DE60003606T2

DE60003606T2 - Immunochromatographisches Assay

Info

Publication number: DE60003606T2
Application number: DE60003606T
Authority: DE
Inventors: Kiamars Granger Hajizadeh; Dayaweera Granger Wijesuriya
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: EP1046913B1; EP1046913A3; DE60003606D1; EP1046913A2; JP2000321278A; CA2291914A1; JP4351358B2; US6180417B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Immunochromatografische Streifen-Formate sind für qualitative und halb-quantitative Assayverfahren zunehmend populär geworden, in denen visuelle Nachweisschemata zur Anwendung gelangen. Dieser Typ von Assay beinhaltet die Aufbringung einer flüssigen Testprobe, von der angenommen wird, dass sie den Analyt enthält, der nachgewiesen werden soll, auf eine Aufbringzone eines immunochromatografischen Teststreifens. Der Streifen ist aus einem Matrixmaterial zusammengesetzt, durch welches das Testfluid und darin suspendierter oder gelöster Analyt durch Kapillarwirkung aus der Aufbringzone zu einer Einfangzone zu fließen vermag, wo ein nachweisbares Signal oder die Abwesenheit eines solchen die Anwesenheit und das Vorhandensein des Analyts enthüllen oder nicht. In typischer Weise schließt der Streifen Mittel zur immunospezifischen Bindung des nachzuweisenden Analyts mit seinem spezifischen Bindungspartner ein, der die nachweisbare Markierung aufweist. Die Markierung kann eine, die für das nackte Auge wie kolloidale Metallpartikel oder gefärbter Latex sichtbar ist, ein Enzym, das bei Kontakt mit einem geeigneten Substrat ein sichtbares Signal bildet, oder eine sein, die nur durch Anwendung eines Geräts wie für eine chemilumineszente oder radioaktive Markierung nachweisbar _ ist. In einem dieser Schemata enthält der Streifen einen mit Enzym markierten, mobilen Bindungspartner für den Analyt, wobei jener in einer Probenaufbringzone vorliegt. Ist Analyt in der Testprobe vorhanden, wird er mit seinem markierten Bindungspartner kombiniert, um einen Komplex zu bilden, der entlang des Streifens zu einer Nachweiszone fließt, die ein Substrat zur Enzym-Markierung enthält, das über die Befähigung verfügt, eine gefärbte Reaktion in der Gegenwart des Enzyms zu ergeben. Der Streifen kann eine Zone enthalten, in welcher Analyt immobilisiert ist, so dass markierter Bindungspartner, der wegen der Abwesenheit von Analyt in der Probe nicht mit Analyt kombiniert wird, eingefangen und dadurch daran gehindert wird, die Nachweiszone zu erreichen. Es sind verschiedene Modifikationen dieser Verfahrenstechnik veröffentlicht worden, von denen alle ein gewisses konkurrierendes spezifisches Bindungssystem einschließen, mit welchem die An- oder Abwesenheit von Analyt in der Testprobe durch den Nachweis oder das Fehlen von markiertem Bindungspartner in der Einfangzone bestimmt werden.
Eine Alternative zum oben beschriebenen immunometrischen Assay, bei dem der freie markierte Antikörper nachgewiesen wird, stellt das sogenannte Sandwich-Format dar, in welchem die Einfangzone immobilisierte Antikörper gegen ein Epitop des Analyt enthält, zu welchem der markierte Antikörper spezifisch ist. In diesem Format wird ein Sandwich des Analyt zwischen den immobilisierten und markierten Antikörpern gebildet, um das nachweisbare Signal in der Einfangzone zu ergeben.
Nicht alle der Schemata zur Immunochromatografie beruhen auf einem mit Enzym markierten Bindungspartner/Enzym-Substrat zur Bereitstellung des Signals zum Nachweis des Analyts. In US 4,806,311 ist eine Mehrfachzonen-Testvorrichtung zur spezifischen Bindungsassay-Bindung eines Analyts und eines immobilisierten Bindungspartners für den Analyt zusammen mit einer Einfangzone zur Aufnahme von markiertem Reagens offenbart, welches durch diese aus der Reagenszone hindurchwandert. Die Einfangzone enthält eine immobilisierte Form einer Bindungssubstanz für das markierte Reagens. Das markierte Reagens weist eine chemische Gruppe mit einer nachweisbaren physikalischen Eigenschaft auf, die auf der Basis dieser physikalischen Eigenschaft nachweisbar ist, so dass es keiner chemischen Reaktion mit einer weiteren Substanz zum entsprechenden Nachweis bedarf. US 4,703,017 beschreibt die Anwendung sichtbarer teilchenförmiger Markierungen für den Rezeptor. Verschiedene teilchenförmige Markierungen wie Gold-Sol-Partikel und sichtbarer Farbstoff, der Liposome enthält, sind genannt.
