierischen Zellen in Berührung treten, und keine Gefahr für unerwünschte Reaktionen besteht.

Nach der Transplantation der menschlichen Zellen füttert man das Tier auf übliche Weise ohne Spezialbehandlung.

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Der Vermehrungszeitraum etablierter Zellen beträgt üblicherweise 1 bis 20 Wochen, \ie\m man als transplantierte etablierte Zellen Zellen verwendet, die man aus menschlichen normalen oder Tuinorleukozyten gewonnen hat, ist die Geschwindigkeit der Zellvermehrung derart hoch, daß man die Vermehrung üblicherweise in einem Zeitraum von 1 bis 5 Wochen erzielen kann.

Die Anzahl der vermehrten menschlichen Zellen wurde gezählt und

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betrug etwa 10 bis 10 oder mehr pro Tier.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist demgemäß außerordentlich vorteilhaft zur Erzeugung von Interferon, weil die Anzahl der Zellen, die man auf das Tier transplantiert hat bzw. in es eingeimpft hat, um etwa das 10 - bis 10''-fache oder mehr durch das Verfahren ansteigt; das ist etwa das 10 - bis 10 -fache oder mehr ,jener Zahl, die man durch Einimpfen und Vermehren derselben Zellen im Nährmediuni in vitro erzielte.

In den vermehrten lebenden menschlichen Zellen kann man die Induktion auf eine beliebige Weise vornehmen und Interferon erzeugen. Wan kann den Teil des Tierkörpers selbst, wo man die Zellen vermehrte, einem Interferonauslöser aussetzen. Beispielsweise kann man Interferon erhalten, indem man direkt die intraperitonal vermehrten suspendierten menschlichen Zellen oder die subkutan gebildeten menschlichen Tumorzellen, einem Interferonauslöser aussetzt und Interferon induziert und das induzierte Interferon aus den so behandelten menschlichen Zellen sammelt und reinigt.

Interferon kann man ferner induzieren, indem man die vermehrten menschlichen Zellen aus den Tierkörpern gewinnt und die Zellen dem Interferonauslöser in vitro zusetzt. Beispielsweise kann man menschliche Zellen, die durch Sammeln suspendierter menschlicher Zellen erhalUm wurden, die iiiLraporitonal vermehrt; wurden, oder solche Zellen, die durch Zerteilen von isoliertem menschlichen massiven (massive) Tumor erhalten wurden, der sich subkutan in Tierkörpern bildete, in einem Mährmedium suspendieren, das man bei etwa 20 bis 40 ⁰C hält, und ein.e

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Konzentration von etwa 10 bi;· 10 Zellen/ml erhalten. Danach setzt man die Zellen dein Interferoriauslöser aus und induziert Interferon, sammelt das gebildete Interferon und reinigt es.

Wenn man menschliche Zellen in Diffusionskammern vermehrt, kann man die Zellen den Interferonauslösern in den Kammern aussetzen, oder nachdem man die Zellen aus den Kammern gewonnen hat.

Bei der Induktion von Interferon kann man die Erzeugung von Interferon durch bekannte Methoden weiter steigern, wie z.B. die Inkubationsmethode (priming method) unter Verwendung von Interferon oder die Superinduktionsmethode unter Verwendung eines Stoffwechselinhibitors.

Die Interferonproduktion pro Tier kann man ferner mit den nachstehenden Methoden steigern: (a) Man kann die Anzahl der lebenden Zellen pro Tier weiter steigern, ohne das Tier unnötig zu töten, indem man nacheinander die Kammer entfernt, die Zellen in eine andere Kammer einimpft, die frisches Nährmedium enthält, und die letztere Kammer an dem gleichen Tier anbringt, (b) Die menschlichen Zellen, die man in einem Tierkörper vermehrt hat, setzt man einem Interferonauslöser in vivo und/oder in vitro aus und induziert Interferon unter Verwendung der gleichen Zellen, einmal oder mehrmals.

