DE68915194T2

DE68915194T2 - Vorrichtung zur Abgabe einer flüssigen Probe auf ein diagnostisches Gerät in reguliertem Ausmass.

Info

Publication number: DE68915194T2
Application number: DE68915194T
Authority: DE
Inventors: Patricia A Gary; Melissa S Maret
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1988-03-23
Filing date: 1989-02-15
Publication date: 1994-08-18
Anticipated expiration: 2009-02-16
Also published as: ATE105634T1; EP0334015A2; EP0334015A3; FI96449C; DK141689D0; DK172575B1; FI96449B; JPH0765994B2; CA1340048C; AU3026789A; MY104403A; EP0334015B1; DE68915194D1; ES2051900T3; FI891379L; DK141689A; AU620077B2; JPH0216451A; FI891379A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der diagnostischen In-Vitro-Testvorrichtungen. Insbesondere betrifft sie eine Vorrichtung zum Ausgeben einer Fluidprobe an eine Testvorrichtung mit einer geregelten Fließrate.
Jüngste Fortschritte in der Immunologie haben zur Entstehung einer neuen Art von Diagnosevorrichtungen geführt, die als Durchflußvorrichtungen bekannt sind. Generell sind mit diesen Vorrichtungen durchgeführte Tests erheblich leichter durchzuführen als herkömmliche immunodiagnostische Assays. Sie erfordern weniger Präzision beim Pipettieren und weniger Handgriffe. Sie eliminieren ferner die Notwendigkeit teurer Instrumente zum Lesen der Ergebnisse.
Eine solche Durchflußvorrichtung ist in US-A-4 632 901 beschrieben. Die dort dargestellte Vorrichtung weist ein erstes Teil auf, das eine Membran oder ein Filter ist, das mit einem Antikörper versehen ist, oder das in der Lage ist, Zellen oder Zellfragmente aus einer Fluidprobe zu extrahieren. Das erste Teil hat die Funktion, den Analyten auf der Membran oder dem Filter festzuhalten. Die Vorrichtung weist ferner ein zweites Teil auf, das einen Fluß durch das erste Teil hindurch induziert. Beim Gebrauch werden eine Fluidprobe und flüssige Reagenzien auf eine Fläche der ersten Membran aufgebracht. Die Reagenzien fließen durch das erste Teil zum zweiten Teil. Jeglicher durch Bindung an eine für den Analyten spezifische Bindespezies oder durch physisches Blockieren einer mit dem Analyten verbundenen Zelle oder eines Zellfragments auf dem ersten Teil zurückgehaltene Analyt wird sodann mittels eines Tracer-Systems erkannt. Die Reagenzien für das Tracer-System werden ebenfalls auf die erste Fläche des ersten Teils aufgebracht und fließen durch dieses zum zweiten Teil. Das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein einer erkennbaren Reaktion auf dem ersten Teil gibt das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein von dort gebundenem Analyten an.
Eine andere Durchflußanordnung ist in US-A-4 366 241 beschrieben. Diese Vorrichtung weist eine immunosorbente Zone und eine Flüssigkeitsaufnahmezone auf, die in Flüssigkeit aufnehmender Verbindung mit der immunosorbenten Zone steht. Die immunosorbente Zone weist ein Teil eines immunologischen Paares auf, das nicht-diffusiv an diese angebunden ist. Beim Gebrauch werden eine Fluidprobe und die Reagenzien eines Signalerzeugungssystems auf die immunosorbente Zone aufgebracht. Das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein einer erkennbaren Reaktion an der immunosorbenten Zone gibt das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein von Analyten in der Probe an.
US-A-4 366 241 beschreibt mehrere Vorrichtungen und Assay-Protokolle. Das Patent gibt an, daß eine oder mehr Schichten zwischen der immunosorbenten Schicht und der flüssigkeitsabsorbierenden Zone angeordnet werden können. Diese Schichten dienen als Sperren gegen das Zurückwandern von der flüssigkeitsabsorbierenden Schicht zur immunosorbierenden Schicht, als Füllelemente, zur Flußregelung oder dergleichen.
