DE3882705T2

DE3882705T2 - Immunoglobulin-bestimmungsverfahren.

Info

Publication number: DE3882705T2
Application number: DE88902897T
Authority: DE
Inventors: Philip Mortimer; John Parry
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Public Health England
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2008-04-01
Also published as: DE3882705T3; WO1988007680A1; EP0355099B2; GB8707839D0; DE3882705D1; EP0355099B1; JPH02503228A; EP0355099A1; ATE92189T1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Bestimmung von Immunglobulinen in Körperflüssigkeiten. Insbesondere liefert die Erfindung ein Verfahren, die Anwesenheit oder Menge von spezifischem IgM, IgG oder IgA in Körperflüssigkeiten qualitativ oder quantitativ zu bestimmen.
Die Diagnose von vielen mikrobiellen Infektionen, insbesondere von jenen, die von Viren herrühren, und die Bestimmung von Immunität und Anfälligkeit gegenüber denselben beruht auf Serumtests. Serum ist die Flüssigkeit, die bei Blutgerinnung zurückbleibt, und es ist reich an Proteinen, die Immunglobuline genannt werden. Diese Proteine werden als Antwort auf Infektion mit besonderen Mikroorganismen gebildet und sind diesen gegenüber sehr spezifisch. In diesem Zusammenhang werden Immunglobuline als Antikörper bezeichnet. In den ersten paar Wochen nach dem einer mikrobiellen Infektion Ausgesetztsein steigt die Konzentration der spezifischen Antikörper schnell an. Die anfängliche Antwort auf die Infektion erfolgt gewöhnlich in einer besonderen Klasse von Immunglobulinen (IgM); die Bildung dieser Antikörper-Sorte ist jedoch von kurzer Dauer, so daß sie gewöhnlich nur gegenwärtig ist, wenn die Infektion vor kurzem stattgefunden hat. Sie kann deshalb als diagnostisches Kennzeichen benutzt werden und wird in einer Reihe von Virus- und anderen Infektionen so verwendet.
Eine andere Klasse von Immunglobulinen (IgG) wird etwas später nach der Infektion gebildet. IgG-Antikörper sind so spezifisch wie IgM-Antikörper, sind jedoch viel beständiger und bleiben im Falle vieler Virusinfektionen lebenslänglich vorhanden. Der IgG-Antikörper ist deshalb ein Kennzeichen für Infektion mit oder Immunität gegenüber dem Virus, für welches er spezifisch ist, und seine Abwesenheit ist ein Kennzeichen von Anfälligkeit. Unter den Infektionen, für welche die Messung spezifischer IgM- und IgG-Antikörper gebräuchlich ist, sind Röteln, Hepatitis A, Hepatitis B, Humaner Parvovirus B19, Masern, Mumps, Cytomegalievirus und Windpocken. Es wird zunehmend wünschenswert, auf IgM- und IgG-Antikörper gegen das Virus, das für die Krankheit AIDS (z.B. HIV, HTLV III oder LAV) verantwortlich ist, und andere Retroviren wie HTLV I zu testen.
In einigen Fällen ist es ebenfalls wünschenswert, auf eine weitere Klasse spezifischer Immunglobuline, IgA, zu testen, obwohl diese im allgemeinen für Diagnose- und Bestimmungszwecke weniger geeignet ist. Gegenwärtig wird der Test auf die Anwesenheit von spezifischem IgG und IgM an Blutserum ausgeführt, einer Körperflüssigkeit, die eine sehr hohe Konzentration von IgG und IgM enthält. Ein geeigneter Serumtest ist zum Beispiel in J. Medical Virology 19 (1986), 387 - 397 beschrieben. GB 2 026 691A beschreibt eine Bestimmung für Blutserum-IgG, -IgM und -IgA, in welcher das Ig von einem auf einem Substrat immobilisierten anti-γ, -u oder -α abgefangen und anschließend mit einem direkt oder indirekt markierten Antigen nachgewiesen wird. EPA 0 132 170 und 0 101 166 beschreiben ebenfalls Bestimmungen für Serum-Ig unter Verwendung verschiedener Verfahren.
Bedauerlicherweise kann Serum nicht ohne Venenpunktion gesammelt werden, und dies ist unbequem und manchmal unannehmbar, besonders bei Kindern und nervösen Erwachsenen. Im Falle von Tests auf das AIDS-Virus gibt es eine wirklich weitverbreitete öffentliche Voreingenommenheit gegenüber Venenpunktion. Venenpunktion ist außerdem sehr teuer, da eine sterile Nadel, Spritze, Hautdesinfektionsmittel und Verband erforderlich sind, und in bestimmten Fällen ist sie gefährlich und schwierig.
Spezifische Immunglobuline sind bekanntermaßen in anderen Körperflüssigkeiten vorhanden, von denen einige viel zugänglicher sind als Serum, zum Beispiel Speichel, Tränen, Sperma, Urin und Rückenmarksflüssigkeit. Die IgM- und IgG-Konzentrationen in diesen Flüssigkeiten sind viel niedriger als in Serum, z.B. in der Größenordnung von 0,01 und 0,001 der Konzentration in Serum. Speichel ist gewöhnlich eine der zugänglichsten solcher Flüssigkeiten.
Einige Arbeiten wurden über die Charakterisierung von Immunglobulinen in Speichel und über Verfahren, diese zu bestimmen, durchgeführt. Viele dieser Arbeiten waren allgemeiner Natur. Zum Beispiel zeigen Oral Surg. Oral Medicine Oral Pathol (US) (1985) 60(4), 372 - 376, J. Immunol. Meth. (1983) 57(1-3), 51-7 und Invest. Opthamol. Visual Sci. (1986) 27(4), 622 - 5 die Anwesenheit aller Klassen (IgA, IgG und IgM) in Speichel.
J. Immunological Methods (1984) 71, 203 - 10 zeigt die Anwesenheit von anti-Escherichia coli-IgG- und IgM-Antikörpern in Serum, indem spezifisches Escherichia coli-Antigen auf einem Substrat abgeschieden und dies dem Serum ausgesetzt wird. Diese Referenz vermutet, daß das Verfahren verwendet werden könnte, um auf diese Antikörper in Speichel zu testen - jedoch ohne irgendwelchen experimentellen Beweis.
J. Infect. Diseases (US) (April 1987) 155 (4), 793 - 796 und (1985) 152(6), 1238 - 44 beschreiben Versuche, IgA in Speichel zu bestimmen. Die 1987-Referenz verwendet ein Verfahren, das für wissenschaftliche Anwendungen, aber nicht für klinische Routine-Arbeit geeignet ist, und das Gelchromatographie des gebildeten Immunpräzipitats umfaßt Die 1985-Referenz immobilisiert ein spezifisches Poliovirus-Antigen auf einem Substrat und versucht, spezifisches IgA einzufangen. Beide dieser Referenzen weisen auf die Notwendigkeit hin, die Probe zuerst zu zentrifügieren.
Die hauptsächlichen in Immunglobulinbestimmungen verwendeten Immunglobuline, IgG und IgM, kommen in Speichel nur zu ungefähr 0,3% des Wertes von IgA in Speichel vor, und deshalb wird von keinem der oben aufgeführten Verfahren erwartet, für die Bestimmung von IgG oder IgM in Speichel, oder, was das betrifft, in anderen Körperflüssigkeiten, die solch niedrige Werte von IgG oder IgM enthalten, verwendbar zu sein. Tatsächlich waren aufgrund dieser niedrigen Konzentration keine gegenwärtig verwendeten Tests oder Bestimmungen für IgG oder IgM sehr erfolgreich oder zuverlässig, wenn sie entweder auf Speichel oder auf solche Flüssigkeiten angewendet wurden, und bis jetzt wurde kein geeignetes Verfahren für IgG- oder IgM-Bestimmung in solchen Flüssigkeiten ohne unbequeme vorherige Behandlung wie Zentrifugieren oder Aufkonzentrieren usw. gefünden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist es, einen qualitativen und quantitativen Test (Bestimmung) auf spezifische Immunglobuline in leicht zugänglichen Körperflüssigkeiten, insbesondere Speichel, zu liefern.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung spezifischer Immunglobuline einiger oder aller Klassen geliefert, die in einer menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Speichel, Tränen, Sperma, Urin und Rückenmarksflüssigkeit, vorhanden sind, welches die Schritte von
(i) Immobilisieren eines Antikörpers gegen eine oder mehrere Klassen von Immunglobulinen auf einem festen Substrat
(ii) Aussetzen des immobilisierten Antikörpers einer Probe der Körperflüssigkeit, um Bindung eines Teils von irgendeinem Immunglobulin, das in der Flüssigkeit vorhanden ist, an den immobilisierten Antikörper zu erreichen, und
entweder
