DE68905117T2

DE68905117T2 - Verfahren zur stabilisierung von blutgewinnungsfaktoren.

Info

Publication number: DE68905117T2
Application number: DE8989116866T
Authority: DE
Inventors: Masayasu Enomoto
Original assignee: Nippon Shoji Co Ltd
Current assignee: Nippon Shoji Co Ltd
Priority date: 1988-09-12
Filing date: 1989-09-12
Publication date: 1993-08-05
Anticipated expiration: 2009-09-13
Also published as: EP0359201A3; JPH0650999B2; ES2053897T3; FI894303A0; NO893637L; NO178682C; NO893637D0; FI93494B; FI894303L; DE68905117D1; NO178682B; DK447489D0; EP0359201A2; DK447489A; FI93494C; US5147803A; JPH0275953A; EP0359201B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Stabilisieren von Blutkoagulationsfaktoren.
Es ist bekannt, daß Blutkoagulation sowohl endogene wie auch exogehe Reaktionen umfaßt, und viele Koagulationsfaktoren nehmen an diesen Reaktionen teil. Die genaue Bestimmung ihrer Reaktionen in einer Probe ist einer der wichtigen Punkte der klinischen Tests. Jedoch sind viele dieser Koagulationsfaktoren Protein und neigen dazu, denaturiert zu werden. Von diesen ist insbesondere im Hinblick auf die Faktoren V und VIII bekannt, daß diese leicht inaktiviert werden. In vielen Fällen bewirkt die Instabilität der Faktoren eine Störung der klinischen Tests. Es wird beispielsweise gesagt, daß eine einem Koagulationstest auszusetzende Probe bei 2 bis 8ºC aufbewahrt werden sollte, und der Test sollte innerhalb von 4 Stunden nach Blutsammlung durchgeführt werden. Darüber hinaus ist ein bei dem Test zu verwendendes kommerziell erhältliches Kontrollplasma (lyophilisiertes Produkt) in dem Test nur einen Tag lang unter Kühlung nach seiner Wiederherstellung stabil. Die Stabilitäten von als Testreagenzien zu verwendenden Plasmen, denen verschiedene Koagulationsfaktoren fehlen, sind sehr gering, und viele von ihnen sind nur einige Stunden unter Kühlung stabil und sollten nicht eingefroren werden.
Wenn derartige instabile Blutkoagulationsfaktoren stabilisiert werden können, ist es möglich, die Beschränkung hinsichtlich der Lagerbedingungen und Lagerbeständigkeit einer Probe nach Blutabnahme, des Kontrollplasmas und des Plasmas, dem verschiedene Koagulationsfaktoren fehlen, zu erleichtern. Dieses ist im Hinblick auf klinische Tests wie auch industrielle Zwecke sehr vorteilhaft. Somit besteht ein Verlangen im Hinblick auf die Entwicklung eines Verfahrens zum Stabilisieren von Blutkoagulationsfaktoren.
Andererseits sind viele Untersuchungen im Hinblick auf die Stabilisierung verschiedener Proteine einschließlich Enzyme durchgeführt worden. Jedoch sind Substanzen, die Stabilisierungswirkungen bei Proteinen zeigen, gemäß den Arten und Ursprüngen der Proteine sehr unterschiedlich, und gegenwärtig werden entsprechende spezifische Substanzen zum Stabilisieren der entsprechenden Proteine unabhängig voneinander festgestellt.
Wenn man die Stabilisierung von Blutkoagulationsfaktoren betrachtet, so sind Koagulationsfaktorherstellungen von bestimmten Faktoren, beispielsweise VIII, IX und XIII Faktoren, vorgeschlagen worden, wobei diese Faktoren unter Verwendung von Albumin, Dextran, Zuckern, Aminosäuren, organischen Karbonsäuren und neutralen Salzen wie beispielsweise NaCl, KCl und dergleichen stabilisiert werden (JP-A-56-127308, 56-135418, 58- 74617, 59-134730, 60-199829, 61-60614, 62-10019 und 62-195331) . Es besteht jedoch bezüglich dieser das Ziel, die Koagulationsfaktoren während der Wärmebehandlung für die Inaktivierung von Viren bei den Herstellungen zu stabilisieren, und deshalb werden sie in sehr hohen Konzentrationen hinzugegeben. Wenn in einem Blutkoagulationstest eine Substanz wie beispielsweise eine Aminosäure wie Glycin oder Alanin zu Blut oder Plasma in hoher Konzentration gegeben wird, beispielsweise 10 % oder mehr, wird die Koagulationsreaktion selbst inhibiert, und der gewünschte Koagulationstest kann nicht durchgeführt werden. Darüber hinaus ist das zuvor beschriebene Verfahren auf bestimmte Koagulationsfaktoren beschränkt, und die Präparationen enthalten nicht viele andere Blutkomponenten. Somit bezieht sich das Verfahren nicht auf Plasma oder Blut, in dem alle oder ein Teil der Faktoren, die an den Koagulationsreaktionen teilnehmen, darin enthalten sind oder wobei ein Teil von ihnen fehlt.
