JP2002201141A

JP2002201141A - 蛋白質合成抑制遺伝子の発現増強剤

Info

Publication number: JP2002201141A
Application number: JP2001116710A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Yanai; 嘉明柳井; Tsukasa Sano; 吏佐能; Masashi Kurimoto; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-04-16
Publication date: 2002-07-16
Also published as: US20030039629A1; WO2002036153A1; CA2395324A1; KR100830268B1; US7189389B2; TWI283582B; US6773701B2; EP1329223A4; US20040197307A1; EP1329223A1; KR20020065620A

Abstract

(57)【要約】【課題】蛋白質合成抑制遺伝子の発現を顕著に増強す
るヒトインターフェロンαにおけるサブタイプの組合わ
せを特定し、斯かる組合わせのサブタイプを有効成分と
して含む該遺伝子の発現増強剤とその用途を提供する。【解決手段】有効成分としてヒトインターフェロンα
におけるサブタイプα２及びサブタイプα８を含む蛋白
質合成抑制遺伝子の発現増強剤と、当該増強剤の医薬品
を含む用途を提供することにより解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質合成抑制遺
伝子の新規な発現増強剤、詳細には、ヒトインターフェ
ロンαにおけるサブタイプα２及びサブタイプα８（以
下、インターフェロンを「ＩＦＮ」、インターフェロン
αを「ＩＦＮ−α」、ヒトインターフェロンαにおける
サブタイプα２及びサブタイプα８を、それぞれ「ＩＦ
Ｎ−α２」及び「ＩＦＮ−α８」と略記する。）を有効
成分として含んでなる、蛋白質合成抑制遺伝子の発現増
強剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＦＮは、脊椎動物細胞がウイルス感染
や抗原刺激等の外部からの刺激を受けた際に細胞外に分
泌する、抗ウイルス活性を有する一群の蛋白質に与えら
れた総称であり、その抗原特異性に基づいてＩＦＮ−
α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γの３種のタイプに大別され
ている。ＩＦＮは、抗ウイルス活性のほか、細胞増殖抑
制活性、抗腫瘍活性など多様な生理活性を有することが
知られている。ＩＦＮに対する受容体についても単離・
同定が進み、例えば、ロビン・カラードら、『ザ・サイ
トカイン・ファクツ・ブック』（１９９４年、アカデミ
ック・プレス社発行）、１４８乃至１６２頁に記載され
ているように、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βは共通の受容
体を共有する一方、ＩＦＮ−γに対してはこれとは異な
る受容体が存在することが知られている。他のサイトカ
インの場合と同様に、ＩＦＮによる生理活性の発現は、
ＩＦＮによる感受性細胞の刺激、すなわち、細胞表面に
発現されたＩＦＮ受容体に対するＩＦＮの結合に端を発
し、これに引き続いて細胞内情報伝達系が作動し、その
情報に応答して、細胞内で特定の遺伝子発現が起こるな
ど、細胞が諸種の変化を起こすことによって達成され
る。この細胞内情報伝達系に関わる分子の単離・同定も
近年急速に進んでいる。

【０００３】ＩＦＮによる細胞の刺激に応答して発現が
誘導される遺伝子には種々のものがある。例えば、アン
ガス・トムソン編、『ザ・サイトカイン・ハンドブック
第３版』（１９９８年、アカデミック・プレス社発
行）、第１８章、表２には、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β
の刺激により発現が誘導される遺伝子の産物（蛋白質）
として、２′，５′−オリゴアデニル酸合成酵素（以
下、「２′，５′−オリゴアデニル酸」を「２−５Ａ」
と略記する。）、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナー
ゼ（以下、「ＰＫＲ」と略記する。）、Ｍｘ蛋白質、ク
ラスＩならびにクラスＩＩのＭＨＣ分子、β−２ミクロ
グロブリン、グアニル酸結合蛋白質、メタロチオネイン
などが挙げられている。これらは多くの場合ＩＦＮ−γ
によっても誘導される。ＩＦＮにより誘導されるこれら
の遺伝子産物のうち、蛋白質合成を抑制する酵素である
２−５Ａ合成酵素とＰＫＲや、Ｍｘ蛋白質は、細胞の腫
瘍化や細胞へのウイルス感染などの異常が発生した細胞
において斯かる異常を抑える直接的な役割を果たす。一
方、ＭＨＣ分子やβ−２ミクログロブリンは、生体にお
ける免疫系の機能に関連する蛋白質であり、生体の免疫
系の作動を介して腫瘍やウイルスを生体から除去するこ
とに間接的に関与する。また、グアニル酸結合蛋白質や
メタロチオネインについては、ＩＦＮによる生理活性の
発現との関連は現在のところ詳細には解明されていな
い。

【０００４】ＩＦＮは、発見当初は「夢の新薬」と称さ
れるなど、医薬として大きな期待がかけられてきた。し
かしながらその期待に反して、ある種の疾患に対しては
期待されていたほどの治療効果は得られていない。その
ひとつの原因としては、ＩＦＮは個々のタイプやサブタ
イプごとに、それを作用させる条件、例えば、対象とす
る細胞、その細胞に感染しているウイルスの種類や、用
いるＩＦＮの組合わせなどによって発揮される作用の種
類や強弱に特性があるのに対して、個々の状況で目的と
する作用を十分に発揮させる最適な条件が完全には解明
されていないことにあると考えられる。

【０００５】ＩＦＮ−α、β、γ間での遺伝子の発現増
強作用の比較に関しては、例えば、ピー・エル・トリオ
ッツィら、『ジャーナル・オブ・バイオロジカル・レス
ポンス・モディファイアーズ』、第５巻、第６号、５６
２乃至５７０頁（１９８６年）や、イー・エム・コッシ
アら、『ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサー
チ』、第８巻、第１号、１１３乃至１２７頁（１９８８
年）などに見られるように、ＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−α
並びにＩＦＮ−βに比べて２−５Ａ合成酵素遺伝子やＰ
ＫＲ遺伝子の発現誘導能が劣ることを示す報告例があ
る。これに対して、ＩＦＮ−αには、ＩＦＮ−βやＩＦ
Ｎ−γとは異なり、少なくとも十数種以上のサブタイプ
が存在するところ、ＩＦＮによる遺伝子の発現の誘導作
用を顕著に発揮させるためのＩＦＮ−αの作用条件、特
に、そのためのＩＦＮ−αにおけるサブタイプの組合わ
せの最適化を目指した研究例は現在のところ一切見られ
ない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような状況下、本
発明者等は、ＩＦＮにより発現が誘導される蛋白質合成
抑制遺伝子の産物が、ＩＦＮによるある種の作用の発揮
に直接的に関与すること、ならびに、該遺伝子の発現誘
導におけるＩＦＮ−αのサブタイプの組合わせの最適化
を目指した研究が未だ為されていないことに着目し、該
遺伝子の発現を顕著に増強するＩＦＮ−αにおけるサブ
タイプの組合わせ見出すことができれば、ＩＦＮの医薬
としてのさらなる有効利用が達成できると考えた。

【０００７】すなわち、本発明の課題は、蛋白質合成抑
制遺伝子の発現を顕著に増強するＩＦＮ−αにおけるサ
ブタイプの組合わせを特定し、斯かる組合わせのサブタ
イプを有効成分として含む遺伝子の発現増強剤とその用
途を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明者等は、ヒトＩＦＮ−αにおける諸種のサブ
タイプの単離標品を用いて、個々の標品が細胞に対して
示す作用を、それぞれ単独の場合と、適宜組み合わせた
場合とで広く調べ、その結果を相互に比較した。その結
果、ヒトＩＦＮ−αにおけるサブタイプであるＩＦＮ−
α２及びＩＦＮ−α８を組み合わせて細胞に作用させる
と、その細胞内において２−５Ａ合成酵素遺伝子などの
蛋白質合成抑制遺伝子の発現量が相乗的に高まるという
全く新規な現象を見出した。そして、この現象は、２−
５Ａ合成酵素が直接的に関与するとされる抗ウイルス活
性を指標として調べた際にも相乗作用として確認される
という事実によって裏づけられた。本発明は、本発明者
等によるこれらの全く新規な発見に基づくものである。

【０００９】すなわち、本発明は、ヒトＩＦＮ−αにお
けるサブタイプであるＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８を
有効成分として含んでなる蛋白質合成抑制遺伝子の発現
増強剤と、当該増強剤の医薬品をはじめとする用途を提
供することにより上記の課題を解決するものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、ヒトＩＦＮ−αにおけ
るサブタイプ（以下、ヒトＩＦＮ−αにおけるサブタイ
プを単に「サブタイプ」という場合がある、）であるＩ
ＦＮ−α２とＩＦＮ−α８とを有効成分として含んでな
る、蛋白質合成抑制遺伝子の発現増強剤（以下、「本発
明の発現増強剤」又は「当該増強剤」という場合があ
る。）に関するものである。本発明でいうＩＦＮ−α２
及びＩＦＮ−α８は、アモス・ベイローク（Ａｍｏｓ
Ｂａｉｒｏｃｈ、スイス国）による蛋白質データベース
『スイスプロット』にアクセスコード『Ｐ０１５６３』
及び『Ｐ３２８８１』を付して収録されている、両サブ
タイプのアミノ酸配列（いずれもＮ末端部のシグナル配
列を含む。それぞれ、本願明細書における配列表に配列
番号１及び２を付して示している。）と実質的に同等の
配列を有し、下記に詳述するような適宜の測定系におい
て抗ウイルス活性が確認される蛋白質を意味するもので
あり、その高次構造やアミノ酸配列以外の糖鎖などの構
造は問わない。ここでいう「実質的に同等の配列」と
は、用いるサブタイプのアミノ酸配列が、ヒトＩＦＮ−
αに分類されるものであって、公知のＩＦＮ−αにおけ
るサブタイプのアミノ酸配列と比較したとき、配列表に
おける配列番号１又は２のアミノ酸配列と最も高い相同
性を示すことを意味する。公知のヒトＩＦＮ−αにおけ
るサブタイプのアミノ酸配列は、例えば、ジー・アレン
ら、『ジャーナル・オブ・インターフェロン・アンド・
サイトカイン・リサーチ』、第１６巻、１８１乃至１８
４頁（１９９６年）に、個々のアミノ酸配列を報告して
いる原報を示しつつ纏められている。因みに、ジー・ア
レンらによるこの文献には、ＩＦＮ−α２には、配列表
における配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質とと
もに、このアミノ酸配列とは１箇所アミノ酸が異なる配
列を有する他の２種類の蛋白質が含まれ、また、ＩＦＮ
−α８には、配列表における配列番号２のアミノ酸配列
を有する蛋白質とともに、このアミノ酸配列とは４又は
６箇所アミノ酸が異なる配列を有する他の２種類の蛋白
質が含まれることが示されている。本発明でいうＩＦＮ
−α２ならびにＩＦＮ−α８も配列番号１又は２に示す
アミノ酸配列に限定されるものではなく、配列表におけ
る配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、通
常、１０箇所以下、望ましくは、８箇所以下、より望ま
しくは、６箇所以下でアミノ酸が異なるアミノ酸配列を
有する場合がある。

