Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Element zur
quantitativen Bestimmung eines Rheumafaktors in biologischen Proben,
wie menschlichem Serum, und ein Verfahren zu dessen Bestimmung.
Hintergrund der Erfindung
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Man weiß, daß der Rheumafaktor (RF) sehr häufig in Serum- und
Synovialflüssigkeit von Patienten auftritt, die unter chronischem
Gelenkrheumatismus leiden, einer der Autoimmunkrankheiten. Es ist
auch bekannt, daß Patienten auch bei Collagenkrankheiten,
Leberkrankheiten, Infektionskrankheiten und anderen Krankheiten
positive Tests auf Rheumafaktor ergeben. Ein Assay für einen
Rheumafaktor ist sehr nützlich beim Diagnostizieren und Behandeln
dieser Krankheiten einschließlich chronischen Gelenkrheumatismus.
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Man hält den Rheumafaktor für einen Antikörper, der durch eine
Fehlerkennung von Immunglobulin gebildet wird. Dies wird zur
Beispiel durch die Tatsache nahegelegt, daß in
Synovialflüssigkeit von Patienten mit chronischem Gelenkrheumatismus ein
Immunkomplex, der IgG und Rheumafaktor umfaßt, gebildet wird.
Traditionell wurde der Rheumafaktor als Makroprotein mit einem
Molekulargewicht von etwa 1000000 identifiziert, das hauptsächlich
zur IgM-Klasse gehört. Kürzlich wurde jedoch bestätigt, daß es
weitere Rheumafaktortypen gibt, die zur IgG-Klasse und IgA-Klasse
gehören. Man erwartet, daß ein Assay zur Bestimmung der Menge von
Rheumafaktor der IgG-Klasse, Rheumafaktor der IgM-Klasse und
Rheumafaktor der IgA-Klasse, d.h. ein Assay nach Immunglobulin
klassen, eine wirksame Aufklärung der Krankheitsursache und ein
wirksame Diagnose erlaubt.
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Die verbreitet verwendeten Assayverfahren sind das
RA-Assayverfahren, das sich der Latexagglutinierung bedient, und das RAHA-
Assayverfahren, das sich der passiven Hämagglutinierung von roten
Blutkörperchen des Schafes bedient. Obwohl bei diesen
Assayverfahren auch eine halbquantitative Bestimmung durch
Verdünnungsreihen möglich ist, beruhen alle diese Verfahren auf nichts
weiter als einer qualitativen Reaktion. Daher führen diese
Assayverfahren zu Schwierigkeiten, zum Beispiel bei der genauen
Bestimmung von zeitlichen Veränderungen des Rheumafaktors.
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Einige quantitative Assayverfahren für einen Rheumafaktor wurden
als Verbesserung dieser qualitativen oder halbquantitativen
Verfahren entwickelt. Beispiele für das quantitative Assayverfahren
für einen Rheumafaktor sind das Laser-Nephelometrieverfahren, das
turbidimetrische Immunoassayverfahren und das
Markierungsimmunoassayverfahren. Von diesen quantitativen Assayverfahren erlauben
weder das Laser-Nephelometrieverfahren noch das turbidimetrische
Immunoassayverfahren eine genaue Bestimmung des Rheumafaktors zum
Beispiel der IgG-Klasse, obwohl sie beide die Bestimmung des
hochmolekularen Rheumafaktors der IgM-Klasse allein erlauben, da
sie auf Agglutinierung beruhen. Andererseits erlaubt das
Markierungsimmunoassayverfahren die Bestimmung von Rheumafaktoren nach
Immunglobulinklassen, da es sich der hohen Spezifität und hohen
Nachweisempfindlichkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion bedient,
wobei Antigen oder Antikörper auf einem unlöslichen Träger
immobilisiert sind (wegen Immunoassays auf einem festen Träger siehe
z.B. US-A-4 020 151 und EP-A- 070 527). Zum Beispiel beschreiben
I. Teitsson und M. Valdimarsson im Journal of Immunological
Methods, inl, 149 (1984), das folgende Verfahren. Zuerst wird ein
Element hergestellt, das einen unlöslichen Träger, wie
Polystyrol, und daran gekoppelt ein Immunglobulin, wie Kaninchen-IgG
oder denaturiertes Human-IgG, umfaßt. Zu diesem Element gibt man
eine Probe, die Rheumafaktor enthält, woraufhin der Rheumafaktor
an das IgG in dem Element bindet. Der so erhaltene IgG-gebundene
Rheumafaktor wird dann jeweils mit markierten Antikörpern, wie
markierten Anti-lluman-IgG, markierten Anti-Human-IgM und
markiertem Anti-Human-IgA, zur Reaktion gebracht. Dann wird die Menge
jedes an den Rheumafaktor gebundenen markierten Antikörpers
gemessen. Dieses Bestimmungsverfahren erlaubt die Bestimmung von
Rheumafaktor in der Probe nach der Immunglobulinklasse (z.B. RF
der IgG-Klasse, RF der IgM-Klasse oder RF der IgA-Klasse). Dieses
Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die Immunreaktivität von
trägergekoppeltem IgG in Fällen, bei denen das oben erwähnte
Element, das einen unlöslichen Träger und daran gekoppeltes IgG
umfaßt, vor der Verwendung hergestellt und in trockenem Zustand
gelagert wird, während der Lagerung merklich abnimmt. Die
Verwendung von Polystyrolträgern in isotypspezifischem ELISA zum
Nachweis von Rheumafaktoren ist aus Acta path. microbiol. immunol.