DE-A-1 227 414 offenbart, daß das Protein Cytochrom C durch Hinzufügen eines Stabilisators aus einer Liste von verschiedenen variierten Verbindungen, welche Glycylglycin und Glycylglycylglycin umfaßt, stabilisiert werden kann.
Die Erfinder haben intensive Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zum Stabilisieren vieler im Blut oder Plasma enthaltener Blutkoagulationsfaktoren, welches eine Koagulationsreaktion nicht ungünstig beeinflußt, festzustellen. Als Ergebnis ist festgestellt worden, daß die Koagulationsfaktoren bemerkenswert durch Hinzufügen des Dipeptids Glycylglycin und/oder des Tripeptids, Glycylglycylglycin zu Blut oder Plasma stabilisiert werden können.
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Stabilisieren von Blutkoagulationsfaktoren zur Verfügung zu stellen.
Dieses Ziel wie auch andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung offensichtlich.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Stabilisieren von Blutkoagulationsfaktoren zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren Hinzufügen von Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycylin in derartigen Mengen zu Blut oder Plasma umfaßt, daß diese keinen Einfluß auf die Blutkoagulationszeit haben.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Kontrollplasma, welches als Stabilisator der Blutkoagulationsfaktoren Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin in derartiger Menge umfaßt, daß sie keinen Einfluß auf die Blutkoagulationszeit haben.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Reagenz zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Blutkoagulationsfaktoren, welches als Stabilisator der Blutkoagulationsfaktoren Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin in einer derartigen Menge umfaßt, daß sie keinen Einfluß auf die Blutkoagulationszeit haben.
Das bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Glycylglycin und Glycylglycylglycin sind Peptide, wobei zwei bzw. drei Aminosäuren gebunden sind, und sie unterscheiden sich von den in bekannten Stabilisierungsverfahren verwendeten Substanzen. Es ist bis jetzt im Stand der Technik nicht bekannt gewesen, daß diese Substanzen sich nicht nur für die Stabilisierung bestimmter Koagulationsfaktoren sondern auch für die aller Koagulationsfaktoren eignen.
Blutkoagulationsfaktoren werden in diejenigen eingeteilt, die an einem endogenen Koagulationsreaktionsweg teilnehmen, deren Koagulationsreaktion durch Kontakt mit der Oberfläche einer Fremdsubstanz begonnen wird, und in diejenigen, die an einem exogenen Koagulationsreaktionsweg teilnehmen, deren Koagulationsreaktion durch Gewebethromboplastin begonnen wird. Die vorliegende Erfindung hat zur Zielsetzung, alle Faktoren zu stabilisieren, die an beiden Reaktionswegen teilnehmen, und diese Faktoren werden durch Hinzufügen von Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin zu Blut oder Plasma stabilisiert.
Das bedeutet, daß das Stabilisierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durch Hinzufügen von Glycylglycin, Glycylglycylglycin oder beiden Stoffen zu einem zu stabilisierenden System durchgeführt wird. Die Konzentration dieser Substanzen beträgt beispielsweise 0,1 bis 2,0 % (G/V), vorzugsweise 0,5 bis 1,0 % (G/V), wenn das zu stabilisierende System Blut ist (Gesamtblut). Wenn die Konzentration weniger als 0,1 % ist, wird keine Stabilisierungswirkung erwartet. Andererseits wird eine leichte Hämolyse bei einer Konzentration von 1,5 % beobachtet, und die Hämolyse wird signifikanter, wenn die Konzentration ansteigt. Darüber hinaus besteht die Tendenz, daß die Koagulationszeit [Prothrombinzeit (PT) oder aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APPT)] allmählich bei einer Konzentration von 1,5 % oder höher verlängert wird. Deshalb ist eine Konzentration