Eines der Erfordernisse dieser Durchflußvorrichtungen ist, daß die Probe der oberen Schicht in ausreichendem Maß ausgesetzt wird, um den Analyten auf der Schicht zurückzuhalten, üblicherweise mit einer spezifischen Bindereaktion. Danach müssen die Reagenzien des Tracers in ausreichendem Maße der oberen Schicht ausgesetzt sein, um das Eintreten der geeigneten Reaktionen zu bewirken. Wenn die Vorrichtung die Fluide zu schnell durch die Schichten saugt, können die Reaktionen nicht eintreten. EP-A-0 310 862, das gemäß Artikel 54(3) EPÜ zum Stand der Technik gehört, behandelt das Problem des Regelns des Flusses über einen porösen Träger, auf dessen Oberseite eine Testfläche ausgebildet ist. Die dort beschriebene Vorrichtung weist eine poröse Schicht mit Poren auf, die ausreichend groß sind, daß nicht gebundener Tracer und Analyt hindurch zu einer absorptiven Schicht fließen können. Die poröse Schicht und die absorptive Schicht wirken zum Regeln des Flusses von Reagenzien durch die poröse Schicht in die absorptive Schicht. Die Vorrichtung kann ebenfalls eine zwischen der porösen Schicht und der absorptiven Schicht angeordnete Flußregelschicht aufweisen.
Ein kürzlich eingeführtes Kit zur Erkennung von Gruppe-A-Streptokokken verwendet die in EP-A-0 310 862 beschriebene Erfindung. Dieses Kit enthält alle Reagenzien und Vorräte zum Erkennen des Analyten in Proben. die aus dem Rachen eines Patienten entnommen wurden. Die Probe wird in einer DispensTube -Vorrichtung extrahiert. Die Extraktionsvorrichtung ist ein Teströhrchen, in das die Probe und Extraktionsreagenzien hineingegeben werden. Nach dem Extrahieren der Probe wird eine Pipettenspitze auf das Röhrchen gesetzt und die extrahierte Probe kann in die Testvorrichtung ausgegeben werden. Die Pipettenspitze enthält ein grobes Filter zum Zurückhalten jeglicher großer Fragmente, die in der Probe enthalten sind. Sobald die Probe extrahiert ist, kann der gesamte Assay-Vorgang in nur drei bis fünf Minuten durchgeführt werden. Das Kit kann Streptokokken der Gruppe A in verhältnismäßig geringen Mengen erkennen.
Während das zuvor beschriebene Directigen 1-2-3 -Test-Kit (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cokeysville, Mo.) bei Streptokokken der Gruppe A sehr gute Ergebnisse zeitigt, ist bei Assays für andere Analyten eine zusätzliche Flußregelung erwünscht.
Ein weiteres Problem, das sich im Zusammenhang mit dem Aufkommen sehr empfindlicher und spezifischer Assays ergeben hat, ist das Problem von Falsch-Positiven, die sich aus dem Vorhandensein einer anderen Substanz als dem Analyten ergeben, die sich mit der spezifischen Bindespezies des Tracers und nicht spezifisch mit der Analyt-Immobilisierungsschicht eines Testsystems verbindet. Somit ergeben bei Assays, die im Tracer-System monoklonale Antikörper verwenden, welche aus von Mäusen erhaltenen Antiseren gewonnen sind, Proben von Menschen mit Antikörpern gegen Mäuse Falsch-Positive. Aus diesem Grund besteht eine Notwendigkeit, den sich aus dem Vorhandensein von Antikörpern gegen die zur Herstellung eines in dem Assay verwendeten Antiserums verwendete Spezies ergebenden Verlust an effektiver Spezifizität zu eliminieren.
EP-A-0 217 403 beschreibt eine Festphase-Analysevorrichtung mit einer planaren Schicht aus einem Material mit einer porösen Matrix aus Fasern und mehreren im wesentlichen kugelförmigen, festen Partikeln. Die Vorrichtung weist ferner eine in bezug zur Probenberührungsfläche der Planaren Schicht angeordnete Filtereinrichtung auf. Je nach Art des durchgeführten Assays wird die Filtereinrichtung als ein "Vorfilter" zum Entfernen überschüssiger Materie in einer Probe oder, zum Beispiel, zum Trennen und Zurückhalten von Blutzellen aus einer vollständigen Blutprobe bei gleichzeitigem Durchlassen von Plasma verwendet. Ein Nachteil der bekannten Vorrichtung ist es, daß keine zusätzliche Flußregelung der zur porösen Schicht geleiteten Probe möglich ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zum Ausgeben einer Fluidprobe an eine Durchflußvorrichtung mit einer geregelten Flußrate zu schafen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Ansprüchen des Anspruchs 1 gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Ausgeben von Fluidproben an eine In-Vitro-Diagnosevorrichtung mit geregelter Flußrate. Sie weist einen Napf zum Aufnehmen einer Fluidprobe, eine Öffnung im Boden des Napfs und eine die Öffnung bedeckende Flußregelmembran auf. Die Größe der Öffnung und die durchschnittliche Porengröße der Flußregelmembran sind derart gewählt, daß ein Fluid in dem Napf mit geregelter Rate auf die Oberfläche einer Diagnosevorrichtung ausgegeben wird.