Man kann einen beliebigen Interferonauslöser, z.B. ein Virus^ ein Bakterium, Protozoen, Rickettzien, eine Nukleinsäure, ein Endotoxin oder Polysaceiraricl nach freier Wahl verwenden.

Das gebild&te Interferon kann man leicht mit bekannten Reinigungsjiiethoden reinigen, J)ei-spiels weise duirch Aussalzen, Dialyse-, Filtrieren, Zentrifugieren, Einengen oder Lyophilisieren. Gegebenenfalls kann man die Zubereitung ides erhaltenen Interferons weiter auf bekannte Weise reinigen, z.B. durch Adsorption und Desorption mit einem Ionen-Austauscher, Gel-Filtration, AffinitätsChromatographie, Fraktionieren am isoelektrischen Punkt oder Elektrophorese»

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Die Interferon-Aktivität bestimmte man durch die Fleckenverminderungsmethode (plaque reduction method) mit FL-Zellen, die man aus menschlichem Ainnion gewonnen, hat, wie iu "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 20, Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975) von Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, beschrieben ist.

Dem Ilämagglutinintiter untersuchte man gemäß der Methode, die im "Journal of Immunology", Dd. ^9, S. 87 (19^4) (J.E. SaIk) beschrieben ist.

Die Erfindtmg bestraf ft-also ein Verfahren für «ine leicht anwendbare technische Erzeugung von Interferon und die Möglichkeiten der Produkte zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten, die auf Interferon ansprechen.

Statt etablierte menschliche Zellen in ein Kulturmedium in vitro einzuimpfen und darin zu kultivieren, transplantiert man erfindungsgemäß etablierte menschliche Zellen auf andere warmblütige Tiere oder impft die Zellen in eine Diffusionskammer ein, vermehrt die Zellen darin, während man die Tiere die Zellen mit ihren nährenden Körperflüssigkeiten versorgen läßt, setzt die erhaltenen. Zellen in vivo oder in vitro der Wirkung eines Interferonauslösers axis und erzeugt leicht eine große Men^e Interferon. Erfindungsgemäß ist ferner das Interferon, das man erfindungsgemäß erhalten hat, eine wirksame und überlegene Zubereitung zur Vorbeugung und -Behandlung von Krankheiten, i3ie auf Interferon ansprechen»

Nachstellend wird ^x e Erf indturg -durch -Beispiele naher -erläutert,-:

ErwcrcTisenen naclcteoa Mäusen "transplantiert« man subkutan te BALL-!-"/eilen *frjs Rensxshen und fütterte TdIc Tiere «uf Tihliche "Weise 3 Woclien Isia^ TEtwa 10 g massiven Tumor· pro nackte Maus, der sich subkutan KQ^ü-de* hatte, isolierte man, zerschnitt ihn fein, suspendierte ihn in einer Salzlösung, die Trypsin enthielt,

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trennte so den Tumor in Zellen auf und sammelte die Zellen durch Zentrifugieren. Die Zellen wusch man mit einem Medium mit Minimalkonzoiitrafcionen aller essentiellen Stoffe (Eagle ) mit einem pH— Wert von 7,2, einer Temperatur von 37 C und einem Gehalt von 5 VoI % menschlichem Serum, suspendierte sie wieder und erhielt eine Konzentration von etwa 5 x 10 Zellen/ml. Zu der erhaltenen Mischung gab man etwa 100 Einheiten/ml eines teilweise gereinigten menschlichen artspezifi&chen Interferons, inkubierte die Mischung etwa 2 h lang, gab danach- eine Menge von etwa 300 Hämagglutinintiter je ml Sendai-Virus zu, inkubierte weitere 20 h und induzierte Interferon. Die Lösung der inkubierten Mischung zentrifugierte man bei etwa 1.000 χ 9,8 ms" (1.000 χ g) bei etwa 4 C und entfernte den Niederschlag, z.B. Zellen JDie überstehende Flüssigkeit dialysxerte man gegen eine Pufferlösung (0,1 Mol/1) mit einem pH-Wert von 2,0 und einem Gehalt an Salzsäure und Kaliumchlorid bei k C kB h lang, dialysxerte danach gegen eine phosphatgepufferte Salzlösung (O,01 Mol/l) mit einem pH-Wert von 7,2 12 h lang und filtrierte sorgfältig bzw. vorsichtig durch Membranfiltration. Das Filtrat engte man ein und lyophilisierte man zu einem Interferonpulver mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug etwa 20.000.000 Einheiten pro nakte Maus.