【００１１】本発明で用いるサブタイプは、上記のとお
り定義されるＩＦＮ−α２ならびにＩＦＮ−α８である
限り、給源や調製方法は問わない。例えば、ヒト細胞か
ら得られる天然型のサブタイプや、ヒト細胞を含む脊椎
動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、大腸菌や枯草菌
などの原核細胞及び酵母や黴などの真核細胞を含む微生
物のいずれかを宿主として慣用の遺伝子工学的手法によ
り産生された組換え型のサブタイプなどが有用であるほ
か、所期の活性を維持している限り、ＩＦＮ−α２及び
／又はＩＦＮ−α８として、ポリペプチド鎖に共有結合
している水溶性高分子（後述）を有する天然物ならびに
人為的な調製物としてのサブタイプ（以下、「水溶性高
分子による修飾物」という場合がある。）なども有利に
利用できる。なお、水溶性高分子による修飾物としての
サブタイプは、例えば、本来的に水溶性高分子を有して
いる天然型のサブタイプであっても、また、予め調製さ
れた天然型もしくは組換え型のサブタイプに人為的に水
溶性高分子を共有結合させて得られるものであっても、
所期の活性を維持している限り、いずれも有利に利用で
きるけれども、後述するような人為的な手法により得ら
れる水溶性高分子による修飾物としてのサブタイプは、
当該増強剤を医薬用途に利用する場合、適用患者に投与
されたとき、その生体内での安定性の高さの点で比較的
優れているという特徴がある。また、天然型のサブタイ
プを用いると、適用患者に対する抗原性の低さなどの点
で有利な場合がある。一方、組換え型のサブタイプは比
較的低コストで調製ないしは入手できるという利点があ
る。したがって、本発明の実施においては、以上のよう
なそれぞれの種類のサブタイプの性質を勘案して、状況
に応じて、利用目的に合致するものを選択して利用する
ことができる。

【００１２】本発明で用いるサブタイプがＩＦＮ−α２
又はＩＦＮ−α８であることの確認は、目的とするサブ
タイプを常法にしたがって解読して得られる部分アミノ
酸配列か、あるいは、該サブタイプの給源から対応する
ｃＤＮＡを単離し、その塩基配列の解読結果から推測さ
れるアミノ酸配列と、配列表における配列番号１又は２
のアミノ酸配列の該当部との同一性を調べることにより
行うことができる。

【００１３】ＩＦＮ−α活性（力価、タイター）は通
常、抗ウイルス活性に基づいて、ＩＦＮ−αの国際標準
試料との比較により国際単位（以下、「ＩＵ」と記載す
る場合がある。）として表示される。ヒトＩＦＮ−αの
国際標準試料は、米国国立衛生研究所よりコード番号
『Ｇａ２３−９０１−５３２』を付して１アンプル当り
２５，０００ＩＵ封入した状態で提供されている。抗ウ
イルス活性は種々の方法により確認することができる。
例えば、ジェイ・イマニシら、『ビケン・ジャーナ
ル』、第２４巻、１０８乃至１０９頁（１９８１年）に
記載された色素取り込み法を利用すれば、ウイルスが細
胞にもたらす細胞変性効果（サイトパシック・エフェク
ト。以下、「ＣＰＥ」と略記する場合がある。）に対し
てＩＦＮ−αが示す抑制活性として抗ウイルス活性を定
量的に確認することができる。本明細書を通してＩＦＮ
−α活性は、本法にしたがって、ウイルスとしてシンド
ビスウイルスを、細胞としてヒト羊膜由来の樹立細胞株
であるＦＬ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−６２）を用いて測
定されるＩＵで表示している。その原理を述べると、先
ず、ＦＬ細胞に対するシンドビスウイルスのＣＰＥを５
０％阻害する上記国際標準試料の濃度Ｘ（ＩＵ／ｍｌ）
を求め、次に、これと同じ条件下で、被験試料（目的と
するＩＦＮ−αを含む試料）がＣＰＥを５０％阻害する
濃度Ｙ（ｍｇ／ｍｌ）を求め、得られた結果に基づい
て、被験試料１ｍｇ当りの活性Ｚ（ＩＵ／ｍｇ）を、数
式Ｚ＝Ｘ／Ｙにより算出する。また、この方法にしたが
って求められる活性と蛋白質定量の結果を組み合わせれ
ば、比活性（ＩＵ／ｍｇ蛋白質）が求められる。

【００１４】本発明でいう蛋白質合成抑制遺伝子とは、
細胞における蛋白質合成の過程、すなわち、ＤＮＡから
のｍＲＮＡへの転写又はｍＲＮＡからの蛋白質の翻訳の
いずれかの工程に属する細胞内での反応を抑制ないしは
阻害する機能を有する蛋白質をコードする遺伝子であっ
て、通常、ＩＦＮの刺激によりその発現が誘導されるも
のを意味する。ここでいう転写の工程は、ＤＮＡから一
次転写産物ＲＮＡの生成、ＲＮＡのスプライシング、Ｒ
ＮＡへのキャップ構造又はポリアデニル酸の付加等の、
鋳型ＤＮＡに対応した配列の機能的なｍＲＮＡを生成す
る全ての細胞内反応を含む。また、上記でいう翻訳の工
程は、ｍＲＮＡへのリボゾームの結合を契機とする、い
わゆる「蛋白質の生合成の開始」、ｍＲＮＡ上の遺伝暗
号にしたがってアミノ酸を連結する、いわゆる「ポリペ
プチド鎖の伸長」、ｍＲＮＡ上の終始コドンにおける、
いわゆる「蛋白質の生合成の終結」等の、ｍＲＮＡに対
応した配列のポリペプチドを生成する全ての細胞内反応
を含む。本発明の対象となる蛋白質合成抑制遺伝子の具
体例としては、例えば、２−５Ａ合成酵素遺伝子やＰＫ
Ｒ遺伝子が挙げられる。斯かる遺伝子の産物である２−
５Ａ合成酵素は、ＡＴＰを基質として細胞内で２−５Ａ
を生成し、２−５Ａは細胞内に不活性型として存在する
リボヌクレアーゼＬを活性型に変換し、活性型のリボヌ
クレアーゼＬがＲＮＡを分解することにより蛋白質の合
成を阻害する。一方、ＰＫＲは、上記でいう蛋白質の生
合成の開始に関わる因子であるｅＩＦ−２のαサブユニ
ットを二本鎖ＲＮＡ依存的にリン酸化して不活性化する
ことにより蛋白質の合成を阻害する。

【００１５】本発明でいう、「ＩＦＮの刺激による遺伝
子発現の誘導」とは、ＩＦＮによる細胞の刺激に応答し
てその細胞内の遺伝子の発現のレベルが、遺伝子の転写
量及び／又はｍＲＮＡの翻訳量の上昇として確認される
ことを意味する。遺伝子の種類や該遺伝子を有する細胞
の種類にもよるけれども、本発明が対象とする蛋白質合
成抑制遺伝子は、ＩＦＮの刺激によって、その発現レベ
ルが、通常、１．５倍以上、好適な場合には、２倍以
上、さらに好適な場合には、２．５倍以上に上昇する。
遺伝子の発現レベルを転写量で比較するには、例えば、
通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲやノーザン・ブロッティング
などを利用すればよい。因みに上記例の遺伝子の塩基配
列は、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロ
ジー・インフォメーション（米国）による核酸データベ
ース『ジェンバンク』に、それぞれ下記表１に示すアク
セスコードを付して登録されているので、この情報に基
づいて調製したプライマーやプローブを用いてこれらの
方法を実施すれば、目的とする遺伝子の転写量を感度よ
く、定量的に検出することができる。一方、遺伝子の発
現レベルを翻訳量で比較するには、その遺伝子の発現産
物である蛋白質を特異的に定量する方法を利用すればよ
く、例えば、対象とする遺伝子の発現産物に対する特異
抗体が入手可能な場合には免疫学的手法（イムノアッセ
イ等）により、対象とする遺伝子の発現産物が酵素活性
を有する場合には所定の酵素活性測定法により、また、
対象とする遺伝子の発現産物が生理活性を有する場合に
は所定のバイオアッセイにより定量的に検出することが
できる。

【００１６】

【表１】

【００１７】本発明の発現増強剤はＩＦＮ−α２及びＩ
ＦＮ−α８を有効成分として含み、それぞれのサブタイ
プが単独で示す蛋白質合成抑制遺伝子に対する発現誘導
作用の和、あるいは、斯かる和と想定される作用を明ら
かに上回る作用、すなわち、蛋白質合成抑制遺伝子の発
現誘導において相乗作用を発揮することを特徴とする。
この相乗作用は、上述のようにして求められる転写量や
翻訳量に基づいて確認することができる。また、本発明
でいう蛋白質合成抑制遺伝子の発現産物は、通常、ＩＦ
Ｎ−αが感受性細胞に対して示す生理活性の主要な機能
分子であることから、当該増強剤による相乗作用は、当
該増強剤をそれに対する感受性細胞に作用させた際の該
感受性細胞におけるＩＦＮ−αの生理活性の発現、例え
ば、抗ウイルス活性、細胞増殖抑制活性、アポトーシス
誘導活性などの発現における相乗作用としても確認する
ことが可能である。例えば、アポトーシス誘導活性は、
肝臓癌細胞などの癌細胞に当該増強剤を作用させ、アポ
トーシスに特徴的な現象である細胞内ＤＮＡの断片化
や、Ｆａｓなどのアポトーシス関連分子の発現を定量的
に観察する慣用の方法によって確認することもできる。
また、当該増強剤は、ＩＦＮ−γによる蛋白質合成抑制
遺伝子の発現誘導作用をも、相乗的に、顕著に増強する
ことから、ＩＦＮ−γによる該遺伝子の発現誘導作用の
増強剤としても利用することができる。

【００１８】上記のようにして確認される当該増強剤に
よる相乗作用を、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８それぞれ
単独による発現誘導作用の和若しくは斯かる和と想定さ
れる値を数値１として示すと、当該増強剤は、通常、
１．２以上、好適な場合には、１．５以上で示される発
現誘導作用を発揮する。また、この相乗作用は、例え
ば、ティー・シー・チョウ、『シナジズム・アンド・ア
ンタゴニズム・イン・ケモセラピー』（１９９１年、ア
カデミックプレス社発行）、６１乃至１０２頁に記載さ
れた多変量解析により確認することができる。この方法
によれば、下記表２に示すように、異なる２種の薬剤に
よる相乗作用の有無ならびに強弱をコンビネーション・
インデックス（ＣＩ）として数値化して評価することが
できる。この方法によるとき、当該増強剤のＣＩは、対
象とする遺伝子にもよるけれども、通常、０．９未満、
好適な場合には、０．８５未満を示す。