Die Vorrichtung ist derart ausgebildet, daß der Napf und die Öffnung im Boden des Napfs derart bemessen und geformt sind, daß sie zu einer Testfläche der Testvorrichtung passen. Bei diesem Aufbau dient die Vorrichtung zum Ausgeben von Fluiden mit einer geregelten Rate über die gesamte Oberfläche der Testfläche.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung weist die Vorrichtung eine Einrichtung zum selektiven Entfernen von Spezies auf, die das Assay nachteilig beeinflussen könnten, während sie gleichzeitig das Ausfließen des Analyten aus dem Napf ermöglicht. Vorzugsweise handelt es sich bei der Einrichtung zum Entfernen störender Substanzen um eine spezifische Bindespezies, die die störende Substanz erkennt und den Analyt nicht bindet. Die spezifische Bindespezies zum Entfernen der störenden Substanz ist in vorteilhafterweise Weise an der Flußregelmembran angebracht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Flußregelmembran lösbar mit Reagenzien für das Assay beschichtet. Dies ermöglicht das trockene Lagern der Reagenzien vor ihrem Gebrauch. Sodann werden die Reagenzien beim Durchlaufen der Probe und der anderen Fluide durch die Flußregelmembran in die Testvorrichtung eluiert.
Die meist bevorzugte Ausführung der Vorrichtung weist ferner einen an dem Napf angebrachten Griff auf. Der Griff ermöglicht das Handhaben der Vorrichtung ohne Berührung der in den Napf eingebrachten Fluide. Wenn die Vorrichtung vor dem Hinzufügen der Tracer-Reagenzien in die Diagnosevorrichtung verwendet und weggeworfen werden soll, ist der Griff besonders erwünscht.
Das erfindungsgemäße Kit weist die zuvor beschriebene Flußregelvorrichtung und eine an deren Fluidausgabefähigkeiten angepaßte In-Vitro-Diagnosevorrichtung auf. Auf diese Weise können Systeme entwickelt werden, bei denen die Fluidausgabevorrichtung und eine Durchfluß-Diagnosevorrichtung an ein bestimmtes Analyt- und Assay-Format angepaßt sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Fluidprobe in den Napf der Fluidausgabevorrichtung ausgegeben und ihr Ausfließen aus der Öffnungüber die Flußregelmembran zu einer Testfläche einer Diagnosevorrichtung ermöglicht. Danach können Reagenzien eines Tracer-Systems über die Fluidausgabevorrichtung oder unabhängig von der Fluidausgabevorrichtung an die Testfläche ausgegeben werden. Wenn es wichtig ist, die Fließrate eines Tracerkonjugats über die Testfläche zu regeln, kann somit die Fluidausgabevorrichtung zum Bewirken der Regelung verwendet werden.
Gleichermaßen können bei manchen Systemen mehrere Fluidausgabevorrichtungen zum Ausgeben von Spezies mit erheblich unterschiedlichen Größen mit geregelter Fließrate verwendet werden.
Fig. 1 ist eine Seitenansicht der erfindungsgemäßen Ausgabevorrichtung;
Fig. 2 ist ein Querschnitt entlang der Schnittlinie 2 -2 in Fig. 1;
Fig. 3 ist eine Draufsicht auf die bevorzugte Durchfluß-Diagnosevorrichtung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Kit;
Fig. 4 ist eine Seitenansicht der in Fig. 3 dargestellten Vorrichtung; und
Fig. 5 ist eine Schnittdarstellung der in Fig. 3 dargestellten Durchflußvorrichtung entlang der Schnittlinie 5 - 5.
Wie in den Zeichnungen dargestellt, besteht die erfindungsgemäße Ausgabevorrichtung aus einem Napf 10, der an seinem oberen Ende sich nach außen erstreckende Flansche 11 und herabhängende Seitenwände 12 aufweist. Die herabhängenden Seitenwände 12 enden an einem Boden 13. Eine Öffnung 14 im Boden 13 ermöglicht das Ausfließen eines in dem Napf befindlichen Fluids. Vorzugsweise ist an dem Napf 10 der Ausgabevorrichtung ein Griff 20 vorgesehen. Vorzugsweise weist der Griff 20 einen Abschnitt 21 mit einem Querschnitt auf, der dünner ist als der Rest des Griffs, um den Griff leicht biegsam zu machen.
Der Napf und der Griff sind vorteilhafterweise einstückig durch Gießen ausgebildet. Die Wahl des Materials ist nicht kritisch. Dem Fachmann sind geeignete Kunststoffe bekannt. Der Napf sollte groß genug sein, um eine Fluidprobe von beispielsweise 400 ul aufzunehmen. Die Öffnung ist zum Erzielen der für das betreffende Assay erwünschten Fließrate bemessen. Sie kann einen Durchmesser im Bereich von 0,05 bis 0,22 Inch (0,13 cm bis 0,56 cm) aufweisen. Vorzugsweise hat die Öffnung einen Durchmesser von 0,12 Inch (0,3 cm).