Herstellungsbeispiel 2:

In erwachsene nackte Mäusen transplantierte man intraperitonal etablierte OUMS-20-Zellen des Menschen und fütterte die Tiere auf übliche Weise 5 Wochen lang. Den Mäusen spritzte man intraperitonal Newcastle-Disease-Virus ein, der ursprünglich einen Hämagglutinintiter von etwa 3·000 aufwies, aber vorher durch UV-Strahlung fast vollständig inaktiviert worden war, tötete die Tiere nach 2k h und gewann danach die aszitische- Flüssigkeit. Die Flüs-

— 2 sigkeit zentrifugierte man bei ca.1.000 χ 9» 8 ms (1.000 χ g) bei k C und entfernte den Niederschlag, z.B. Zellen.Die überstehende Flüssigkeit dialysxerte man gegen eine Pufferlösung (0,1 Mol/l) mit einem pH-Wert von 2,0 und einem Gehalt an Salzsäure und Kaliumchlorid bei 4 C 48 h lang, dialysxerte danach gegen eine phosphatgepufferte Salzlösung (0,01 Mol/l) mit einem pH-Wert von 7,2

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15 Ii lang und filtrierte sorgfältig durch Membranfiltration. Das Filtrat engte man ein und erhielt eine Interferonlösung mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug etwa 700.000 Einheiten/ 10 nackte Mäuse.

Herstellungsbeispiel 3:

Neubeboroiie Hamster, die eine intraperitonale Injektion von bekanntem Antilymphozytenserum von Kaninchen gegen Thyinossyten von Hamstern und eine subkutane Transplantation etablierter JBL-ZeI-len des Menschen erhalten hatten, fütterte man auf übliche Weise 4 Wochen lang.

Etwa 30 g massiven Tumor pro Hamster, der sich subkutan gebildet hatte, isolierte man lind trennte ihn wie im Iierstellungsbeispiel 1 auf. Die erhaltenen Zellen wusch man mit KPMI-l64O-Medium mit einem pH-Wert von 7,4, einer Temperatur von 37 C und einem Gehalt von 10 VoI % Kälberserum, suspendierte sie wieder und erhielt eine. Konzentration von etxva 2 χ 10 Zellen/ml» Zu der erhaltenen Mischunkslösung gab man 200 Einheiten/ml teilweise gereinigtes Interferon mit menschlicher Artspezifitat und inkubierte die Mischung etwa lh. Dazu gab man eine Menge von etwa 100 Hämagglutinintiter ,ie ml Sendai-Virus, inkubierte die erhaltene Mischung weitere l6 h lang und induzierte Interferon.

Danach reinigte man die erhaltene Lösung, engte sie wie im Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt eine Interferonlösung mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug etwa 15,000.000 Einheiten pro Hamster.

Iierstellungsbeispiel k%

Neugeborenen Ratten transplantierte man intravenös etablierte Namalva-Zellen des Menschen ein und fütterte die Tiere auf übliche V/eise k Wo el 1 en lang.

Etwa 50 g massiven Tumor pro Ratte, der sich subkutan gebildet hatte, isolierte man und trennte ihn wie im Herstellungsbeispiel

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1 auf.

Danach behandelte man die erhaltenen Zellen wie im Ilerstellimgsbeispiel 1 und induzierte Interferon. Die erhaltene Jn (. er f or onlösung reinigte man und lyophilisierte sie wie im Ilerstellungsbeispiel 1 zu einem Interferonpulver mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug ca. JO.000.000 Einheiten, pro Ratte.