【００１９】

【表２】

【００２０】本発明の発現増強剤におけるＩＦＮ−α２
とＩＦＮ−α８との活性比は、蛋白質合成抑制遺伝子の
少なくとも１個に対して斯かる相乗作用を発揮する限り
特に制限はない。対象とする遺伝子の種類や細胞の種類
にもよるけれども、両者の活性比を国際単位換算で１：
０．２５以上１．５未満とするときには、所期の相乗作
用を特に顕著に発揮する特徴がある。因みに、所期の相
乗作用を顕著に発揮させるための本発明の発現増強剤に
おけるＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８との好ましい存在
比を、両者の重量比として表すと、用いるサブタイプの
精製度や調製方法などにもよるけれども、通常、１：
０．０５以上０．５未満、望ましくは、１：０．０６以
上０．４未満である。なお、本発明でいうサブタイプの
重量とは、目的とするサブタイプを、それが単離された
状態で、糖鎖を実質的に含まない単純蛋白質を標準試料
を対照とし、ローリー法や紫外吸収法などの慣用の蛋白
質定量法に供して求められる重量（ポリペプチド鎖部分
に相当する重量）を意味する。

【００２１】本発明の発現増強剤においては、ＩＦＮ−
α２とＩＦＮ−α８とによる相乗作用を消失しない範囲
で、これら以外のサブタイプを含有せしめることもでき
る。例えば、ＩＦＮ−α１やＩＦＮ−α７などは、その
含有量が比較的低い場合には、通常、ＩＦＮ−α２とＩ
ＦＮ−α８とによる相乗作用に影響を与えないので、当
該増強剤に含有せしめることができる。対象とする遺伝
子の種類や細胞の種類によるけれども、ＩＦＮ−αの総
量に対する、ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８の合計量の
百分率が、国際単位換算で、通常、９０％以上、望まし
くは、９５％以上、さらに望ましくは、９８％以上であ
る当該増強剤は、ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８以外に
含まれるサブタイプの種類によらず、遺伝子発現の誘導
において比較的顕著な相乗作用を発揮する特徴がある。

【００２２】本発明の発現増強剤におけるＩＦＮ−α２
とＩＦＮ−α８との活性比ならびに、ＩＦＮ−αの総量
に対するＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８の和の百分率
は、以下のように求めることができる。すなわち、先
ず、当該増強剤を、抗ヒトＩＦＮ−α抗体カラムなどを
利用して、含有する蛋白質が実質的にＩＦＮ−αにおけ
るサブタイプのみからなる状態にまで精製する。次にこ
の精製標品を、イオン交換クロマトグラフィーや逆相ク
ロマトグラフィーなどのＩＦＮ−αにおけるサブタイプ
を分離する慣用の方法に供して分画し、個々のサブタイ
プごとに単離する。必要に応じて、Ｎ末端アミノ酸配列
分析などにより、単離されたサブタイプがヒトＩＦＮ−
αにおけるいずれのサブタイプであるかを確認する。そ
して、本発明で定める方法にしたがって、単離された個
々のサブタイプの比活性（ＩＵ／ｍｇ蛋白質）を求め
る。これとは別途、上記のＩＦＮ−α精製標品を、ＩＦ
Ｎ−αにおけるサブタイプごとに分離する高速液体クロ
マトグラフィー等により分析し、その結果得られるクロ
マトグラムにおけるピーク面積比に基づいて、全ＩＦＮ
−α量に対するＩＦＮ−α２ならびにＩＦＮ−α８の存
在比（重量比）を求める。以上の結果得られるＩＦＮ−
α２及びＩＦＮ−α８の比活性と存在比を用いれば、目
的とする活性比を国際単位換算で算出することができ
る。

【００２３】本発明の発現増強剤は、種々の方法により
調製することができる。天然型のＩＦＮ−α２ならびに
ＩＦＮ−α８は、ヒト細胞にＩＦＮ−αを産生せしめ、
その産生物からＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８とを採取
し、この採取物を用いて当該増強剤は調製することがで
きる。ここで用いるヒト細胞は、ＩＦＮ−α２及びＩＦ
Ｎ−α８のいずれか又は両方を適宜の誘導剤による刺激
によって産生する細胞であればよく、その産生能に応じ
て２種以上の細胞を適宜組み合わせて利用することもで
きる。具体的には、ヒト生体から単離されたリンパ球、
単球などの白血球や、マクロファージのほか、ヒトリン
パ芽球様細胞などのヒト起源の樹立細胞株などが挙げら
れる。エス・ヒラキら、『ジャーナル・オブ・ナショナ
ル・キャンサー・インスティテュート』、第５９巻、９
３頁（１９７７年）に記載された、ヒトリンパ芽球様細
胞の一種であるＢＡＬＬ−１細胞は両サブタイプを良好
に産生するので本発明の実施に特に有用である。ヒト細
胞にＩＦＮ−αを産生せしめるには、先ず、該細胞を生
体外で又はヒト以外の温血動物の生体内で増殖させる。
生体外での増殖は培養器やファーメンターなどを用い
る、動物細胞の培養のための慣用の方法によればよく、
また、生体内での培養は、例えば、特公昭５６−５４１
５８号公報に記載された方法にしたがって、ハムスタ
ー、正常マウス、ヌードマウス、ラット、モルモット、
ウサギ、ウマ、ブタ、ヤギ、サル、ネコ、イヌなどの哺
乳類や、ニワトリ、ハトなどの鳥類の生体を利用する慣
用の方法によればよい。そして、生体外又は生体内での
細胞の増殖の途中またはその前後の適宜の時期に該細胞
にＩＦＮ誘導剤を作用させることによってＩＦＮ−αを
産生せしめることができる。ＩＦＮ誘導剤としては、例
えば、ウイルス、二本鎖ＲＮＡ、細菌、エンドトキシン
のほか、ＩＦＮ−α自身やＩＬ−１、ＴＮＦなどのＩＦ
Ｎ−αの発現を誘導するサイトカインが挙げられる。

【００２４】引き続いて、ＩＦＮ−αを産生せしめる以
上のような工程の産物から、ＩＦＮ−α又はそのサブタ
イプであるＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８の一方又は両
方を採取する。ＩＦＮ−αの採取は慣用の方法によれば
よく、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮、凍
結乾燥、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー、等電点分画、電気泳動などを
適宜組み合わせて、分画される画分から所望の画分、例
えば、所期の抗ウイルス活性を示す画分を採取すること
によって所望のレベルにまで精製されたＩＦＮ−α標品
を得ることができる。より具体的には、先ず、上記のよ
うにしてＩＦＮ−αを産生せしめる工程の産物を、抗Ｉ
ＦＮ−α抗体を担体とするアフィニティークロマトグラ
フィーなどのクロマトグラフィーで分画し、ＩＦＮ−α
以外の夾雑蛋白質を実質的に含まない精製標品を得、次
に、この精製標品を、イオン交換クロマトグラフィーや
逆相クロマトグラフィーなどで分画して個々のサブタイ
プを分離すれば、電気泳動的に実質的に単一のＩＦＮ−
α２ならびにＩＦＮ−α８の精製標品が得られる。この
精製サブタイプを、必要に応じて、さらに濃縮、乾燥等
の処理を加えた後に所望の活性比で配合するか、あるい
は、必要に応じて、後述する組換え型サブタイプや水溶
性高分子による修飾物としてのサブタイプから選ばれる
１種又は２種以上と組み合わせて、ＩＦＮ−α２とＩＦ
Ｎ−α８との活性比が所望の比となるように配合すれ
ば、当該増強剤の有効成分が得られる。また、ＩＦＮ−
αを採取する過程で、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８との
活性比が所期の範囲にあり、かつ、本発明の目的の達成
を妨げない精製レベルにまで達している標品であれば、
これを当該増強剤の有効成分として利用することもでき
る。さらにまた、ＩＦＮ−α標品の市販品（コスモバイ
オ株式会社販売の研究用試薬等）から、上記のようにし
て単離されたＩＦＮ−α２ならびにＩＦＮ−α８標品を
有効成分として用いたり、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８
との活性比ならびにその精製レベルが所期のレベルに達
している場合には、斯かる市販品から精製された、両サ
ブタイプを含んでいる標品をそのまま当該増強剤の有効
成分とすることも可能である。

【００２５】一方、組換えＤＮＡ技術を利用して当該増
強剤を調製するには、先ず、公知の情報を参照して、目
的とするサブタイプをコードするＤＮＡを入手する。例
えば、エム・オー・ディアズら、『ジャーナル・オブ・
インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサー
チ』、第１６巻、１７９乃至１８０頁（１９９６年）に
は、ヒトＩＦＮ−αにおける各種サブタイプをコードす
るＤＮＡを報告している論文が纏めて示されている。ま
た、慣用の核酸データーベースも有用であり、例えば、
ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・
インフォメーション（米国）による核酸データベース
『ジェンバンク』にアクセスコード『Ｊ００２０７』及
び『Ｘ０３１２５』を付して登録されている配列は、そ
れぞれ、ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８をコードするＤ
ＮＡの配列である（それぞれ、本願明細書の配列表に配
列番号３及び４を付して示している）。これらの情報を
もとに、適宜の給源から得たＲＮＡ又はＤＮＡを用いて
ＰＣＲ等のＤＮＡのクローン化のための慣用の方法を適
用すれば、目的とするＤＮＡは得ることができる。次
に、入手されたＤＮＡを、所望の発現ベクターに挿入す
る。本発明で利用できる発現ベクターとしては、例え
ば、ｐＥＴ、ｐＫＫ２２３−３、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ
ｐ、ＢＣＭＧＳＮｅｏ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、
ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐＳＶ−２ｇｐｔ、ｐＣＤＭ８、ｐ
ＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳなどのプラス
ミドベクターが挙げられる。複製可能なベクターは、通
常、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結
部位、スプライシング配列及び／又は選択配列などの、
本発明のＤＮＡが個々の宿主において発現するための適
宜塩基配列を含んでなる。なお、プロモーターとして、
例えば、熱ショック蛋白質プロモーターや、あるいは、
同じ特許出願人による特開平７−１６３３６８号公報に
開示されたプロモーターを用いるときには、形質転換体
における当該ＤＮＡの発現を外部刺激により人為的に制
御できることになる。