von mehr als 2 % unerwünscht. Wenn beide Substanzen zusammen verwendet werden, kann eine Menge von jeder Substanz entsprechend ausgewählt werden, und die zuvor definierte Konzentration entspricht der Summe dieser. Wenn das zu stabilisierende System Plasma ist, beträgt die Konzentration 0,1 bis 4,0 % (G/V) vorzugsweise 0,5 bis 2,0 % (G/V). Wenn die Konzentration geringer als 0,1 % ist, wird kein Stabilisierungseffekt erwartet. Obwohl die Koagulationszeit bei einer Konzentration von 2 % oder höher allmählich verlängert ist, wird noch ein Stabilisierungseffekt beobachtet. In Abhängigkeit von dem Zweck der Stabilisierung bewirkt eine Konzentration von bis zu 4 % (G/V) kein Problem. Wenn die Konzentration höher als 4 % wird, wird die Koagulationszeit zu lang, und dieses ist unerwünscht. In ähnlicher Weise kann im Falle von Plasma, wenn beide Substanzen zusammen verwendet werden, die Menge jeder Substanz entsprechend ausgewählt werden, und die zuvor definierte Konzentration entspricht der Summe aus diesen.
Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung werden Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin zu Blut hinzugegeben, beispielsweise zusammen mit einer als Antikoagulans verwendeten Substanz, wenn das Blut gesammelt ist, oder zu dem Blut gegeben, wobei sie in einer Lösung eines Antikoagulanses gelöst werden. Alternativ können Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin zu Blut gegeben werden, zu dem das Antikoagulans bereits hinzugefügt wurde. Beispiele des für die Ansammlung von Blut verwendeten Antikoagulanses umfassen Natriumcitrat, Oxalsäure oder EDTA. Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin in Form von Feststoffen oder einer wäßrigen Lösung können auch zu durch Zentrifugation von Blut erhaltenem Plasma, zu dem ein Antikoagulans bereits hinzugefügt wurden ist, gegeben werden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird hauptsächlich zur Zeit der Blutabnahme von einem Patienten an einem Ort durchgeführt, an dem ein Koagulationstest durchgeführt wird, oder nach der Blutabnahme von einem Patienten für die Durchführung eines Koagulationstests durchgeführt. Darüber hinaus können Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin zu Blut oder Plasma bei der industriellen Herstellung von Kontrollplasma oder Plasma, dem es an verschiedenen Koagulationsfaktoren fehlt, welches zur Verwendung als Reagenzien für die Bestimmung der biologischen Aktivität der Koagulationsfaktoren bestimmt ist, hinzugefügt werden. Beispielsweise können sie bei der Herstellung von normalem und abnormalem Kontrollplasma, Plasma, dem es an verschiedenen Koagulationsfaktoren wie beispielsweise den Faktoren I, II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII und XIII mangelt, Plasma von dem Protein C entfernt ist oder Plasma von dem Antithrombin III entfernt ist, verwendet werden.
Somit liefert die vorliegende Erfindung auch ein Kontrollplasma und ein Reagenz zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Blutkoagulationsfaktoren, wobei Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin als Stabilisatoren der Blutkoagulationsfaktoren darin enthalten sind. Dieses Kontrollplasma und die Reagenzien können durch Vermischen von Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin mit anderen konventionellen Komponenten in der zuvor beschriebenen Konzentration gemäß dem konventionellen Verfahren hergestellt werden. Sie können in Form von Flüssigpräparationen, konzentrierten Flüssigpräparationen oder gefriegetrockneten Produkten vorliegen. Darüber hinaus können sie in Form von Kits vorhanden sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Handhabung von Probenplasma an dem Ort, an dem ein klinischer Test durchgeführt wird, leicht. Darüber hinaus kann die Lagerbeständigkeit von Plasma, dem es an verschiedenen Koagulationsfaktoren fehlt, verlängert werden, wodurch der Verlust auf ein Minimum gebracht wird.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen zusätzlich detailliert die vorliegende Erfindung.

