DE68921261T2

DE68921261T2 - Auf menschlichem Serum basierende stabile Kontrolle.

Info

Publication number: DE68921261T2
Application number: DE68921261T
Authority: DE
Inventors: Alan Posner; Pedro Romero
Original assignee: Dade International Inc
Current assignee: Dade Behring Inc
Priority date: 1988-07-11
Filing date: 1989-07-03
Publication date: 1996-08-29
Anticipated expiration: 2009-07-04
Also published as: EP0351117A3; EP0351117A2; EP0351117B1; US4994375A; DE68921261D1; CA1338915C

Description

Die Erfindung betrifft allgemein ein rekonstituiertes stabiles Kontrollgemisch auf der Basis von Humanserum zur Unterstützung der Überwachung der Präzision und Genauigkeit der nachstehenden Assays: Gesamtprotein, CK (Kreatinkinase), CK-Isoenzyme, LD (Laktatdehydrogenase), LD-Isoenzyme und spezifische Proteine.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft rekonstituierte stabile Kontrollgemische auf der Basis von Humanserum, die zur Unterstützung bei der Messung von Gesamtprotein, Gesamt-CK, CK-Isoenzymen, Gesamt-LD, LD-Isoenzymen und spezifischen Proteinen eingesetzt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung ein lyophilisisertes stabiles Kontrollgemisch auf der Basis von Humanserum mit Langzeitlagerfähigkeit und relativer Lagerstabilität im rekonstituierten Zustand.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Eine Reihe von physiologischen Bedingungen und Zuständen ist mit den obigen Enzymen in Wechselbeziehung. Ein erhöhter Gesamt-CK-Spiegel steht in Wechselbeziehung mit Myokardinfarkt, Myokardischämie, Stenokardie, Tachykardie, Myokarditis, Subarachnoidalblutung, Schlaganfall, Gehirntumor, Krämpfen, Meningitis, Enzephalitis, akuter Psychose, Epilepsie, Muskeldystrophie, virusbedingter Myositis, schwerer Myoglobinurie, maligner Hyperthermie, Kohlenmonoxidvergiftung usw.
Ein erhöhter Spiegel des grundlegenden Isoenzyms CK-MB geht einher mit Myokardinfarkt, Myokardischämie, Muskeldystrophie, Myositis, schwerer Myoglobinurie, maligner Hyperthermie und Kohlenmonoxidvergiftung. Erhöhte CK-MM-Spiegel haben derzeit keine klinische Bedeutung. Die Gegenwart von LD gemeinsam mit CK-MB ist ganz spezifisch für Mykardinfarkt. Die Isoenzyme von LD stehen auch mit bestimmten Krankheitszuständen in Wechselbeziehung.
Es sind Tests entwickelt worden, um die Gegenwart oder Konzentration dieser Enzyme in Körperfluiden zu bestimmen. Siehe beispielsweise NHL CK MB, NHL CK, NHL LD (DR 5020), ACA LDH-Pack, Paragon (Beckman) CK-Isoenzym-Elektrophorese usw.
Um die Präzision und Genauigkeit dieser Tests beibehalten zu können, schreibt eine gute Laborpraxis vor, daß jedesmal, wenn ein Assay durchgeführt wird, Kontrollmaterialien mit den Patientenproben vorgesehen sein sollen. Wenn die Kontrollwerte außerhalb des Bereichs zu liegen scheinen, wenn Auf- oder Abwärtstrends beobachtet werden, oder wenn plötzliche Verschiebungen in Kontrollwerten zu erkennen sind, sollten sämtliche Betriebsparameter einschließlich der Kalibrierung der Instrumente überprüft werden.
Es wurde jedoch beobachtet, daß CK- und LD-Enzyme nicht sehr stabil sind. Um den Transport und die Lagerung dieser Tests zu erleichtern, werden die Kontrollgemische lyophilisiert. Es wurde außerdem beobachtet, daß die Enzymaktivität während der Lyophilisierung und der Rekonstituierung verlorengehen kann.