(a) das gebundene Immunglobulin einem ausgewählten Antigen auszusetzen, um Bindung des markierten Antigens an wenigstens einen Teil des gebundenen Immunglobulins zu erreichen
oder
(b) das gebundene Immunglobulin einem ausgewählten Antigen auszusetzen, um Bindung des Antigens an wenigstens einen Teil des gebundenen Immunglobulins zu erreichen, und anschließend Binden eines markierten Antikörpers mit Spezifität für das ausgewählte Antigen direkt oder indirekt an wenigstens einen Teil des gebundenen Antigens
(iii) und anschließend Nachweis und/oder Messung einer Eigenschaft des markierten Antigens oder Antikörpers
umfaßt.
Mit "markiert" ist ein Antigen oder Antikörper mit einer nachweisbaren und/oder meßbaren charakteristischen Eigenschaft gemeint. Diese Eigenschaft kann in einem bekannten Antigen oder Antikörper vorhanden sein oder kann chemisch oder physikalisch in das Antigen oder den Antikörper eingeführt werden. Die Technik des Markierens und geeignete Marker sind wohlbekannt, und jeder herkömmliche Marker kann verwendet werden. Geeignete Marker umfassen Radio-, Enzym-, Fluoreszenz- oder Lumineszenzmarkierung, Oberflächen- Plasmonen-Resonanz (SPR) oder Anhängen an kleine Partikel wie aus Latex oder Gelatine, die irgendeine nachweisbare charakteristische Eigenschaft haben.
Mit "ausgewähltes Antigen" ist ein Antigen gemeint, für welches die Anwesenheit von spezifischem Immunglobulin in der Körperflüssigkeit aufzuzeigen gewünscht wird.
Mit dem Verfahren der Erfindung kann die nachweisbare und/oder meßbare Eigenschaft des markierten Antigens oder Antikörpers qualitativ oder quantitativ mit der Anwesenheit und/oder Menge des spezifischen Immunglobulins in der Körperflüssigkeit verknüpft werden.
Ein kennzeichnender Faktor für das Verfahren der Erfindung ist, daß die Möglichkeit der Bestimmung nicht so sehr von der Absolutkonzentration des spezifischen Immunglobulins in der Körperflüssigkeit abhängt, sondern von dem Teil des Gesamtimmunglobulins, der für den gebundenen Antikörper spezifisch ist.
Unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann die Anwesenheit und/oder Menge eines spezifischen Immunglobulins in einer Körperflüssigkeit, in der es in verhältnismäßig geringen Mengen vorhanden ist, nachgewiesen und/oder gemessen werden. Von diesen ist Speichel aufgrund der bequemen Verfügbarkeit vorzuziehen.
Mittels der Erfindung können viele menschliche und/oder tierische Immunglobuline bestimmt werden, zum Beispiel jene, die als Antwort auf die Viren, die mit Hepatitis (A und B), Röteln, Masern, Humanem Parvovirus B19, Mumps, Windpocken (VZ Virus) und AIDS (HIV, LAV oder HTLV III) verbunden sind, gebildet werden. Obwohl das Verfahren für alle Klassen von Immunglobulinen, z.B. IgA, IgM und IgG, geeignet ist, wird bevorzugt, es für die Bestimmung von IgM und/oder IgG zu verwenden, da diese zum Nachweis von Infektion oder Immunität am brauchbarsten sind.
Klassenspezifische und nichtklassenspezifische Antikörper gegen Immunglobuline, welche in Schritt (i) der Erfindung verwendet werden können, sind bekannt und können kommerziell erhältlich sein oder unter Verwendung bekannter Verfahren, z.B. monoklonaler Verfahren, hergestellt werden. Geeignete Beispiele schließen die bekannten anti-IgG-, anti- IgM- und anti-IgA-Antikörper ein, zum Beispiel jene, welche für die Immunglobulin-γ-, -u- oder -α-Ketten, die jeweilig in IgG, IgM und IgA gefünden werden, spezifisch sind.
Der Antikörper kann an das Substrat unter Verwendung bekannter Verfahren gebunden werden, z.B. Eintauchen des Substrats in eine Lösung des Antikörpers bei geeigneter Verdünnung und pH-Wert. Zum Beispiel kann ein pH-Wert von 7 bis 11, vorzugsweise 9 bis 10, verwendet werden, der mit bekannten Puffern, z.B. einem Na&sub2;CO&sub3;/NaHCO&sub3;-Puffer, erreicht wird. Lösungen von Antikörpern sind kommerziell erhältlich, und eine geeignete Verdünnung ist 1 : 200 bis 1 : 4000 der kommerziellen Antikörper-Lösung. Geeignete Substrate schließen Polystyrol z.B. in Form von Kügelchen [bead form] oder in Form einer Mikrotiterplatte oder eines anderen kleinen Gefäßes ein.
Die Körperflüssigkeitsprobe zur Bestimmung kann durch völlig konventionelle Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt sind, genommen werden. Im Falle der bevorzugten Flüssigkeit, Speichel, wird bevorzugt, daß der Speichel gesammelt wird, indem der Patient auf ein Schwamm- oder Baumwoll-Röllchen kaut, welches anschließend zusammengepreßt oder zentrifügiert werden kann, um geklärten Speichel zu gewinnen. Daher besteht im allgemeinen keine Notwendigkeit, die Immunglobuline aufzukonzentrieren oder den Speichel vor Anwendung des Bestimmungsverfahrens weiter zu zentrifügieren.
Das Substrat, das den gebundenen Antikörper trägt, kann anschließend einer Probe der Körperflüssigkeit, z.B. Speichel, ausgesetzt werden, welche - falls notwendig - mit einem Puffer auf einen geeigneten Wert verdünnt werden oder manchmal unverdünnt verwendet werden kann. Typischerweise, aber nicht ausschließlich, kann die Flüssigkeit 1 : 2 bis 1 : 20 im Puffer verdünnt werden. Für üblicherweise gesuchte Immunglobuline, z.B. die IgG oder IgM, die als Antwort auf die Infektionen Röteln, Masern, Mumps, Hepatitis A oder B, AIDS (d.h. HIV), gebildet werden, sind Verdünnungen der Speichelprobe in einem Bereich 1 : 2 bis 1: 10 im Puffer im allgemeinen geeignet. Ein geeigneter Puffer ist phosphatgepufferte Salzlösung [phosphate buffered saline] (PBS), die 0,06 - 0,10 Gew.% Natriumazid, 0,05 - 0,15% Tween 20 (Warenzeichen) und 5 - 15% fötales Kälberserum (FCS) enthält. Die Bedingungen des Aussetzens, z.B. Zeit, Temperatur usw., werden von der Flüssigkeit, dem zu bestimmenden Immunglobulin, dem gebundenen Antikörper, dem Substrat usw. abhängen, können jedoch ausreichend mild gemacht werden, um zu ermöglichen, daß das Verfahren in klinischen Tests und Screening bequem zu verwenden ist. Beispielsweise ist mit den oben erwähnten gewöhnlich gesuchten Immunglobulinen Inkubation mit der verdünnten oder unverdünnten Flüssigkeit, z.B. Speichelprobe, für ungefähr 1 bis 3 Stunden bei 37 ºC im allgemeinen geeignet. Überschüssige Körperflüssigkeits-Lösung wird dann weggewaschen, z.B. mit einer Lösung von Tween 20 in PBS.
Wenn Alternative (a) des Verfahrens verwendet wird, kann das gebundene Material anschließend einer Lösung des markierten Antigens ausgesetzt werden, z.B. einem radioaktiv- oder enzym-markierten Antigen von einem oder mehreren der oben aufgeführten Viren. Diese können mit bekannten Methoden (z.B. Schmitz et al., J. Gen. Virol. 50 (1980) hergestellt und kommerziell erhalten werden.
In Alternative (a) des Verfahrens ist es meistens vorzuziehen, eine Form des Antigens, so rein wie sie erhalten werden kann, zu verwenden, um die Möglichkeit zu vermeiden, daß anderes Material als das Antigen an das gebundene Immunglobulin bindet, z.B. Bruchstücke [debris], die von dem Medium, in dem das Antigen hergestellt wurde, übrigbleiben.
Eine bevorzugte Form von markiertem Antigen zur Verwendung in Alternative (a) des Verfahrens ist ein kleines mit dem Antigen beschichtetes Partikel. Viele solcher Partikel sind kommerziell erhältlich. Wenn solche Partikel irgendeine nachweisbare Eigenschaft besitzen, wie Radioaktivität oder insbesondere Farbigkeit, kann die Bindung der Partikel an das gebundene Immunglobulin leicht beobachtet und/oder gemessen werden.
Wenn die Partikel deutlich gefärbt sind, z.B. rot oder blau, wenn ferner das Substrat aus der Oberfläche einer Vertiefüng in einer Platte besteht, dann kann der relative Bindungsgrad der Partikel gemessen werden, indem die Intensität der durch die Bindung dieser Partikel verursachten Farbe beobachtet wird. Wahlweise kann, wenn die Oberfläche geformt oder ausgerichtet ist, so daß die Schwerkraft dazu führt, daß ihre Bindung an die Oberfläche verhindert wird, das Ausmaß, in welchem sie sich zu tieferen Teilen der Platte hin absetzen, beobachtet werden, z.B. mit dem bloßen Augen oder einem Mikroskop.
