DE69836315T2

DE69836315T2 - Verwendung von TCF-II zur Behandlung von durch Krebs verursachtem Gewichtsverlust, Anaemie und TNF-Erhöhung

Info

Publication number: DE69836315T2
Application number: DE69836315T
Authority: DE
Inventors: Masamichi Kojiro; Hirohisa Yano; Akihiro Iemura
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Atlas Pharmaceuticals Inc Sunnyvale Calif Us
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-11
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: CA2253629A1; EP0950416B1; DK0950416T3; US7138372B2; DE69836315D1; US20030236191A1; AU6309398A; US20060193827A1; EP0950416A4; US7115568B2; ES2274567T3; US20030082134A1; US20020041863A1; ZA982068B; EP0950416A1; ATE344050T1; AU734766B2; WO1998041230A1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von tumorzytotoxischem Faktor-II (TCF-II) als Therapeutikum. Hierin wird ein ausgezeichnetes Mittel zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Kachexie infolge eines der Faktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, erworbenem Immundefizienzsyndrom (AIDS), Herzerkrankungen, Infektionskrankheiten, Schock, Verbrennungen, Endotoxinämie, Organentzündung, Operationen, Diabetes, Kollagenkrankheiten, Radiotherapie, Chemotherapie, beschrieben, das für die Medizin von Nutzen ist.
Technischer Hintergrund
Im Allgemeinen werden Krankheiten wie Krebs, erworbene Immundefizienz (AIDS), Herzerkrankungen, usw. von Anorexie, Gewichtsverlust, physischer Erschöpfung, Marasmus, Hautatrophie, Xerose, Anämie, Ödem, abnormer Blutgerinnung-Fibrinolyse usw. begleitet, wobei diese Pathologie als Kachexie definiert ist. Nach der Erkrankung an diesem systemischen Marasmus stirbt ein Patient schließlich (Tamaguma, M. et al., Igakutto-ayumi, 149, 371–373 (1989)). Findet ferner eine Radiotherapie und/oder Chemotherapie bei einem Patienten mit progressivem oder terminalem Krebs statt, für den eine Operation voraussichtlich keine Heilung bringt, dann kann es zu einer extremen Verringerung der biologischen Körperabwehrfunktion, wie der immunologischen Funktion, infolge einer spezifischen Mangelernährung kommen, die in einer Lebensverkürzung resultiert. Dies sind daher in deren praktischer Behandlung ernste Probleme. Es wurde bisher angenommen, dass Kachexie durch eine Unausgewogenheit des Nährstoffgleichgewichts zwischen (verringerter) Nährstoffaufnahme und (erhöhtem) Nährstoffverbrauch und die Auswirkungen des humorigen [sic] Faktors, mobilisiert von Krebs oder Läsion, auf den Systemmetabolismus ausgelöst wird. In den obigen Situationen findet eine positive Alimentation unter Verwendung einer kompletten parenteralen Ernährung statt, um extremen Nährstoff- oder Energiemangel aufzubessern und die immunologische Funktion zur Behandlung von Kachexie zu verbessern. Bei Kachexie wird die Aufnahme von Energie jedoch nicht dazu genutzt, das Leben des Patienten zu retten, sondern zur Proliferation der Tumorzelle, so dass eine Alimentation keine ausreichende Behandlung sein kann.