Es ist bekannt, daß das Enzym CK aufgrund seiner reaktiven SH-Gruppe eines der am wenigstens stabilen Enzyme ist. Um die Enzymaktivität von CK und anderen SH-enthaltenden Enzymen zu konservieren, werden der CK-Lösung ein oder mehr Thiolverbindungen zugesetzt. N. Kar, "Activation of Creatine Phosphokinase by Sulfhydryl Compounds in Normal and Muscular Dystrophy Sera", 18 Proc. Exp. Bio. Med. 662, 663 (1985). D. Miyada, "Creatine Kinase Reactivation by Thiol Compounds", 58 Clinica Chimica Acta 97 (1975); G. Szasz, "Creatine Kinase in Serum: 5. Effect of Thiols on Isoenzyme Activity During Storage at Various Temperatures", 24 Clin. Chem. 1557 (1978). Zusätzlich zu einer allgemeinen Stabilisierung von CK ist es häufig erwünscht, dieses Enzym enthaltende Lösungen zu lyophilisieren und zu rekonstituieren. Einige Forscher schlagen vor, daß die Reaktivierung in Gegenwart von zugesetztem Thio-Aktivator stattfinden sollte. O. Hetland, "Activation of Creatine Kinase Activity in Lyophilized Control Materials", 37 Scand. J. Clin. Lab. Invest. 563 (1977); L. Morin, "Creatine Kinase: Stability, Inactivation, Reactivation", 23 Clin. Chem. 646 (1977).
Eine andere Methode zur Stabilisierung von SH-Enzymen ist die Modifikation der reaktiven -SH-Gruppen mit einem Reagens. Diese Reagenzien, z. B. Iodacetat, führen zu einer irreversiblen Reaktion der SH-Gruppe und einem unerwünschten Verlust der Enzymaktivität.
Noch eine andere Methode zur Stabilisierung von SH-Enzymen umfaßt die Umsetzung eines Organodisulfids, eines Organothiosulfonats, eines Tetrathionats oder eines Gemischs davon mit CK, um eine stabile Zwischen-Zusammensetzung zum Einbau in einen diagnostischen Referenz-Standard zu bilden. Siehe US-PS 4 339 533.
Außerdem wurde beobachtet, daß Salze und Koenzyme bestimmte Enzyme vor Denaturierung schützen können. Disabato untersuchte die Wirkung einer Reihe von organischen und anorganischen Salzen auf die Inaktivierung von Milchsäure- Dehydrogenase von Hühnern durch Harnstoff. G. Disabato, "The Denaturation of Lactic Dehydrogenases", 240 J. Biological Chem. 1072, 1073 (1965). Es wurde ferner beobachtet, daß die Stabilität in Abhängigkeit von dem pH der Lösung veränderlich ist. C. Chervenka, "The Urea Denaturation of Chymotrypsinogen as Determined by Ultraviolet Spectral Changes; The Influence of pH and Salts", 82 J. Am. Chem. 582 (1960). Außerdem ist es bekannt, daß die Stabilität, gemessen an einer Abnahme der Aktivität, von einzelnen Enzymen als eine Funktion der Zeit und der Lagertemperatur veränderlich ist. P. Hissin et al., "Stability of Total Dehydrogenase (LD) and LD isoenzymes at Differerit Storage Temperatures as a Function of Time", 31 Clin. Chem. 999 (1985); H. Kreutzer, "Lactic Dehydrogenase Isoenzymes in Blood Serum After Storage at Different Temperatures", 9 Clin. Chim. Acta 64 (1964).
EP-A-0 130 708 zeigt ein Kontrollgemisch, in dem CK und LD- Isoenzyme durch die Zugabe bestimmter Zucker stabilisiert sind. Citrat kann als ein Antikoagulans zugefügt sein.
Die Erfindung stellt ein Kontrollgemisch gemäß Anspruch 1, ein Verfahren zum Herstellen eines solchen Kontrollgemischs gemäß Anspruch 5 sowie die Verwendung von Natriumcitrat zur Enzymstabilisierung bei der Herstellung eines stabilen Kontrollgemischs auf der Basis von Humanserum gemäß Anspruch 6 bereit.
Das Kontrollgemisch der Erfindung ist ein stabiles rekonstituiertes Kontrollgemisch auf der Basis von Humanserum, das bei der Überwachung der Präzision und Genauigkeit der folgenden Assays zu verwenden ist: Gesamtprotein, Gesamt-CK (Kreatinkinase), CK-Isoenzyme, Gesamt-LD, LD-Isoenzyme und spezifische Proteine. Insbesondere zeigt das stabilisierte Kontrollgemisch die gleiche Enzymstruktur nach der Lyophilisierung und Rekonstituierung wie bei der Untersuchung im frischen Zustand.
Das Kontrollgemisch weist bevorzugt ein Gemisch aus frischem Humanserum und Natriumcitrat mit einem pH 6,7 auf, das zur Stabilisierung der Enzyme eingesetzt wird. Sehr überraschend werden dem Gemisch keine Thiolverbindungen zusätzlich zu den Thiolverbindungen zugesetzt, die bei der Reinigung der Human-CK-Enzyme eingesetzt werden.