Ilerstellungsbeispiel 5:

Erwachsene Mäuse unterwarf man einer Bestrahlung mit Röntgenstrahlen bei etwa 4θΟ rem und schwächte ihre Immunreaktionen; danach transplantierte man ihnen subkutan etablierte TALL-1-Zellen des Menschen ein und fütterte die Tiere auf übliche Weise 3 Wochen lang.

Etwa 10 g massiven Tumor, der sich subkutan pro Maus gebildet hatte, isolierte man und trennte ihn wie im Ilerstellungsbeispiel 1 nui*.

Die erhaltenen Zellen behandelte man wie im Herstellungsbeispiel 3 und induzierte Interferon. Die erhaltene Interferonlösung reinigte man und .engte -sie wie im Ilerstellungsheispiel 2 ein und erhielt eine Interferonlösung mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität -*>etrtig etwa 8.000.000 Einheiten pro Maus.

Herstellungsbeispiel f>:

Etablierte menschliche OUMS-25-Zellen transplantierte man subkutan Hamstern wie im Ilerstellungsbeispiel 3 für einen Zeitraum von 3 Wochen ein und transplantierte sie danach intraperitonal in 10 Tage alte nackte Mäxise» Die nackten Mäuse fütterte man auf übliche Weise 5 Wochen lang, betäubte sie und gewann die as zitische Flüssigkeit«, Die Flüssigkeit zentrifugierte man und gewann die vermehrten Zellen,, Die Zellen wusch man und ließ darin Interferon induzieren wie im Ilerstellungsbeispiel l_o Die erhaltene Inter·= feronlösung reinigte man und engte sie wie im Herstellungsbeispiel

2 ein und erhielt eine Interferonlösung von hoher Aktivität» Die Interferon-= Aktivität betrug etwa 2 „ 000_o 000 Einheiten pro nackte

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llerstellungsbeispiel 7s

Etablierte JBL-Zellen des Menschen suspendierte man in einer Salzlösung in zylindrischen Diffusionskammern aus Kunststoff mit einem Volumen von 10 ml, die mit einer Membran mit Poren von etwa 0,5 /um Durchmesser versehen waren. Die Kammern bettete man intraperitonal in erwachsene Ratten ein.

Die Ratten fütterte man auf übliche Weise 4 Wochen lang und entfernte die Kammern.

Dre I\onzentr€itxon der Zellen in den Kammern wurde festgestellt

9 3

und betrug etwa 5 x 10 Zellen/ml^ diese Menge war *twa 10 -mal höher als j-ene, die man in vitro in je in ein Nährmedium in einem GQ -Inkubator erhalten hat.te.

Dxe Zellen behandelte man wie im IJerstellungs±>eispiel 1 und induzierte Interferon. Die erlialtene Interferonlösung reinigte man, en.gte sie ein mnd lyophilipierte sie 2vu einem Interf eronpulver mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität "betrug etwa 3Ο.ΟΟΟ.Ό00 Einheiten pro Ratte.

8:

In die AllantoishohXnngen von befruchteten Tieißen Eiern, die man bei 37 C 5 d inkubi-ert hatte, transplantierte man NALL- 1-ZeT.len des Menschen und inkubierte die Eier bei 37 C 1 Woche tang.

Die Eier öffnete man und sammelte die vermehrten Zellen. Die Zellen behandelte man wie im llerstellungsbeispiel 1 und induzierte Interferon. Die erhaltene Interferonlösung reinigte man, engte sie wie im llerstellungsbeispiel 2 ein und erhielt eine Interferonlösung mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug etwa 'lOO.OOO Ei.nheiten/10 befrachtete weiße Eier«

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IIerstellungsbeispiel 9:

Das Interferonpulver, das man wie im llerstellungsbeispiel i erhalten hatte, reinigte man weiter durch die Methoden, die von G₀ Bodo, (Symposium on Preparation,, Standardization and Clinical Use of Interferon, "11th International Immunobiological Symposium", 8_ffl -5· 9« Juni 1977, Zagreb, Jugoslawien) beschrieben wurden, d.h. durch Adsorption und Desorption mit Ionen-Aus tauschen], Molekulargewichtsfraktionierung durch Gelfiltration, Einengen und sorgfältiges Filtrieren mit einem Membranfilter _o Die erhaltene Interferonlösung hatte eine Aktivität von 2 χ 10 Einheiten/mg Proteine Die Interferonausbsuta betrug etwa ho %_o

Das Interferon, das man gamäß den Herstellungsbeispielen 1 bis hergestellt hatte, kann man vorteilhaft als solches oder in Mischungen mit einer oder mehreren Substanzen für Injektionen und Arzneimittel 7axt äußeren und inneren Anwendung bei der Vor= beugung und Behandlung menschlicher Krankheiten verwenden, die auf Interferon, ansprechen«,

Versuch is

Behandlung von Viruskrankheiten rait Interferon (Test der Hemmung der Virusvermehrung in vitro) _a

Zu einzelligen Schichten von Lungenzellen menschlicher Embryonen, die man. durch Primärkultur .(primary culture) in Petri=Schalen von 6 cm Durchmesser gebildet hatte, gab man 0, 1, 10 bzw«, 100 Einheiten dss Interferons, das man gemäß der Methode von Her·» Stellungsbeispiel 9 erhalten hatte, und inkubierte die erhaltenen Mischungen in einem Inkubator (5 VoI % C0„) bei 3 7° C 20 h lang* Zu den Zellen gab man Varieella-Zoster-Virus oder menschlichen Cytomegalovirus in einer Mange, die etwa 100 Flecken bildete, wenn man kein Interferon zu den Zellen gab. Die Mischung inkubierts man und zählte die Anzahl der gebildeten Flecken_o

Die» Hsmeiwirktmg von Interferon auf die V ir us Vermehrung bestimmte man unter Anwendung der nachstehenden Gleichung?

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Verminderung der Fleckenzahl (%) = τ— x 100

worin A die Anzahl der Flecken ohne Interferonzugabe bedeutet, und B die Anzahl der Flecken bei Interferonzugabe bedeutet.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt»

Tabelle 1

Einheiten Varicella-Zoster-Virus menschliches Cytomegalovirus

0 0 % 0 %

1 12 % 5 % 10 53 % Sk %

100 91 % Μ %

Wie sich aus den Ergebnissen von Tabelle 1 ergibt, hemmt das Interferon gemäß der Erfindung die Vermehrung von krankheitsverursachenden Viren.

Man bemerkte keine Abnorraalität bei den kultivierten menschlichen Zellen, wenn man Interferon zu den Zellen zugab.

Versuch 2:

Behandlung von Krankheiten mit Interferon, die nicht durch Viren verursacht werden.

(I) Test der Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vitro:

Zu RPMI-l640-Medium, das man mit 15 Vol.-% fetalem Kälberserum ergänzt hatte, gab man Interferon, das man gemäß Herstellungsbeispiel 9 hergestellt hatte und erhielt Konzentrationen von 30, 300 bzw. 3.000 Einheiten/ml. Die erhaltenen Medien impfte man mit menschlichen Tumorzellen und erhielt eine Konzentration von

bei 37°C 5 d lang. Danach zählte man die Anzahl der Zellen pro

5 χ 10 Zellen/ml und inkubierte sie in Inkubatoren (5 VoI

nach zählte man

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ml Medium. Vergleichsiaedien, cie man wie oben mit der Ausnahme hergestellt hatte, daß man das Interferon durch Erwärmen bei 100 C 30 min. lang vorher inaktiviert hatte, inkubierte man auf gleiche Weise.