In jüngster Zeit wurde Monokin oder Cytokin, wie Tumornekrosefaktor (TNF), mobilisiert von Makrophage, als Ursache für Kachexie Beachtung geschenkt. Man hat festgestellt, dass TNF ein Faktor ist, der die Tumorzelle beeinflusst, und es hat sich herausgestellt, dass er von Makrophage sekretiert wird, der einer der Immunozyten ist und eine phagozytische Wirkung hat. Zwar wurde ursprünglich damit gerechnet, dass er aufgrund seiner direkten zytotoxischen Wirkung und starken Antitumoraktivität ein krebshemmendes Medikament ist, doch wurden kürzlich verschiedene Wirkungsweisen von TNF untersucht, da man festgestellt hatte, dass er Kachexie, d.h. Marasmus, einschließlich Gewichtsverlust bei einem Patienten mit Krebs oder einer starken Infektionskrankheit oder einer Anführer-Cytokin-induzierten Entzündung, verursacht. Die Hauptwirkungen sind (1) eine osteoklastische Wirkung, (2) die Einleitung von Hyperlipidämie durch Inhibition der Aufnahme von Lipid in die Zelle, (3) die Einleitung der Produktion von Interleukin 1 und Koloniestimulationsfaktor, (4) die Schädigung der Angioendothelzelle, (5) eine Zwischenreaktion eines Exotoxinschocks bei einer schlimmen Infektionskrankheit. Obwohl die Entwicklung eines Mittels zur Behandlung von Kachexie in Verbindung mit Krebs, erworbenem Immundefizienzsyndrom (AIDS), Herzerkrankungen, Infektionskrankheiten, Schock, Verbrennungen, Endotoxinämie, Organentzündung oder dieser Krankheiten an sich oder verschiedener Arten von Entzündungskrankheiten, wie chronische Rheumatoidarthritis und entzündliche Darmerkrankung, erwartet wird, gibt es derzeit tatsächlich kein zufrieden stellendes Mittel.
Offenbarung der Erfindung
Die Autoren der vorliegenden Erfindung führten beflissen Untersuchungen durch, um ein Mittel zur Behandlung von Kachexie zu finden, und stellten fest, dass TCF-II, bekannt als tumorzytotoxischer Faktor, eine ausgezeichnete Wirkung zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Kachexie hatte.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von TCF-II bei der Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung gegen und/oder Behandlung von Körpergewichtsverlust infolge der Proliferation von Krebszellen, des Fortschritts von Anämie infolge der Proliferation von Krebszellen und der Erhöhung von TNF infolge der Proliferation von Krebszellen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt einen Verbesserungseffekt von TCF-II auf den Gewichtsverlust bei Mäusen mit transplantierter KYN-2-Zelle im 1. Beispiel dar. In der Figur steht (++) für eine bedeutende Differenz (p < 0,01) zwischen der Situation vor und nach der Verabreichung und (**) steht für eine bedeutende Abweichung (p < 0,01) von Gruppe I nach der Verabreichung.
2 stellt einen Verbesserungseffekt von TCF-II auf einen verringerten Hämatokritwert bei Mäusen mit trans plantierter KYN-3-Zelle im 1. Beispiel dar. In der Figur steht (++) für eine bedeutende Differenz (p < 0,01) zwischen der Situation vor und nach der Verabreichung.
3 stellt einen Unterdrückungseffekt auf erhöhten TNF in Ascites bei Mäusen mit transplantierter KYN-3-Zelle im 1. Beispiel dar. In der Figur steht (*) für eine bedeutende Abweichung (p < 0,05) von Gruppe I und (**) steht für eine bedeutende Abweichung (p < 0,01) von Gruppe I.
Beste Art der Umsetzung der vorliegenden Erfindung
TCF-II, ein wirksamer Bestandteil der vorliegenden Erfindung, ist ein bekanntes Protein, das von humanen Fibroblasten gewonnen wird und die folgenden Eigenschaften hat. 1) Relative Molekülmasse (gemäß SDS-Elektrophorese)