Insofern als die Verwendung von solchen gefärbten Teilchen keine hochentwickelten Nachweisapparaturen wie Radioaktivitätsdetektoren erforderlich macht, ist sie zum Gebrauch im Feldeinsatz oder durch verhältnismäßig ungeübtes medizinisches Personal besonders bequem.
Inter alia wird Alternative (b) bevorzugt, da sie die Verwendung eines so reinen Antigens, wie es für Alternative (a) benötigt wird, nicht notwendigerweise erfordert. In diesem Fall wird das gebundene Material einem unmarkierten Antigen, d.h. einem Antigen von einem oder mehreren der oben aufgeführten Viren, ausgesetzt. Die Aussetzungsbedingungen werden von dem verwendeten Antigen usw. abhängen, können aber, wie oben, so sein, daß sie bequeme klinische Verwendung erlauben. Typischerweise kann eine kommerziell erhältliche Antigen-Lösung, falls notwendig mit dem oben angegebenen Puffer verdünnt, verwendet werden, die ebenfalls normales (d.h. das den in der Bestimmung gesuchten spezifischen Antikörper nicht hat) humanes Serum, z.B. 0 - 5%, enthält.
Nachdem dem unmarkierten Antigen ausgesetzt wird, sollte überschüssige Antigen-Lösung weggewaschen werden, z.B. mit der oben angegebenen Pufferlösung.
Die Bindung des markierten Antikörpers an das gebundene Antigen kann direkt sein, z.B. indem das gebundene Antigen dem markierten Antikörper in Lösung direkt ausgesetzt wird. Wahlweise kann die Bindung des markierten Antikörpers an das gebundene Antigen indirekt sein, z.B. ein weiterer Antikörper gegen das gebundene Antigen, z.B. kann ein monoklonaler anti-Röteln-Antikörper an das gebundene Antigen gebunden werden, indem der weitere Antikörper ausgesetzt wird, z.B. indem der markierte Antikörper dem weiteren Antikörper ausgesetzt wird.
Die Bindung eines radioaktiv markierten Antikörpers gegen das gebundene Antigen oder den weiteren Antikörper kann erreicht werden, indem das gebundene Antigen oder der weitere Antikörper einer Lösung des radioaktiv markierten Antikörpers ausgesetzt wird.
Die Lösung kann ein kommerziell erhältlicher radioaktiv markierter Antikörper sein, wenn notwendig mit einem Puffer verdünnt, z.B. einem Puffer, der PBS und 0,15 - 0,25% Tween 20, 5 - 15% FCS, 0 - 15% normales Kaninchen-Serum (NRS), 0 - 10% normales Ziegen-Serum (NGS) und 0 - 50% normales humanes Serum (NHS) enthält. Überschüssige Lösung, die den nicht-gebundenen Radio-Marker enthält, sollte anschließend weggewaschen werden.
Geeignete Radio-Marker schließen ¹²&sup5;J, ³²P, ³H und ³&sup5;S ein. Diese Marker können unter Verwendung bekannter Methoden, z.B. jener von Salicinski et al., J. Endocrinology 81 (1979), in das Antikörper-Molekül eingeführt werden.
Falls ein Radio-Marker verwendet wird, wird die Radioaktivität des markierten Materials anschließend unter Verwendung herkömmlicher Verfahren gemessen.
Falls ein enzym-markierter Antikörper gegen das gebundene Antigen oder den weiteren Antikörper verwendet werden soll, kann dies ebenfalls erreicht werden, indem das gebundene Antigen oder der weitere Antikörper einer Lösung des enzym-markierten Antikörpers ausgesetzt wird. Typischerweise kann ein kommerziell erhältliches Antikörper-Enzym- Konjugat verwendet werden, das, falls notwendig, verdünnt wird, z.B. in einem Puffer wie einem, der PBS, 0 - 50% FCS, 0,5 - 15% NHS, 0 - 10% normales Kaninchen-Serum (NRS), 0 - 0,3% Tween 20 enthält.
Überschüssige Lösung, die ungebundenen enzym-markierten Antikörper enthält, sollte anschließend weggewaschen werden, z.B. mit PBS mit Tween 20.
Geeignete Enzym-Marker schließen Peroxidase-Enzym, z.B. Meerrettichperoxidase (HRPO), und Phosphatase-Enzyme ein. Falls kommerziell nicht erhältlich, können Antikörper- Enzym-Konjugate nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Einige der Schritte des (und einschließlich des) Aussetzens des gebundenen Antikörpers der Probe, die die Körperflüssigkeit enthält, können gleichzeitig ausgeführt werden.
Wenn in Alternative (a) oder (b) ein Enzymmarker verwendet wird, kann die Enzymaktivität des markierten Stoffes anschließend gemessen werden, zum Beispiel indem man den gebundenen Enzymmarker eine Reaktion katalysieren läßt, deren Fortschreiten quantitativ gemessen und zu der an gebundenem Marker vorhandenen Menge in Bezug gesetzt werden kann. Bevorzugte Reaktionen sind jene, die photometrisch verfolgt werden können, zum Beispiel durch Bildung oder Verschwinden einer optisch absorbierenden Verbindung. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet üblich.
Ob Alternative (a) oder (b) befolgt wird und einerlei, welche Art von Marker verwendet wird, können die Ergebnisse, z.B. Radioaktivität, Enzymaktivität der Bestimmung oder Beobachtung von Farbe, z.B. von gebundenen farbigen Teilchen, in einer herkömmlichen Art der Datenverarbeitung behandelt werden. Zum Beispiel können die Ergebnisse einer Bestimmung an einer bestimmten Flüssigkeitsprobe mit Standard-Negativ-Proben, die bekanntermaßen nichts des spezifischen Immunglobulins enthalten, oder mit einem Set positiver Proben, die bekanntermaßen einen Bereich von Einheiten des spezifischen Immunglobulins enthalten, verglichen werden. Geeignete Vorgehensweisen werden dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt sein.
Um die Verwendung der Erfindung in der Praxis zu unterstützen, können Kits bereitgestellt werden, die zum Beispiel Proben der notwendigen Reagenzien enthalten, z.B. Antikörper fuhr Schritt (i), ausgewähltes markiertes Antigen für Schritt (ii)b, markierten Antikörper für Schritt (ii)b. Das Kit kann außerdem eine Tabelle zur Interpretation der Ergebnisse von Schritt (iii) enthalten, z.B. des Auftretens des Substrats, falls in Schritt (ii)a farbige Partikel verwendet werden. Die Reagenzien usw. können in solch einem Kit in einer geeigneten Verdünnung, wie oben diskutiert, bereitgestellt werden, und das Kit kann ein Substrat enthalten, auf welchem bereits Antikörper für Schritt (i) immobilisiert sind.
Zur Vermeidung von Unklarheiten: Hinweise auf eine 1 : n Verdünnung (z.B. 1 : 1000 etc.) bedeuten hierin, daß 1 Volumenteil Flüssigkeit mit dem Verdünnungsmittel auf n Volumenteile aufgefüllt wird.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben - nur in Bezug auf die folgenden Figuren.
Figuren 1 bis 4 zeigen Vergleiche zwischen IgG-Bestimmungen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung und Bestimmungen unter Verwendung bekannter Verfahren an Serum.
Figur 5 zeigt IgM-Bestimmung in Speichel, gebildet als Antwort auf Hepatitis A von zwei Patienten.
Figuren 6 und 7 zeigen die Wirkung verschiedener Verdünnungsgrade bei Speichel-IgM, gebildet als Antwort auf Hepatitis A von zwei Patienten C und K.
Figur 8 zeigt Test : Negativ-Werte in Speichel-IgM, gebildet als Antwort auf Masern gegen die Anzahl der Tage nach Ausbruch der Infektion.
Figur 9 zeigt eine Bestimmung von IgM in Speichel, gebildet als Antwort auf Mumps.
In den folgenden Beispielen veranschaulichen die Bestimmungsbeispiele 1, 2, 3, 4 und 5 Bestimmungen für IgG in Speichelproben, und die Bestimmungsbeispiele 6 und 7 veranschaulichen Bestimmungen für IgM in Speichel. Beispiele 5 und 7 verwenden das Verfahren von Alternative (a) und der Rest verwendet jenes von Alternative (b). Vier klinische Beispiele sind ebenfalls beschrieben, um die Verwendung der Erfindung in medizinischer Praxis zu veranschaulichen.
Die folgenden Bezeichnungen, die in dieser Beschreibung verwendet werden, sind Warenzeichen: Dako, Pentawash, Sterilin, Tween, Elavia.