scand. Sect. C, Vol. 95, S. 161-165 (1987), ebenfalls bekannt.
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Da ein Assay von Rheumafaktor nach der Immunglobulinklasse bei
der ätiologischen Aufklärung, Diagnose und Behandlung
verschiedener mit Rheumafaktor zusammenhängender Krankheiten sehr
nützlich ist, erwartet man, daß man ein Assayelement und ein
Verfahren entwickeln wird, die die Bestimmung von Rheumafaktor mit
hoher Reproduzierbarkeit und hoher Präzision erlauben.
Offenbarung der Erfindung
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Der oben erwähnte Nachteil im Stand der Technik wird durch die
vorliegende Erfindung überwunden. Dementsprechend ist es ein Ziel
der vorliegenden Erfindung, ein Element zur quantitativen
Bestimmung eines Rheumafaktors, das die Bestimmung von Rheumafaktor
nach Immunglobulinklassen mit hoher Reproduzierbarkeit und hoher
Präzision auf der Basis des Markierungsimmunoassayverfahrens
erlaubt und eine ausgezeichnete Langzeitlagerungseigenschaft
besitzt, sowie ein Assayverfahren, das dieses Element verwendet,
bereit zustellen.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf ein Element zur
quantitativen Bestimmung eines Rheumafaktors in einer
biologischen Probe, gekennzeichnet durch einen festen
Polyalkylmethacrylatträger, der auf seiner Oberfläche aus Blut erzeugtes
Albumin trägt, wobei das Albumin an den festen Träger gebunden
ist und Anti-Albumin-IgG vom Kaninchen immunologisch an das
Albumin gebunden ist.
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Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur
quantitativen Bestimmung eines Rheumafaktors der IgG-Klasse, eines
Rheumafaktors der IgM-Klasse oder eines Rheumafaktors der IgA-
Klasse in einer biologischen Probe, gekennzeichnet durch das
Umsetzen einer unbekannten Menge des Rheumafaktors in der
biologischen Probe mit dem oben definierten Element, Umsetzen des an das
Element gebundenen Rheumafaktors mit enzymmarkiertem Anti-Human-
IgG, enzvmmarkiertem Anti-Human-IgM oder enzymmarkiertem
Anti-Human-IgA, Bestimmen der Menge des Markerenzvms, das an das Element
gebunden oder nicht gebunden ist, und quantitatives Bestimmen des
Rheumafaktors der IgG-Klasse, des Rheumafaktors der IgM-Klasse
oder des Rheumafaktors der IgA-Klasse in der biologischen Probe.
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Der für das Element der vorliegenden Erfindung zum quantitativen
Bestimmen eines Rheumafaktors verwendete feste Träger ist ein aus
Polyalkylmethacrylat, vorzugsweise Polvmethylmethacrylat,
geformtes Produkt, z.B. eine Mikrotiterplatte, eine Kugel oder ein
Röhrchen. Die Verwendung dieses Polyalkylmethacrylatträgers
reduziert die nicht spezifische Adsorption im Vergleich zur Verwendung
eines festen Trägers aus einem anderen Material, wie Polystyrol
oder Polyamid, für den Assay und erlaubt daher eine genauere
Bestimmung von Rheumafaktor mit hoher Empfindlichkeit.
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Das Element der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen eines
Rheumafaktors wird zum Beispiel wie folgt hergestellt: Zuerst wird
aus Blut erzeugtes Albumin, wie Rinderserumalbumin (BSA) in einer
geeigneten Pufferlösung gelöst und mit dem oben erwähnten festen
Träger in Kontakt gebracht, um das aus Blut erzeugte Albumin zu
adsorbieren und zu immobilisieren. Nach Entfernen des nicht
adsorbierten Albumins wird eine Lösung von Anti-Albumin-IgG mit dem
Träger in Kontakt gebracht, um das Anti-Albumin-IgG an das
trägergekoppelte Albumin zu binden und einen Immunkomplex zu bilden.
