DE69329377T2

DE69329377T2 - Trennmittel für rote blutkörperchen bei untersuchungen mit spezifischer bindung

Info

Publication number: DE69329377T2
Application number: DE69329377T
Authority: DE
Inventors: John Burd; Steven Miller; Allan Pronovost; Gerald Rowley
Original assignee: Quidel Corp
Current assignee: Quidel Corp
Priority date: 1992-03-10
Filing date: 1993-03-05
Publication date: 2001-04-05
Anticipated expiration: 2013-03-06
Also published as: JP2948318B2; US5939331A; ES2151902T3; EP0630475A4; EP0630475B1; JPH07504747A; WO1993018398A1; EP0630475A1; DE69329377D1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft immunologische und verwandte Assay-Verfahren und -Vorrichtungen, insbesondere solche, die bei Bluttests zum Einsatz kommen.

Hintergrund der Erfindung

Die Literatur zu verschiedenen Formen diagnostischer Testverfahren einschließlich spezifischer Bindungsassays, insbesondere Immunoassays, ist umfassend, und die kommerziellen Produkte sind zahlreich. Eine große Anzahl an vereinfachten und zweckmäßig gepackten Assays ist derzeit verfügbar. Nichtsdestotrotz bleibt ein Bedarf an Assayvorrichtungen, welche leicht zu gebrauchen und zu interpretieren sind.
Vollblutproben können die Ablesung von Testresultaten infolge von Eintrübung und Verfärbung unklar machen. Um dieses Problem zu lösen, beschrieben Forscher in der Vergangenheit Vorrichtungen, welche sowohl die roten Blutzellen (RBCs) separieren als auch das erhaltene Plasma oder Serum auf eine spezielle gelöste Komponente analysieren. Die EPO-Veröffentlichung Nr. 287731 von Maddox beschreibt eine Trockentestvorrichtung, umfassend eine Absorbierungsreagenszone, die einen chemischen Assay oder Immunoassay und ein Analytziel mit einem Polysaccharidmaterial enthält, welches das Passieren von RBCs einschränken kann oder die RBCs auf oder in der Nähe der Oberfläche der Absorbierungsreagenszone halten kann. Eine einstufige Verfahrensweise, welche die gleichzeitige Abtrennung von Vollblut mit dem Testen auf eine gewünschte Komponente anwendet, ist in dem US-Patent Nr. 4 678 757 von Rapkin et al. beschrieben. Blut wird auf die Oberfläche eines mit Carbohydrat behandelten Trägers aufgebracht. Der Fluidanteil bewegt sich von der Kontaktstelle weg, und die Zellkomponenten bleiben in unmittelbarer Nähe zu der Kontaktstelle. Wenn der Träger weiter mit einem Reagens behandelt wird, das zum Nachweis einer Komponente eingesetzt wird, wird eine Farbe in dem Fluid sicht bar. Das US-Patent Nr. 3 552 928 von Fetter beschreibt ein Mittel zur Separierung von Vollblut in ein farbloses Fluid und eine Rote-Zellen- oder Rückstandskomponente. Das Vollblut wird mit einem Trennreagens (einer wasserlöslichen, nichtflüchtigen Aminosäure) kontaktiert, der Rückstand wird entfernt und das verbleibende Fluid kann mit einem Testreagens kontaktiert werden. Beide Reagentien können auf einer einzelnen Matrix (d. h. einem saugfähigen Filterpapier) enthalten sein, jedoch muß die Matrix ein Fließen des farblosen Fluids von dem Trennreagens zu dem Testreagens zulassen. Das US-Patent 4 594 327 von Zuk beschreibt eine Verfahrensweise, bei welcher Blut zunächst mit einem Rote-Blutzellen-Abscheidemittel, wie einem Antikörper, Lectin oder bestimmten polymeren Aminosäuren, behandelt wird und anschließend in einen "Immunochromatographen" geschickt wird. Die roten Blutzellen verbleiben an der Flüssigkeit/Luft-Grenzfläche.
Das US-Patent 4 943 522 von Eisinger et al. beschreibt Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung spezifischer Bindungspaar-Assays, wie Immunoassays. Eine poröse Membran, die zu einer nichtsaugfähigen lateralen Strömung in der Lage ist, wird als Assaysubstrat verwendet. Ein Teilglied des Bindungspaars wird in einer in dem Substrat definierten Indikatorzone angebracht. Die Probe wird an einer von der Indikatorzone entfernten Position aufgebracht und seitlich durch die Zone fließen gelassen. Analyt in der Probe wird durch das angebrachte spezifische Bindeteil komplexiert und delektiert.
Das US-Patent 5 079 142 beschreibt Immunoassays, wo eine Blutprobe auf eine Vorrichtung aufgebracht wird, die eine saugfähige Matrix umfaßt, wobei die Fließrichtung in der Einfangzone so ausgerichtet ist, daß sie zu der Strömung bis zu diesem Punkt rechtwinklig verläuft.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung bzw. Präparierung einer Blutfluidprobe bereit, welche im wesentlichen frei an roten Blutzellen (RBCs) ist. Dieses Verfahren umfaßt das Fließen einer Vollblutprobe durch einen nichtsaugfähigen, festen Träger, welcher ein Reagens enthält, wie Antikörper oder deren immunobiologisch reaktive Fragmente, das gegen RBCs oder ihre Komponenten gerichtet ist. Der Anteil der Blutfluidprobe, welche im wesentlichen frei an RBCs ist, wird aus dem festen Träger rückgewonnen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens oder der Menge an Analyt unter Anwendung eines spezifischen Bindungsassays bereit. Die Vorrichtung umfaßt eine laterale Fließmembran, die eine Probenaufbringungszone besitzt, welche ein Reagens wie auf RBCs gerichteten Antikörper enthält, um die Vollblutprobe aufzunehmen und die roten Blutzellen einzufangen, wodurch ein im wesentlichen RBC-freies Fluid erhalten wird, sowie eine Erweiterung der lateralen Fließmembran für die Analyse des verbleibenden Fluids. Die Erweiterung muß nicht aus einer festen Trägermatrix bestehen, die mit derjenigen der Probenaufbringungszone identisch ist. In einer Ausführungsform umfaßt diese Erweiterung eine Markierungszone, die eine Markierung enthält, die zum spezifischen Binden an den Analyt oder zur Kompetitierung mit diesem in dem Assay fähig ist, eine Einfangzone, umfassend eine ein Reagens enthaltende Matrix, welches zur Bindung der Markierung oder des an die Markierung gebundenen Analyten fähig ist, und eine Absorbierungszone zum Absorbieren des Rests der Probe.
In einer alternativen Ausführungsform der vorgenannten Vorrichtung enthält die Markierungszone selbst und nicht die Probenaufbringungszone den Antikörper, welcher die roten Blutzellen einfängt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens von Analyt in einer Probe. Das Verfahren umfaßt das Kontaktieren der Probe mit einer festen Trägermatrix, welche mindestens ein Reagens wie einen Antikörper enthält, um die RBCs in der Probe in der Matrix zurückzuhalten, das Fließenlassen des resultierenden RBCfreien Fluids auf eine Markierungszone, wo der Analyt in der Probe an die Markierung gebunden wird oder wo die für ein spezifisches Bindemittel konkurrierende Markierung in die Flüssigkeit mobilisiert wird, und das Einführen der Markierung in eine Einfangzone und Feststellen der Bindung der Markierung in der Einfangzone als ein direktes oder umgekehrtes Maß für das Vorhandensein oder Fehlen oder die Menge an Analyt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 ist eine auseinandergezogene Ansicht der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
Die Fig. 2 ist eine Ansicht von oben der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.