unter nichtreduzierenden Bedingungen: 78.000 ± 2000 oder 74.000 ± 2000

unter reduzierenden Bedingungen: 52.000 ± 2000 (gemeinsame Bande A) 30.000 ± 2000 (Bande B) 26.000 ± 2000 (Bande C)

2) Isoelektrischer Punkt: 7,4–8,6
Der obige TCF-II kann gewonnen werden durch Adsorbieren von Kulturmedium aus humanen Fibroblasten auf einer Ionenaustauschsäule, anschließendes Reinigen des Eluats durch Affinitätschromatographie (WO 90/10651) oder durch gentechnische Manipulation (WO 92/01053). TCF-II, ein wirksamer Bestandteil der vorliegenden Erfindung, kann von Fibroblasten gewonnen oder durch gentechnische Manipulation unter Verwendung eines mikrobiellen Organismus oder einer anderen Zelle auf der Basis der in der WO 90/10651 beschriebenen Gensequenz produziert werden. Ferner kann auch TCF-II verwendet werden, der durch gentechnische Manipu lation wie in der WO 92/01053 beschrieben erhalten wird. TCF-II mit unterschiedlicher Kohlenhydratkette oder ohne Kohlenhydratkette aufgrund einer Abweichung bei der Wirtszelle oder beim mikrobiellen Organismus kann ebenfalls verwendet werden. Allerdings wird ein solcher mit Kohlenhydratkette bevorzugt verwendet. Mit diesen Verfahren gewonnener TCF-II kann durch gewöhnliche Isolierungs- und Reinigungsverfahren konzentriert und gereinigt werden. Als Beispiele sind eine Präzipitation mit organischem Lösungsmittel, Aussalzung, Gelpermeation, Affinitätschromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper und Elektrophorese zu nennen. Eine Reinigung durch Affinitätschromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper kann mit dem in der ungeprüften, offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 97 (1993) beschriebenen monoklonalen Antikörper durchgeführt werden. Der gewonnene TCF-II kann lyophilisiert oder gefroren aufbewahrt werden.
Eine Substanz mit der gleichen Aktivität wie TCF-II kann als erfindungsgemäßes Mittel verwendet werden. Als Beispiele sind Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF; ungeprüfte, offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 22526 (1988)), der durch Einfügen von 5 Aminosäuren in TCF-II-Protein gebildet wird, oder gereinigter Streufaktor (SF; Gherardi und Stocker, Nature, 346, 228 (1990)) zu nennen.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Vorbeugung gegen und/oder Behandlung von Kachexie kann intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden. Diese pharmazeutischen Präparate können mit einem bekannten Verfahren zur Zubereitung von Pharmazeutika zubereitet werden und bei Bedarf kann ein pH-Konditionierer, Puffer und/oder Stabilisator zugegeben werden. Die Dosis des vorliegenden Mittels kann je nach der Schwere der Symptome, des Gesundheits zustands, Alters und Körpergewichts eines Patienten variieren. Zwar ist die Dosis nicht eingeschränkt, doch kann ein pharmazeutisches Präparat aus 0,6 mg–600 mg TCF-II/Tag, vorzugsweise 6 mg–60 mg TCF-II/Tag einer erwachsenen Person auf einmal oder in mehreren Teildosen verabreicht werden.
Beispiel
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlich durch veranschaulichende Beispiele beschrieben. Es handelt sich hierbei aber lediglich um Beispiele, die die vorliegende Erfindung nicht begrenzen.
1. Herstellungsbeispiel
Reinigung von TCF-II
Mit einem in der WO 90/10651 beschriebenen Verfahren und einem von Higashio et al (Higashio, K. et al., B.B.R.C., Bd. 170, S. 397–404 (1990)) beschriebenen Verfahren wurde eine Zelle kultiviert und gereinigter TCF-II wurde gewonnen. Das heißt, 3 × 10⁶ humane Fibroblasten-IMR-90-(ATCC CCL-186)-Zellen wurden in eine Rollerflasche gegeben, die 100 ml DMEM Medium mit 5 % fötalem Kälberserum enthielt, und durch Rotieren mit einer Geschwindigkeit von 0,5–2 rpm 7 Tage lang kultiviert. Als die Gesamtzellzahl 1 × 10⁷ erreichte, wurden die Zellen von der Wand durch Tripsinverdau entfernt und am Boden der Flasche gesammelt. 100 g Keramik mit einer Größe von 5–7 mesh (Toshiba Ceramic) wurden sterilisiert und zugegeben, worauf eine 24-stündige Kultivierung folgte. Danach wurden 500 ml des obigen Kulturmediums zugegeben und die Kultivierung fortgesetzt. Das Gesamtvolumen des Kulturmediums wurde alle 7–10 Tage gewonnen und durch frisches Medium ergänzt.
Die Produktion wurde 2 Monate lang so fortgesetzt, wobei 4 Liter Kulturmedium pro Rollerflasche gewonnen wurden. Die spezifische Aktivität von TCF-II in dem wie oben gewonnenen Kulturmedium betrug 32 μg/ml. Kulturmedium (750 l) wurde durch Ultrafiltration mit einem Membranfilter (MW 6000 cut; Amicon) konzentriert und durch eine 4-Stufen-Chromatographie gereinigt, d.h. CM-Sephadex C-50 (Pharmacia), Con-A-Sepharose (Pharmacia), Mono-S-Säule (Pharmacia), Heparin-Sepharose (Pharmacia), um gereinigten TCF-II zu erhalten. Dieser TCF-II hatte die gleiche relative Molekülmasse und den gleichen isoelektrischen Punkt wie zuvor beschrieben.
2. Herstellungsbeispiel
Produktion von rekombinantem TCF-II
Mit dem in der WO 92/01053 beschriebenen Verfahren wurde eine mit TCF-II-Gen transformierte Zelle kultiviert und es wurde gereinigter TCF-II erhalten. Demzufolge wurde eine transformierte Namalwa-Zelle kultiviert und es wurden 20 l Kulturmedium gewonnen. Dieses Kulturmedium wurde durch CM-Sephadex-C-50-Chromatographie, Con-A-Sepharose-CL-6B-Chromatographie und schließlich HPLC mit einer Mono-S-Säule behandelt, um etwa 11 mg rekombinanten TCF-II zu gewinnen.
3. Herstellungsbeispiel
Herstellung eines pharmazeutischen TCF-II-Präparates
Es wurde ein Beispiel für die Herstellung von Injektionen des im 1. und 2. Beispiel gewonnenen TCF-II demonstriert:

(1) TCF-II 20 μg

Humanserumalbumin 100 mg
Die obige Zusammensetzung wurde in Zitronensäurepufferlösung mit einem pH-Wert von 6,03 gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie auf Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach einer Lyophilisation verschlossen wurden.

(2) TCF-II 40 μg

Tween 80 1 mg

Humanserumalbumin 100 mg
Die obige Zusammensetzung wurde in physiologischer Kochsalzlösung für Injektionszwecke gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie in Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach einer Lyophilisation verschlossen wurden.

(3) TCF-II 20 μg

Tween 80 2 mg

Sorbitol 4 g
Die obige Zusammensetzung wurde in Zitronensäurepufferlösung mit einem pH-Wert von 6,03 gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie in Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach einer Lyophilisation verschlossen wurden.

(4) TCF-II 40 μg

Tween 80 1 mg

Glycin 2 g
Die obige Zusammensetzung wurde in physiologischer Kochsalzlösung für Injektionszwecke gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie in Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach der Lyophilisation verschlossen wurden.

(5) TCF-II 40 μg

Tween 80 1 mg

Sorbitol 2 g

Glycin 1 g
Die obige Zusammensetzung wurde in physiologischer Kochsalzlösung für Injektionszwecke gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie in Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach der Lyophilisation verschlossen wurden.

(6) TCF-II 20 μg

Sorbitol 4 g

Humanserumalbumin 50 mg
Die obige Zusammensetzung wurde in Zitronensäurepufferlösung mit einem pH-Wert von 6,03 gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie in Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach der Lyophilisation verschlossen wurden.

(7) TCF-II 40 μg

Glycin 2 g

Humanserumalbumin 50 mg
Die obige Zusammensetzung wurde in physiologischer Kochsalzlösung für Injektionszwecke gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie in Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach der Lyophilisation verschlossen wurden.