Nach Entfernen des ungebundenen Anti-Albumin-IgG wird eine
Pufferlösung, die zum Beispiel Zucker enthält, mit dem Immunkomplex
in Kontakt gebracht, um den nichtspezifischen Bindungsbereich auf
der Oberfläche des Trägers zu blockieren. Nach Entfernen der
obigen Pufferlösung wird der Träger gründlich getrocknet, wobei
erforderlichenfalls ein Vakuumtrockner verwendet wird, wodurch
man das Element der vorliegenden Erfindung zum quantitativen
Bestimmen eines Rheumafaktors erhält. Ein Immunkomplex aus Albumin
und Anti-Albumin-IgG des Kaninchens kann durch ein chemisches
oder physikalisches Mittel auf dem festen Träger immobilisiert
werden. Es ist wünschenswert, daß das so hergestellte Element zum
quantitativen Bestimmen eines Rheumafaktors zusammen mit einem
Trockenmittel, wie Silicagel, in einem mit Stickstoffgas
gefüllten Behälter verschlossen und unter Kühlbedingungen gelagert
wird.
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Als Beispiel für das aus Blut erzeugte Albumin, das für das oben
erwähnte Element verwendet wird, sei Rinderserumalbumin (BSA)
erwähnt. Anti-Rinderserumalbumin-IgG-Antikörper des Kaninchens
(α-BSA rab. IgG) ist das besonders geeignete Anti-Albumin-IgG.
Die Verwendung dieser Komponenten ergibt ein Element zum
Bestimmen eines Rheumafaktors mit viel höherer Reproduzierbarkeit
im Vergleich mit der Verwendung von konventionellem Kaninchen-IgG
oder denaturiertem Human-IgG, das frei von der Möglichkeit eines
Aktivitätsverlusts ist.
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Wenn das oben erwähnte Element zum Bestimmen eines Rheumafaktors
verwendet wird, kann der Rheumafaktor wie folgt bestimmt werden.
Zum Beispiel wird eine biologische Probe, wie Humanserum, mit dem
wie oben hergestellten Element zum Bestimmen eines Rheumafaktors
in Kontakt und gründlich zur Reaktion gebracht. Der Rheumafaktor
in der biologischen Probe reagiert mit dem Albumin/Anti-Albumin-
IgG-Immunkomplex auf dem festen Träger. Nach Beendigung der
Reaktion werden die nicht umgesetzten Substanzen entfernt, und danach
erfolgt eine Reaktion mit einem enzymmarkierten Antikörper, der
der Immunglobulinklasse des zu bestimmenden Rheumafaktors
entspricht (z.B. markiertes Anti-Human-IgG, wenn RF der IgG-Klasse
bestimmt werden soll). Nach der Trennung des markierten
Antikörpers, der auf dem festen Träger mit dem Rheumafaktor reagierte,
von dem nicht umgesetzten markierten Antikörper wird die Menge
des Enzyms in dem markierten, an Rheumafaktor gebundenen
Antikörper oder die Menge des Enzyms in dem nicht gebundenen
markierten Antikörper bestimmt. Die Menge des an das Element der
vorliegenden Erfindung zum Bestimmen eines Rheumafaktors
gebundenen Markerenzyms ist proportional zu der Menge des in der
biologischen Probe vorhandenen Rheumafaktors, während die Menge des
nicht an das Element gebundenen Markerenzyms der Menge des
Rheumafaktors in der biologischen Probe umgekehrt proportional
ist. Zu den Beispielen für das beim oben erwähnten Verfahren zur
Markierung des Antikörpers verwendete Enzym gehört Peroxidase.
Die Messung des Markerenzyms wird im Einklang mit einem
gewöhnlichen Verfahren erreicht. Peroxidase wird zum Beispiel anhand
einer Farbreaktion unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und
o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid gemessen. Der Rheumafaktor wird
mit großer Präzision nach der Immunglobulinklasse quantifiziert,
indem man die Menge des Enzyms in dem markierten Antikörper wie
oben beschrieben bestimmt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlicher anhand
der folgenden Arbeitsbeispiele und dem Vergleichsbeispiel
beschrieben.