【００２６】斯かる組換えＤＮＡを次に適宜の宿主に導
入する。宿主としては、斯界において慣用される適宜の
原核細胞及び真核細胞を含む微生物や、植物、脊椎動物
及び無脊椎動物を含む動物に由来する細胞、さらには動
植物体そのものを用いることができる。動物由来の宿主
細胞の具体例としては、例えば、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓａ
ｌｂｉｎｏ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２）、Ｃ１２７
Ｉ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６１６）、ＣＨＯ−Ｋ１細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ−７０）、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ−１６５０）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−
２）、ＭＯＰ−８細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７０９）
及びそれらの変異株を始めとする、ヒト、サル、マウス
及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血
系細胞が挙げられる。斯かる宿主に本発明のＤＮＡを導
入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン
法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リ
ポフェクション法、マイクロインジェクション法、さら
には、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイ
ルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法な
どを用いればよい。斯くして得られる形質転換体におい
て所期のサブタイプを産生するクローンを選択すればよ
い。斯くして得られるクローンを適宜の培地で培養し、
必要に応じて誘導剤を加えてＩＦＮ−αを産生せしめ、
その産物を、上記で述べた天然型のＩＦＮ−α２ならび
にＩＦＮ−α８の調製方法と同様に、あるいは、用いた
宿主−ベクター系に適した慣用の方法にしたがって精製
すれば、組換え型のＩＦＮ−α２ならびにＩＦＮ−α８
は得ることができる。そして所望の活性比で両サブタイ
プを配合するか、あるいは、必要に応じて、上述の天然
型サブタイプや、後述する水溶性高分子による修飾物と
してのサブタイプから選ばれる１種又は２種以上と組み
合わせて、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８との活性比が所
望の比となるように配合すれば、当該増強剤の有効成分
が得られる。

【００２７】ＩＦＮ−α２及び／又はＩＦＮ−α８の水
溶性高分子による修飾物を調製するには、先ず、上記の
いずれかの方法によって天然型又は組換え型の目的とす
るサブタイプを調製し、得られたサブタイプに水溶性高
分子を共有結合させる公知のの反応に供すればよい。本
発明でいう水溶性高分子とは、同一種又は二種以上のモ
ノマーによる反復構造によって本質的に構成される、通
常、分子量５００以上の物質であって、水に対する溶解
性を有する分子を意味し、天然分子、合成分子ならび
に、これらの部分分解物ならびに修飾物を包含する。本
発明で利用しうる水溶性高分子としては、例えば、可溶
性澱粉、アミロペクチン、デキストラン、ポリスクロー
ス、プルラン、エルシナン、カードラン、アラビアガ
ム、トラガントガム、グアーガム、キサンタンガム、カ
ラゲナン、ヒアルロン酸、ヘパリン、グルコマンナン、
キトサン、リポ多糖、ポリエチレングリコール、ポリビ
ニルピロリドン、アシアロオロソムコイド、アシアロフ
ェツイン、アルブミン、ガラクトース修飾アルブミン、
ポリリジン、ガラクトース修飾ポリリジン等が挙げら
れ、本発明の実施において望ましい分子量は、用いる水
溶性高分子の種類によるけれども、平均分子量として、
通常、５００乃至１０，０００，０００、より望ましく
は、１０，０００乃至１，０００，０００の範囲であ
る。

【００２８】上記のような水溶性高分子をＩＦＮ−α２
及び／又はＩＦＮ−α８に共有結合させるには、例え
ば、ジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋法、ア
ミド結合法などの公知の方法によればよい。例えば、同
じ特許出願人による特開平３−９３７３０号公報や、同
じ特許出願人による特許第１１６２７７８号公報にはそ
の代表的な方法が詳述されており、本発明においても有
利に利用できる。また、トランスグルタミナーゼの作用
を利用して所望の蛋白質に水溶性高分子を共有結合させ
る慣用の方法も有利に利用できる。例えば、国際特許出
願公開公報ＷＯ９６／１００８９にはトランスグルタミ
ナーゼの作用を利用する方法が開示されている。

【００２９】ジアゾ法によって修飾物を得るには、目的
に応じて選ばれる水溶性高分子に、例えば、ｐ−アミノ
ベンジル基、ｐ−アミノベンゾイル基、ｍ−アミノアニ
ソール基、ｍ−アミノアニソール基、ｍ−アミノベンジ
ルオキシメチル基、３−（ｐ−アミノフェノキシ）−２
−ヒドロキシプロピオニル基、３−（ｐ−アミノ−ｍ−
メチルアニリノ）−５−クロロトリアジニル基などの芳
香族アミノ基を公知の方法によって導入して得た誘導体
を、ＩＦＮ−α２及び／又はＩＦＮ−α８と反応させれ
ばよい。

【００３０】ペプチド法によって修飾物を得るには、例
えば、カルボキシル基を本来的に有する水溶性高分子も
しくはカルボキシル基を導入した水溶性高分子を常法に
より酸アジド、酸クロリド、カルボジイミド、イソシア
ナートなどのカルボン酸誘導体とするか、あるいは、水
酸基を本来的に有する水溶性高分子にシアヌル酸ハロゲ
ン化物を反応させてシアヌル酸ハロゲン化物活性化水溶
高分子とするなどして水溶性高分子を活性化し、斯かる
活性化水溶性高分子と、ＩＦＮ−α２及び／又はＩＦＮ
−α８とを反応させればよい。

【００３１】アルキル化法によって修飾物を得るには、
例えば、適宜の水溶性高分子に、クロロアセチル基、ブ
ロモアセチル基、ヨードアセチル基、ハロゲン化トリア
ジニル基などを常法により導入して得られる、水溶性高
分子のハロゲン化アルキル誘導体と、ＩＦＮ−α２及び
／又はＩＦＮ−α８とを反応させればよい。

【００３２】架橋法によって修飾物を得るには、ＩＦＮ
−α２及び／又はＩＦＮ−α８と水溶性高分子とを、例
えば、グルタルアルデヒド、グリオキザール、サクシン
アルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエ
ン−２，４−ジイソシアナート、ビスアゾベンジジン、
Ｎ，Ｎ′−エチレンビスマレインイミドなどの架橋試薬
の存在下で反応させればよい。

【００３３】アミド結合法によって修飾物を得るには、
例えば、アミノ基を本来的に有する水溶性高分子もしく
はアミノ基を導入した水溶性高分子を、例えば、ブロモ
アセチルブロマイド、クロロブチリルクロライド、フル
オロプロピオニルフルオライド、ヨードバレリルヨーダ
イドなどのハロアシルハライドと反応させて得られる活
性化水溶性高分子と、ＩＦＮ−α２及び／又はＩＦＮ−
α８とを反応させればよい。

【００３４】トランスグルタミナーゼ（ＥＣ２．３．
２．１３）の作用によって修飾物を得るには、例えば、
アミノ基を本来的に有する水溶性高分子もしくはアミノ
基を導入した水溶性高分子と、ＩＦＮ−α２及び／又は
ＩＦＮ−α８とを所望の起源のトランスグルタミナーゼ
の存在下で反応させればよい。反応条件は、トランスグ
ルタミナーゼにより触媒される、蛋白質中のグルタミン
残基のγ−カルボキシアミド基と一級アミンとの間での
アシル基転移反応を妨げないものであればよい。微生物
起源、とりわけ、放線菌起源の該酵素は、熱やｐＨ安定
性が他の起源のものに比べて比較的高いので本発明の実
施における修飾物の調製に特に有用である。

【００３５】上記のような修飾物を得るための反応にお
けるＩＦＮ−α２又はＩＦＮ−α８と水溶性高分子との
割合は、反応方法にもよるけれども、重量比で、通常、
１：０．００１乃至１，０００、望ましくは、１：０．
０１乃至１００の範囲から選ばれる。反応方法によって
は、この範囲を大きく下回るとＩＦＮ−α２又はＩＦＮ
−α８同士の結合が顕著に起こる場合があり、一方、こ
の範囲を大きく上回ると水溶性高分子同士の結合が起こ
る場合があるので好ましくない。反応の温度、ｐＨ及び
時間は、ＩＦＮ−α２ならびにＩＦＮ−α８が失活した
り、分解したりすることなく、かつ、副反応の進行がで
きる限り抑えられるものであればよく、温度を通常０℃
乃至１００℃、ｐＨ約１乃至１２とし、反応時間を０．
１時間乃至５０時間時間とするのが比較的望ましい。ま
た、例えば、ＩＦＮ−α２及び／又はＩＦＮ−α８の修
飾物の利用目的などによって、平均分子量や分子量分布
の点で特定の特性を示す水溶性高分子による修飾物が必
要とされる場合には、斯かる修飾物の調製に際して、目
的に合致した特性を有する水溶性高分子を材料として用
いるのが望ましい。市販の水溶性高分子の調製品には平
均分子量や分子量分布を特定して提供されているものが
あるので、このような市販の調製品のうちで目的に合致
するものを選択して材料とすることができる。また、同
じ特許出願人による特開平６−６５３０２号公報や、特
許第８６６８８９号公報には、プルラン産生能を有する
微生物の培養条件を制御して所望の平均分子量や分子量
分布を有するプルランを産生させる方法が開示されてお
り、これらの方法は、本発明で用いる修飾物の材料の調
製に有用である。以上のようなＩＦＮ−α２及び／又は
ＩＦＮ−α８の修飾物のうち、本質的にマルトトリオー
スを反復単位とするプルランやエルシナンなどの多糖
類、望ましくは、分子量が１０，０００乃至１，００
０，０００の範囲にある該多糖による修飾物は、ヒト生
体内での安定性の高さやヒト生体に対する抗原性の低さ
の点で比較的優れており、本発明で特に有利に利用でき
るもののひとつである。

【００３６】以上のような反応により修飾されたＩＦＮ
−α２及びＩＦＮ−α８は、天然型もしくは組換え型の
ＩＦＮ−α２やＩＦＮ−α８の精製方法に準じて精製手
段に供することにより、所望のレベルにまで精製された
標品として得ることができる。そして、以上のようにし
て得られる得られる修飾されたＩＦＮ−α２及びＩＦＮ
−α８を所望の活性比で配合するか、あるいは、必要に
応じて、上述の天然型及び組換え型サブタイプから選ば
れる１種又は２種以上と組み合わせて、ＩＦＮ−α２と
ＩＦＮ−α８との活性比が所望の比となるように配合す
ればよい。