Modi zur Ausführung der Erfindung

Die Erfindung ist nützlich für eine große Vielzahl an Assaystrategien, bei welchen eine Blutfluidprobe, die im wesentlichen frei an roten Blutzellen (RBCs) ist, erforderlich ist.
Alle Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung verwenden eine feste Trägermatrix, die ein spezifisches Bindungsreagens für rote Blutzellen enthält, durch welches eine Vollblutprobe geleitet werden kann. Beim Hindurchleiten der Vollblutprobe durch diesen festen Träger werden die roten Blutzellen entfernt, und das restliche Fluid, das frei an RBCs ist, wird rückgewonnen, entweder direkt oder durch Leiten durch eine Erweiterung des festen Trägers in Regionen, in welche zusätzliche Reagentien zugeführt werden. Das Fluid wird so für die Bestimmung eines bestimmten Analyten, von welchem vermutet wird, daß er darin enthalten ist, empfänglich gemacht.

Feste Träger

Ein wesentliches Merkmal des Verfahrens der Erfindung ist die Verwendung einer festen Trägermatrix, wie einer Membran, die zu einer lateralen Strömung in der Lage ist, welche ein Einfangreagens für rote Blutzellen enthält. Die verwendeten Membranen ermöglichen eine nichtsaugfähige Strömung. Unter "nichtsaugfähige" Strömung ist eine Flüssigkeitsströmung zu verstehen, in welcher alle gelösten oder dispergierten Komponenten der Flüssigkeit mit praktisch gleichen Geschwindigkeiten und mit relativ unbeeinträchtigter Strömung lateral durch die Membran befördert werden im Gegensatz zur bevorzugten Retention einer oder mehrer Komponenten, wie sie beispielsweise in Materialien vorkommen würden, die zum Adsorbieren oder "Durchtränken" von einer oder mehreren Komponenten in der Lage sind. "Saugfähige" Materialien schließen Papier, Nitrocellulose, Nylon und dergleichen ein, die die Fähigkeit besitzen, eine chromatographische Abtrennung der darin enthaltenen Materialien zu bewirken. Diese Materialien können durch die Anwendung einer geeigneten Beschichtungsverfahrensweise nichtsaugfähig gemacht werden.
Ein Beispiel für Membranmaterial, in welchem es zu einer kapillaren, nichtsaugfahigen Strömung kommt, ist spinngebundenes Textil, das so hergestellt ist, daß es 100% Acrylfaser oder variierende Fasermischungen enthält. Das Textil besitzt typischerweise eine nichtgewebte Struktur aus hydraulisch vernetzten Fasern mit oder ohne chemische oder thermische Bondierung bzw. Verklebung. Ein Beispiel für dieses Material ist "SONTARA" (100% spinngebundene Acrylfaser, Dupont Wilmington, Delaware, USA).
Ein weiteres Beispiel für das Membranmaterial, in welchem es zu einer kapillaren, nichtsaugfahigen Strömung kommt, ist das Polyethylenblattmaterial hoher Dichte oder mit extrem hohem Molekulargewicht, hergestellt von Porex Technologies Corp. von Fairbum, Georgia, USA. Diese Membran besitzt eine offene Porenstruktur mit einer typischen Dichte, bei 40% Hohlraumvolumen, von 0,57 g/cm³ und einem mittleren Porendurchmesser von 1 bis 250 Mikrometer, wobei der Durchschnittswert allgemein 3 bis 100 Mikrometer beträgt. Der optimale Porendurchmesser für die Membran zur Verwendung in der Erfindung beträgt etwa 10 bis etwa 50 um. Die Membranen sind etwa 0,1 mm bis 5 mm dick. Die Membran kann zur Anpassung an die laterale Strömung mit einer allgemein wasserundurchlässigen Schicht unterstützt bzw. unterlegt werden oder können völlig freistehend sein. Während aus Polyethylen hergestellte Membrane sich als hochzufriedenstellend erwiesen, können auch nichtsaugfähige Membranen mit einer lateralen Strömung, die aus anderen Olefinen oder anderen thermoplastischen Materialien, z. B. Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Copolymeren von Vinylacetat und Vinylchloridpolyamid, Polycarbonat, Polystyrol etc. gebildet werden, verwendet werden. Durch das klassische Phasenumkehrverfahren gebildete Membranen können ebenfalls verwendet werden.
Auf diese Weise besitzen die nichtsaugfahigen Membranen im allgemeinen eine Porengröße von etwa 1-100 um, vorzugsweise etwa 5-20 um; sind aus einem inerten Material aufgebaut; und sind weniger als 5 mm dick. Sie können eine laterale Strömung leiten, doch kann eine isotrope Strömung ebenfalls angewandt werden. Während die Anmelder annehmen, daß diese nichtsaugfähige Strömung zumindest teilweise durch Kapillarwirkung herbeigeführt wird, sind sie nicht an irgendeine spezielle Theorie gebunden, um das charakteristische Wesen dieser Strömung zu erklären.
Feste Träger, die zum Leiten der nichtsaugfahigen Strömung in der Lage sind, können auch durch Behandeln von saugfähigen festen Trägem mit Beschichtungen erhalten werden, welche die durch die saugfähigen Materialien ausgeübten Anziehungskräfte beeinträchtigen. Somit können Materialien, die in ihrem unbehandelten Zustand saugfähig sind, wie Papier, Nitrocellulose und Nylon, in eine nichtsaugfähige Strömungscharakteristik überführt werden durch Behandeln des nativen Materials mit geeigneten Blocking-Mitteln, wie methyliertem Rinderserum Albumin und dergleichen. Verfahren zur Umwandlung saugfähiger fester Träger in Träger mit nichtsaugfahigen Strömungscharakteristika sind ausführlich in der US-Serien-Nr. 639 967 beschrieben.