(8) TCF-II 40 μg

Humanserumalbumin 50 mg
Die obige Zusammensetzung wurde in Zitronensäurepufferlösung mit einem pH-Wert von 6,03 gelöst, so dass das Gesamtvolumen bei 20 ml lag. Anschließend wurde sie in Phiolen mit jeweils 2 ml nach der Sterilisation aufgeteilt, die nach der Lyophilisation verschlossen wurden.
[1. Beispiel]
Wirkung einer TCF-Verabreichung auf Kachexie bei Mäusen mit transplantiertem humanem, hepatozellulärem Karzinom
Als transplantiertes humanes, hepatozelluläres Karzinom wurde die KYN-2-Zelllinie oder die KYN-3-Zelllinie verwendet, die Proliferation oder Zelldispersion im einleitenden In-vitro-Experiment aufzeigen. Es wurde eine statische Kultur beider Zelllinien mit Dulbecco MEM-Medium (Nissui-seiyaku) mit 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (Gibco), 12 mmol/1 Natriumbicarbonat, 20 % hitzeaktiviertem Kälberserum (Whittaker Bioproducts) bei 37°C, 5 % CO₂ und 100 % Feuchtigkeit durchgeführt. Nachdem Tripsin-EDTA zu beiden kultivierten Zelllinien gegeben worden war, wurden die Zellen getrennt, zweimal mit Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen und zu einer Zellsuspension mit 2,0 × 10⁷ Zellen/ml verarbeitet.
Nach dem Rasieren des Fells über der Haut der Transplantationsstelle von 4–5 Wochen alten weiblichen SCID-Mäusen, Desinfizieren der Stelle mit 70%igem Ethanol und einer Ätheranästhesie wurde die zuvor vorbereitete Tumorzelle in die Mäuse mit einer 23 G Spritzenkanüle transplantiert. Die KYN-2-Zelllinie (1,0 × 10⁷) wurde subkutan in den Rücken des Tieres transplantiert und KYN-3 (1,0 × 10⁷) wurde intraperitoneal transplantiert. Drei Wochen nach der subkutanen Transplantation der KYN-2-Zelllinie, als der Tumor einen Durchmesser von 5 mm erreichte, und 5 Wochen nach der intraperitonealen Transplantation der KYN-3-Zelllinie, wurden die Mäuse mit transplantiertem Tumor in jeweils 4 Gruppen aufgeteilt. Den Mäusen der Gruppe I, II, III und IV wurde jeweils ein Vehikel, 0,3 mg TCF-II/kg/Tag, 3,0 mg TCF-II/kg/Tag und 30 mg TCF-II/mg/kg verabreicht. Zwei Wochen lang wurde TCF-II zweimal täglich intraperitoneal Mäusen mit transplantierter KYN-2-Zelllinie und subkutan Mäusen mit transplantierter KYN-3-Zellinie verabreicht.
Das Körpergewicht wurde vor und nach der Verabreichung an die Mäuse mit subkutan transplantierter KYN-2-Zelllinie gewogen. Der Hämatokritwert wurde vor und nach der Verabreichung von TCF-II gemessen, indem von Mäusen mit KYN-3 unter Ätheranästhesie eine Blutprobe mit heparinisierter Hämatokrit-Kapillare (Termo) aus der Augenfundusarterie genommen und in üblicher Weise zentrifugiert wurde. Anschließend wurde der TNF-Wert in Ascites mit dem Factor-Test-XTM Mouse TNF ELISA Kit (Genzyme) nach der TCF-Verabreichung und Autopsie unter Ätheranästhesie gemessen. Easy Reader EAR 400 (SLT Laboinstruments) wurde zur Absorptiometrie verwendet.
Die Körpergewichtsveränderung bei der Gruppe mit Vehikelverabreichung und den Gruppen, denen TCF-II verabreicht wurde, ist in 1 dargestellt. Bei der Gruppe mit Vehikelverabreichung (Gruppe I) ging das Körpergewicht im Laufe von 2 Wochen wesentlich zurück (Verlust von etwa 20 %). Bei den Gruppen, denen TCF-II verabreicht wurde, wurde der Körpergewichtsverlust hingegen in dosisabhängiger Weise unterdrückt. Vor allem bei der Gruppe IV gab es keine wesentliche Differenz zwischen der Situation vor und nach der Verabreichung und ferner war das Körpergewicht der Gruppe IV deutlich höher als das der Gruppe I nach der Verabreichung. Die Veränderung des Hämatokritwertes bei der Gruppe mit Vehikelverabreichung und den Gruppen mit TCF-II-Verabreichung ist in 2 dargestellt. Durch die Verabreichung von TCF-II wurde der Hämatokritwert bei Mäusen mit Krebs verbessert und der Fortschritt von Anämie in Verbindung mit einer Tumorproliferation wurde tendenziell unter drückt. Außerdem ist der Unterdrückungseffekt von TCF-II auf die TNF-Erhöhung in 3 dargestellt. TNF, der bei Tieren mit Krebs eine Ursache für Kachexie war, wurde durch die Verabreichung von TCF-II auf dosisabhängige Weise wesentlich verringert, und selbst bei Gruppe II, der die Mindestdosis von 0,3 mg/kg/Tag verabreicht wurde, wurde eine wesentliche Unterdrückung beobachtet. Folglich wurde durch die TCF-II-Verabreichung Kachexie, wie Körpergewichtsverlust infolge einer Krebsproliferation, des Fortschritts von Anämie und einer Erhöhung von TNF, wesentlich verbessert.

Claims

Verwendung von TCF-II zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung gegen und/oder Behandlung von Körpergewichtsverlust infolge einer Krebszellenproliferation, Anämiefortschritt infolge einer Krebszellenproliferation und eine/einer Erhöhung von TNF infolge einer Krebszellenproliferation.