Am Boden des Napfs ist eine Flußregelmembran 30 befestigt. Flußregelmembranen sind aus zahlreichen, dem Fachmann bekannten Quellen erhältlich. Gegenwärtig wird eine Nylon-66-Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 3,0 Mikrometer bevorzugt (Immunodyne I, Pall Corporation, East Hills, N.Y., 11548). Die Membran kann durch jedes geeignete Mittel an dem Napf befestigt werden, einschließlich Kleben, Heißsiegeln oder Ultraschallschweißen.
Das bevorzugte erfindungsgemäße Kit verwendet die zuvor beschriebene Ausgabevorrichtung und die in den Fign. 3 - 5 dargestellte Durchfluß-Diagnosevorrichtung. Die Testvorrichtung 40 besteht aus einem porösen Träger 41 mit einer Ober- und einer Unterseite und einer auf der Oberseite ausgebildeten Testfläche 48. Der Unterseite des porösen Trägers 41 benachbart ist eine Flußregelschicht 42 angeordnet. Unmittelbar unter der Flußregelschicht 42 befindet sich eine poröse Abstandhalteschicht 43. Unmittelbar unter der porösen Abstandhalteschicht 43 befindet sich die absorptive Schicht 44.
Die Schichten 41, 42, 43 und 44 der Testvorrichtung können in beliebiger Weise aneinander angebracht sein, zum Beispiel durch Zusammennähen der Schichten. Die zusammengesetzte Vorrichtung wird in einen Behälter eingesetzt, der aus einer Basis 45 und einer Abdeckung 46 besteht. Die Abdeckung 46, über dem porösen Träger 41 liegt, weist einen erhöhten Bereich mit einer geeigneten Öffnung 47 auf, die über der Testfläche 48 liegt. Wie in der Zeichnung dargestellt, ist die Testfläche 48 ein Dreieck, das vollständig von einem Hintergrundbereich des porösen Trägers umgeben ist, der sich ebenfalls in der von der Öffnung 47 begrenzten Fläche erstreckt.
Die Abdeckung 46 ist über dem porösen Träger 41 durch zahnartige Vorsprünge 49 gestützt, die sich von den Seiten der Basis 45 aufwärts erstrecken. Die Vorsprünge 49 sind ausreichend hoch, um Luftkammern 50 zu bilden, die eine Belüftung der Seiten der Testvorrichtung 40 bewirken.
Der erhöhte Bereich der Abdeckung 46, der die Öffnung 47 umschließt, kann eine farbige Fläche 51 umfassen, deren Farbe mit derjenigen der Abdeckung 46 und der in der Testfläche zu erzeugenden Farbe kontrastiert, um ein besseres Erkennen der Testergebnisse zu ermöglichen, die im allgemeinen anhand der Farbe bestimmt werden. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht der Behälter, der aus der Basis 45 und der die farbige Fläche 51 aufweisenden Abdeckung 46 zusammengesetzt ist, aus Kunststoffmaterialien.
Vorzugsweise ist die Ausgabevorrichtung derart ausgebildet, daß der Napf 10 in die Öffnung 47 in der Behälteroberseite paßt. Höchst vorzugsweise ist der Boden des Napfs derart bemessen und ausgebildet, daß er mit der Oberseite des Trägers 47 zusammenpaßt. Im Gebrauch werden die Fluidprobe und alle Reagenzien, für die eine Flußregelung erfolgen soll, in den Napfgegeben und ihr Fließen durch die Membran zur Testfläche ermöglicht. Wird die Ausgabevorrichtung nicht länger benötigt, kann sie mittels des Griff s entfernt und weggeworfen werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung, dient die Ausgabevorrichtung der weiteren Funktion des Entfernens störender Substanzen aus in dem Assay zu verwendenden Fluiden. Diese Funktion ist durch Beschichten der Innenwände des Napfs, der Flußregelmembran oder beider mit einer spezifischen Bindespezies, die die störende Substanz bindet, ohne den Analyten und in dem Assay aktive Spezies zu binden, erzielbar. Vorzugsweise ist die Flußregelmembran mit einer spezifischen Bindespezies beschichtet. Werden in einem Assay zum Beispiel Antikörper von Mäusen, Hasen oder Ziegen verwendet und sollen sehr geringe Analytmengen festgestellt werden, können im Patientenserum enthaltene Antikörper gegen die zur Herstellung der Reagenzien verwendeten Tierspezies zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Dieses Problem existiert ebenfalls bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden, nicht einschränkenden Beispielen.