Den Hemmeffekt des Interferons auf die Ze11Vermehrung bestimmte man gemäß der nachstehenden Gleichung:

Hemmung der Zellvermehrung (%) = _{χ ±QQ}

(A-5xlO-^>)

■in A die Anzahl der Zellen im Vergleichsmedium und B die Anzahl der Zellen im mit Interferon behandelten Medium bedeuten.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Interferon-Konsentration Menschliche Tumorzellen

I 1 ι ι

( Einheitei/ml) j BALL-I TALL-I NALL-I j JBL

j 1

30 J +18 % +12 % +21 % +19 %

+57 % . +61 % +63 %

300 ! +57 % . +61 % +63 % ! +54 %

3 000 i +88 %

+82 % i +85 %

+91 %

Wie sich aus äen Ergebnissen von Tabelle 2 ergibt, hemmt Interferon außerordentlich stark die Vermehrung von Tumorzellen, wie z.B. DALL-I-Zellen, TALL-I-Zeilen, NALL-1-Zellen und JBL-Zellen, und das Interferon wirkt in einer Konzentration im Bereich von 30 bis 3.000 Einheiten/ml.

(II) Tests der Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vivQ·

Den Test führte man mit 8 nackten Mäusen aus, die etwa 2 Monate alt waren. TALL-I-Zellen (Tumorzellen), transplantierte man in einer Menge von 7_f5 x 10 Zellen pro nackte Maus subkutan in alle Mäuse,, Ab de_m dritten Tag nach der Transplantation erhielten k

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Mäuse intraperitonal 20 Dosierungen Interferon, das man gemäß ilerstellungsbeispiel 3 hergestellt hatte, wobei eine Dosierung 10.000 Einheiten pro nackte Maus betrug und 3 Dosierungen pro Woche gegeben wurden. Nach den Transplantationen fütterte man die Mäuse 48 d lang und tötete sie. Das Naßgewicht der in den Mäusen gebildeten Tumoren wog man. Die übrigen 4 Mäuse, die man als Verglexchstiere verwendete, fütterte und tötete man auf gleiche Weise, mit der Ausnahme, daß sie kein Interferon erhielten. Das Naßgewicht der gebildeten massiven Tumoren wog man.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

	Vergleich	g	mit Interferon-Dehandlung	6	g
	5,8	g		i-	g
2	8,8	g			g
3	4,3	g g	0	7	g g
4 ! Durchschnitts- Kewiclii;	7,5	J j ! """ °'

(III) Test der Hemmung der Vermehrung von Tumor zellen in vivo:

Den Test führte man mit 8 nackten Mäusen aus, die etwa 2 Monate alt waren«

JBL-Zellen (Tumorzellen) transplantierte man in einer Menge von IO Zellen pro nackte Maus subkutan in alle Mäuse. Ab der dritten Woche nach der Transplantation erhielten 4 Mäuse intraperitonal 8 Dosierungen des Interferons, das man gemäß der Methode von Herstellungsbeispiel 2 hergestellt hatte; eine Dosisbetrug 1.000Einheiten pro nackte Maus, und man gab 2 Dosierungen pro Woche. Nach der Transplantation fütterte man die Mäuse 42 d lang und tötete sie. Das Naßgewicht der gebildeten Tumoren wog man. Die übrigen 4 Mäuse, die als Vergleichstiere dienten, fütterte man und tötete man auf gleiche Weise, mit der Ausnahme, daß sie kein Interferon

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erhielten. Das Naßgewicht der gebildeten Tumoren wog man. Die Ergebnisse sind in Tabelle k gezeigt.