【００３７】斯くして得られるＩＦＮ−α２とＩＦＮ−
α８とを含む組成物は、それ自体で、又は、目的に応じ
て、担体、緩衝剤、安定剤、溶剤、希釈剤等の適宜の他
の成分と配合した上で、蛋白質合成抑制遺伝子の発現増
強剤として諸種の分野で利用することができる。例え
ば、当該増強剤は、ヒト生体において、蛋白質合成抑制
遺伝子の発現により細胞の異常を抑える効果を顕著に発
揮し、しかも当該増強剤に含まれるＩＦＮ−α２及びＩ
ＦＮ−α８はいずれもヒトを対象とする医薬用途に広く
利用されているので、当該増強剤を医薬用組成物の有効
成分として有利することができる。本発明による医薬用
組成物は、有効成分としての当該増強剤とともに、通
常、生理学的に許容される、すなわち、医薬品分野で通
常用いられる、担体、賦形剤、安定剤、溶剤、緩衝剤、
さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１若しく
は複数種をさらに含む組成物として、液状、固体状、半
固体状など、適応症や適用方法に応じた適宜の形態で提
供される。ここで利用しうる安定剤としては、具体的に
は、血清アルブミンやゼラチンなどの蛋白質、グルコー
ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハ
ロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、
ラクチトールなどの糖質が、緩衝剤としてはクエン酸塩
若しくは燐酸塩を主体とする緩衝剤などが、また、併用
し得る他の生理活性物質としては、例えば、塩酸ナイト
ロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、メルカプトプリ
ン、エトポシド、アクチノマイシンＤ、塩酸ミトキサン
トロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レンチナン、アシクロ
ビルなどの他に、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γなどの
サイトカインが挙げられる。

【００３８】以上のように構成される本発明による医薬
用組成物は、蛋白質抑制遺伝子の発現が直接的又は間接
的に関与して症状が治療、緩和又は予防される疾患、す
なわち、該遺伝子の発現に感受性を示す、例えば、免疫
系、造血組織、循環器、皮膚組織、消化器、神経系、筋
肉、眼などにおける諸疾患、より詳細には、アレルギ
ー、リウマチ、エイズ、白血病、悪性黒色腫、肉腫、結
膜炎、肝炎、腸炎などのための治療薬、緩和薬、予防薬
として利用することができる。投与経路は、対象疾患に
応じて、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、経皮、
経口などから適宜選ばれる。投与量は対象者の年齢や、
疾患の種類・症状、投与経路にもよるけれども、当該医
薬用組成物は、筋肉内注射により投与する場合、成人１
人、１日当たり、有効成分の総量として、国際単位換算
で、通常、１００万ＩＵ乃至１０００万ＩＵ、より望ま
しくは、３００万ＩＵ乃至６００万ＩＵの用量で、連日
又は症状を観察しながら１日又は２日以上の間隔をおき
ながら投与される。また、経口投与する場合には、成人
１人、１日当たり、通常、１０ＩＵ乃至２０００ＩＵ、
望ましくは、２０ＩＵ乃至８００ＩＵ、さらに望ましく
は、４０ＩＵ乃至４００ＩＵの用量で、連日又は症状を
観察しながら１日又は２日以上の間隔をおきながら投与
される。

【００３９】当該増強剤が、ＩＦＮ−α２又はＩＦＮ−
α８単独の場合に比べて、蛋白質合成抑制遺伝子の発現
をより顕著に誘導することは、当該増強剤をＩＦＮ−α
感受性細胞に作用させた際の細胞内の反応がより明確に
観察できることを意味している。したがって、当該増強
剤は、ＩＦＮ−αがその感受性細胞に作用して蛋白質合
成抑制遺伝子の発現を誘導する際の細胞内の分子機構、
例えば、細胞内情報伝達系を分子レベルで解析するため
の研究用試薬として有利に利用できる。

【００４０】当該増強剤による相乗作用は、当該増強剤
が対象とする遺伝子の転写調節領域の構造に専ら依存し
ており、遺伝子の発現産物自体には通常関わりがない。
このことから、当該増強剤が対象とする遺伝子の転写調
節領域を単離し、その制御下に所望の蛋白質をコードす
る遺伝子（構造遺伝子）を配置した組換えＤＮＡを準備
し、この組換えＤＮＡをＩＦＮ−α感受性細胞に導入し
た後に、この細胞を当該増強剤で刺激すれば、この細胞
は、目的とする蛋白質を顕著に発現することとなる。Ｉ
ＦＮ−α感受性細胞としては、本来的にＩＦＮ−α受容
体を細胞表面に発現しているヒト細胞のほか、組換えＤ
ＮＡ技術により、ヒトＩＦＮ−α受容体を細胞表面に発
現するように作出したヒト又はヒト以外の脊椎動物細胞
も利用できる。また、ここで生産の対象とする蛋白質
は、それをコードするＤＮＡが入手できる限り、ヒト起
源であっても、それ以外の起源、例えば、ヒト以外の脊
椎動物、無脊椎動物、植物又は微生物起源のものであっ
てもよい。したがって、当該増強剤は、組換え蛋白質の
生産における誘導剤としても有利に利用できる。

【００４１】上記で説明したとおり、ＩＦＮ−α２とＩ
ＦＮ−α８は蛋白質合成抑制遺伝子の発現誘導において
相乗作用を示すので、ＩＦＮ−α２を、ＩＦＮ−α８を
用いて蛋白質合成抑制遺伝子の発現を誘導する際に斯か
る誘導作用を増強するための用途で、また、逆に、ＩＦ
Ｎ−α８を、ＩＦＮ−α２を用いて蛋白質合成抑制遺伝
子の発現を誘導する際に斯かる誘導作用を増強するため
の用途で、それぞれ用いることもできる。この事実に基
づいて、本発明は、ＩＦＮ−α２又はＩＦＮ−α８を有
効成分とする遺伝子発現の増強剤ならびに斯かるいずれ
か又は両方のサブタイプを用いる該遺伝子の発現の増強
方法をも提供するものである。本発明によるこれらの増
強剤ならびに増強方法は、当該増強剤を利用しうる医薬
品、研究用試薬、蛋白質製造などの諸種の分野で有利に
利用できる。

【００４２】ところで、本発明が開示する発現増強剤の
構成は、遺伝子療法に応用することもできる。すなわ
ち、通常の遺伝子療法にしたがって、ＩＦＮ−α２及び
ＩＦＮ−α８をコードするＤＮＡを、例えば、レトロウ
イルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウ
イルス由来のベクターに挿入するか、該ＤＮＡを必要に
応じて他の塩基配列と連結した後に、カチオニックポリ
マーや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋し、
この状態で、蛋白質合成抑制遺伝子の発現に感受性を示
す疾患に罹患した患者に直接注入する。あるいは、上記
ＤＮＡを適宜のベクターに組み込んだ後に、該患者から
採取したリンパ球に生体外で導入し、これを患者に自家
移植する。なお、各サブタイプをコードするＤＮＡを、
転写活性の異なる転写調節領域の制御下に配置するよう
に操作することによって、各サブタイプの発現量の比を
加減することも有利に実施できる。このような遺伝子療
法を受けた患者の生体内においては、ＩＦＮ−α２及び
ＩＦＮ−α８が存在することとなるので、上記で例示し
たような疾患の治療・緩和が達成されることとなる。な
お、これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順
は、例えば、島田隆、斎藤泉、小澤敏也編集、『実験医
学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ遺伝子治療の基
礎技術』（１９９６年、羊土社発行）等に詳述されてい
る。

【００４３】以下、実験及び実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明する。

【００４４】

【実験１】〈蛋白質合成抑制遺伝子の発現誘導における
ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８による相乗作用〉

【００４５】

【実験１−１】〈ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８の調
製〉

【００４６】

【実験１−１（ａ）】〈ＩＦＮ−αサブタイプ産生形質
転換体の調製〉核酸データベース『ジェンバンク』よ
り、アクセスコードＪ００２０７を付して登録されてい
るＩＦＮ−α２遺伝子の塩基配列に関する情報を入手し
た。この配列は、配列表に配列番号３を付して示してい
る。この情報に基づいて設計し調製したプライマーと、
鋳型としてのヒト染色体ＤＮＡとを用いて、通常のＰＣ
Ｒにより、５′末端に開始コドンが付加された成熟型の
ＩＦＮ−α２に対応する塩基配列（配列表の配列番号３
における塩基番号５８０乃至１０７７）を含むＤＮＡ断
片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を常法により大腸菌
用の発現ベクター（東洋紡績株式会社販売、『ｐＥＴ−
３ａ』）のプロモーターの下流に挿入した。斯くしてＩ
ＦＮ−α２発現プラスミドを調製した。このプラスミド
を常法により大腸菌コンピテントセル（東洋紡績株式会
社販売、『ＢＬ２１（ＤＥ３）』）に導入し、ＩＦＮ−
α２産生形質転換体を得た。

【００４７】核酸データベース『ジェンバンク』より、
アクセスコードＸ０３１２５を付して登録されているＩ
ＦＮ−α８遺伝子の塩基配列に関する情報を入手した。
この配列は、配列表に配列番号４を付して示している。
この情報に基づいて設計し調製したプライマーと、鋳型
としてのヒト染色体ＤＮＡとを用いて、通常のＰＣＲに
より、５′末端に開始コドンが付加された成熟型のＩＦ
Ｎ−α８に対応する塩基配列（配列表の配列番号４にお
ける塩基番号１１７乃至６１４）を含むＤＮＡ断片を増
幅した。増幅したＤＮＡ断片を常法により大腸菌用の発
現ベクター（東洋紡績株式会社販売、商品名『ｐＥＴ−
３ａ』）のプロモーターの下流に挿入した。斯くしてＩ
ＦＮ−α８発現プラスミドを調製した。このプラスミド
を常法により大腸菌コンピテントセル（東洋紡績株式会
社販売、『ＢＬ２１（ＤＥ３）』）に導入し、ＩＦＮ−
α８産生形質転換体を得た。

【００４８】

【実験１−１（ｂ）】〈ＩＦＮ−αサブタイプの産生と
精製〉実験１−１（ａ）で得た形質転換体をそれぞれ常
法にしたがって、培地としてＬブロス培地を、誘導剤と
してイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を用いて培養し、それぞれのサブタイプを
菌体内に産生させた。培養物を遠心分離して菌体を回収
し、ＰＢＳに懸濁後、超音波処理して菌体を破砕した。
菌体破砕物を遠心分離し、上清画分を採取した。採取し
たそれぞれの上清画分を、常法にしたがって、疎水クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画し、抗ウイル
ス活性画分を精製した。常法により還元条件下でのＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、得られた
精製画分が電気泳動的に実質的に単一であることを確認
した。

【００４９】それぞれの形質転換体から得たゲル濾過精
製画分の一部をとり、常法により、還元カルボキサミド
メチル化処理した後にエドマン分解法によりＮ末端から
３０残基めまでのアミノ酸配列を解読した。ＩＦＮ−α
２産生形質転換体から得た精製画分は、Ｎ末端がメチオ
ニンであり、それ以降の配列は配列表における配列番号
１に示すＩＦＮ−α２のアミノ酸配列（データベース
『スイスプロット』、アクセスコード『Ｐ０１５６
３』）におけるシグナルペプチドを除くＮ末端部のアミ
ノ酸配列（アミノ酸番号２４乃至５２）と完全に一致し
た。一方、ＩＦＮ−α８産生形質転換体からの場合は、
Ｎ末端がメチオニンであり、それ以降の配列は配列表に
おける配列番号２に示すＩＦＮ−α８のアミノ酸配列
（データベース『スイスプロット』、アクセスコード
『Ｐ３２８８１』）におけるシグナルペプチドを除くＮ
末端部のアミノ酸配列（アミノ酸番号２４乃至５２）と
完全に一致した。以上の結果より、本実験で得た電気泳
動的に単一の２つの精製標品が、それぞれ、ＩＦＮ−α
２とＩＦＮ−α８の精製標品であることを確認した。