Genaue Beschreibung der Erfindung und beste Art der Ausführung

BEISPIEL 1

1. Herstellen eines Basispools

Frisches Humanserum (die Menge ist gleich derjenigen Menge, die zum Erhalt von 6,5 bis 7,5 g/dl notwendig ist) wird in einem rostfreien Stahlbehälter 15 min (fünfzehn Minuten) gemischt. Der Pool wird durch einen geeigneten Vorfilter (z. B. Zeta Plus CPS-50, Ertel #3) in einen reinen rostfreien Stahlbehälter futriert. Antibiotika (Gentamycin 86 mg/l, Cycloheximade 50 mg/l) und Natriumcitrat 8,8 g/l werden zugefügt, und der Pool wird für 15 min (fünfzehn Minuten) vermischt. Der pH des Pools wird gemessen und mit Salzsäure oder 7N Natriumhydroxid auf 6,7 ±0,1 eingestellt. Der Pool wird durch ein autoklaviertes Filterset, das in einem Filter kleiner als 0,3 µm endet, in einen geeigneten sterilen Lagerbehälter futriert und bis zum Gebrauch bei 2 bis 8 ºC gelagert. Ein Basispool sollte nicht länger als sechs (6) Tage gelagert werden.

2. Herstellen von stabilisierten Enzymen

CK-MB vom menschlichen Herzen (Lee Scientific) wird dem Basispool zugefügt und für 15 min (fünfzehn Minuten) vermischt. Die von Lee Scientific erhaltenen Human-CK-Enzyme werden ausgereinigt durch Dialysieren von Human-CK-Enzymen gegen 0,01M Natriumphosphat, 0,01M EDTA, 0,001M Thiol (Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythreitol (DTE)). Die CK- MB-Konzentration wird auf 15 bis 25 % der CK-Gesamtkonzentration eingestellt. Die CK-Gesamtkonzentration liegt bei 620 bis 770 IE/1 (ACA) (ungefähr 15 % (fünfzehn Prozent) Aktivität geht bei der Lyophilisierung verloren). Humanherz- CK-MM (Lee Scientific) wird dem Basispool zugefügt und für 15 min (fünfzehn Minuten) vermischt. die Konzentration von CK-MM wird auf 70 bis 80 % der CK-Gesamtkonzentration eingestellt. Humanherz-LD wird zugefügt, und der Pool wird für 15 min (fünfzehn Minuten) vermischt. Die LDH-Konzentration wird auf 300 bis 400 IE/1 eingestellt. CK-BB weist 2 bis 10 % Gesamt-CK auf, LD1 weist 37 bis 47 % Gesamt-LD auf, LD2 weist 23 bis 37 % Gesamt-LD auf, LD3 weist 7 bis 19 % Gesamt-LD auf, LD4 weist 2 bis 8 % Gesamt-LD auf, und LDS weist 3 bis 11 % Gesamt-LD auf. Diese Analyten werden nicht eingestellt, weil ihre Werte gewöhnlich aus dem Basismaterial und Spikes vorhanden sind. Der Pool wird mit gereinigtem Wasser auf das gewünschte Volumen gebracht und für 15 min (fünfzehn Minuten) vermischt. Der Pool wird durch einen sterilen Filter kleiner als 0,3 µm in einen sterilen Behälter futriert. Die aus den zugefügten Human-CK-Enzymen erhaltene Thiolkonzentration sollte 3 x 10&supmin;²M nicht überschreiten. Nach Beendigung der Schritte 1 und 2 von Beispiel 1 besteht das Kontrollgemisch aus den folgenden Bestandteilen: TABELLE I CK/LD-KONTROLLGEMISCH Bestandteil Methode Naßzielbereich Gesamtprotein Gesamt-CK Gesamt-LDH Natriumcitrat aca & Paragon 1 CK-MB = (ACA-Gesamt-CK) (% MB aus Paragon (Beckman)) 2 Bezogen auf Gesamt-CK-ACA -Bereich von 620-770 IE/1. 110 IE/1 ist als Ziel zu verwenden.