Beispiel 1
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(A) Herstellung eines Elements zum Bestimmen eines Rheumafaktors:
Auf eine Polymethylmethacrylat-Mikrotiterplatte wurde eine 1/15 M
phosphatgepufferte Salzlösung (im folgenden als PBS abgekürzt,
ph 7,2), die 0,2% BSA enthielt, mit 50 ul pro Vertiefung
verteilt. Nachdem die Mikrotiterplatte drei Tage bei 4ºC
stehengelassen wurde, um BSA zu adsorbieren, wurde jede Vertiefung
zweimal mit 0,01 M PBS (pH 7,2) gewaschen, um die nicht adsorbierten
Substanzen zu entfernen. Auf jede Vertiefung der Mikrotiterplatte
verteilte man 50 ul einer Lösung, die durch Verdünnen von 6,0
mg/ml α-BSA rab. IgG (erzeugt von Cappel Co.) mit 1/15 M PBS (pH
7,2) auf das 400-fache erhalten wurde. Man ließ die
Mikrotiterplatte über Nacht bei 4ºC stehen, um durch Reaktion zwischen an
der Innenwand der Mikrotiterplatte immobilisiertem BSA und α-BSA
rab. IgG einen Immunkomplex zu bilden. Nach Beendigung der
Reaktion wurde jede Vertiefung zweimal mit 0,01 M PBS (pH 7,2)
gewaschen. Auf jede Vertiefung verteilte man 100 ul 1/15 M PBS
(pH 7,2), die 5% Sucrose enthielt; dann wurde die
Mikrotiterplatte zum Blockieren 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen
gelassen. Schließlich wurde jede Vertiefung einmal mit 0,01 M PBS
(pH 7,2) gewaschen; die Mikrotiterplatte wurde mit Hilfe eines
Vakuumtrockners gründlich getrocknet; dann wurde die
Mikrotiterplatte zusammen mit Silicagel in einen aluminiumbeschichteten
Beutel gegeben, der dann nach Ersetzen der Luft durch
Stickstoffgas verschlossen wurde. Diese Mikrotiterplatte in dem
verschlossenen Beutel wurde vor der Verwendung bei 4ºC gelagert.
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(B) Bestimmung von Rheumafaktor: Auf jede Vertiefung der oben in
(A) erhaltenen Mikrotiterplatte verteilte man 50 ul Serum, das
mit 0,05 M PBS (pH 7,2), das 0,5% BSA enthielt, auf das 101-fache
verdünnt worden war; diese Mikrotiterplatte wurde 1 Stunde bei
Raumtemperatur stehen gelassen, um die Reaktion durchzuführen.
Nach Beendigung der Reaktion wurde diese Mikrotiterplatte fünfmal
mit 0,01 M PBS (pH 7,2) gewaschen, um die nicht umgesetzten
Substanzen zu entfernen. Dann wurde ein mit Peroxidase markierter
Antikörper, der auf eine geeignete Konzentration verdünnt worden
war und der der Immunglobulinklasse des zu bestimmenden
Rheumafaktors entsprach (z.B. mit Peroxidase markiertes Anti-Human-IgG,
wenn RF der IgG-Klasse gemessen werden soll) mit 50 ul pro
Vertiefung auf die Mikrotiterplatte verteilt. Diese Mikrotiterplatte
wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die
Reaktion durchzuführen. Nach Beendigung der Reaktion wurde diese
Mikrotiterplatte wiederum fünfmal mit 0,01 M PBS (pH 7,2)
gewaschen, um die nicht umgesetzten Substanzen zu entfernen. Auf
jede Vertiefung verteilte man 50 ul einer Lösung von
o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (3 mg/ml), die 0,02% Wasserstoffperoxid
enthielt. Nach 30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur wurde in
jede Vertiefung 100 ul 1 N H&sub2;SO&sub4; gegeben, um die Enzymreaktion zu
beenden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe eines Spektrometers
für Mikrotiterplatten (Microplate EL 310, erzeugt von Biotech
Co.) bei einer Wellenlänge von 490 nm getestet.
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(C) Lagerstabilitätstest: Die in (A) oben erhaltene
Mikrotiterplatte wurde bei einer kontrollierten Temperatur von 9ºC ± 1ºC
gelagert und alle drei Monate getestet. Die verwendeten Proben
waren zwei Serumproben, die einen positiven Test auf Rheumafaktor
ergaben (Standards 1 und 2), eine Serumprobe, die einen negativen
Test auf Rheumafaktor ergab (NHS), sowie eine Probe, die kein
Serum enthielt (Blindprobe). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1(a)
zusammengefaßt.
Vergleichsbeispiel 1
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Dieselbe Polymethylmethacrylat-Mikrotiterplatte wie in Beispiel
1 wurde als fester Träger verwendet. Auf jede Vertiefung dieser
Mikrotiterplatte verteilte man 100 ul einer Lösung (20 ug/ml) von
Kaninchen-IgG (erzeugt von Miles Co.), das durch 30 Minuten
Erwärmen auf 56ºC denaturiert worden war, in 0,01 M PBS (pH 7,2).