BEISPIEL 1

Hinzugabe von Plasma

(1) Wirkung der Hinzugabe von Glycylglycin

Blut (9 Volumenteile) welches einer normalen Person abgenommen worden ist, wurde mit 3,2 % Trinatriumcitratlösung (1 Volumenteil) gemischt, und die Mischung wurde bei 3.000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten unter Erhalt von Plasma zentrifugiert. Zu dem Plasma wurden 0 % (Kontrolle) bis 4 % (G/V) Glycylglycin hinzugegeben und die Koagulationszeit wurde zur Bestimmung der Stabilisierungswirkung im Hinblick auf die Koagulationsfaktoren gemessen. Die Messung der Prothrombinzeit (PT) zur Bestimmung der Inaktivierung bei exogenen Koagulationsfaktoren (II, V, VII und X) wie auch die der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) zur Bestimmung der Inaktivierung bei endogenen Koagulationsfaktoren (XII, XI, IX, VIII, Prekallikrein und hochmolekulares Kininogen) wurden an den Tagen O, 4, 8 und 12 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Messungen von PT und APTT wurden folgendermaßen durchgeführt:

PT Messung

Zu Plasma (0,1 ml), welches zuvor 2 Minuten bei 37 ºC erhitzt worden war, wurde ein auf 37 ºC (0,2 ml) erwärmtes Thromboplastinreagenz (Thrombomat, hergestellt von BioMérieux S.A., Frankreich) für den Beginn der Koagulationsreaktion gegeben, und die Koagulationszeit (Sekunden) wurde gemessen.