Bestimmungsbeispiel 1

Röteln IgG Capture Radioimmunoassay (GACRIA) und Enzymimmunoassay (GACELISA) an Speichelproben

1. Beschichten von Polystyrol-Kügelchen durch Eintauchen in 1/1000 Dako Anti-IgG (γ- Kette), verdünnt in Beschichtungspuffer (0,01M Natriumcarbonat / 0,01M Natriumbicarbonat Puffer, pH-Wert 9,6).
2. Herstellen einer 1/2 Verdünnung von jeder Speichelprobe in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,08% Natriumazid, 0,1% Tween 20 und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
3. Dreistündiges Inkubieren der Proben mit den mit anti-IgG beschichteten Kügelchen bei 37 ºC.
4. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST) unter Verwendung des Pentawash-Systems (Abbott Laboratories). Hinzufügen einer 1/12 Verdünnung von Röteln-HA-Antigen (hergestellt von Division of Microbiological Reagents & Quality Control, CPHL. Zu beachten ist, daß die Konzentration des hergestellten HA-Antigens zwischen Chargen verschieden sein kann.). Verdünnen des Antigens in PBS, 0,1% Tween 20 und 10% FCS. Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur.

A. Radioimmunoassay

5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST und zweistündiges Inkubieren bei 37 ºC mit anti-Röteln-monoklonalen-Antikörper-Ascites (1/50000), verdünnt in PBS, 0, 1% Tween 20 (T&sub2;&sub0;), 10% FCS, 5% normalem Kaninchen-Serum (NRS) und 2% normalem humanem Serum (NHS).
6. Viermaliges Waschen in PBST und Hinzufügen von ¹²&sup5;I-markiertem anti-Maus-IgG (10&sup5; counts pro Minute in 190 ul Verdünnungsmittel) in PBS, 0,2% T&sub2;&sub0;, 10% FCS, 5% NRS, 5% normales Ziegen-Serum (NGS) und 2% NHS. Zweistündiges Inkubieren bei 37 ºC.
7. Viermaliges Waschen in PBST, Übertragen der Kügelchen in Abbott-Röhren und fünfminütiges Zählen der gebundenen Radioaktivität in einem γ-Zähler.

B. Enzymimmunoassay

1. - 4. wie oben.
5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST. Hinzufügen von HRPO-konjugiertemmonoklonalem-Anti-Röteln, verdünnt 1 in 50 oder 1 in 100 in PBS (ohne Azid), 5% FCS, 1% NHS, 1% NRS, 0,1% Tween 20. Dreistündiges Inkubieren bei Raumtemperatur.
6. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST und Übertragen in Plastikröhren. Hinzufügen von 240 ul Substrat, d.h. ortho-Phenylendiamin (OPD) zu der 1 in 100 Verdünnung und Tetramethylbenzidin (TMB) zu der 1 in 50 Verdünnung. 45-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur. Abbrechen der Reaktion mit 100 ul 4N H&sub2;SO&sub4;.
7. Übertragen von 150 ul jeder Probe und eines Blanks. Ablesen der Optischen Dichte (O.D.) bei 492 nm oder 450 nm (TMB).

Bestimmungsbeispiel 2

Hepatitis A IgG Capture Radioimmunoassay (GACRIA) und Enzymimmunoassay (GACELISA) an Speichelproben

1. Beschichten von Polystyrol-Kügelchen durch Eintauchen in 1/1000 Anti-IgG (DAKO, γ- Kette), verdünnt in Beschichtungspuffer (0,01M Natriumcarbonat / 0,01M Natriumbicarbonat Puffer, pH-Wert 9,6).
2. Herstellen einer 1/10 Verdünnung von jeder Speichelprobe in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,08% Natriumazid, 0,1% Tween 20 und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
3. Dreistündiges Inkubieren der Proben mit den mit anti-IgG beschichteten Kügelchen bei 37 ºC.

A. Radioimmunoassay

4. Viermaliges Waschen der Kügelchen in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,05% Tween 20 (PBST) unter Verwendung des Pentawash-Systems (Abbott Laboratories). Hinzufügen einer 1/25 Verdünnung von Hepatitis-A-Antigen (HAV Ag) in PBS, 0,1% Tween 20 (T&sub2;&sub0;), 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% normalem humanem Serum (NHS). Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur.
5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST und dreistündiges Inkubieren bei 37 ºC mit ¹²&sup5;I-markiertem humanem anti-HAV (10&sup5; counts pro Minute in 190 ul Verdünnungsmittel) in PBS, 0,2% T&sub2;&sub0;, 50% FCS, 10% NHS und 5% NRS.
6. Viermaliges Waschen in PBST, Übertragen der Kügelchen in Zählrohre und fünfminütiges Zählen der gebundenen Radioaktivität in einem γ-Zähler.

B. Enzymimmunoassay

1. - 3. wie oben.
4. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST unter Verwendung des Pentawash-Systems (Abbott Laboratories). Hinzufügen einer 1/15 Verdünnung von HAV Ag in PBS, 0,1% T&sub2;&sub0;, 10% FCS und 1% NHS. Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur.
5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST. Hinzufügen von 1/100 Verdünnung von anti-HAV-HRPO-Konjugat (hergestellt von Division of Microbiological Reagents and Quality Control, Public Health Laboratory Service) in PBS, 0,2% T&sub2;&sub0;, 50% FCS, 5% NRS und 10% NRS. Einstündiges Inkubieren bei 37 ºC.
6. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST, anschließend Übertragen in Abbott-Röhren und Hinzufügen von 240 ul OPD-Substrat zu jedem Kügelchen. 45-minütiges Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur und Abbrechen der Reaktion mit 100 ul 4N Schwefelsäure.
7. Übertragen von 150 ul einer jeden Probe und eines Blanks auf eine Mikrotiterplatte und Ablesen der Optischen Dichte (O. D.) bei 492 nm.

Bestimmungsbeispiel 3

Hepatitis B core (HBc) IgG Capture Radioimmunoassay (GACRIA) und Enzymimmunoassay (GACELISA) an Speichelproben

1. Beschichten von Polystyrol-Kügelchen durch Eintauchen in 1/1000 DAKO Anti-IgG (γ- Kette), verdünnt in Beschichtungspuffer (0,01M Natriumcarbonat / 0,01M Natriumbicarbonat Puffer, pH-Wert 9,6).
2. Herstellen einer 1/10 Verdünnung von jeder Speichelprobe in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,08% Natriumazid, 0,1% Tween 20 und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
3. Zweistündiges Inkubieren der Proben mit den mit anti-IgG beschichteten Kügelchen bei 45 ºC.
4. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST) unter Verwendung des Pentawash-Systems (Abbott Laboratories). Hinzufügen einer 1/200 Verdünnung von HBc-Antigen in PBS, 0,1% Tween20 (T&sub2;&sub0;), 10% FCS und 0,5% normalem humanem Serum (NHS). 60-minütiges Inkubieren bei 45 ºC.