Tabelle ¹I

Vergleich mit Interferon-Behandlung

1	4	,5	g	0.	7	g
2	4	,9	g	1,	4	g
3	17	,1	g	0,	,9	g
4	20	,3	g	0.	,7	g
Durchschnitts gewicht	11	,7	g	- 0.	,9	g

Wie sich aus den Ergebnissen der Tabellen 3 und h ergibt, hemmt Interferon die Bildung von menschlichem massiven Tumor bei Mäusen, und selbst dann, wenn sich ein Tumor bildet, ist sein Gewicht viel geringer als jenes bei den Vergleichstieren. Isn Vergleich zu den Vergleichstieren hatten die mit Interferon behandelten nackten Mäuse einen stärkeren Appetit und waren körperlich aktiver»

Versuch 3:

Test auf akute Toxizität

Den Test auf akute Toxizität führte man mit Mäusen mit einem Alter von 20 Tagen aus, indem man intraperitonal die Interferonlösung einspritzte, die man wie im Herstellungsbeispiel 9 erhalten hatte. Die Ergebnisse zeigten eine extrem geringe Toxizität: LD δ 20,000.000 Einheiten/kg bei intraperitonal er In^ktdonin Mäuse.

V/ie sich aus den genannten Versuchen klar ergibt, sind die erwähnten Krankheiten, die auf Interferon ansprechen, jene, denen man mit dem Interferon gemäß der Erfindung vorbeugen, bzw« die man damit behandeln kann; d.h» Viruskrankheiten, wie z.B. epidemische Keratokonjunktivitis, Herpes-Keratitis, Gripp©, Röteln

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und Serum-Hepatitis, und Kranineiten, die nicht durch Viren verursacht werden, wie z.B. Leukämie und Osteosarkom.

Arzneimittel oder therapeutische Mittel gegen auf Interferon ansprechende Krankheiten mit einem Gehalt von Interferon kann man in verschiedenen Formen und Phasen entsprechend der schließlichen Anwendung herstellen, d.h. als flüssige Zubereitung, z.B. Nebel, Eigenwasser, Nasentropfen, Gurgelmittel und Injektionsmittel, pastöse Zubereitung, wie z.B. Salben,und feste Zubereitungen, wie z.B. Pulver, Granulat und Tabletten,

Die Zubereitungen sind zur Vorbeugung und Behandlung der auf Interferon ansprechenden Krankheiten ausreichend wirksam, wenn sie im allgemeinen 1 bi.s 10.000.000 Einheiten Interferon pro g enthalten· Gegehenenfalls kann man in die Zubereitungen einen oder mehrere Stoffe aus der aus therapeutischen Mitteln, Trtigerstoffen, Füllmitteln und Stabilisatoren bestehenden Gruppe einarbeiten.

Zubereitungsbeispiel 1:
Flüssige Zubereitung

Ein flüssige Zubereitung stellte man mit einer Salzlösung und dem Interferon her, das man wie im Ilerstellimgsbeispiel 1 erhalten hatte, und erhielt eine Interferon-Konzentration von 500 Einheiten/ml. Die Zubereitung war als Nebel, Augenwasser, Nasentropfen und Gurgelmittel zur Vorbeugung und Behandlung von Viruskraukheiten geeignet, insbesondere epidemischer Keratokon-,■junktivitis und Grippe.

Zubereitungsbeispiel 2;
Injektionslösung

Eine In.iektionslösung stellte man mit einer Salzlösung und dem Interferon her, das man wie im Ilerstellungsbaispiel 9 hergestellt

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hatte, und erhielt eine Interieronkonzentration von 100.000 Einheit en/nil.

Die Injektionslösung war zur Behandlung aller auf Interferon ansprechenden Krankheiten geeignet, wie z.B. Viruskrankheiten und Tumorkrankheiten.

Zuhereitungsbeispiel 3:
Iii.j ektionslösung

Eine Injektionslösung stellte man mit 5OO ml einer wässrigen Maltose-Lösung (10 % bezogen auf Gewicht/Volumen), 1.000.000 Einheiten des Interferons, das man gemäß Ilerstellungsbexspiel 5 hergestellt hatte,-und 10 mg Cyclophosphamid her. Die Injolctionslösunc; war zur Behandlung insbesondere von Tumorkrankheiten geeignet.