3. Abfüllen/Lyophilisieren

Innerhalb von 36 h (sechsunddreißig Stunden) nach dem Formulieren und Abfüllen muß mit der Lyophilisierung begonnen werden. Fläschchen, die 1 ml des formulierenten Serums enthalten, werden in einem Lyophilisiergerät bei einer Temperatur von -37 ºC gefroren. Das Wasser in dem gefrorenen Serum wird unter Vakuum bei einer Temperatur von ca. +23 ºC sublimiert. Die das lyophilisierte Produkt enthaltenden Flaschen werden unter Vakuum hermetisch verschlossen und dann bei 4 ºC aufbewahrt.
Nichtrekonstituiertes Material sollte bei 2 bis 8 ºC im Kühlschrank gelagert werden. Rekonstituiertes Material ist für 5 d (fünf Tage) stabil, wenn es dicht verschlossen im Dunkeln bei 2 bis 8 ºC aufbewahrt wird.

4. Rekonstituieren

Zur Rekonstitution des Produkts: Man nehme das Kontrollgemisch aus dem Kühlschrank und lasse es Raumtemperatur annehmen (ungefähr 10 min (zehn Minuten)). Man öffne das Fläschchen vorsichtig; unter Verwendung einer volumetrischen Pipette, Klasse A, füge man genau 1,00 ml entionisiertes (oder destilliertes) Wasser mit Raumtemperatur zu. Man verschließe das Fläschchen und lasse es für 10 min (zehn Minuten) bei Raumtemperatur stehen. Man drehe das Fläschchen vorsichtig wenigstens dreimal um, um sicherzustellen, daß das Kontrollgemisch in Lösung und der Inhalt gründlich vermischt ist. Lagerung im dunkeln bei 2 bis 8 ºC. Rekonstituiertes Produkt wird auf Stabilität, d. h. auf die Enzymaktivität über der Zeit geprüft.
Um die Stabilität im rekonstituierten Zustand zu bestimmen, wurden die folgenden Tests durchgeführt. Aus diesen Tests ist ersichtlich, daß die Enzyme bei der Rekonstituierung im wesentlichen die gleichen Charakteristiken zeigen, die in der Tabelle I angegeben sind. Die Enzyme behalten diese Eigenschaften über wenigstens sieben (7) Tage. TABELLE II Analyt Zeit 7 d nach Rekonstit. Protein Albumin Protein-Elektrophorese % Alpha glob Beta Gamma Gesamt IE/1 Spezifische Proteine mg/dl Haptoglobin Transferrin Alpha-1-antitryp Acidglycoprotein Macroglobin Ceruloplasmin Apolipoprotein Thyroid -Funktion Aufnahme % Thyroid-bindendes Globulin µg/ml
* LDH-Stabilität wird in einem Referenzlabor bestimmt, NHL (DR 5020), und zwar auf einem Olympus-Analysator.
** CK-Aktivität wird für Arrhenius-Stabilität auf einem DuPont ACA , "CK Pack" bestimmt.