APTT Messung

Plasma (0,1 ml) und APTT-Reagenz (Actimat, hergestellt von BioMérieux S.A., Frankreich) (0,1 ml) wurden gemischt, und die Mischung wurde 3 Minuten bei 37 ºC erwärmt. Dazu wurden auf 37 ºC (0,1 ml) erwärmtes 15 mM Calciumchlorid für den Beginn der Koagulationsreaktion gegeben, und es wurde die Koagulationszeit (Sekunden) gemessen. Die Messung der Koagulationszeit wurde unter Verwendung eines Blutkoagulationsmeßgerätes, Option 8 (hergestellt von BioMérieux S.A., Frankreich), welches den Endpunkt der Koagulation durch optische Messung der Trübungsänderung anzeigte, durchgeführt. Tabelle 1 Wirkung der Glycylglycinzugabe (gelagert bei 25 ºC) Konzentration (%) Tag (Sekunden)
Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich ist, wurde PT der Kontrolle (Glycylglycin 0 %) von 11,4 Sekunden auf 22,4 Sekunden bei 25 ºC in 12 Tagen verlängert, und APTT wurde von 37,4 Sekunden auf 131,8 Sekunden verlängert. Das heißt, es wurde Inaktivierung der Koagulationsfaktoren beobachtet. Desgleichen wurde bei einer geringeren Konzentration als 0,1 % kein Stabilisierungseffekt beobachtet. Andererseits wurde der Stabilisierungseffekt bei einer höheren Konzentration als 2 % beobachtet. Die Koagulationszeit war jedoch auf Grund der Zugabe von Glycylglycin verlängert. Das heißt, am Tage 0 betrug PT der Kontrolle (Glycylglycin 0%) 11,4 Sekunden, und deren APTT betrug 37,3 Sekunden. Durch Hinzufügen von 3 %-igem Glycylglycin wurde PT auf 13,5 Sekunden verlängert und APTT auf 46,5 Sekunden verlängert. Auf Grund dieser Verlängerung war eine höhere Konzentration als 4 % unerwünscht. Wenn man die Hinzugabe von 1 % Glycylglycin betrachtet, wurde PT in 12 Tagen von 11,5 Sekunden auf 14,2 Sekunden bei 25 ºC verlängert, und APTT wurde von 33,2 Sekunden auf 60,1 Sekunden verlängert. Im Vergleich zur Kontrolle war jedoch diese Verlängerung gering, und es wurde erkannt, daß die Inaktivierung der Koagulationsfaktoren inhibiert war.
Gemäß dieser Koagulationszeiten wird angenommen, daß im Vergleich zur Kontrolle die Koagulationsfaktoren um das dreifache oder mehr im Hinblick auf PT und um das zweifache oder mehr im Hinblick auf APTT stabilisiert werden.

(2) Zugabewirkung von Glycylglycylglycin

PT und APTT wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (1) im Hinblick auf die Bestimmung der Zugabewirkung von Glycylglycylglycin gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Zugabewirkung von Glycylglycylglycin (bei 25 ºC gelagert) Konzentration (%) Tag (Sekunden)
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wurde PT der Kontrolle (Glycylglycylglycin 0 %) in 12 Tagen bei 25 ºC von 10,5 Sekunden auf 21,9 Sekunden verlängert, und APTT wurde von 29,9 Sekunden auf 101,1 Sekunden verlängert. Wenn man andererseits die Zugabe von 1 % Glycylglycylglycin betrachtet, wurde PT von 10,8 Sekunden auf 13,1 Sekunden und APTT von 25,8 Sekunden auf 45,7 Sekunden verlängert. Im Vergleich zur Kontrolle war diese Verlängerung gering, und es wurde erkannt, daß die Inaktivierung von Koagualationsfaktoren inhibiert war. Es wurde kein Stabilisierungseffekt bei einer geringeren Konzentration als 0,1 % beobachtet. Aufgrund der Verlängerung war eine höhere Konzentration als 4 % unerwünscht.
Gemäß diesen Koagulationszeiten wird angenommen, daß im Vergleich zur Kontrolle die Koagulationsfaktoren um das dreifache oder mehr im Hinblick auf PT und um das zweifache oder mehr im Hinblick auf APTT stabilisiert werden.
Gemäß diesen Ergebnissen ist es klar, daß Glycylglycin und Glycylglycylglycin sich zum Stabilisieren aller Blutkoagulationsfaktoren im Plasma eignen.