Diese Mikrotiterplatte wurde über Nacht bei 4ºC stehen gelassen.
Dann wurde jede Vertiefung zweimal mit 0,01 M PBS (pH 7,2)
gewaschen. Auf jede Vertiefung verteilte man 200 ul 0,01 M PBS (pH
7,2), die 1% BSA und 5% Sucrose enthielt. Die Mikrotiterplatte
wurde zum Blockieren 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Schließlich wurde die Mikrotiterplatte einmal mit 0,01 M PBS
(pH 7,2) gewaschen, woraufhin sie in derselben Weise wie in
Beispiel 1 getrocknet und gelagert wurde.
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Die wie oben hergestellte Mikrotiterplatte wurde demselben
Lagerstabilitätstest wie in Beispiel 1 unterzogen. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 1(b) gezeigt.
Tabelle 1(a)
RF nach Immunglobulinklasse
Lagerzeit
Probe
Start
Monate
Standard
Blindprobe
Tabelle 1(b)
RF nach Immunglobulinklasse
Lagerzeit
Probe
Start
Monate
Standard
Blindprobe
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Wie aus den Tabellen 1(a) und (b) hervorgeht, gewährleistet die
Verwendung eines Elements der vorliegenden Erfindung zum
Bestimmen eines Rheumaffaktors, insbesondere ein Element, das einen
BSA/(α-BSArab.IgG)-Immunkomplex umfaßt, eine merkliche
Verbesserung der Lagerstabilität im Vergleich zur Verwendung von
Kaninchen-IgG. Es ist auch offensichtlich, daß die Lagerstabilität
sich besonders merklich bei den quantitativen Assaysystemen für
Rheumafaktor der IgM-Klasse und Rheumafaktor der IgA-Klasse von
Vergleichsbeispiel 1 verbessert hat.
Beispiel 2
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Der Einfluß des Typs des festen Trägermaterials auf die
Assayempfindlichkeit wurde unter Verwendung zweier Arten von
Mikrotiterplatten untersucht, die aus verschiedenen Materialien bestanden,
das heißt, einer Polymethylmethacrylat-Mikrotiterplatte und einer
Polystyrol-Mikrotiterplatte. Unter Verwendung dieser beiden Arten
von Mikrotiterplatten wurden Rheumafaktor-Assayplatten in
derselben Weise wie in Beispiel 1 hergestellt und dann verwendet, um
Rheumafaktor der IgG-Klasse in Proben von Humanserum, das einen
positiven Test auf Rheumafaktor ergab, sowie in solchen von
Humanserum, das einen negativen Test auf Rheumafaktor ergab
(normales Humanserum), nach demselben quantitativen Assayverfahren
zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Polymethylmethacrylatplatte
Polystyrolplatte
RF-positives Serum
RF-negatives Serum
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Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, überschreitet der OD-Wert des
Serums, das einen positiven Test auf Rheumafaktor ergibt, bei dem
Polymethylmethacrylat-Element der vorliegenden Erfindung zum
Bestimmen eines Rheumafaktors den des Serums, das einen negativen
Test auf Rheumafaktor ergibt, ausreichend. Während bei dem zum
Vergleich verwendeten Polystyrolelement zum Bestimmen eines
Rheumafaktors der OD-Wert des Serums, das einen positiven Test
auf Rheumafaktor ergibt, niedriger ist als der des Serums, das
einen negativen Test auf Rheumafaktor ergibt; man kann nicht
sagen, daß dieses Polystyrolelement eine ausreichende
Empfindlichkeit für die quantitative Bestimmung von Rheumafaktor in
HUmanserum habe. Dieser Befund zeigt klar, daß
Polymethylmethacrylat, das im Element der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen
eines Rheumafaktors verwendet wird, aufgrund reduzierter
nichtspezifischer
Adsorption anderen Materialien, wie Polystyrol, in
bezug auf die Assayempfindlichkeit überlegen ist.
Auswirkung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Element zur quantitativen
Bestimmung eines Rheumafaktors bereit, das die Bestimmung von
Rheumafaktor nach Immunglobulinklassen mit hoher
Reproduzierbarkeit und hoher Präzision erlaubt. Die Verwendung dieses Elements
erlaubt einen hochempfindlichen Assay auf Rheumafaktor nach
Immunglobulinklassen auf der Basis eines Enzymimmunassays. Das
Element der vorliegenden Erfindung zeigt auch nach längerer
Lagerung eine sehr gute Stabilität.