【００５０】

【実験１−１（ｃ）】〈比活性〉ジェイ・イマニシら、
『ビケン・ジャーナル』、第２４巻、１０８乃至１０９
頁に記載された色素取り込み法にしたがって、ヒト羊膜
由来の樹立細胞株であるＦＬ細胞へのシンドビスウイル
スによる細胞変性効果（ＣＰＥ）に対するＩＦＮ−α試
料の抑制作用を、色素としてニュートラルレッドを用い
て、正常細胞に取り込まれた色素量を波長５４０ｎｍの
吸収で測定することにより定量的に求めた。ＩＦＮ−α
試料として、実験１−１（ｂ）で得たＩＦＮ−αサブタ
イプの精製標品の２倍ごとの段階希釈液と、ＩＦＮ−α
の国際標準品『Ｇａ２３−９０１−５３２』（２５，０
００ＩＵ／アンプル、米国国立衛生研究所より入手）の
２倍ごとの段階希釈液を用い、それぞれがＣＰＥを５０
％阻害したときの希釈倍率を求めた。得られた結果よ
り、実験１−１（ｂ）によるＩＦＮ−αサブタイプの精
製標品の抗ウイルス活性（ＩＵ／ｍｌ）を算出した。一
方、これとは別途、実験１−１（ｂ）によるＩＦＮ−α
サブタイプの精製標品の蛋白質含量をローリー法にした
がって測定した。以上の結果より、実験１−１（ｂ）に
よるＩＦＮ−α２精製標品の比活性は７．２×１０⁷Ｉ
Ｕ／ｍｇ蛋白質、ＩＦＮ−α８精製標品の比活性は３．
０×１０⁸ＩＵ／ｍｇ蛋白質と算出された。

【００５１】

【実験１−２】〈蛋白質合成抑制遺伝子の発現の誘導に
おけるＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８との相乗作用〉ヒト
肝細胞由来の樹立細胞株ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣＨ
Ｂ−８０６５）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地中で常法により所期の細胞数に
達するまで培養した後、同培地により細胞密度１×１０
⁵個／ｍｌの細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液を
９６ウェルマイクロプレートに１ウェル当たり１００μ
ｌずつ注入し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂インキュベーター
中、３７℃で４８時間培養した。

【００５２】実験１−１（ｂ）で得た精製標品を用い
て、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８とを、国際単位換算
で、１０：０、８：２、６：４、５：５、４：６、２：
８、又は０：１０の活性比で含み、ＩＦＮ−α活性の計
算上の総和が１×１０⁴ＩＵ／ｍｌであるＩＦＮ−α２
／ＩＦＮ−α８混液を準備した。それぞれの混液を、上
記の培地で２倍ごとに段階希釈した。なお、因みに、こ
こで準備した混液におけるＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８
との重量比は、実験１−１（ｃ）で求めた比活性に基づ
いて計算すると、それぞれ、１００：０、９４：６、８
６：１４、８１：１９、７４：２６及び５１：４９、及
び０：１００である。

【００５３】マイクロプレート中で４８時間の培養を終
えたＨｅｐＧ２細胞の各ウェルに、個々の活性比のＩＦ
Ｎ−α２／ＩＦＮ−α８混液の各段階希釈液を、それぞ
れ５０μｌずつ添加し、各ウェル内を十分に混合した
後、さらに２４時間培養を継続した。

【００５４】その後、各ウェルより培養上清を除去し、
各ウェルに予め準備しておいたウイルス密度３×１０⁵
ｐｆｕ／ｍｌのＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）液を１
００μｌずつ添加し、さらに２４時間培養した。なお、
対照として、上記と同じ１ウェル当りの細胞数から開始
する一方、ＩＦＮ−α処理及びＶＳＶ処理を施さない系
を設け同じ時間培養した。また、全ての培養系について
同じものを３組ずつ設けた。

【００５５】培養後、各ウェルより細胞を回収し、常法
により各ウェルごとに生細胞数を計測し、各系ごとに平
均値を求めた。この結果に基づいて、各ＩＦＮ−α２／
ＩＦＮ−α８混液について、ＨｅｐＧ２細胞の生存曲線
（混液の希釈倍率に対して生細胞数をプロット）を作成
した。生存曲線において、各ＩＦＮ−α２／ＩＦＮ−α
８混液が、ＨｅｐＧ２細胞の生存を、対照の細胞数の５
０％を維持したときの希釈倍率より、ＨｅｐＧ２細胞に
対するＶＳＶのＣＰＥ（細胞変性効果）を５０％阻害す
る各混液の濃度（ＩＣ₅₀、１ｍｌ当りの計算上のＩＦＮ
−α活性の総和として、ＩＵ／ｍｌ）の平均値を算出し
た。また、算出された値を、ティー・シー・チョウ、
『シナジズム・アンド・アンタゴニズム・イン・ケモセ
ラピー』（１９９１年、アカデミックプレス社発行）、
６１乃至１０２頁に記載された多変量解析法により解析
し、ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８による相乗作用の有
無ならびに強弱をコンビネーション・インデックス（Ｃ
Ｉ）として数値化した。なお、ＣＩが示す相乗作用の強
度は上述の表２に纏めたとおりである。結果を表３に示
す。

【００５６】

【表３】

【００５７】表３に示すとおり、ＨｅｐＧ２細胞にＶＳ
ＶがＣＰＥを示す系においては、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ
−α８とをそれぞれ単独で添加した場合には、ＩＦＮ−
α８がより顕著な抗ウイルス活性、ＩＣ₅₀で比較すると
ＩＦＮ−α２の２．４倍程度の抗ウイルス活性を示すこ
とが判明した（１０：０と０：１０の結果より）。この
結果より、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８を混合して、Ｉ
ＦＮ−α８の割合が順次高まるように段階的に活性比を
変えて調製した両者の混液においては、両者が単に相加
的に抗ウイルス活性を示すのであれば、ＩＣ₅₀は順次減
少して０：１０の場合の値に収束すると想定された。し
かしながら、５：５のＩＦＮ−α２／ＩＦＮ−α８混液
の前後においては、実際に求められたＩＣ₅₀は、この想
定に反する値を示し、両サブタイプは特定の活性比で共
存するとき、相乗作用を示すと考えられた。そして、こ
のことは、表３における右欄に示すとおり、ＩＣ₅₀の多
変量解析によって裏づけられ、両サブタイプの活性比が
６：４乃至５：５である時に相乗作用が特に顕著である
ことが判明した。

【００５８】以上に結果を示したとおり、ＩＦＮ−α２
とＩＦＮ−α８とは、抗ウイルス活性の発現において、
所定の活性比で共存するとき、顕著な相乗作用を発揮す
る。この事実は、斯かる活性比でＩＦＮ−α２とＩＦＮ
−α８とが共存するとき、抗ウイルス活性を直接的に担
う機能分子をコードする遺伝子である、２−５Ａ合成酵
素遺伝子やＰＫＲ遺伝子などの蛋白質合成抑制遺伝子の
発現の誘導において、両者が顕著な相乗作用を示すこと
を意味している。

【００５９】一方、以上の操作に準じて、別途調製した
組換え型のＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α５及びＩＦＮ−α
１０を用いて、ＩＦＮ−α８との組合わせにおける効果
を調べたところ、ＩＦＮ−α５又はＩＦＮ−α１０をＩ
ＦＮ−α８と組み合わせて用いた場合には相乗作用は認
められず、両者の活性比によっては、明かな負の相乗作
用が認められる場合もあった。また、ＩＦＮ−α１をＩ
ＦＮ−α８と組合わせた場合には、わずかな相乗作用が
認められる場合はあったものの、ＩＦＮ−α２との組合
わせの場合ほど顕著ではなかった。以上の結果は、ＩＦ
Ｎ−α２とＩＦＮ−α８との組合わせが蛋白質合成抑制
遺伝子の発現を特に顕著に増強することを示している。

【００６０】

【実験２】〈２−５Ａ合成酵素遺伝子の発現誘導におけ
るＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８との相乗作用〉ヒト肝細
胞由来の樹立細胞株ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣＨＢ−
８０６５）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地中で常法により所期の細胞数に達す
るまで培養した後、同培地により細胞密度１×１０⁵個
／ｍｌの細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液を２４
ウェルマイクロプレートに１ウェル当たり１ｍｌずつ注
入し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂インキュベーター中、３７
℃で４８時間培養した。

【００６１】実験１−１（ａ）で得た精製標品を用い
て、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８とを、国際単位換算
で、１０：０、８：２、６：４、５：５、４：６、２：
８、又は０：１０の活性比で含み、ＩＦＮ−α活性の計
算上の総和が２００ＩＵ／ｍｌであるＩＦＮ−α２／Ｉ
ＦＮ−α８混液を準備した。

【００６２】これらの混液のいずれかを、マイクロプレ
ート中で４８時間の培養を終えたＨｅｐＧ２細胞の各ウ
ェルにそれぞれ２５μｌずつ添加し、各ウェル内を十分
に混合した後、さらに２４時間培養を継続した。対照と
して、上記と同じ１ウェル当りの細胞数から開始する一
方、ＩＦＮ−α処理を施さない系を設け同じ時間培養し
た。また、全ての培養系について同じものを３組ずつ設
けた。

【００６３】その後、各ウェルより細胞を回収し、それ
ぞれ、ＰＢＳに懸濁した後、凍結融解して細胞を抽出
し、１００μｌの細胞抽出液を得た。これらの細胞抽出
液における２−５Ａ合成酵素活性を、該酵素活性測定の
ための市販のキット（栄研化学株式会社製造、商品名
『２−５Ａキット’栄研’』）を用いて、該酵素の作用
により生成する２−５Ａ量（ｐｍｏｌ／ｄｌ）として求
め、各系ごとに平均値を求めた。ＩＦＮ−α処理系の値
から対照系の値を差し引いた値を、各試料が示した２−
５Ａ合成酵素誘導活性として評価した。１０：０（ＩＦ
Ｎ−α２のみの処理）の場合約２００ｐｍｏｌ／ｄｌ、
０：１０（ＩＦＮ−α８のみの処理）の場合約４５０ｐ
ｍｏｌ／ｄｌであり、実験１−２で観察された両サブタ
イプの抗ウイルス活性の違いとの間によい相関が見られ
た。