Rote-Blutzellen-Bindereagentien

Das Reagens, welches zur Bindung roter Blutzellen in der Lage ist, welches in der festen Trägermatrix enthalten ist, wie die obenstehend beschriebenen, ist typischerweise, und am meisten bevorzugt, ein Antikörper, polyklonal oder monoklonal, was für rote Blutzellen spezifisch ist. Solche Antikörper können unter Verwendung von Standard-Immunisierungsprotokollen durch Verabreichung von RBC von einer fremden Spezies an einen Antikörper produzierenden Wirt hergestellt werden. Die resultierenden Antiseren können an sich in den festen Trägermatrices der Erfindung verwendet werden, oder die Immunoglobuline von dem Antiserum können unter Anwendung von Standardtechniken unter Erhalt einer Immunoglobulinfraktion gereinigt werden. Das Immunoglobulin kann weiter unter Anwendung der Affinitätschromatographie mit dem RBC-Antigen als Affinitätsligand gereinigt werden. Monoklonale Antikörper können ebenfalls aus den Lymphocyten oder der Milz der immunisierten Versuchspersonen bzw. -tiere hergestellt werden. Antikörperfragmente, Fab, Fab' und F(ab')&sub2; von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, können ebenfalls verwendet werden. Alternativ können auch andere Reagentien, von denen bekannt ist, daß sie rote Blutzellen binden, wie Lectine oder polymere Aminosäuren, z. B. Polylysin und Polyarginin, verwendet werden.
Das RBC-Bindereagens wird anschließend auf der festen Trägermatrix unter Anwendung von Standardtechniken, meistens in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der gewählten Matrix, immobilisiert. Für relativ inerte Matrices wird die Matrix mit einer Lösung oder Dispersion des Bindereagens behandelt, und das Lösungsmittel wird durch Trocknen oder Lyophilisierung entfernt, was zu einer passiven Anhaftung an dem Träger führt. Alternativ können derivatisierte Träger verwendet werden, um eine kovalente Bindung des Trägers an das Reagens zu bewirken.

Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens

In dem Verfahren der Erfindung wird die Vollblutprobe auf die feste Trägermatrix, die das RBC- Bindereagens enthält, aufgebracht und durch die Matrix passieren gelassen, die dann als im wesentlichen RBC-freies Fluid austritt, welches anschließend direkt für die Analyse verwendet werden kann.
Die feste Trägermatrix wird durch zusätzlichen festen Träger erweitert, welcher zum Leiten einer nichtsaugfähigen Strömung in der Lage ist, so daß die Abtrennung der RBC von dem restlichen Fluid und die Schritte in der Analyse in einer einzigen Vorrichtung durchgeführt werden, wie der untenstehend beschriebenen. In dieser Ausführungsform befindet sich die RBC-Bindereagens enthaltende feste Trägermatrix in Fluidverbindung mit zusätzlicher fester Trägermatrix, die zusätzliche, in der Analyse nützliche Elemente enthalten kann. Zum Beispiel enthält die erweiterte feste Trägermatrix, durch welche das RBC-freie Fluid austritt, eine Einfangzone, die zum spezifischen Einfangen eines gewünschten Analyten fähig ist. Der in der Einfangzone eingefangene Analyt kann dann durch eine beliebige brauchbare Methode, wie das Behandeln der Einfangzone mit Entwicklungs- und Detektions- bzw. Nachweisreagentien, die eine Markierung enthalten, nachgewiesen werden. Die Markierung wird durch eine Markierungszone, die in dem erweiterten festen Träger eingeschlossen ist, bereitgestellt. Eine große Anzahl an spezifischen Protokollen, die mimunoassays oder spezifische Bindeassays auf festen Trägern beinhalten, wurden in dem Fachbereich beschrieben. Jedes dieser Protokolle kann in geeigneter Weise in Bezug auf das Fluid, das aus der festen Trägermatrix für die Trennung austritt, welche die RBC zurückhält, angewandt werden.
Es sollte betont werden, daß die erweiterte feste Trägermatrix, in welche das RBC-freie Fluid austritt, nicht aus demselben Material wie dasjenige, in welchem das RBC-Bindereagens enthalten ist, besteht. Somit kann die RBC-Entfernungszone als eine eigene "RBC-Entfernungszone" bereitgestellt werden und angrenzend an zusätzlichen fluidleitenden Matrixträger, der denselben oder einen unterschiedlichen polymeren Aufbau aufweist, positioniert werden.