Zubereitungsbeispiel 41
Inj ektionslösung

Eine Injektionslösung stellte man mit 100 ml einer wässrigen Maltose-Lösung (10 % auf Basis von Gewicht/Volumen), 500_e000 Einheiten des Interferons, das man gemäß Herstelluugsbeispial 6 erhalten hatte, und 2 rag Mitomycin C her_o Die Injektionslösung war zur Behandlung insbesondere von Tuinorkraiikheiten geeignet,,

Zubereitungsbeispiel 5?

Eine Salbe stellte man auf übliche Weise her, indem man das Interferonpulver5 das man gemäß Ilerstellungsbexspiel k erhalten hatte, mit Vaseline und. flüssigem Paraffin mischte und erhielt eine Interferonaktivität von 10_o000 Einheiten/g„ Die Zubereitung war zur Behandlung von Virus-Hautkrankheiten geeignet»

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Zubereitungsbeispiel G:
Table t ten

Tabletten stellte man auf übliche Weise her, indem man eine Mischung aus Interferonpulver , das man gemäß tier Stellungsbeispiel 7 hergestellt hatte, Stärke und Maltose tablettierte und erhielt eine Interferonaktivität von 1.000 Einheiten/Tablette (100 mg). Die Tabletten waren zur Vorbeugung und Behandlung von Viruskrankheiten des Verdamingssystems geeignet.

Zubereitungsbeispiel 7*
Flüssige Zubereitung

Eine flüssige /,uhereituiift' /,ur oralen Verabreichung stellte mau mit IO ml einer wässrigen Maltose-Lösung (10 % auf Basis von Gewicht/Volumen), 200.000 Einheiten des Interferons, das man gemäß Ilerstellungsbeispiel 8 erhalten hatte, und 5 <"g Methotrexat her. Die Zubereitung war zur Behandlung insbesondere von Tumorltrankheilen geeignet.

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Claims

Π & A - P 050 179 Patentansprüche

1. Interferon, hergestellt durch Transplantation etablierter
menschlicher Zellen auf den Körper eines anderen warmblütigen Tiers oder Einimpfen der Zellen in eine Diffusionskamraer,
Vermehrung der Zellen, während man das Tier die Zellen mit
seiner nährenden Körporflüssigkeit "versorgen läßt,
Aussetzen der erhaltenen Zellen in vivo oder in vitro der
Wirkung eines Interferonauslösers und Induktion des Interferons, Sammeln und Reinigung des Interferons.

2. Interferon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die etablierten Zellen Leukozyten sind.

3. Interferon nach Ausspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die etablierten Zellen Naiiialva-Zellen, TALL-I-Zellen, DALL-1-Zellen, NALL-1-Zellen oder JBL-Zellen sind.

k. Interferon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekemazeichnet, daß das warmblütige Tier ein Säugetier ist.

5. Interferon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusionskaminer Poren von etwa 10
bis 10 m Durchmesser Jiat.

6. Interferon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich die menschlichen Zellen 1 bis 20
Wochen vermehrt wojrd-ßn -sind-.

7. Interferon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

"daß axe erhaltenen Zellen <ler Wirkung eine^s sers in 'einer Konzentr
10 Zellen/ml "aits^oset7.t worden sind-

Interferon«uslosers in 'einer Konzentration von etwa lö bis

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8. Intorferon nach einem der -vorhergehenden Ansprüche, dadurch

daß die erhaltenen Zellen der Wirkung des Iuterferonauslosers bei etwa 20 bis 'lO C ausgesetzt worden

9. Zubereitung zur Vorbeugung und Behandlung von auf Interferon ansprechende Krankheiten, enthaltend Interferon gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.

10. Zubereitungen nach Anspruch 9, mit eineai Gehalt von 1 bis 10.000.000 Einheiten Interferon/g.

11. Zubereitungen nach Anspruch 9 oder 10, zur Vorbeugung oder Behandlung von Viruslcrankheiten oder Tumorkrankheiten, enthaltend Interferon gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.

12. Zubereitungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form von flüssigen Zubereitungen, Injektionslösungen, Salben oder Tabletten vorliegen.

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