BEISPIEL 2

Hinzugabe zu Blut

(1) Zugabewirkung von Glycylglycin

Von einer normalen Person abgenommenes Blut (9 Volumenteile) wurde mit 3,2 %-igem Trinatriumcitrat (1 Volumenteil) gemischt, und zu dem sich ergebenen Gesamtblut wurde Glycylglycin hinzugefügt. Nach Lösung wurde die Mischung 10 Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute unter Erhalt von Plasma zentrifugiert. Als Kontrollen wurden nach Zentrifugation des gleichen Gesamtblutes, wobei Plasma erhalten wurde, Glycylglycin zu dem Plasma gegeben. Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurden die Wirkungen im Hinblick auf die Koagulationszeiten (PT und APTT) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Clycylglycin (% G/V) Gesamtblut (Sekunden) Plasma (Sekunden) Hämolyse von Gesamtblut keine Hämolyse leichte Hämolyse starke Hämolyse
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, wurde starke Hämolyse beobachtet, und die Koagulationszeiten waren verlängert, wenn 4 % Glycylglycin zu dem Gesamtblut gegeben wurde. Diese Verlängerung wurde der Hämolyse zugeschrieben. Es wurde beinahe der gleiche Stabilisierungseffekt wie in Beispiel 1 beobachtet.

(2) Zugabewirkung von Glycylglycylglycin

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 (1) wurde Glycylglycylglycin zu dem Gesamtblut gegeben, und es wurde die Wirkung davon auf die Koagulationszeiten (PT und APTT) bestimmt.
Die Ergebnisse sind Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Glycylglycylglycin (% G/V) Gesamtblut (Sekunden) Plasma (Sekunden) Hämolyse von Gesamtblut keine Hämolyse leichte Hämolyse starke Hämolyse
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, wurde starke Hämolyse beobachtet, wenn 4 %-iges Glycylglycylglycin zu dem Gesamtblut gegeben wurde. Es wurde beinahe der gleiche Stabilisierungseffekt wie in Beispiel 1 beobachtet.

BEISPIEL 3

Wirkung bei Verwendung einer Kombination aus Glycylglycin uhd Glycylglycylglycin

Nach dem Auftauen von kommerziell erhältlichem eingefrorenem Plasa bei Raumtemperatur wurde dieses bei 3.000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten unter Entfernung von Niederschlägen zentrifugiert. Zu dem sich ergebenen Plasma wurde eine Mischung aus Glycylglycin und Glycylglycylglycin in dem Verhältnis von 3:0, 2:1, 1:2 oder 0:3 gegeben, so daß die Konzentration der Mischung in dem Plasma 1,5 % (G/V) wurde, und die Mischung gelöst wurde.
Gemäß Beispiel 1 wurden die Koagulationszeiten (PT und APTT) unter Verwendung von Plasma ohne Hinzugabe von Glycylglycin und Glycylglycylglycin als Kontrolle zur Bestimmung der Wirkung der Kombination dieser Substanzen gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Wirkung der Kombination (bei 25 ºC gelagert) Tag Glycylglycin : Glycylglycylglycin Kontrolle (keine Hinzugabe) (Sekunden)
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, wurde ein Stabilisierungseffekt sowohl beim Verbinden von Glycylglycin und Glycylglycylglycin (2:1 oder 1:2) wie auch beim Verwenden dieser Substanzen alleine (3:0 oder 0:3) beobachtet.