Geeignete Analyte

Geeignete Analyte, auf welche einige Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung angewandt werden können, sind jegliche, für die sich ein spezifischer Bindungspartner oder Konkurrent finden läßt. Im allgemeinen können die meisten Analyte von medizinischer und biologischer Signifikanz spezifische Bindungspartner in gegen diese hergestellten Antikörpern oder Fragmenten von diesen Antikörpern finden; gleichermaßen kann in den meisten Fällen entweder zusätzlicher Analyt selbst oder ein immunologisch kreuzreaktives Analog zur Herstellung von Markierung verwendet werden und kann damit als geeigneter Konkurrent fungieren. Wie aber allgemein bekannt ist, sind spezifische Bindewechselwirkungen nicht auf Antigen/Antikörper- Paare beschränkt, sondern können auch Rezeptoren und ihre Liganden, Enzyme und ihre Substrate, Polynukleotide und Oligonukleotide und dergleichen, einschließen.
Somit schließen geeignete Bindungspaare zur erfindungsgemäßen Verwendung die folgenden Typen von wechselwirkenden Komponenten ein, sind aber nicht auf diese beschränkt: Antigen/Antikörper; Antikörper/Hapten; Antikörper/Zelle oder Zelle/Fragment; RNA/DNA-Sonden; Rezeptor/Rezeptor-Liganden; Enzym/Substrat; Enzym/Inhibitor und Lectin/Carbohydrat.
Geeignete Analyte schließen lösliche Analyte, wie Hormone, Enzyme, Lipoproteine, bakterielle oder virale Antigene, Immunoglobuline, Lymphokine, Cytokine, Arnzeistoffe, lösliche Krebsantigene und dergleichen ein. Diese Analyte schließen verschiedene Proteine, wie Protamine, Histone, phosphorylierte Proteine, Nukleoproteine etc., wie beispielsweise Transcortin, Erythropoietin, Transferrin, verschiedene Globuline, Thyroxin bindendes Globulin, die Immunoglobuline verschiedener Unterklassen A, G, D, E und M, verschiedene Komplementärfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, wie Fibrinogen, Faktor VIII, Gewebe-Tromboplastin und Thrombin, ein.
Ebenfalls eingeschlossen sind Hormone, wie Insulin, Glucagon, Relaxin, Thyrotropin, Somatotropin, Gonadotropin, Follikel stimulierendes Hormon, Gastrin, Bradykinin, Vasopressin und verschiedene Freisetzungsfaktoren. Ein weiter Bereich an antigenen Polysacchariden, Lipopolysacchariden, Lipoproteinen, Proteoglycanen und Glycoproteinen kann ebenfalls bestimmt werden, wie diejenigen von Chlamydia, Neisseria gonorrheae, Pasteurella pestis. Shigella dysentereae und bestimmte Pilze, wie Mycosporum und Aspergillus. Noch eine weitere Hauptgruppe umfaßt Oligonukleotid-Sequenzen, die spezifisch mit anderen Oligonukleotiden oder Protein zielen reagieren. Umfassende Listen und Erläuterungen löslicher Analyte, die in dem Verfahren der Erfindung bestimmbar sind, finden sich in dem US-Patent 4 943 522.