【００６４】一方、データは省略するけれども、予備的
な実験の結果より、実験１−２の方法による抗ウイルス
活性（ＩＣ₅₀）の対数値（底１０）と、本実験による条
件下で測定される２−５Ａ合成酵素誘導活性の測定値
（ｐｍｏｌ／ｄｌ）とが直線関係を示すという知見を得
た。この知見に基づいて、ＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α８
とが相加的に作用したと想定したときの２−５Ａ合成酵
素誘導活性（ｐｍｏｌ／ｄｌ）に対する本実験による測
定値の倍率を求めて相乗作用の有無を判定した。結果を
表４に示す。

【００６５】

【表４】

【００６６】表４に示すとおり、２−５Ａ合成酵素誘導
活性は、ＩＦＮ−α２／ＩＦＮ−α８混液をＨｅｐＧ２
細胞に作用させた場合、両者の活性比が４：６及び２：
８の場合には相加的な作用による想定値とほぼ同じ値を
示したのに対して、両者の活性比が、８：２、６：４及
び５：５の場合には、それぞれの想定値を上回り、とり
わけ、６：４及び５：５の場合に高い活性を示した。こ
の結果は、実験１−２で示された抗ウイルス活性の測定
に基づく知見を具体的に裏づけている。

【００６７】

【実施例１】〈医薬品製造用原液〉安定剤として含水結
晶トレハロースを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に、実
験１−１（ａ）乃至実験１−１（ｂ）の方法で得たＩＦ
Ｎ−α２及びＩＦＮ−α８の精製標品を常法により膜濃
縮した後、国際単位換算で両者の活性比が２：１とな
り、計算上のＩＦＮ−α活性の総和が１×１０⁶ＩＵ／
ｍｌとなるよう溶解させた溶液を、常法にしたがって精
密濾過により除菌して液剤を得た。

【００６８】安定性に優れた本品は、蛋白質合成抑制遺
伝子の発現に感受性を示す、免疫系、造血組織、循環
器、皮膚組織、消化器、神経系、筋肉などにおける諸疾
患の治療剤・緩和剤・予防剤の製造用原液として有用で
ある。また、本品は、研究用試薬や組換え型蛋白質の製
造における誘導剤として利用することも可能である。

【００６９】

【実施例２】〈医薬品製造用原液〉ヒトリンパ芽球様細
胞の一種であるＢＡＬＬ−１細胞由来のヒトＩＦＮ−α
溶液（コスモバイオ株式会社販売）を、抗ヒトＩＦＮ−
αモノクローナル抗体カラムクロマトグラフィー（担
体：ロンザ社製『ＮＫ−２セファロース』，移動相：Ｐ
ＢＳ，溶出液：０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ
クエン酸水溶液（ｐＨ２．０））に供して、該溶液中に
存在するウシ血清アルブミンを除去し、精製ヒトＩＦＮ
−α標品を得た。常法により分析したところ、この精製
標品におけるヒトＩＦＮ−αのサブタイプは実質的にＩ
ＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８からなり、該精製標品にお
ける両サブタイプの活性比は国際単位換算で約１：１で
あった。

【００７０】上記の精製ヒトＩＦＮ−α標品をＰＢＳに
対して透析し、透析内液を採取して常法により濃縮した
後、安定剤として含水結晶トレハロースを１％（ｗ／
ｖ）含む生理食塩水と混合し、ＩＦＮ−α活性が５×１
０⁶ＩＵ／ｍｌとなるよう調整し、常法にしたがって精
密濾過により除菌して液剤を得た。

【００７１】安定性に優れた本品は、蛋白質合成抑制遺
伝子の発現に感受性を示す、免疫系、造血組織、循環
器、皮膚組織、消化器、神経系、筋肉などにおける諸疾
患の治療剤・緩和剤・予防剤の製造用原液として有用で
ある。また、本品は、研究用試薬や組換え型蛋白質の製
造における誘導剤として利用することも可能である。

【００７２】

【実施例３】〈医薬品製造用原液〉実験１−１（ａ）乃
至実験１−１（ｂ）の方法にしたがって得たＩＦＮ−α
２及びＩＦＮ−α８の精製標品を常法により膜濃縮した
後、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈して、各サブタイプの
濃度２ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。

【００７３】同じ特許出願人による特開平６−６５３０
２号公報に記載された方法にしたがって調製した平均分
子量約２００，０００のプルランを常法により脱色、脱
塩して精製し、凍結乾燥して精製プルランの粉末を得
た。この精製プルランの粉末をＰＢＳ（ｐＨ７．０）に
溶解し、濃度２０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。このプ
ルラン溶液と、濃度１％（ｗ／ｖ）に調整した塩化シア
ヌルのアセトン溶液とを、体積比３０：１で混合し、こ
の混合物を、穏やかに撹拌しながら、氷冷下で２時間イ
ンキュベートして反応させ、塩化シアヌルによりプルラ
ンを活性化した。この塩化シアヌル活性化プルランを含
む反応混合物と、上記で得たＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−
α８のいずれかの溶液とを、体積比１：１で混合し、穏
やかに撹拌しながら、３７℃で６時間インキュベートし
て各サブタイプのプルランによる修飾反応を行った。そ
の後、この反応混合物にグリシンを濃度５％（ｗ／ｖ）
となるように添加し、穏やかに撹拌しながら、４℃で１
６時間インキュベートして反応を停止させた。

【００７４】上記の反応混合物を、それぞれ、ゲル濾過
クロマトグラフィー（ゲル濾過担体として、アマシャム
・ファルマシア・バイオテク株式会社販売の商品名『セ
ファクリルＳ−２００カラム』を使用。移動相としてＰ
ＢＳを使用。）に供して分画した。各画分の蛋白質量を
ブラッドフォード法により分析した。その結果、それぞ
れの反応混合物において保持時間の異なる２個のピーク
が認められた。保持時間のより短いピーク（分子量約２
００，０００以上に相当）の画分を採取し、ＩＦＮ−α
２及びＩＦＮ−α８それぞれについてのプルラン結合サ
ブタイプ含有画分とした。次に、得られたプルラン結合
サブタイプ含有画分を、それぞれ、常法により、ポリク
ローナル抗体カラムによるクロマトグラフィーに供し
た。ポリクローナル抗体カラムは、実施例２の方法で得
た精製ヒトＩＦＮ−α標品を抗原として得たウサギ抗ヒ
トＩＦＮ−αポリクローナル抗体を用いて、常法により
準備したものを使用した。このポリクローナル抗体カラ
ムへの結合画分を採取して、プルラン結合サブタイプ
（ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−α８それぞれ）の精製標品
を得た。両精製標品のＩＦＮ−α活性を常法により測定
し、プルラン結合ＩＦＮ−α２とプルラン結合ＩＦＮ−
α８の活性比が国際単位換算で１：１となるように両者
を混合した後、安定剤として含水結晶トレハロースを１
％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に対して透析した。透析内
液を採取し、ＩＦＮ−α活性が５×１０⁴ＩＵ／ｍｌと
なるように上記のトレハロース含有生理食塩水で調整
し、精密濾過により除菌して液剤を得た。

【００７５】生体内での安定性ならびに生体に対する抗
原性の低さの点で優れた特性を有する本品は、蛋白質合
成抑制遺伝子の発現に感受性を示す、免疫系、造血組
織、循環器、皮膚組織、消化器、神経系、筋肉などにお
ける諸疾患の治療剤・緩和剤・予防剤の製造用原液とし
て有用である。また、本品は、研究用試薬や組換え型蛋
白質の製造における誘導剤として利用することも可能で
ある。

【００７６】

【実施例４】〈医薬品製造用原液〉実施例３に示した塩
化シアヌル活性化プルランとＩＦＮ−α２又はＩＦＮ−
α８との反応におけるＩＦＮ−α２又はＩＦＮ−α８に
代えて実施例２の方法で調製した精製ヒトＩＦＮ−α標
品を用いた以外は実施例３にしたがって、プルランによ
る修飾反応を実施し、引き続いて、実施例３にしたがっ
て反応産物をゲル濾過クロマトグラフィー及び抗体カラ
ムクロマトグラフィーにより精製した。常法により分析
したところ、この精製標品におけるヒトＩＦＮ−αのサ
ブタイプは実質的にプルラン結合ＩＦＮ−α２及びプル
ラン結合ＩＦＮ−α８からなり、該精製標品における両
サブタイプの活性比は国際単位換算で約１：１であっ
た。この精製標品を、安定剤として含水結晶トレハロー
スを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に対して透析した。
透析内液を採取し、ＩＦＮ−α活性が１×１０⁵ＩＵ／
ｍｌとなるように上記のトレハロース含有生理食塩水で
調整し、精密濾過により除菌して液剤を得た。

【００７７】生体内での安定性ならびに生体に対する抗
原性の低さの点で優れた特性を有する本品は、蛋白質合
成抑制遺伝子の発現に感受性を示す、免疫系、造血組
織、循環器、皮膚組織、消化器、神経系、筋肉などにお
ける諸疾患の治療剤・緩和剤・予防剤の製造用原液とし
て有用である。また、本品は、研究用試薬や組換え型蛋
白質の製造における誘導剤として利用することも可能で
ある。

【００７８】

【実施例５】〈乾燥注射剤〉実施例１乃至４による医薬
品製造用原液を、それぞれバイアル瓶に１ｍｌずつ分注
し、凍結乾燥した後、密栓した。安定性に優れた本品
は、蛋白質合成抑制遺伝子の発現に感受性を示す、免疫
系、造血組織、循環器、皮膚組織、消化器、神経系、筋
肉などにおける諸疾患を治療、緩和又は予防するための
乾燥注射剤として有用である。

【００７９】

【実施例６】〈軟膏剤〉滅菌蒸留水にカルボキシビニル
ポリマー（和光純薬工業株式会社製、商品名『ハイビス
ワコー１０４』）と含水結晶トレハロースをそれぞれ濃
度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるよ
うに溶解し、さらに、細胞賦活剤のルミンを５ｍｇ／ｇ
となるように混合した。この混合物に、実施例２又は４
による医薬品製造原液を５×１０⁴ＩＵ／ｇとなるよう
に添加・混合した混合物を、ｐＨ７．２に調整してゲル
状物を得た。

【００８０】延展性と安定性に優れ、細胞賦活作用を併
せ持つ本品は、蛋白質合成抑制遺伝子の発現に感受性を
示す、免疫系、皮膚組織、神経系、筋肉などにおける諸
疾患を治療、緩和又は予防するための軟膏剤として有用
である。

【００８１】

【実施例７】〈錠剤〉無水結晶マルトース（株式会社林
原商事販売、商品名『ファイントース』）に、実施例２
又は４による医薬品製造原液を１×１０³ＩＵ／ｇとな
るように混合し、これを常法により打錠して１錠当たり
約２００ｍｇの錠剤を得た。