A. Radioimmunoassay

5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST und zweistündiges Inkubieren bei 45 ºC mit ¹²&sup5;I-markiertem humanem anti-HBc (10&sup5;counts pro Minute in 190 ul Verdünnungsmittel) in PBS, 0,2% T&sub2;&sub0;, 10% normales Kaninchen-Serum (NRS), 10% FCS und 40% NHS.
6. Viermaliges Waschen in PBST, Übertragen der Kügelchen in Zählrohre und fünfminütiges Zählen der gebundenen Radioaktivität in einem γ-Zähler.

B. Enzymimmunoassay

5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST. Hinzufügen von 1/100 Verdünnung von anti-HBc-HRPO-Konjugat (hergestellt von Division of Microbiological Reagents and Quality Control, CPHL), verdünnt in PBS (ohne Azid), 0,2% T&sub2;&sub0;, 10% FCS, 5% NRS und 10% NHS. Zweistündiges Irkubieren bei 37 ºC.
6. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST, anschließend Übertragen in Abbott-Röhren und Hinzufügen von 240 ul OPD-Substrat zu jedem Kügelchen. 45minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur und Abbrechen der Reaktion mit 100 ul 4N Schwefelsäure.
7. Übertragen von 150 ul jeder Probe und eines Blanks auf eine Mikrotiterplatte und Ablesen der Optischen Dichte (O.D.) bei 492 nm.

Bestimmungsbeispiel 4

Humaner Immunschwäche-Virus (HIV) IgG Capture Radioimmunoassay (GACRIA) und Enzymimmunoassay (GAC-ELISA) an Speichelproben

1. Beschichten von Polystyrol-Kügelchen durch Eintauchen in 1/1000 DAKO Anti-IgG (γ- Kette), verdünnt in Beschichtungspuffer (0,01M Natriumcarbonat / 0.01M Natriumbicarbonat Puffer, pH-Wert 9,6).
2. Herstellen einer 1/10 Verdünnung von jeder Speichelprobe in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,08% Natriumazid, 0,1% Tween 20 (T&sub2;&sub0;) und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
3. Dreistündiges Inkubieren der Proben mit den mit anti-IgG beschichteten Kügelchen bei 37 ºC.
4. Viermaliges Waschen der Kügelchen in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,05% T&sub2;&sub0; (PBST) unter Verwendung des Pentawash-Systems (Abbott Laboratories). Hinzufügen einer 1/80 Verdünnung von HIV-Antigen* (HIV Ag) in PBS, 0,1% T&sub2;&sub0;, 10% FCS und 1% normalem humanem Serum (NHS). Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur.
*Die optimale Antigenverdünnung kann zwischen Chargen variieren.

A. Radioimmunoassay

5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST und zweieinhalbstündiges Inkubieren bei 37 ºC mit ¹²&sup5;I-markiertem humanem anti-HIV (10&sup5;counts pro Minute in 190 ul Verdünnungsmittel) in PBS, 0,2% T&sub2;&sub0;, 10% FCS, 20% NHS und 10% normales Kaninchen-Serum (NRS).
6. Viermaliges Waschen in PBST, Übertragen der Kügelchen in Zählrohre und fünfminütiges Zählen der gebundenen Radioaktivität in einem γ-Zähler.

B. Enzymimmunoassay

1. - 4. wie oben.
5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST. Hinzufügen einer 1/4 Verdünnung von Wellcome-humanem-anti-HIV-Peroxid-Konjugat in PBS mit 10% NHS. Zweieinhalbstündiges Inkubieren bei 37 ºC.
6. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST, anschließend Übertragen in Abbott-Röhren und Hinzufügen von 240 ul OPD-Substrat zu jedem Kügelchen. 30-minütiges Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur und Abbrechen der Reaktion mit 100 ul 4N Schwefelsäure.
7. Übertragen von 150 ul jeder Probe und eines Blanks auf eine Mikrotiterplatte und Ablesen der Optischen Dichte (O.D.) bei 492 nm.

Bestimmungsbeispiel 5

Humaner Immunschwäche-Virus (HIV) IgG Capture Partikel-Bestimmung an Serum und Speichelproben

1. Beschichten von 'U' oder Flachboden [flat-bottom] Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit einer 1/1500 Verdünnung von DAKO anti-IgG (γ-Kette) in Beschichtungspuffer (0,01M Natriumcarbonat / 0,01M Natriumbicarbonat Puffer, pH-Wert 9,6).
2. Herstellen von Verdünnungen der Serumprobe (Bereich 1/10 - 1/2000) oder einer 1/5 Verdünnung von jeder Speichelprobe in der Vertiefüng in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,08% Natriumazid, 0,01% Tween 20 (T&sub2;&sub0;) und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
3. Ein- bis dreistündiges Inkubieren der Proben in den mit anti-IgG beschichteten Platten bei 37 ºC.
4. Viermaliges Waschen der Vertiefüngen in PBS mit 0,05% T&sub2;&sub0; (PBST) unter Verwendung eines geschützten [proprietary] Mikrotiterplattenwaschsystems.
5. Herstellen einer Arbeitssuspension von mit Antigen beschichteten Partikeln (z.B. HIV-beschichteten Gelatinepartikeln, wie von Fujirebio/Serodia geliefert, jedoch weiter verdünnt 1 in 20 in PBS mit 2% FCS). Hinzufügen von 50 ul der Suspension in jede Vertiefüng.
6. Abdecken der Platte und Absetzenlassen der Teilchen über Nacht bei Raumtemperatur.
7. (U-Boden-Platten) Verzeichnen der Bindung der Partikel auf einer Skala von 4+ = vollständige Bindung bis 0 = vollständiges Absetzen der Partikel. Werte von 2 bis 4 werden als vorläufig positive Reaktionen betrachtet, die mit anderen Verfahren bestätigt werden müssen.
8. (Flach-Boden-Platten) Platten werden um 45 ºC geneigt und die Bindung von Partikeln wird durch den Grad des Absetzens der Partikel an der Bodenkante der Vertiefüng, bewertet wie in 7, oben, beurteilt.
9. Falls erforderlich, können Paralleltests mit unbeschichteten Partikeln (zur Kontrolle) gleichermaßen durchgeführt werden.

Bestimmungsbeispiel 6

IgM Capture Radioimmuno-, Enzymimmuno- und Partikel-Bestimmungen zum Nachweis von IgM-Klassen-Antikörpern gegen Humanen Immunschwäche-Virus, Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus-Core-Antigen, Röteln-Virus, Masern-Virus und Mumps-Virus in Speichelproben