Assay-Strategien

Wie Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt ist, steht eine große Vielzahl an möglichen Assaystrategien für Bestimmungen zur Verfügung, die bei dem RBC-freien Fluid durchgeführt werden können, in Abhängigkeit hauptsächlich von der Natur des Analyten und der Verfügbarkeit geeigneter Reagentien zur Verwendung in dem Assay. Das experimentelle Design-Protokoll der Assays kann daher variiert werden, wie für Assays auf Basis einer spezifischen Bindung bekannt ist. Solche Assays können Enzym, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder andere direkt abgelesene, sichtbare Markierungen einschließen. Insbesondere können die meisten Protokolle eines Immunoassays zur Analyse des von RBCs freien Fluids, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, verwendet werden.
Das von RBCs freie Fluid strömt von dem das Bindereagens enthaltenden festen Träger in eine Erweiterung desselben Trägers oder eine aus einem anderen Material bestehende Erweiterung, welcher den festen Träger umfaßt, in welchen das RBC-freie Fluid direkt strömen kann. Daher ist der das RBC-Bindereagens enthaltende feste Träger an einen erweiterten festen Träger angrenzend, welcher die Reagentien und Ablesezonen enthält, die für den nachfolgenden Assay geeignet sind. Der erweiterte feste Träger enthält ganz bestimmte Regionen, wie Markierungszonen, Einfangzonen, Absorbierungszonen und dergleichen entsprechend dem Aufbau des Assays.
Wo zum Beispiel der Analyt selbst für eine sichtbare Markierung sorgt oder wo eine sichtbare Markierung direkt mit dem Analyt vor dessen Einführung in die Assay-Vorrichtung assoziiert werden kann, kann das direkte Einfangen von jetzt sichtbarem Analyt in einer Einfangzone auf dem erweiterten Bereich des festen Trägers unter Verwendung eines für den Analyt spezifischen Einfang-Reagens durchgeführt werden. Am typischten jedoch zielen Assays gemäß der vorliegenden Erfindung auf den Nachweis von Analyten, die keine sichtbare Markierung enthalten oder nicht so leicht eine direkte Assoziierung der sichtbaren Markierung zulassen. Für die Bestimmung des Vorhandenseins solcher Analyte können die Assays unter Verfolgung von einer der nachfolgenden Strategien durchgeführt werden; Koppeln der sichtbaren Markierung mit einem Rest, der spezifisch an den Analyt bindet; Koppeln der sichtbaren Markierung mit einem Rest, der ein den Analyt bindendes Intermediat bindet; oder Koppeln der sichtbaren Markierung mit einem Rest, welcher mit Analyt um ein Einfangreagens in einer Einfangzone konkurriert. Je nach der Beschaffenheit des Analyts kann dieses letzte Kompetitierungs-Assay-Protokoll ebenfalls von Nutzen sein.
Damit kann zur Herstellung einer Analyt bindenden Markierung die sichtbare Markierung mit einem Bindungspartner, welcher spezifisch den Analyt bindet, gekoppelt werden. Wenn zum Beispiel der Analyt ein Antigen ist, wäre ein für dieses Antigen spezifischer Antikörper (oder immunologisch reaktive Fragmente des Antikörpers, wie F(ab')&sub2;, Fab oder Fab') ein geeigneter Träger für den Markierungsrest. Diese sichtbare, Markierung enthaltenden spezifischen Bindungsreste bilden dann Komplexe mit jedwedem Analyt in der Probe entweder vor der Einführung der gesamten Probe in die Testvorrichtung, während die Probe durch eine Markierungszone geleitet wird, oder nachdem der Analyt eingefangen ist. Für die ersten zwei Methoden können Analyt/Markierung-Komplexe (sowie jegliche ungebundenen Materialien) durch den Flüssigkeitsstrom in eine Einfangzone befördert werden. Wenn die Komplexe die Einfangzone erreichen, hält ein für den Analyten spezifisches Einfangreagens (wie ein Antikörper oder Fragment davon, wie obenstehend dargelegt) diese gekoppelten Konjugate zurück, an welche Analyt gebunden wurde; Markierung, welche nicht mit Analyt assoziiert ist, wird nicht zurückgehalten.
Für jene Ausführungsformen, die ein Einfangreagens und Markierung enthalten, die beide für den Analyten spezifisch sind, ist die Verwendung eines Überschusses an Markierung bevorzugt, um so sicherzustellen, daß der gesamte Analyt in einer Probe vor seiner Einführung in die Einfangzone markiert wird, da jegliche nicht komplexierte Markierung sich leicht durch Waschen entfemen läßt. Wenn sowohl die Markierung als auch das Einfangreagens für den Analyten spezifisch sind, kann es erforderlich sein, Markierung und Einfangmittel zu wählen, die auf unterschiedliche, nicht überlappende Bindungsstellen auf dem Analyten gerichtet sind. Wenn zum Beispiel der Analyt ein Polypeptid ist, können die Markierung und das Einfangreagens in geeigneter Weise jeweils monoklonale Antikörper umfassen, die für verschiedene, nicht überlappende Epitope des Polypeptids immunospezifisch sind.
Andere Nachweismethoden beinhalten die Verwendung eines markierten sekundären Reagens, um das Vorhandensein eines gebundenen Analyten (oder Bindungspartners dafür) nachzuweisen. Auf diese Weise könnte beispielsweise das Vorhandensein gebundener Antikörper, die selbst Analyte sind oder die spezifische Bindemittel für Analyte in einer Nachweiszone sind, unter Verwendung markierter Anti-Immunoglobulin-Antikörper, Protein A oder Protein G, bewertet werden. Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung indirekter Nachweismethoden ist, daß ein einzelnes markiertes Präparat beispielsweise von Anti-IgG-Antikörpern verwendet werden könnte, um eine große Vielzahl unterschiedlicher gebundener Analyt/IgG-Komplexe nachzuweisen.
Kompetitierungsmethoden verwenden einen konkurrierenden Rest, welcher mindestens eine signifikante, Assay-bezogene Eigenschaft mit dem Analyten teilt. Zum Beispiel wird bei der Kompetitierungs-Bindungsmethode die sichtbare Markierung mit einem Rest gekoppelt, welcher mit Analyt um ein Einfangreagens in einer Detektions- oder Einfangzone konkurriert; am typischten werden markierte Formen des Analyten selbst als Konkurrent verwendet. Sowohl der Analyt aus der Probe als auch der an die Markierung gebundene Konkurrent werden danach in eine Detektionszone befördert. Während Analyt und sein Konkurrent beide mit dem Einfangreagens reagieren (das am typischten sowohl mit dem Analyten als auch mit seinem Konkurrenten spezifisch reaktiv ist), ist der unmarkierte Analyt in der Lage, die Menge an Konkurrent-konjugierter sichtbarer Markierung zu verringern, die in der Detektionszone zurückgehalten wird. Diese Verringerung der Retention bzw. Zurückhaltung der sichtbaren Markierung wird zu einem Maß für den Analyten in der Probe.