Vergleichsbeispiel 1

Herstellung der Diagnosevorrichtung

Schleicher & Schuell-Nitrozellulose-Membranen mit einer Porengröße von 5 Mikrometer werden mit 50ul eines monoklonalen Antikörpers gegen zytoplasmatische Antigene (48 - 52 kD) des im US- Patent 4 670 382.0 beschriebenen Fungus Candida Albicans beschichtet. Die Beschichtungslösung enthält Antikörper zu 100 Mikrogramm/ml in phosphat-gepufferter Salzlösung (0,1 M, pH 6,0), die 0,2% NaN&sub3; enthält. Nach dem Trocknen wird die Membran mit 0,5% Gelatine in phosphat-gepufferter Salzlösung (0,1 M., pH 8,0) blockiert. Sodann werden die Membranen getrocknet.
Die Testvorrichtung wird zusammengesetzt, indem die Nitrozellulose-Membran auf ein Scichten-Verbundmaterial gelegt wird. Die beiden unteren Schcihten bestehen aus absorbierendem Zellulosepapier (1/4" dick); über diesen unteren Schichten befindet sich eine poröse Abstandhalterschicht aus einer Kunstseide-Vliesstoffbahn (Schleicher & Schuell Kat. Nr. 5-S). Die drei Schichten werden zusammengenäht und die poröse Nitrozellulose-Trägerschicht wird darauf angeordnet. Das zusammengefügte Verbundmaterial weist eine Fläche von 1cm² und eine Dicke von 0,5 cm auf. Die mit Antikörpern versehene Stelle auf der Nitrozellulose- Membran weist die Form eines Dreiecks auf. Das Verbundmaterial wird wie in den Figuren dargestellt in einem Behälter angeordnet.

Herstellung der Ausgabevorrichtung

Der Napf und der Griff werden aus Polystyrolharz (K-Harz KR03, Phillips Petroleum, Bartlesville, Ok.) geformt. Der Napf ist zylindrisch und weist einen Außendurchmesser von 0,395 Inch (1,0 cm) auf. Sein Fassungsvermögen beträgt 400 ul. Der Boden des Napfs ist mit einer Öffnungvon 0,12 Inch (0,3 cm) versehen. Der Napf paßt genau in die Öffnungder Durchfluß vorrichtung.
Eine Flußregelmembran ist durch Heißsiegeln am Boden des Napfs angebracht. Sie bedeckt die Öffnung im Boden des Napfs vollständig. Die Membran ist eine Nylon-66-Membran. Die Vorrichtungen werden mit Membranen hergestellt, die eine durchschnittliche Porengröße von 3 Mikrometer aufweisen, sowie mit Membranen, deren durchschnittliche Porengröße 1,2 Mikrometer beträgt (Immodyne I Kat. Nr. B1A030HC5 bzw. B1A012HC5, Pall Corporation, East Hills, NY).

Herstellung der Testsuspension

Serum-Proben mit einer bekannten Konzentration des zytoplasmatischen Antigens (48 - 50 kD) des Fungus Candida Albicans werden aus gepoolten Blutspenderseren gewonnen, die mit Antigen in Konzentrationen von 500 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml 50, ng/ml und 25 ng/ml geimpft sind.