Analog zu den Bestimmungsbeispielen 1 - 5 oben und an deren Verfahren eng angelehnt wurden Bestimmungen entwickelt, bei welchen mit Antikörpern gegen humanes IgM (u-Kette spezifisch) anstatt mit Antikörpern gegen humanes IgG beschichtete Oberflächen verwendet wurden. Die anderen verwendeten Reagenzien waren im wesentlichen dieselben wie in den vorangegangenen Beispielen, oder sie waren Antigene gegen Röteln-, Masern- oder Mumps- Viren. Optimal arbeitende Verdünnungen wurden für jede Bestimmung individuell bestimmt. Zum Beispiel, Capture Radioimmunoassay für IgM-anti-Masern in Serum und Speichel (verwendet, um akute oder kürzliche Infektionen mit Masern-Virus zu bestätigen):
1. Beschichten von Polystyrol-Kügelchen durch Eintauchen in 1/3000 TAGO Anti-IgM (γ- Kette), verdünnt in Beschichtungspuffer (0,01M Natriumcarbonat / 0.01M Natriumbicarbonat Puffer, pH-Wert 9,6).
2. Herstellen einer 1/50 Verdünnung jeder Serum- oder einer 1/10 Verdünnung jeder Speichelprobe in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,08% Natriumazid, 0,1% Tween 20 (T&sub2;&sub0;) und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
3. Ein- bis dreistündiges Inkubieren der Proben mit den mit anti-IgM beschichteten Kügelchen bei 37 ºC.
4. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBS mit 0,05% T&sub2;&sub0; (PBST) unter Verwendung des Pentawash-Systems (Abbott Laboratories). Hinzufügen einer 1/1000 Verdünnung von Masern*-Antigen (pelletiert aus der Gewebekulturflüssigkeit von infizierten Vero- Zellkulturen) in PBS, 0,1% T&sub2;&sub0;, 10% FCS und normalem humanem Serum (NHS). Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur.
*Die optimale Antigenverdünnung kann zwischen Chargen variieren.
5. Viermaliges Waschen der Kügelchen in PBST und einstündiges Inkubieren bei 37 ºC mit monoklonalem Antikörper gegen Masern-Virus und anschließend, nach weiterem Waschen, mit mit ¹²&sup5;I-markiertem humanem anti-Maus-IgG (9x10&sup4; counts pro Minute in 190 ul Verdünnungsmittel) in PBS, 0,2% T&sub2;&sub0;, 10% FCS, 5% NHS, 5% normalem Kaninchen-Serum (NRS) und 5% normalem Ziegen-Serum.
6. Viermaliges Waschen in PBST, Übertragen der Kügelchen in Zählrohre, und fünfminütiges Zählen der gebundenen Radioaktivität in einem Gamma-Zähler.

Bestimmungsbeispiel 7

Humaner Immunschwäche-Virus (HIV) IgM Capture Partikel-Bestimmung an Serum und Speichel

Eine Bestimmung für IgM, gebildet als Antwort auf HIV (AIDS) Infektion, wurde ausgeführt unter Verwendung von mit Antigen beschichteten Partikeln als ein ausgewähltes markiertes Antigen.
Mikrotiterplatten wurden mit einer 1/1000 Verdünnung von Dako anti-IgM (u-Kette) in Beschichtungspuffer wie in Bestimmungsbeispiel 5 beschichtet. Das Verfahren von Beispiel 5 wurde im übrigen befolgt.

KLINISCHE EXPERIMENTE

Experimente wurden unter Verwendung der Verfahren der Bestimmungsbeispiele 1 - 4 und 6 oben ausgeführt, wobei Kügelchen mit 6 mm Durchmesser verwendet wurden, um Capture und Nicht-Capture Bestimmungen an Speichel und Serum zu vergleichen.

Klinisches Experiment 1

Die Proben von Serum und Speichel wurden gleichzeitig von 29 Mitgliedern des Laborpersonals erhalten und nebeneinander auf Antikörper gegen folgende Antigene getestet:
Röteln, Hepatitis A und Hepatitis B core. Eine kleine Menge von Serum/Speichel-Paaren von Patienten und einverstandenem Personal wurde auf Antikörper gegen HIV (AIDS Virus)- Antigen getestet.
IgG-Bestimmungen an den Speichelproben wurden unter Verwendung der Verfahren der Beispiele 1 - 5 oben ausgeführt. Vergleichsbestimmungen wurden an Serum unter Verwendung von GACRIA (z.B. Parry, J. Med. Virol. 19 (1986), 387-397), COMPRIA (Competitive Radio Immunoassay, Vergleichs-Radioimmunobestimmung) (z.B. Parry, Med. Lab. Sci. 38 (1981), 303 - 311, Mortimer et al., BMJ 290 1176 - 78, Cohen et al., J. Virol. Meth. 2 (1981), 181 - 192) und radialer Hämolyse (Kurtz et al., J. Hygiene 84 (1980), 213 - 222) ausgeführt.
Die Ergebnisse zeigten folgendes:
(i) Spezifisches IgM konnte ohne weiteres sowohl im Speichel als auch im Serum von Patienten mit Hepatitis A Infektion nachgewiesen werden.
(ii) Spezifisches IgG konnte sowohl im Serum als auch im Speichel von Personen für eine Reihe von Infektionen nachgewiesen werden.
(iii) Ergebnisse von Immunglobulinbestimmungen an Serum und Speichel zeigten vollständige qualitative und enge quantitative Korrelation. Korrelationen zwischen Bestimmungen an Speichel (Anwendung des Verfahrens der Erfindung) und denselben GACRIA- und COMPRIA-Bestimmungen und der Nicht-Capture (radiale Hämolyse)-Bestimmung an Serum wurden für Röteln, Hepatitis A und B und HIV (AIDS-Virus) gefünden.
Die Figuren 1 - 4 zeigen Diagramme von T:N-Verhältnissen - d.h. dem Verhältnis der Radioaktivität einer Testprobe (T) zu der eines negativen Standards (N), der bekanntermaßen kein spezifisches IgG enthält -, die unter Verwendung von GACRIA und COMPRIA an Speichel erhalten wurden, gegen T:N-Verhältnisse an den entsprechenden herkömmlichen Serumbestimmungen.
Figur 1 zeigt die Korrelation zwischen Hepatitis-A-Bestimmungen unter Verwendung von GACRIA an Speichel im Verfahren von Beispiel 2(A) und GACRIA, wie es auf Serum angewendet wird.
Figur 2 zeigt die Korrelation zwischen Röteln-Bestimmungen unter Verwendung von GACRIA an Speichel wie im Verfahren von Beispiel 1(A) und GACRIA, wie es auf Serum angewendet wird.
Figur 3 zeigt die Korrelation zwischen Hepatitis-A-Bestimmungen unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2(A) und einer entsprechenden COMPRIA-Bestimmung an Serum.
Figur 4 zeigt die Korrelation zwischen Röteln-Virus-Bestimmungen unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1(A) und einem radialen Hämolyse-Test an Serum.

Klinisches Experiment 2

Paare von Serum/Speichel-Proben wurden mit herkömmlichen Tests (COMPRIA, radiale Hämolyse, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA (Elavia)) (z.B. Pasteur Diagnostics, Rubenz G, Northumbria Biologicals) und IgG Capture Bestimmungen (GACRIA, GACELISA)) auf Antikörper gegen Hepatitis A Virus (100 Paare untersucht), HIV (53 Paare), Hepatitis B Virus core (62) und Röteln-Virus (30) getestet. Herkömmliche Bestimmungen versagten beim Nachweis von Antikörpern gegen die vier Viren im Speichel von vielen (93/119) Versuchspersonen, deren Serum diese Antikörper enthielt. Das Verfahren der Erfindung wies die Antikörper im Speichel aller Personen nach, die bei herkömmlichen Tests serumpositiv waren, außer bei zwei Speichelproben, welche fälschlicherweise negativ waren für anti-HBc, und einer, die fälschlicherweise negativ war für anti-Röteln-Virus. Es gab keinen bezeichnenden Unterschied zwischen GACRIA-anti-HIV- und -anti-HBc-Reaktivitäten in Serum und Speichel, aber GACRIA-anti-HAV- und -anti-Röteln-Reaktivitäten waren in Serum größer als in Speichel. GACRIA- und GACELISA-Ergebnisse an Speichel für die vier viralen Antikörper korrelierten eng und GACELISA-Ergebnisse an Speichel für anti-HAV und anti- HIV waren so genau wie GACRIA-Ergebnisse. Sowohl für Speichel als auch für Serum war GACRIA den IgA-Capture-Bestimmungen bei der Detektion von anti-HAV und HIV überlegen.

Materialien und Methoden

(i) Materialien

Für anti-HAV (Hepatitis A Virus) und anti-Röteln-Virus wurden Testpaare von Serum/Speichel-Proben von Reisenden, die um Prophylaxe gegen HAV ersuchten, und von Laborpersonal genommen. Jede Versuchsperson spendete Blut durch Venenpunktion und spuckte in ein Schraubdeckelgefäß mit 3,5 cm Durchmesser (Sterilin). Für anti-HIV-Tests wurden Blut- und Speichel-Probenpaare von Versuchspersonen mit hohem und geringem Risiko ähnlich genommen. Diese Proben und jene vom Laborpersonal wurden ebenfalls auf anti-HBc (Hepatitis B core) getestet. Zum Testen wurde das Serum von jeglichem geronnenen Blut getrennt, Speichelproben wurden unbehandelt getestet. Serum und Speichel wurden bei -30 ºC gelagert.