Aufbau einer bevorzugten Vorrichtung

Die Fig. 1 ist eine auseinandergezogene Ansicht einer Ausführungsform der Vorrichtung der Erfindung. Die vier Basisschichten der Vorrichtung sind die folgenden: die Bodenabdeckung 11, der Teststreifen 13, das Fenster 15 und die obere Abdeckung 17.
Das Mylar-Basisblatt 21 dient als eine undurchlässige Unterlage für die festen Trägerbereiche, die einen Flüssigkeitsstrom ermöglichen. Das Blatt kann jedwede Form und fast jede Größe haben, die praktisch gehandhabt werden können. Jedoch ist das Blatt vorzugsweise zwischen etwa 3 und 11 mm breit, zwischen etwa 50 und 150 mm lang und zwischen etwa 0,01 und 1 mm dick, weiter bevorzugt ist das Blatt 9 mm breit, 90 mm lang und 0,1 mm dick.
Der als Beispiel erläuterte Teststreifen 13 umfaßt vier getrennte Bereiche, eine Probenzone 23, eine Markierungszone 26, einen Nitrocelluloseabschnitt 27 mit einer Einfangzone 29 und eine Absorbierungszone 31. Weiterhin ist der Teststreifen in der Bodenabdeckung 11 enthalten, die gegenüber Flüssigkeiten undurchlässig ist und aus einem thermoplastischen Material wie Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Copolymeren von Vinylacetat und Vinylchloridpolyamid, Polycarbonat und Polystyrol besteht, und ist vorzugsweise zwischen etwa 15,9 und 25,4 mm (5/8 und Inch) breit und zwischen etwa 76,2 und 101,6 mm (3 und 4 Inch) lang und zwischen etwa 2,0 und 2,5 mm (0,08 und 0,10 Inch) dick. Weiter bevorzugt ist die Bodenabdeckung 11,4 mm (0,45 Inch) breit und 77,7 mm (3,06 Inch) lang und 2,3 mm (0,09 Inch) dick.
Die Probenzone 23 ist typischerweise aus einer nichtsaugfähigen Matrix wie "SONTARA" oder "POREX" (Polyethylenblatt hoher Dichte oder mit extrem hohem Molekulargewicht, Porex Technologies, Fairbum, Georgia, USA). Sie wird für ein spezifisches Bindereagens für rote Blutzellen unter Einsatz eines geeigneten Mittels zur Kopplung solcher Reagentien mit festen Trägem derivatisiert. Im allgemeinen sind die Verfahren zum Koppeln solcher Reagentien mit der Probenzone mit den untenstehend beschriebenen für das Anhaften von Markierungsreagentien an die Markierungszone identisch.
Die Probenzone 23 besteht aus einer Membran, die zu einer nichtsaugfähigen lateralen Strömung fähig ist, wie zuvor beschrieben. Die Zone wird einzeln mit einer Mylar-Schicht 24 unterlegt. Die Probenzone ist bevorzugt zwischen etwa 3 und 11 mm breit und zwischen etwa 5 und 20 mm lang und zwischen etwa 0,1 und 1 mm dick. Weiter bevorzugt ist die Zone 9 mm breit und 11 mm lang und 0,5 mm dick. Das Mylar ist zwischen etwa 0,01 und 1 mm dick, vorzugsweise 0,1 mm dick und hat dieselben Breiten- und Längenabmessungen wie die Probenzone. Der Mylarbereich der mit Mylar unterlegten Probenzone ist an einem Ende des Mylar-Basisblatts 21 befestigt, wie in Fig. 1 angegeben.
Der Nitrocelluloseabschnitt 27 ist vorzugsweise zwischen etwa 3 und 11 mm breit und zwischen etwa 5 und 50 mm lang und zwischen etwa 0,1 und 1 mm dick. Weiter bevorzugt ist der Nitrocelluloseabschnitt 9 mm breit und 20 mm lang und 0,5 mm dick. Der Nitrocelluloseabschnitt ist mit einer Mylar-Schicht 30 unterlegt. Das Mylar ist zwischen etwa 0,01 und 1 mm dick, vorzugsweise 0,1 mm dick, und hat dieselben Breiten- und Längenabmessungen wie der Nitrocelluloseabschnitt. Der Mylar-Bereich des mit Mylar unterlegten Nitrocelluloseabschnitts ist an dem Mylar-Basisblatt 21 in einem Abstand von 5 bis 20 mm von der Probenzone 23, vorzugsweise 9 mm von der Probenzone, festgemacht.
Der Nitrocelluloseabschnitt 27 enthält einen Bereich, der eine Einfangzone 29 darstellt (oder Mehrfacheinfangzonen enthält), welcher mindestens ein Einfangreagens umfaßt, das zur entsprechenden Wechselwirkung mit der Markierung in der Form in der Lage ist, die als ein Index für die Menge oder das Vorhandensein von Analyt vorgesehen ist. Das Einfangreagens haftet physikalisch, chemisch, biologisch oder anderweitig an der Nitrocellulosematrix in einer Weise, daß, wenn markierte Reste in die Zone eingeführt werden, diese eingefangen werden, wenn sie mit dem entsprechenden Bindungspartner assoziiert sind, und durch die Zone passieren können, wenn sie nicht auf diese Weise assoziiert sind. Es ist nicht notwendig, daß das Einfangreagens direkt an die Matrix gebunden ist; zum Beispiel kann das Reagens mit einem weiteren Material verbunden sein, welches seinerseits physikalisch in der Einfangzone eingefangen ist oder anderweitig daran anhängt. Zum Beispiel kann ein Reagens kovalent oder passiv an Kügelchen oder dergleichen anhaften gelassen werden, und die Kügelchen können dann auf der Membran festgemacht werden. Es ist jedoch wichtig, daß das Einfangreagens nicht aus der Einfangzone entfernt wird, wenn die Testvorrichtung jeglichen Behandlungen, die zur Entfernung ungebundener Materialien aus dieser zweckmäßig sind, unterworfen wird. Geeignete Verfahren zum Festmachen geeigneter Einfangmittel an der Matrix der Einfang-/Detektionszone sind in dem Fachbereich allgemein bekannt. Ein bevorzugtes Verfahren ist das Festmachen des entsprechenden Bindungspartners an eine auf die Einfangzone getüpfelte Linie.
Eine Markierungszone 26 ist vorhanden. Die Markierungszone 26 ist aus einer Matrix oder einem festen Träger aufgebaut, die zu einer nichtsaugfahigen Strömung fähig sind, wie SONTARA, wie zuvor beschrieben. Die Zone ist mit einer Mylar-Schicht 25 unterlegt. Die Markierungszone ist vorzugsweise zwischen etwa 3 und 11 mm breit und zwischen etwa 5 und 20 mm lang und zwischen etwa 0,1 und 1 mm dick. Weiter bevorzugt ist die Zone 9 mm breit und 11 mm lang und 0,5 mm dick. Das Mylar ist zwischen etwa 0,01 und 1 mm dick, vorzugsweise 0,1 mm dick und hat dieselben Breiten- und Längenabmessungen wie die Markierungszone. Der Strömungsmatrixbereich der mit Mylar unterlegten Markierungszone ist an dem Mylar-Basisblatt festgemacht, so daß er den Zwischenraum zwischen der Probenzone 23 und dem Nitrocelluloseabschnitt 27 ausfüllt. Die Markierungszone überlappt die Probenzone um etwa 0,5 bis 2 mm und weiter bevorzugt 1 mm und überlappt weiterhin den Nitrocelluloseabschnitt um etwa 0,5 bis 2 mm und weiter bevorzugt 1 mm.
Ein Fenster 15 bedeckt die Einfang-Detektionszone, so daß das Binden von Markierung als ein Indikator für das Vorhandensein oder Fehlen oder die Menge an Analyt beobachtet werden kann. Das Fenster besteht aus einem dünnen, klaren oder transluzenten Material. Eine obere Abdeckung 17 ist so konstruiert und angepaßt, daß sie gut mit der Bodenabdeckung 11 zusammenpaßt. Die Oberseite bildet und definiert zwei Durchlässe: die Proben-Einführungsöffnung 35 und die Indikator-Öffnung 37. Diese Durchlässe können in Kammern unterteilte oder abgeschrägte Seiten aufweisen und können jegliche zweckmäßige Gestalt oder Größe oder Konfiguration aufweisen. Die Proben-Einführungsöffnung ermöglicht die Einführung der Probe in die Probenzone 23. Die Indikatoröffnung deckt das Fenster 15 ab und ermöglicht die Ablesung der Resultate des in der Einfangzone 29 enthaltenen Assays. Eine Reihe von Schlitzen 39 in der oberen Abdeckung 17 ermöglicht die Verdampfung von Fluid aus der Absorbierungszone 31. Die Absorbierungszone ist vorzugsweise zwischen etwa 3 und 11 mm breit und zwischen etwa 5 und 50 mm lang und zwischen etwa 0,2 und 2 mm dick. Weiter bevorzugt ist die Zone 9 mm breit und 30 mm lang und 0,7 mm dick. Die Absorbierungszone haftet an das Mylar-Basisblatt 21 an und überlappt den Nitrocelluloseabschnitt 27 um etwa 0,5 bis 2 mm und weiter bevorzugt 1 mm.
Die Fig. 2 ist die Ansicht von oben der obenstehend beschriebenen Vorrichtung im zusammengebauten Zustand.
Bei Betrieb nimmt die Probenzone 23 die Vollblutprobe auf. Die Probenzone 23 enthält ein Reagens, das zum Binden roter Blutzellen, wie Antiserum oder Antikörper, in der Lage ist. Die roten Blutzellen werden auf diese Weise auf der Probenzone zurückgehalten, und das verbleibende RBC-freie Fluid fließt in den restlichen Teil der Vorrichtung. Die Markierungszone 26 enthält die Markierung, die an den Analyten in der Probe binden soll, oder die so ausgelegt ist, dass sie mit diesem konkurriert, m einer alternativen Ausführungsform nimmt die Probenzone 23 die Vollblutprobe auf, und die Markierungszone 26 enthält sowohl das Reagens zum Einfangen der roten Blutzellen als auch die Markierung wie obenstehend. In jeder Ausführungsform kann das RBC-Einfängreagens ein Antikörper sein, der monoklonale oder polyklonale Antikörper oder immunologisch reaktive Antikörper-Fragmente, wie F(ab')&sub2;, Fab' oder Fab einschließt, oder kann ein Lectin oder anderes RBC-Bindemittel sein. Die Probenzone 23 und die Markierungszone 26 stehen in Fluidverbindung, wobei die Markierungszone 26 darüberliegt und die Probenzone leicht überlappt, so daß das Fluid von der Probenzone zu der Markierungszone in der Vorrichtung von Fig. 1 strömt. Die Markierungszone 26 und der Nitrocelluloseabschnitt 27 stehen ebenfalls in Fluidverbindung, so daß das Fluid in die Einfangzone 29 strömt. Nach Erreichen der Einfangzone 29 entfernt das Einfangreagens, das spezifisch die gewünschte markierte Form binden soll, diesen markierten Rest aus dem Fluid. Das verbleibende Fluid strömt anschließend durch die Einfangzone und in die Absorbierungszone 31.