Herstellung des Tracers

A. Herstellung des Liposomteilchen-Labels

1. In eine Rundboden-Rotationsverdampferflasche von 100 ml wird eingegeben:
a. 50 mg Cholesterol (Sigma #CH-S),
b. 94 mg Disteaorylphosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids #850365),
c. 10 mg Distearoylphosphatidylglycerin (Avanti Polar Lipids),
d. 3,75 mg Vernetzungsmittel (Distearoylphosphatidylethanol-Amin-p-Maleinimidophenyl) Capryl (Becton Dickinson Immunodiagnostic, Orangeburg, N.Y.); und
e. 50 ml Chloroform (Fisher).
2. Mischen durch Verrühren.
3. Auf dem Rotationsverdampfer mit den folgenden Einstellungen anordnen:
Wasserbadtemperatur = 44º C
Rotationsgeschwindigkeit = 4
4. Vakuum langsam erhöhen bis das Schäumen aufhört (ungefähr 30 - 40 Min.).
5. Verringern des Drucks und Rekombinierenlassen der Liposomen bei 44ºC für 30 Minuten.
6. Über Nacht lyophilisieren.
7. In einen Rotationsverdampfer 50 ml destilliertes Wasser geben und bei 60ºC ohne Vakuum rühren bis der Lipidfilm aufgelöst ist.
8. In Trockeneis und Methanol frieren.
9. Zu einem trockenen pulverförmigen Liposom lyophilisieren.
10. Getrenntes Zubereiten einer farbigen Lösung aus Sulforhodamin B (0,1 M in Natriumazetatsalzlösungspuffer, 0,1 M, pH 4,5).
11. 50 ml der farbigen Lösung zu dem Liposompulver geben und für 15 Minuten auf 60ºC erwärmen.
12. Extrudieren der warmen Liposomzubereitung durch jeweils eine Biorad Unipore Polycarbonat-Membran (Biorad) von 1,0 Mikrometer, 0,4 Mikrometer und sodann eine Membran von 0,2 Mikrometer.
13. Trennen des freien farbigen Materials von der Liposomensupension auf einer Sepharose CL6B Chromatographiesäule (Pharmacia), die in 50 mM Natriumazetatpuffer PH 4,5 mit 1 mM ÄDTE und 50 mM NaCl äquilibriert ist.
14. Lagern der Liposome in dem in Schritt 13 angegebenen Puffer.

B. Verbinden der Liposomteilchen-Label mit einer spezifischen Bindespezies

1. Ziegen-Antikörper gegen Hasen (6 mg, Jackson Immuno Reasearch, Westgrove, Pa.) in phosphat-gepufferter Salzlösung (100 mM, PH 7,5) werden mit SPDP (Sigma) in einem Molverhältnis von 6,6 ug SPDP : 1 mg Antikörper gemischt; die Mischung wird mit Stickstoff durchspült und versiegelt. Sie reagiert unter Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. 1/10 des Volumens von 1 M Natriumazetat pH 4,5 hinzugeben, 30 Sekunden lang rühren.
4. 1/100 des Volumens von 1 M Dithiothreitol in Wasser hinzugeben.
5. Entfernen des Dithiothreitols durch Laufenlassen des Reaktionsvolumens über eine Sephadex G-25-Mediumsäule, die mit einem Tris-Puffer äquilibriert ist (50 mM Tris, 50 mM Natriumazetat, 50 mM NaCl, 1 mM ÄDTE, pH 8,0). Mit Stickstoff spülen und versiegeln.
6. Überwachen der O.D. 280 und Poolen der proteinhaltigen Fraktionen.
7. Mischen dieser Lösung mit den 10 ml frisch zubereiteter Liposome. Die Menge der Liposomen wird durch das Verhältnis von 20 uM Phosphor zu 1,25 mg wiedergewonnenem Protein bestimmt. Die Phosphorbestimmung kann von Liposomenzubereitung zu Liposomenzubereitung variieren.
8. Mit N&sub2; spülen und versiegeln.
9. 2 Stunden über Nacht bei Raumtemperatur regieren lassen.
10. Trennen des verbundenen Produkts auf einer Sepharose Fast Flow Chromatographiesäule (Pharmacia), die mit einem Standard-Boratpuffer (pH 8) äquilibriert ist.
11. Sammeln und Poolen des Zwischenkornvolumenteils.
12. Bei 4ºC lagern.

Assay-Ablauf

Assays werden mit oder ohne Ausgabevorrichtung durchgeführt. Wenn keine Ausgabevorrichtung verwendet wird, werden die Testsuspension und alle Reagenzien direkt auf die Testfläche der Diagnosevorrichtung aufgebracht. Bei Verwendung der Ausgabevorrichtung wird diese in die Öffnung der Diagnosevorrichtung eingeführt und eine Testsuspension (200 ul) wird in den Napf eingebracht; diese fließt bis zur Testfläche und von dort bis zur absorptiven Schicht. Ein Aliquot von Hasen-Antikörpern gegen zytoplasmatisches Antigen (48-52 kD) des Fungus Candida Albicans (150ul, 300ug/ml) wird sodann in den Napf der Ausgabevorrichtung gegeben und fließt bis zur Testfläche. Anschließend wird die Ausgabevorrichtung von der Diagnosevorrichtung entfernt und weggeworfen. Der Tracer (150 ul) wird hinzugefügt.
Die Testfläche wird sodann mit dem Waschpuffer (0,1M Guanidin HCl) gewaschen und die Ergebnisse werden sodann durch visuelles Erkennen des Vorhandenseins einer charakteristischen rosa Farbe (Dreieck) auf der Testfläche gelesen.
Die Gesamtzeit für die Durchführung jedes Assays beträgt drei bis fünf Minuten. In der Tabelle I steht das Symbol "++" für das Vorhandensein einer charakteristischen rosa Farbe auf der Testfläche, das Symbol "+" bezeichnet eine schwache rosa Farbe und das Symbol "-" bedeutet, daß keine Farbe erkannt wurde. Die Verwendung der Ausgabevorrichtung verbessert die Empfindlichkeit des Assays wesentlich von 200 ng/ml auf 25 ng/ml. Tabelle I Antigen-Konzentration ng/ml Assay-Format ohne Ausgabevorrichtung Vorrichtung (3-Mikrometer)