(ii) Herkömmliche Tests

Anti-HAV, anti-HIV und anti-HBc wurden mit COMPRIA gemessen. Die Ergebnisse wurden in Prozent Bindungshemmung des ¹²&sup5;I-Markers ausgedrückt. Cut-off-Werte waren 50% Hemmung für den anti-HAV und den anti-HIV und 70% für den anti-HBc. Anti-Röteln wurde mit radialer Hämolyse gemessen. Anti-HIV und anti-Röteln wurden ebenfalls mit ELISA und Elavia gemessen.

(iii) Capture-Bestimmungen

6 mm Polystyrol-Kügelchen wurden durch Eintauchen in eine 1 : 1000 Verdünnung von Kaninchen-Antiserum gegen die humane γ- oder α-Kette (DAKO Immunglobuline) beschichtet. Vor der Verwendung und zwischen jedem Schritt in den Bestimmungen wurden die Kügelchen in PBS mit 0,05% Tween 20 gewaschen. Serum oder Speichelproben, verdünnt mit PBS mit 0,05% Tween 20, wurden mit den Kügelchen inkubiert. Anschließend wurde HIV-Antigen, HAV-Antigen, HBc-Antigen oder Röteln-Virus Hämagglutinin angewendet, gefolgt von einem Nachweisreagenz. Dieses Reagenz war gereinigtes humanes IgG mit einem hohen Titer von anti-HAV, anti-HIV oder anti-HBc oder gereinigter Maus-monoklonaler- Antikörper gegen Röteln, entweder mit ¹²&sup5;I oder mit Peroxidase verbunden. Nichtspezifische Haftung des Nachweisreagenz wurde durch Zusatz von humanem Serum verringert (spezifischer Antikörper negativ). Die Bindung des Nachweisreagenz wurde entweder als γ- Emissionen oder als die Optische Dichte der Farbe, die durch die Einwirkung des Enzyms auf Orthophenylendiamin oder (für Röteln) Tetramethylbenzidin erzeugt wurde, gemessen. Reaktionen, die die Negativkontrolle zweimal überschritten (T : N > 2) wurden als positiv betrachtet.

(iv) Ergebnisse

Für jeden viralen Antikörper wurden die Ergebnisse aus Capture-Bestimmung für IgG- Antikörper an Serum und Speichel mit Ergebnissen aus herkömmlichen Tests (Tabelle 1) verglichen. Herkömmliche Testergebnisse an Seren waren wie folgt für anti-HAV 66 Versuchspersonen negativ, 34 positiv (COMPRIA 84% - 98% Hemmung, Mittelwert 92%), für anti-HIV 10 Versuchspersonen negativ, 43 positiv (COMPRIA 84% - 98%, Elavia alle > 2,00), für anti-HBc 37 Versuchspersonen negativ, 25 positiv (COMPRIA 76% - 95%, Mittelwert 91%) und für anti-Röteln 3 negativ, 27 positiv (radiale Hämolyse 7 - 12 mm, Mittelwert 10 mm, Rubenz G 0,75 - 2,00, Mittelwert 2,00). Die Ergebnisse herkömmlicher Tests am Speichel von serumpositiven Versuchspersonen waren meistens negativ. Röteln-Virus radiale Hämolyse und ELISA wiesen Antikörper in Speichel niemals nach, und COMPRIA für anti-HAV und anti-HBc tat dies nur in einigen Fällen (3/32, 2/18).
Mit sehr wenigen Ausnahmen waren IgG-Antikörper-Capture-Radioimmunoassay (GACRIA)-Ergebnisse von Serum und Speichelproben qualitativ dieselben und entsprachen herkömmlichen Ergebnissen an den Seren. Die Ausnahmen waren zwei Versuchspersonen, die schwache anti-HBc-, und eine, die schwache anti-Röteln-Reaktivität im Serum hatten. Diese drei waren in GACRIA-Tests an Speichel antikörper-negativ.
Korrelationen zwischen Ergebnissen, die mit herkömmlichen Tests an Serum und mit GACRIA an Serum und Speichel erhalten wurden, waren, außer für anti-Röteln, nicht eng (Tabelle 2). Engere Korrelationen wurden zwischen Serum- und Speichelergebnissen mit GACRIA, außer für anti-HIV, beobachtet. Für diesen Antikörper wurden die zwei Probensorten nicht gleichzeitig getestet, wie sie es für die in Tabelle 2 gezeigten drei anderen wurden.
Bei Verwendung des Enzymimmunoassays (GACELISA) waren die Ergebnisse qualitativ dieselben wie für GACRIA und bei herkömmlichen Tests an den entsprechenden Seren, außer für 4 falsche negative anti-HBc- und zehn falsche negative anti-Röteln-Virus- Ergebnisse. Die 14 zweifelhaften Proben waren in beinahe allen Fällen in GACELISA reaktiver, als die wirklich negativen Proben waren, sie waren jedoch weniger als zweimal der mittlere Negativkontrollwert. GACELISA-Ergebnisse an Speichel korrelierten eng mit GACRIA-Ergebnissen, außer für anti-HAV, für welches 21/32 GACELISA Optische Dichte Werte > 2,00 waren, der oberen Grenze auf dem ELISA-Leser.
In Anbetracht der hohen Konzentrationen von IgA relativ zu IgG in Speichel wurden spezifische IgA und IgG Capture-Bestimmungs-Tests an Speichel verglichen, als ein Mittel, anti-HAV- und anti-HIV-Positivität zu zeigen. Spezifisches IgA konnte nur im Speichel von der Hälfte der Getesteten gefünden werden, obwohl es im Serum aller außer von zwei serumpositiven Personen nachgewiesen wurde (Tabelle 3). Tabelle 1 Positive und negative Ergebnisse in herkömmlichen Tests und mit Capture Assays an Serum- und Speichel-Probenpaaren Herkömmlicher Test an Serum Gacria an Serum Gacria an Speichel Gacelise an Speichel Anti HAV pos Anti HAV neg Anti HIV pos Anti HIV neg Anti HBc pos Anti HBc neg Anti Röteln pos Anti Röteln neg &spplus; in Klammern sind Bereich, Mittelwert Test : Negativ Verhältnis oder (GACELISA) OD Werte dargestellt * in einigen Beispielen konnten nicht alle Speichelproben getestet werden, da ungleiche Volumen gesammelt worden waren Tabelle 2 Korrelation von GACRIA Ergebnissen an Speichel mit anderen Ergebnissen an Serum- und Speichelproben von serumpositiven Personen (dargestellt ist der Korrelationskoeffizient r) Gacria an Speichel gegen: Herkömmlicher Test an Serum&spplus; Gacria an Serum Gacelisa an Speichel anti HAV anti HIV anti HBc anti Röteln &spplus; COMPRIA Ergebnisse, für anti Röteln RH * Signifikante Korrelation p < 0,05 : ** p < 0,01 : *** p < 0,001 Tabelle 3 Vergleich der Ergebnisse der Bestimmung von spezifischem IgG (GACRIA) und spezifischem IgA an Serum- und Speichelproben von 10 anti-HAV-positiven und 19 anti-HIV-positiven Personen Serum Speichel anti-HAV anti-HIV &spplus; Anzahl Positive (Bereich, Mittelwert Test : Negativ Verhältnis)

Klinisches Experiment 3

Das in Bestimmungsbeispiel 5 beschriebene Verfahren wurde verwendet, um anti-HIV- IgG in Serum und Speichelproben nachzuweisen.
170 kodierte Serumproben von Personen mit erhöhtem HIV-Infektionsrisiko wurden getestet. 26 waren mit herkömmlichen Tests als anti-HIV-positiv bestätigt worden, und alle von diesen ergaben 4+ (vollständige) Agglutination in der Partikel-Bestimmung. Von den 144, die als anti-HIV-negativ bekannt waren, ergaben vier ein bißchen (1+) Agglutination und zwei 3+ bis 4+ Agglutination. Bei Testwiederholung waren alle außer einer Serumprobe negativ, die immer noch 4+ Agglutination ergab.
73 Speichelproben, 62 von Patienten, von denen bekannt war, daß sie anti-HIV in ihrem Serum haben, wurden kodiert getestet. Der Speichel von 61 der 62 serumpositiven Patienten war anti-HIV-IgG-positiv (56 ergaben 4+, 5 ergaben 3+ Agglutination). Vom Speichel der 11 serumnegativen Patienten ergaben zwei 4+ Agglutination, was unter Verwendung unbeschichteter (HIV-negativer) Partikel weiter untersucht wurde.