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, schränken diese aber nicht ein.

Beispiel 1

Zwei verschiedene Kaninchen-Antiseren gegen menschliche rote Blutzellen (Anti-RBC), eines im Haus hergestellt (BB#31) und ein weiteres kommerziell erhalten (DAKO A 104), wurden getestet. Es wurde die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung verwendet. Um einen festen Träger für das Einfangen von RBCs zu erhalten, wurde zellenfreies Vollserum in SONTARA-Zonen in Gegenwart von 10 mg/ml methyliertes Rinderserum Albumin (mBSA) dispergiert. Die zwei verschiedenen Antiseren in ihren jeweiligen SONTARA-Zonen wurden danach 24 Stunden lang lyophilisiert.
Die resultierenden Antiserum enthaltenden Zonen wurden zur Herstellung von Teststreifen wie in Fig. 1 gezeigt verwendet, wobei sich die Antiserumzone entweder an der Probenzonenposition oder der Markierungszonenposition befindet. Kontrollen verwendeten Proben- und Markierungszonen, die kein Antiserum enthielten. Als 40 ul Vollblut der Probenzone hinzugegeben wurden, verhinderten beide Antiseren, daß die RBCs in der Probe in die Nitrocellulose gelangten (siehe Tabelle I).

Tabelle I

Kaninchen-Anti-RBC Nitrocellulose
Vollserum Eindringen
BB#31 nein
DAKO nein

Beispiel 2

Nichtimmunisiertes Kaninchenserum und Anti-RBC-Kaninchenserum wurden auf SONTARA lyophilisiert und in die Probenzonenpositionen der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung gegeben. Als 40 ul Vollblut aufgebracht wurden, gelangten die roten Zellen in beiden Fällen in die Markierungszone, jedoch war der Migrationsgrad in die Nitrocelluloseregion geringer für den mit Anti-RBC-Serum hergestellten Streifen, und es wurde eine Abtrennung von RBCs von Plasma bewirkt (siehe Tabelle n). Tabelle II