Beispiel 2

Herstellung der Diagnosevorrichtung

Nitrozellulose-Membranen mit einer durchschnittlichen Porengröße von 5 Mikrometer (MSI, West Borough, Ma.) werden mit 50ul eines monoklonalen Antikörpers gegen zytoplasmatisches Antigen (48-52 kD) des im US-Patent 4 670 382.0 beschriebenen Fungus Candida Albicans beschichtet. Die Beschichtungslösung enthält Antikörper zu 75 Mikrogramm/ml in phosphat-gepufferter Salzlösung (0,1 M, PH 6,0), die 0,2% NaN&sub3; enthält. Nach dem Trocknen wird die Membran mit 0,5% Gelatine in phosphat-gepufferter Salzlösung (0,1 M., pH 8,0) blockiert. Sodann werden die Membranen getrocknet.
Die Testvorrichtung wird zusammengesetzt, indem Nitrozellulose- Membranen auf ein Lagen-Verbundmaterial gelegt werden. Die beiden unteren Lagen bestehen aus absorbierendem Zellulosepapier (1/4" dick); über diesen unteren Schichten befindet sich eine poröse Abstandhalterschicht aus einer Kunstseide-Vliesstoffbahn (Schleicher & Schuell Kat. Nr. 5-S). Über der Kunstseidenschicht ist eine unidirektionelle Polycarbonat-Flußregelmembran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 1,0 um (Nuclepore, Pleasantville, Ca.) angeordnet. Die vier Schichten werden zusammengenäht und die poröse Nitrozellulose-Trägerschicht wird darauf angeordnet. Das zusammengefügte Verbundmaterial weist eine Fläche von 1cm² und eine Dicke von 0,5 cm auf. Die mit Antikörpern versehene Stelle auf der Nitrozellulose-Membran weist die Form eines Dreiecks auf. Das Verbundmaterial wird wie in den Figuren dargestellt in einem Behälter angeordnet.

Assay-Ablauf

Es wurden Assays mit Ausgabevorrichtungen und Tracern gemäß der Beschreibung des Vergleichsbeispiels 1 durchgeführt. Bei in der Öffnung der Diagnosevorrichtung eingesetzter Ausgabevorrichtung 200 ul eines mit 10 ng/ml des zytoplasmatischen Antigens (48- 52kD) des Fungus Candida Albicans geimpftes Testserum in den Napf eingebracht, welches bis zur Diagnosevorrichtung fließt. Ein Aliquot von Hasen-Antikörpern gegen das Antigen (150ul, 7ug/ml) wird sodann in den Napf der Ausgabevorrichtung gegeben und fließt bis zur Testfläche. Anschließend wird die Ausgabevorrichtung entfernt und weggeworfen. Der Tracer (150 ul) wird auf die Testfläche gegeben. Nachdem der Tracer durch die Testvorrichtung geflossen ist, wird die Testfläche mit dem Waschpuffer (0,1M Guanidin HCl) gewaschen und die Ergebnisse werden durch visuelles Erkennen des Vorhandenseins eines charakteristischen rosa Dreiecks auf der Testfläche gelesen. Bei der Wiederholung des Versuchs mit Serum, das nicht mit Antigen geimpft war, wurde ein negatives Ergebnis festgestellt.

Beispiel 3

Herstellung der Ausgabevorrichtung

Der Napf und der Griff werden aus Polystyrolharz (K-Harz KR03, Phillips Petroleum, Bartlesville, Ok.) geformt. Der Napf ist zylindrisch und weist einen Außendurchmesser von 0,395 Inch (1,0 cm) auf. Sein Fassungsvermögen beträgt 400 ul. Der Boden des Napfs ist mit einer Öffnungvon 0,12 Inch (0,3 cm) versehen. Der Napf paßt genau in die Öffnungder Durchflußvorrichtung.
Eine Flußregelmembran ist durch Heißsiegeln am Boden des Napfs angebracht. Sie bedeckt die Öffnung im Boden des Napfs vollständig. Die verwendeten Membranen bestanden aus Nylon 66 (Immodyne I , Pall Corporation, East Hills, NY). oder Nitrozellulose (MSI, West Borough, Mass.). Die Flußregelmembranen in den Ausgabevorrichtungen wurden wie folgt mit Blockierlösungen behandelt:
Vorrichtung 1 - Nylon-Membran mit 3,0 Mikrometer durchschnittlicher Porengröße blockiert mit 1% fettfreier Trokkenmilch.
Vorrichtung 2 - Nylon-Membran mit 3,0 Mikrometer durchschnittlicher Porengröße blockiert mit 10% Mäuseserum.
Vorrichtung 3 - Nitrozellulose-Membran mit 5,0 Mikrometer durchschnittlicher Porengröße blockiert mit 10% Mäuseserum.