Klinisches Experiment 4

Capture-Bestimmungen wurden mit auf Polystyrol-Kügelchen aufgebrachtem anti-Human-IgM versehen, um spezifisches IgM gegen Hepatitis A, Masern und Mumps Viren nachzuweisen. Das Verfahren von Bestimmungsbeispiel 6 wurde verwendet.
Serum und Speichelproben wurden von zweiundzwanzig Fällen klinischer Gelbsucht nebeneinander gesammelt und auf anti-HIV-IgM getestet. Fünfzehn Serum und Speichelpaare waren positiv, und es gab vollständige Übereinstimmung zwischen den herkömmlichen Serumbestimmungen und der Bestimmung an Speichel, mit starken Signalen von den positiven Speicheltests (siehe Tabelle 4). Speichel-anti-HAV-IgM-Tests wurden an aufeinanderfolgenden, 1 in 10 verdünnten Proben von zwei Patienten über einen Zeitraum von 7 Monaten ausgeführt. Spezifische IgM-Antikörper bestanden für ungefähr einen Monat. Andere Tests zeigten, daß die optimale Testverdünnung für Speichel 1 in 10 bis 1 in 20 war, im Gegensatz zu den sehr viel höheren optimalen Testverdünnungen (1 in 5000 - 1 in 40000) für Serum. Die Ergebnisse für zwei Patienten, identifiziert als C und K, sind in den Figuren 5, 6 und 7 graphisch dargestellt.
Figur 6 zeigt Ergebnisse für vier aufeinanderfolgende Proben 1, 2, 3 und 4, jeweils genommen am 15. März, 5. April, 21. Mai und 20. Oktober.
Figur 7 zeigt Ergebnisse für vier aufeinanderfolgende Proben 1, 2, 3 und 4, jeweils genommen am 20. März, 13. April, 16. Mai und 15. Oktober.
Anti-Masern-IgM wurde nachgewiesen, indem nacheinander - mit dazwischenliegenden Waschschritten - Speichelproben, verdünnt 1 zu 10, Masern-Antigen (eine Verdünnung des Virus, pelletiert aus der Gewebekulturflüssigkeit infizierter Vero-Zellen), monoklonaler Antikörper gegen Masern-Virus und zum Schluß ¹²&sup5;I-markierter Antikörper gegen Maus-IgG auf die Kügelchen angewendet wurden.
Von 69 Fällen klinisch diagnostizierter Masern wurde Speichel gesammelt, indem die infizierten Kinder gebeten wurden, auf ein Röllchen Baumwolle zu kauen, welches anschließend zentrifügiert wurde, um geklärten Speichel zu erhalten. 67 dieser klinisch diagnostizierten Fälle ergaben positive Ergebnisse in der Speichelbestimmung von Masern-IgM-Antikörper (T : N 2,0 - 63,4) und 2 ergaben negative Ergebnisse (Bereich 1,2 - 1,9). In n Fällen war das Datum des Ausbruchs der Krankheit genau bekannt, und die T:N Werte für die Bestimmungen konnten gegen den Zeitraum, zu welchem Speichelproben genommen wurden, graphisch dargestellt werden. Diese Ergebnisse sind in Figur 8 dargestellt.
Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um anti-Mumps-IgM nachzuweisen, außer, daß nach dem Hinzufügen von Mumps-Virus eine Verdünnung eines Mumps-Antiserums, gezogen in einem Kaninchen, hinzugefügt wurde, gefolgt von ¹²&sup5;I-markiertem anti-Kaninchen- IgG. Ein Kind, weiblich, 6 Jahre alt, gab Speichelproben im akuten Zustand von Mumps- Parotitis und für neun Monate danach. Die IgM-Antwort war stark in drei Proben, genommen an den Tagen 10, 16 und 21 nach Ausbruch, und blieb für zwei Monate nachweisbar. Die Ergebnisse sind in Figur 9 graphisch dargestellt. Nachweis akuter Hepatitis A unter Verwendung von Speichel, gesammelt bei Fällen klinischer Gelbsucht SPEICHEL SERUM 1 - Speichel anti HAV IgM T:N Werte 11 - 134 2 - Speichel anti HAV IgM T:N Werte 0,9 - 3,0

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung spezifischer Immunglobuline irgendwelcher oder aller Klassen, die in einer menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Speichel, Tränen, Sperma, Urin und Rückenmarksflüssigkeit, vorhanden sind, gekennzeichnet durch die Schritte von:

(i) Immobilisieren eines Antikörpers gegen eine oder mehrere Klassen von Immunglobulinen auf ein festes Substrat,

(ii) Aussetzen des immobilisierten Antikörpers einer Probe der Körperflüssigkeit, um Bindung eines Teils irgendeines Immunglobulins, das in der Flüssigkeit vorhanden ist, an den immobilisierten Antikörper zu erreichen, und entweder:

a. das gebundene Immunglobulin einem ausgewählten markierten Antigen auszusetzen, um Bindung des markierten Antigens an wenigstens einen Teil des gebundenen Immunglobulins zu erreichen, oder

b. das gebundene Immunglobulin einem ausgewählten Antigen auszusetzen, um Bindung des Antigens an wenigstens einen Teil des gebundenen Immunglobulins zu erreichen, und anschließend Binden eines markierten Antikörpers mit Spezifität für das ausgewählte Antigen direkt oder indirekt an wenigstens einen Teil des gebundenen Antigens.

(iii) Nachweis und/oder Messung einer Eigenschaft des markierten Antigens oder Antikörpers.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunglobulin IgG oder IgM ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit Speichel ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Speichel von einem Patienten erhalten wird und anschließend entweder unverdünnt oder verdünnt verwendet wird, jedoch ohne einen Schritt der Erhöhung der Immunglobulin- Konzentration.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Alternative (ii)b verwendet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das zu bestimmende Immunglobulin als Antwort auf Infektion mit Hepatitis A, Hepatitis B, Humanem Immunschwäche Virus (d.h. AIDS Virus), Röteln, Masern oder Mumps gebildet wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das zu bestimmende Immunglobulin als Antwort auf Humanen Parvovirus B19 oder Windpocken (VZ Virus) gebildet wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin ein weiterer Antikörper an das gebundene Antigen gebunden ist und der markierte Antikörper an den weiteren Antikörper gebunden ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das zu bestimmende Immunglobulin als Antwort auf Röteln-Infektion gebildet wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das markierte Antigen ein mit dem Antigen beschichtetes Gelatine- oder Latex-Partikel ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin das Partikel deutlich gefärbt ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin das zu bestimmende Immunglobulin eines ist, das als Antwort auf Infektion mit Humanem Immunschwäche Virus gebildet wird.

13. Verwendung eines Kits zur Bestimmung spezifischer Immunglobuline irgendwelcher oder aller Klassen, die in menschlicher oder tierischer Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Speichel, Tränen, Sperma, Urin und Rückenmarksflüssigkeit, vorhanden sind, unter Verwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit

(i) ein festes Substrat mit Antikörper gegen eine oder mehrere Klassen von Immunglobulinen, der auf demselben immobilisiert ist, und

(ii) markiertes Antigen, das zur Bindung an das spezifische Immunglobulin fähig ist,

umfaßt.

14. Verwendung eines Kits gemäß Anspruch 13, worin das Antigen auf Gelatine- oder Latex-Partikeln aufgebracht ist.

15. Verwendung eines Kits zur Bestimmung spezifischer Immunglobuline irgendwelcher oder aller Klassen, die in menschlicher oder tierischer Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Speichel, Tränen, Sperma, Urin und Rückenmarksflüssigkeit, vorhanden sind, unter Verwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit

(i) ein festes Substrat mit Antikörper gegen eine oder mehrere Klassen von Immunglobulin, der auf demselben immobilisiert ist,

(ii) ein Antigen, das zur Bindung an das spezifische Immunglobulin fähig ist, und

(iii) einen markierten Antikörper mit Spezifität für das Antigen

umfaßt.