Beispiel 3

In einem Assay für IgE in Vollblut wurde das folgende Protokoll verwendet. Anti-RBC-Serum wurde in einer SONTARA-Matrix lyophilisiert, die als die Probenzone verwendet wurde, und in der Vorrichtung von Fig. 1 positioniert. Gefärbte Teilchen, die mit monoklonalem Maus-Anti- Mensch-IgE-Antikörper gekoppelt waren, wurden in SONTARA-Matrix, die als die Markierungszone verwendet wurde, lyophilisiert. Polyklonales Ziegen-Anti-Mensch-IgE wurde auf die Nitrocellulose-Einfängzone aufgebracht.
Vollblutproben wurden mit IgE von 200, 100, 50, 20 und 10 IU/ml unter Verwendung von heparinisiertem Vollblut von einem Spender mit 10 IU/ml Gesamt-IgE und von weiterem Vollserum mit 15 000 IU/ml hergestellt. Die Dosis-Response wurde für diese Proben demonstriert und zeigte, daß der Assay für das gesamte IgE durch das Vorhandensein des Anti-RBC- Antivollserums nicht beeinträchtigt war (siehe Tabelle III). Das Gesamt-IgE-Signal wurde in einer heparinisierten Vollblutprobe von dem zweiten Spender nachgewiesen. Rote Zellen gelangten nicht in die Nitrocellulose-Einfangzone des Teststreifens. Tabelle m

Beispiel 4

Es wurden mit gefärbten Teilchen in der Markierungszone hergestellte Streifen verwendet, um die Blutproben von A-positiven, B-positiven und O-positiven Spendern auf IgE zu testen, um zu zeigen, daß menschliche Blutgruppen nicht unterscheidbar reagieren. Mit diesen Proben, die mit einem Volumen von 50 ul dispensiert wurden, wurde verhindert, daß rote Blutzellen in die Nitrocellulose gelangen, und es wurde eine positive Gesamt-IgE-Response beobachtet (siehe Tabelle IV). Tabelle IV
* Nach dem Spiken bzw. Versetzen von Vollblut mit IgE)
Modifizierungen der obenstehend beschriebenen Wege zur Ausführung der Erfindung, die Fachleuten auf den Gebieten der Medizin, Immunologie, klinischen Chemie und/oder einem verwandten Gebiet offensichtlich sind, sollen innerhalb des Umfangs der nachfolgenden Ansprüche liegen.

Claims

1. Laterale Fließvorrichtung zur Detektion des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge eines Analyten in einer Vollblutprobe, wobei die Vorrichtung in einem allgemein planaren Format Folgendes umfaßt:

(i) eine Probenaufnahmezone (23), umfassend eine erste feste, poröse Matrix mit einem immobilisierten Reagens, welches spezifisch rote Blutzellen-Oberflächen-Antigene bindet und die Entfernung von im wesentlichen allen roten Blutzellen (RBCs) aus der Vollblutprobe bewirkt, was zu im wesentlichen RBC-freiem Fluid, das gelöste oder dispergierte Komponenten enthält, wobei die Probenaufnahmezone sich in einem nichtsaugfähigen lateralen Fließkontakt befindet mit:

(ii) einer Markierungszone (26), umfassend eine zweite feste, poröse Matrix mit einer mobilisierbaren Markierungskomponente, umfassend eine mit einem Rest gekoppelte sichtbare Markierung, welcher zur spezifischen Bindung an den Analyten oder zur Kompetitierung mit dem Analyten um ein immobilisiertes Einfangreagens in der Lage ist, welches spezifisch an den markierten Analyten oder an die mit dem Analyten konkurrierende Markierungskomponente bindet, wobei die Markierungszone sich in einem nichtsaugfähigen lateralen Fließkontakt befindet mit:

(iii) einer Einfangzone (29), umfassend eine dritte feste, poröse Matrix mit einem immobilisierten Einfangreagens, welches spezifisch an den markierten Analyten oder die Markierungskomponente, welche mit dem Analyt konkurriert, bindet, wobei die Einfangzone sich in einem nichtsaugfähigen lateralen Fließkontakt befindet mit:

(iv) einer Absorbierungszone (31);

wobei die Probenaufnahmezone getrennt hergestellt wird und angrenzend an den restlichen Teil der Vorrichtung vor der Anwendung der Probe positioniert wird; und wobei alle gelösten oder dispergierten Komponenten in dem RBC-freien Fluid durch die Probenaufnahmezone, die Markierungszone und die Einfangzone in einer nichtsaugfähigen Strömung fließen.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Markierungskomponente in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, und wobei die Markierungskomponente eine mit einem spezifischen Bindungspartner für den Analyten gekoppelte sichtbare Markierung umfaßt.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Markierungskomponente in der Lage ist, spezifisch mit dem markierten Analyten um das immobilisierte Einfangreagens zu konkurrieren, und wobei die Markierungskomponente eine mit einem Konkurrenten des Analyten um das immobilisierte Einfangreagens gekoppelte sichtbare Markierung umfaßt.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das Reagens, welches spezifisch rote Blutzellen- Oberflächen-Antigene bindet, ausgewählt ist aus der einen monoklonalen Antikörper, polyklonale Antikörper und ihre F(ab')&sub2;-, Fab'- und Fab-Fragmente umfassenden Gruppe.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei mindestens eine aus der ersten festen, porösen Matrix, der zweiten festen, porösen Matrix und der dritten festen, porösen Matrix eine nichtgewebte Textilstruktur umfassen.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, wobei das Textil eine spinngebundene Struktur besitzt.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei mindestens eine der ersten festen, porösen Matrix, der zweiten festen, porösen Matrix und der dritten festen, porösen Matrix weiterhin jeweils aus einem Polyethylenblatt hoher Dichte bestehen.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei das Blatt eine offene Porenstruktur mit einer Dichte, bei 40% Hohlraumvolumen, von 0,57 g/cm³ und einen mittleren Porendurchmesser von 1 bis 250 Mikrometer besitzt.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Zonen eine Porengröße von etwa 1-100 Mikrometer aufweisen.

10. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandensein, des Fehlens oder der Menge eines Analyten in einer Vollblutprobe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Kontaktieren der Vollblutprobe mit der Vorrichtung gemäß Anspruch 1; und

(b) Visuelles Feststellen der Bindung der Markierung als eine Funktion des Vorhandenseins oder des Fehlens oder der Menge des Analyten in der Vollblutprobe.