【００８２】摂取性、安定性に優れた本品は、蛋白質合
成抑制遺伝子の発現に感受性を示す、免疫系、造血組
織、循環器、皮膚組織、消化器、神経系、筋肉などにお
ける諸疾患を治療、緩和又は予防するためのための経口
投与用の錠剤として有用である。

【００８３】

【発明の効果】以上説明したとおり、本発明は、ヒトＩ
ＦＮ−αのサブタイプであるＩＦＮ−α２とＩＦＮ−α
８とが共存するとき、蛋白質合成抑制遺伝子の発現誘導
において相乗作用を示すという本発明者等による独自の
発見に基づくものである。本発明の蛋白質合成抑制遺伝
子の発現増強剤は、ヒトを対象とする医薬品として現在
広く利用されているヒトＩＦＮ−αにおけるサブタイプ
を有効成分とすることから、医薬用途、とりわけ、蛋白
質合成抑制遺伝子の発現が直接的又は間接的に関与して
症状が治療、緩和、予防される各種疾患に対する医薬用
途に有利に利用することができる。また、当該発現増強
剤は、ＩＦＮの活性発現に至る分子機構を解明するため
の研究用試薬や、組換え型蛋白質の製造における誘導剤
などとしても有用である。

【００８４】本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する
発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある
発明である。

【００８５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> Agent for enhancing the expression of protein-synthesis- suppressive genes <130> 10086602 <160> 4 <210> 1 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Signal <222> (1)...(23) <220> <221> Mature chain <222> (24)...(188) <300> <308> P01563 (Swissprot) <400> 1 Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys 1 5 10 15 Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser 35 40 45 Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His 65 70 75 80 Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser 85 90 95 Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr 100 105 110 Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val 115 120 125 Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys 130 135 140 Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro 145 150 155 160 Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu 165 170 175 Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 180 185 <210> 2 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Signal <222> (1)...(23) <220> <221> Mature chain <222> (24)...(189) <300> <308> P32881 (Swissprot) <400> 2 Met Ala Leu Thr Phe Tyr Leu Leu Val Ala Leu Val Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Phe Ser Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu 100 105 110 Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly 115 120 125 Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 165 170 175 Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu 180 185 <210> 3 <211> 1733 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (511)...(1077) <220> <221> sig_peptide <222> (511)...(579) <220> <221> mat_peptide <222> (580)...(1074) <300> <308> J00207 (GenBank) <400> 3 gcgcctctta tgtacccaca aaaatctatt ttcaaaaaag ttgctctaag aatatagtta 60 tcaagttaag taaaatgtca atagcctttt aatttaattt ttaattgttt tatcattctt 120 tgcaataata aaacattaac tttatacttt ttaatttaat gtatagaata gagatataca 180 taggatatgt aaatagatac acagtgtata tgtgattaaa atataatggg agattcaatc 240 agaaaaaagt ttctaaaaag gctctggggt aaaagaggaa ggaaacaata atgaaaaaaa 300 tgtggtgaga aaaacagctg aaaacccatg taaagagtgt ataaagaaag caaaaagaga 360 agtagaaagt aacacagggg catttggaaa atgtaaacga gtatgttccc tatttaaggc 420 taggcacaaa gcaaggtctt cagagaacct ggagcctaag gtttaggctc acccatttca 480 accagtctag cagcatctgc aacatctaca atggccttga cctttgcttt actggtggcc 540 ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac 600 agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc 660 tcctgcttga aggacagaca tgactttgga tttccccagg aggagtttgg caaccagttc 720 caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat gagatgatcc agcagatctt caatctcttc 780 agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa 840 ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag 900 actcccctga tgaaggagga ctccattctg gctgtgagga aatacttcca aagaatcact 960 ctctatctga aagagaagaa atacagccct tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc 1020 atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg caagaaagtt taagaagtaa ggaatgaaaa 1080 ctggttcaac atggaaatga ttttcattga ttcgtatgcc agctcacctt tttatgatct 1140 gccatttcaa agactcatgt ttctgctatg accatgacac gatttaaatc ttttcaaatg 1200 tttttaggag tattaatcaa cattgtattc agctcttaag gcactagtcc cttacagagg 1260 accatgctga ctgatccatt atctatttaa atatttttaa aatattattt atttaactat 1320 ttataaaaca acttattttt gttcatatta tgtcatgtgc acctttgcac agtggttaat 1380 gtaataaaat gtgttctttg tatttggtaa atttattttg tgttgttcat tgaacttttg 1440 ctatggaact tttgtacttg tttattcttt aaaatgaaat tccaagccta attgtgcaac 1500 ctgattacag aataactggt acacttcatt tgtccatcaa tattatattc aagatataag 1560 taaaaataaa ctttctgtaa accaagttgt atgttgtact caagataaca gggtgaacct 1620 aacaaataca attctgctct cttgtgtatt tgatttttgt atgaaaaaaa ctaaaaatgg 1680 taatcatact taattatcag ttatggtaaa tggtatgaag agaagaagga acg 1733 <210> 4 <211> 633 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (48)...(617) <220> <221> sig_peptide <222> (48)...(116) <220> <221> mat_peptide <222> (117)...(614) <300> <308> X03125 (GenBank) <400> 4 aggggtcatc catctgaacc agctcagcag catccacaac atctacaatg gccttgactt 60 tttatttact ggtggcccta gtggtgctca gctacaagtc attcagctct ctgggctgtg 120 atctgcctca gactcacagc ctgggtaaca ggagggcctt gatactcctg gcacaaatgc 180 gaagaatctc tcctttctcc tgcctgaagg acagacatga ctttgaattc ccccaggagg 240 agtttgatga taaacagttc cagaaggctc aagccatctc tgtcctccat gagatgatcc 300 agcagacctt caacctcttc agcacaaagg actcatctgc tgctttggat gagacccttc 360 tagatgaatt ctacatcgaa cttgaccagc agctgaatga cctggagtcc tgtgtgatgc 420 aggaagtggg ggtgatagag tctcccctga tgtacgagga ctccatcctg gctgtgagga 480 aatacttcca aagaatcact ctatatctga cagagaagaa atacagctct tgtgcctggg 540 aggttgtcag agcagaaatc atgagatcct tctctttatc aatcaacttg caaaaaagat 600 tgaagagtaa ggaatgagac ctggtacaac acg 633

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 9/00 7/00 17/00 9/00 21/00 17/00 25/00 21/00 27/02 25/00 29/00 １０１ 27/02 31/18 29/00 １０１ 35/02 31/18 37/00 35/02 37/08 37/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 37/08 Ａ６１Ｋ 37/66 ＧＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA23 CA03 DA06 EA04 GA11 4B064 AG09 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA27 CA29 CA44 4C084 AA13 BA35 DA22 ZA01 ZA33 ZA36 ZA51 ZA66 ZA75 ZA89 ZA94 ZB07 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZC55 ZC80

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトインターフェロンαにおけるサブタ
イプα２及びサブタイプα８を有効成分として含んでな
る蛋白質合成抑制遺伝子の発現増強剤。
【請求項２】該発現増強剤におけるヒトインターフェ
ロンαの総量に対してサブタイプα２及びサブタイプα
８が国際単位換算で９０％以上を占める請求項１に記載
の蛋白質合成抑制遺伝子の発現増強剤。
【請求項３】該発現増強剤におけるサブタイプα２と
サブタイプα８との活性比が国際単位換算で１：０．２
５以上１．５未満である請求項１又は２に記載の蛋白質
合成抑制遺伝子の発現増強剤。
【請求項４】蛋白質合成抑制遺伝子である２′，５′
−オリゴアデニル酸合成酵素遺伝子及び／又は二本鎖Ｒ
ＮＡ依存性プロテインキナーゼ遺伝子の発現増強剤とし
ての請求項１、２又は３に記載の蛋白質合成抑制遺伝子
の発現増強剤。
【請求項５】ヒトインターフェロンαにおけるサブタ
イプα２及びサブタイプα８を有効成分として含んでな
り、サブタイプα２とサブタイプα８との重量比が１：
０．０５乃至０．５である蛋白質合成抑制遺伝子の発現
増強剤。
【請求項６】該発現増強剤における有効成分としての
サブタイプα２及び／又はサブタイプα８が、そのポリ
ペプチド鎖に共有結合している水溶性高分子を有するも
のである請求項１乃至５のいずれかに記載の蛋白質合成
抑制遺伝子の発現増強剤。
【請求項７】水溶性高分子が、本質的にマルトトリオ
ースを反復単位とする多糖類である請求項６に記載の蛋
白質合成抑制遺伝子の発現増強剤。
【請求項８】２′，５′−オリゴアデニル酸合成酵素
遺伝子又は二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ遺伝
子の転写調節領域の制御下にある構造遺伝子の発現増強
剤としての、ヒトインターフェロンαにおけるサブタイ
プα２及びサブタイプα８を有効成分として含んでなる
遺伝子の発現増強剤。
【請求項９】請求項１乃至７のいずれかに記載の発現
増強剤を有効成分として含んでなる医薬用組成物。
【請求項１０】生理学的に許容される担体、賦形剤、
緩衝剤及び安定剤から選ばれる１種又は２種以上をさら
に含んでなる請求項９に記載の医薬用組成物。
【請求項１１】ヒトインターフェロンαにおけるサブ
タイプα２を有効成分として含んでなる、ヒトインター
フェロンαにおけるサブタイプα８による蛋白質合成抑
制遺伝子の遺伝子発現誘導作用の増強剤。
【請求項１２】ヒトインターフェロンαにおけるサブ
タイプα８を有効成分として含んでなる、ヒトインター
フェロンαにおけるサブタイプα２による蛋白質合成抑
制遺伝子の遺伝子発現誘導作用の増強剤。
【請求項１３】蛋白質合成抑制遺伝子が、２′，５′
−オリゴアデニル酸合成酵素遺伝子及び／又は二本鎖Ｒ
ＮＡ依存性プロテインキナーゼ遺伝子である請求項１１
又は１２に記載の増強剤。
【請求項１４】ヒトインターフェロンαにおけるサブ
タイプα２とサブタイプα８とをヒトインターフェロン
α感受性細胞に作用させることを特徴とする遺伝子発現
の増強方法。
【請求項１５】ヒトインターフェロンα感受性細胞が
有する蛋白質合成抑制遺伝子の発現を増強する請求項１
４に記載の遺伝子発現の増強方法。
【請求項１６】蛋白質合成抑制遺伝子が、２′，５′
−オリゴアデニル酸合成酵素遺伝子及び／又は二本鎖Ｒ
ＮＡ依存性プロテインキナーゼ遺伝子である請求項１５
に記載の遺伝子発現の増強方法。
【請求項１７】ヒトインターフェロンα感受性細胞が
有する、２′，５′−オリゴアデニル酸合成酵素遺伝子
又は二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ遺伝子の転
写調節領域の制御下にある遺伝子の発現を増強する請求
項１４に記載の遺伝子発現の増強方法。