Assay-Ablauf

Es wurden Assays unter Verwendung von Diagnosevorrichtungen, Tracern und Verfahren gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Die Probe war ein normales menschliches Serum, das ein falsch-positives Ergebnis ergibt. Bei Durchführung des Assays mit durch fettfreie Trockenmilch blockierter Flußregelmembran der Ausgabevorrichtung wurde ein positives Ergebnis festgestellt. Waren bei der Durchführung des Assays beide Ausgabevorrichtungen mit Mäuseserum blockiert, waren die Ergebnisse negativ.

Claims

1. Vorrichtung zum Ausgeben einer Fluidprobe an eine diagnostische Durchfluß-Testanordnung mit geregelter Fließrate, wobei die Testanordnung eine poröse Trägerschicht (41) mit einer Oberseite aufweist, bei der eine spezifisch geformte Testfläche (48) auf der Oberseite des Trägers (41) vorgesehen ist, während die nicht mit der Testfläche (48) versehene Oberseite des Trägers (41) die Testfläche umgibt, mit:

einem Napf (10) zum Aufnehmen der Fluidprobe, mit Seitenwänden (12), die in einem Boden (13) enden, einer Öffnung (14) im Boden des Napfs, die dieselbe Größe und Form aufweist wie die spezifisch geformte Testfläche (48) in der diagnostischen Durchfluß- Testanordnung; und

einer Flußregelmembran (30), die an dem Napf (10) angebracht ist und die Öffnung (14) bedeckt, um die Fluidprobe auf die spezifisch geformte Testfläche (48) an der Oberseite des porösen Trägers (41) der diagnostischen Durchfluß-Testanordnung mit geregelter Fließrate auszugeben.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, ferner mit einer in der Vorrichtung vorgesehenen Einrichtung zum selektiven Entfernen störender Substanzen aus einer Fluidprobe, ohne einen Analyten in der Fluidprobe einzuschließen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der die Einrichtung zum selektiven Entfernen störender Substanzen eine spezifische Bindespezies für die störende Substanz ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der die spezifische Bindespezies an der Flußregelmembran (30) angebracht ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Flußregelmembran (30) mit Assay-Reagenzien lösbar beschichtet ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, ferner mit einem an dem Napf (10) vorgesehenen Griff (20), um das Handhaben der Vorrichtung ohne Berühren einer Fluidprobe in dem Napf zu erleichtern.

7. Diagnose-Kit bestehend aus der Vorrichtung nach Anspruch 1 und einer diagnostischen Durchfluß-Testanordnung.

8. Diagnose-Kit nach Anspruch 7, bei dem diagnostische Durchfluß-Testanordnung ein Gehäuse mit einer Öffnungund einen porösen Träger (41) mit einer Oberseite aufweist, wobei auf der Oberseite des Trägers (41) eine spezifisch geformte Testfläche (48) ausgebildet ist, während die nicht mit einer Testfläche versehene Oberseite des Trägers die Testfläche umgibt.

9. Assay für einen Analyten in einer Fluidprobe mit den folgenden Schritten:

Zusammensetzen des Napfs (10) der Vorrichtung nach Anspruch 1 mit der diagnostischen Durchfluß-Testanordnung,

Ausgeben der Fluidprobe an die Vorrichtung,

Leiten der Fluidprobe aus der Vorrichtung mit geregelter Fließrate,

die spezifisch geformte Testfläche (48) auf der Oberseite der Trägerschicht (41) der Anordnung in Kontakt mit der Probe bringen, wobei die die Testfläche nicht aufweisende Oberseite der Trägerschicht von der Fluidprobe frei ist, wobei die spezifisch geformte Testfläche (48) eine spezifische Bindespezies für den Analyten ohne Störung durch den Träger ist, und

Erkennen des Vorhandenseins des Analyten in der auf die spezifisch geformte Testfläche (48) aufgebrachte Fluidprobe unter Verwendung eines Tracers.