BEIPIEL 4

0,5 % (G/V) Glycylglycin wurden zu Plasma, von dem Antithrombin III (AT III) entfernt war, welches für die Bestimmung der biologischen Aktivität von Antithrombin III verwendet wird (PCT/JP89/00173), hinzugefügt, und die Stabilität davon wurde folgendermaßen bestimmt.
Das Plasma, von dem AT III entfernt war, wurde eingefroren und in einem Gefrierapparat gelagert. Es wurde an jedem Tag der Messung aufgetaut.
An Stelle einer Probe (AT III) wurde Michaelis-Puffer (50 ul) , zu dem Plasma (100 µl), von dem AT III entfernt war, gegeben, und die sich ergebende Mischung wurde 2 Minuten bei 37 ºC inkubiert.
Separat davon wurde kommerziell erhältliches PT Reagenz zehnfach mit 25 mM Calciumchloridlösung, welche 10 E/ml Heparin enthielt, unter Erhalt einer Reaktionsausgangslösung verdünnt. Diese auf 37 ºC (200 ul) erwärmte Lösung wurde zu dem zuvor beschriebenen Plasma gegeben, und es wurde die Koagulationszeit bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Stabilisierung von Plasma, von dem AT III entfernt ist Probe Tag keine Hinzugabe Glycylglycin 0,5 % (Sekunden)
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich ist, wurde die Koagulationszeit von 29,1 Sekunden auf 77,4 Sekunden in 7 Tagen verlängert, wenn Glycylglycin nicht hinzugefügt wurde. Wenn andererseits 0,5 % Glycylglycin hinzugefügt wurde, wurde keine Verlängerung der Koagulationszeit beobachtet, und es wurde ein bemerkenswerter Stabilisationseffekt beobachtet.
Dies zeigt, daß die Eigenschaften des Reagenzes stabil sind.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob oder ob nicht der bemerkenswerte Stabilisationseffekt des Glycylglycins und Glycylglycylglycins auf die Koagulationsfaktoren, wie in den Beispielen 1 bis 4 gezeigt, mit Aminosäuren und Zuckern erhältlich ist.
0,5 % (G/V) Glycin, Alanin oder Natriumaspartat oder 1,0 % (G/V) Mannit, Maltose oder Sucrose wurden zu kommerziell erhältlichem gelagertem Plasma gegeben und mit einer Kontrolle (ohne Hinzugabe) und Glycylglycin (0,5 %) verglichen. Bei diesem Beispiel wurden Einfrieren und Auftauen jeden Tag im Hinblick auf die Bestimmung der Stabilität wiederholt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Vergleich der Zugabewirkungen verschiedener Substanzen Substanz Tag Kontrolle Glycylglycin 0,5 % Glycin 0,5% Alanin 0,5% Natriumaspartat 0,5% Mannit 1,0% Maltose 1,0% Sucrose 1,0% (Sekunden)
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist, zeigte Glycylglycin bemerkenswerte Stabilisierung im Vergleich zu der Kontrolle. Jedoch betrug im Falle der anderen Substanzen APTT mehr als 70 Sekunden am 14 Tag und entsprach der APTT der Kontrolle. Somit wurde kein Stabilisierungseffekt beobachtet. Obwohl überdies ein leichter Stabilisierungseffekt im Fall von Aminosäuren beobachtet wurde, war der Effekt nicht so bedeutend wie der von Glycylglycin.
Somit wird klar erkannt, daß der Stabilisierungseffekt von Glycylglycin und Glycylglycylglycin spezifisch ist.

Claims

1. Verfahren zum Stabilisieren von Blutkoagulationsfaktoren, welches Hinzufügen von Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin als Stabilisator zu Blut oder Plasma in einer derartigen Menge umfaßt, daß der Stabilisator keine Wirkung auf die Blutkoagulationszeit hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Stabilisator zu dem Blut in einer Konzentration von 0,1 bis 2,0 % (G/V) hinzugefügt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Konzentration 0,5 bis 1,0 % (G/V) beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Stabilisator in einer Konzentration von 0,1 bis 4,0 % (G/V) zu dem Plasma gegeben wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Konzentration 0,5 bis 2,0 % (G/V) beträgt.

6. Kontrollplasma, welches Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin als Stabilisator von Blutkoagulationsfaktoren in einer derartigen Menge umfaßt, daß diese keine Wirkung auf die Blutkoagulationszeit haben.

7. Kontrollplasma nach Anspruch 6, wobei die Stabilisatorkonzentration 0,1 bis 4,0 % (G/V) beträgt.

8. Kontrollplasma nach Anspruch 7, wobei die Konzentration 0,5 bis 2,0 % (G/V) beträgt.

9. Reagenz zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Blutkoagulationsfaktoren, welches Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin als Stabilisator von Blutkoagulationsfaktoren in einer derartigen Menge umfaßt, daß sie keine Wirkung auf die Blutkoagulationszeit haben.

10. Verwendung von Glycylglycin und/oder Glycylglycylglycin als Stabilisator von Blutkoagulationsfaktoren.