BEISPIEL II

Das stabile rekonstituierte Kontrollgemisch auf Serumbasis für Gesamt-LD und Gesamt-CK und ihre Isomeren, das in Beispiel I hergestellt wurde, wird als ein Kontrollgemisch bei der Gel-Elektrophorese einer Serumprobe von einem Patienten eingesetzt.
Das LD-Isoenzym-Elektrophorese-Kit Paragon von Beckman ist zur diagnostischen Bestimmung der Isoenzyme von LD in Humanserum gedacht. LD besteht aus vier Polypeptid-Untereinheiten. Die verschiedenen Isoenzyme von LD können auf der Basis ihrer Untereinheitszusammensetzungen unterschieden werden. Unterschiede in der Untereinheitszusammensetzung resultieren in Enzym-Molekülen mit unterschiedlichen Ladungen. Die Unterschiede in der Oberflächenladung sind die Basis, auf der die verschiedenen Isoenzyme durch Elektrophorese getrennt werden können.
Die Elektrophorese von Laktatdehydrogenase-Isoenzymen kann als quantitatives und auch als qualitatives Verfahren angewandt werden. Bei der quantitativen Analyse wird die elektrophoretische Struktur einer densitometrischen Messung unterworfen, und die relativen Mengen der verschiedenen Isoenzyme werden als Prozentsätze berechnet und schließlich als Internationale Einheiten pro Liter bzw. IE/1 Laktatdehydrogenase-Aktivität ausgedrückt. Bei Verwendung als ein qualitatives Verfahren wird jede elektrophoretische Struktur visuell interpretiert.
Die Genauigkeit der Resultate kann gewährleistet werden durch Verwendung des in Beispiel I beschriebenen Kontrollgemischs auf die folgende Weise: TABELLE III Paragon -LD Gel BECKMAN
Die LDH-Struktur der Tabelle III zeigt die Produktstabilität über die Zeit. Die in der Tabelle III gezeigten Trennungen wurden an einem Produkt durchgeführt, das fünf (5) und sieben (7) Tage vor der Analyse rekonstituiert worden war. Die Trennung wird parallel mit frisch rekonstituierter Probe durchgeführt. Bahn Nr. 1 in Gel Nr. 1 und 2 ist das Kontrollgemisch. Bei Gel Nr 1 sind die Bahnen Nr. 7 und 8 die frisch rekonstituierten Proben. Die Bahnen Nr. 9 und 10 sind die Fünf-Tage-Proben, und bei Gel Nr. 2 sind die Bahnen Nr. 2 und 3 die Sieben-Tage-Proben, die der Analyse unterzogen wurden. Die Struktur ist stabil und reproduzierbar, so daß das Produkt zur Verwendung als ein Kontrollgemisch ideal geeignet ist.

Claims

1. Stabiles rekonstituiertes Kontrollgemisch auf der Basis von Humanserum zur Analyse des Gesamtwerts an Laktatdehydrogenase (LD) und Kreatinkinase (CK) sowie von deren Isoenzymen, welches ein Gemisch aus folgendem enthält:

a) frisches Humanserum in ausreichender Menge zur Erzielung einer endgültigen Gesamtproteinkonzentration zwischen etwa 6,5 und 7,5 g/dl;

b) zwischen etwa 525 und 695 U/L der gesamten CK-Menge, wobei das CK aus etwa 70 bis 80 % CK-MM-Isoenzym, rund 15 bis 25 % CK-MB-Isoenzym und ca. 2 bis 10 % CK-BB-Isoenzym besteht;

c) zwischen etwa 300 und 400 U/L LD, wobei das LD aus 37 bis 47 % LDI-Isoenzym, 23 bis 37 % LD2-Isoenzym, 7 bis 19% LD3-Isoenzym, 2 bis 8 % LD4-Isoenzym und 3 bis 11 % LD5-Isoenzym besteht; und

d) Natriumzitrat in ausreichender Menge zur Stabilisierung der Enzyme;

e) wobei das Kontrollgemisch außer einer zur Reinigung der CK-Isoenzyme eingesetzten Menge an Thiol-Verbindungen keine weiteren zugesetzten Thiol-Verbindungen enthält, während das gereinigte CK dem Kontrollgemisch zugesetzt wird, um die zur Erreichung einer Thiol-Konzentration von weniger als 3 x 10&supmin;² M in (1)(b) angegebenen Parameter zu erreichen;

f) wobei das Kontrollgemisch keine Glukose, Sukrose, reduzierenden Monosaccharid-Zucker oder reduzierenden Disaccharidzucker enthält.

2. Kontrollgemisch nach Anspruch 1, bei welchem das Natriumzitrat in einer Konzentration von etwa 1 x 10&supmin;³ M vorliegt.

3. Kontrollgemisch nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der endgültige pH-Wert 6,7 ± 0,1 beträgt.

4. Verfahren zur Kontrolle der Genauigkeit und Richtigkeit einer Analyse zur Bestimmung eines aus der Gruppe gewählten Enzyms, die aus der Gesamtmenge an CK, der Gesamtmenge an LD, der Gesamtmenge an CK-MM, CK-MB, CK-BB, LD1, LD2, LD3, LD4 und LD5 besteht, wobei das Verfahren den Schritt der Vornahme der Analyse unter Einsatz des Kontrollgemisches nach Anspruch 1 umfaßt.

5. Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten und rekonstituierten Kontrollgemisches auf der Basis von Humanserum für die Analyse zur Bestimmung der Gesamtmenge an LD und CK und deren Isoenzyme, wobei die Enzyme sieben Tage lang ab ihrer Rekonstituierung bei Lagerung im Dunklen bei 2 bis 8ºC stabilisiert werden, zu welchem Verfahren der Schritt des Vermischens von folgendem gehört:

c) zwischen etwa 300 und 400 U/L LD, wobei das LD aus 37 bis 47 % LD1-Isoenzym, 23 bis 37 % LD2-Isoenzym, 7 bis 19% LD3-Isoenzym, 2 bis 8 % LD4-Isoenzym und 3 bis 11 % LD5-Isoenzym besteht; und

d) Natriumzitrat in einer Menge von etwa 1,10&supmin;³ M als einzigem Mittel zur Stabilisierung der Enzyme;

e) mit Ausnahme von Thiol-Verbindungen zur Reinigung, die mit den CK-Isoenzymen zugesetzt sind und in dem Kontrollgemisch in einer Konzentration von unter 3,10&supmin;² M vorhanden sind.

6. Verwendung von Natriumzitrat zum Zwecke der Stabilisierung der Enzyme in einem stabilen Kontrollgemisch auf der Basis von Humanserum für die Analyse zur Bestimmung der Gesamtmenge an LD und CK und deren Isoenzyme, wobei das Kontrollgemisch außerdem enthält:

d) eine Thiolkonzentration unter 3,10&supmin;² M aufweist, wobei das Thiol zur Reinigung der CK-Isoenzyme eingesetzt wird und mit den CK-Isoenzymen eingebracht wird.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Natriumzitrat in einer Konzentration von etwa 1 x 10&supmin;³ M vorliegt.

8. Verwendüng von Natriumzitrat nach Anspruch 6 oder 7 zum Zwecke der Stabilisierung der Enzyme während der Lyophilisierung und Rekonstitution des Kontrollgemisches.