EP 0 291 194 offenbart einen immunochromatografischen Streifen eines Typs, der vorliegend in Betracht gezogen wird. Zur Beschreibung des Aufnahmeelements wird in diesem Patent festgestellt, dass jenes aus einem saugfähigen, porösen oder faserartigen Material, einschließlich poröser Kunststoffe wie aus Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylidenfluorid, Ethylenvinylacetat, Acrylnitril oder aus Polytetrafluorethylen, hergestellt sein kann. Indem die Patentinhaber erkennen, dass einige dieser Materialien hydrophob sind, schlagen sie vor, das Material mit einem oberflächenaktiven Mittel vorzubehandeln, um die inhärente Hydrophobizität herabzusetzen. In den Streifen des Standes der Technik wird in typischer Weise ein poröses Aufnahmeelement angewandt, um das Testfluid rasch zu absorbieren, so dass der Streifen schnell vollständig benetzt wird, wenn er in ein Testfluid wie Urin getaucht wird. Allerdings kann diese Benetzbarkeit des Teststreifens problematisch werden, wenn das Probenvolumen kritisch ist, wie in dem Fall, wenn die fluide Testprobe Gesamt- bzw. Vollblut ist, das aus einer Punktur des Fingers erhalten wird. Im Fall von Teststreifen mit einem hydrophilen Probenaufnahmeelement liegt im allgemeinen eine Notwendigkeit für höhere Probenvolumina vor, da das hydrophile Element etwas Flüssigkeit selbst aufnimmt, abhängig von seiner Porosität, bevor die Probe den nächsten Abschnitt auf dem Streifen erreichen kann. Ein Weg zur Minimierung des Probenvolumens beruht darauf, dass man die Abmessungen des Teststreifens verringert oder ihn miniaturisiert. Dieser Lösungsansatz kann wegen bestimmter einschränkender Bedingungen bei den Abmessungen einer Gehäusekassette für den Streifen oder bei einem Gerät wie einem Reflexionsspektrometer nicht immer der geeignete sein, welches zur Ablesung des Streifens eingesetzt wird, was in einigen Fällen nicht empfindlich genug sein kann.
Es wäre wünschenswert und ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Immunochromatografiestreifen des oben beschriebenen Typs anzugeben und bereitzustellen, worin die fluide Testprobe aus dem Streifen-Aufnahmeelement zu seinem Reagens-Teilstück mit verringertem Probenvolumen gezogen wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Assay zur Bestimmung des Vorliegens oder der Konzentration eines Analyt in einer fluiden Testprobe durch Aufbringung des Fluids auf das Aufnahmeelement eines Immunochromatografie-Teststreifens. Das Streifen-Aufnahmeelement steht in fluider Verbindung mit dem Reagens-Teilstück des Streifens, das mindestens ein absorbierendes Material einschließt, durch welches das Testfluid fließen kann, und welches einen mobilen, markierten spezifischen Bindungsparter für den Analyt enthält, worin die Konzentration des Analyts in der fluiden Testprobe durch Messung der Menge an markiertem spezifischen Bindungspartner bestimmt wird, welcher durch einen Einfangmechanismus im Reagens-Teilstück des Streifens eingefangen wird. Die hier offenbarte Erfindung stellt eine Verbesserung dieses Assaytyps dar, welcher die Anwendung eines Teststreifens beinhaltet, worin das Aufnahmeelement aus einem nicht-porösen, hydrophoben Material hergestellt ist.
Durch Bereitstellung einer hydrophoben Plattform als Proben-Aufnahmeunterlage wird eine effizientere und einheitlichere Freisetzung des markierten Konjugats bewerkstelligt. Die Genauigkeit der Reflexionswerte aus den Nachweis- und Vergleichsbereichen der Vorrichtung sind ebenfalls verbessert. Die hydrophobe Natur der Unterlage, die eine Absorption der Probe verhindert, ermöglicht die Anwendung eines kleineren Volumens der Testprobe gegenüber einem herkömmlichen Immuno-Teststreifen, worin eine absorbierende Unterlage mit Dochtwirkung auf die Testprobe verwendet ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B stellen die jeweiligen Front- und Seitenansichten einer Streifenvorrichtung zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung dar.
Beschreibung der Erfindung
Betreffend 1A (Draufsicht) und 1B (Seitenansicht), umfasst die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ein Stützelement 9, das aus einem hydrophoben, nicht-porösen Material wie aus Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen oder aus einem weiteren nicht-saugfähigen hydrophoben Material hergestellt ist, auf welchem die absorbierenden Teilstücke der Vorrichtung angeordnet werden. Die nicht-poröse Proben-Aufbringzone ist ein festes, undurchdringliches hydrophobes Material oder eine feste, undurchdringliche Oberfläche, die behandelt ist, um hydrophobe Eigenschaften zu ergeben. Die Anwendung einer solchen undurchdringlichen hydrophoben Oberfläche hindert die darauf aufgebrachte fluide Probe daran, dass sie übermäßig stark ausgebreitet wird, wodurch die Gesamtprobe maximiert wird, die dann für das System verfügbar ist. Als Ergebnis kann das Probenvolumen in Situationen, wie derjenigen eines Stichs in den Finger, worauf dann nur ein kleines Probenvolumen zur Anwendung gelangt, vorzugsweise oder nötigenfalls minimiert werden. In dieser bevorzugten Ausgestaltungsform wird der Teilbereich 9a des hydrophoben, nicht-porösen Materials unbedeckt von absorbierendem Material gelassen, um die Proben-Aufbringzone zu ergeben. Alternativ dazu, kann ein Stück aus hydrophobem, nicht-porösen Material auf das Stützelement aufgebacht werden, um als das hydrophobe, nicht-poröse Material für die Proben-Aufbringzone 9a zu dienen, in welchem Fall das Stützelement 9 als solches aus anderen Materialien als denjenigen hergestellt sein kann, die hydrophob und nicht-porös sind. Die hydrophobe, nicht-poröse Proben-Aufbringzone braucht nicht auf diese oben genannten Materialien eingeschränkt zu sein; weitere Materialien wie Polytetrafluorethylen und Materialien, die auf ihrer Oberfläche mit hydrophoben Materialien wie mit Polyfluorethylen und Silanierungsmitteln behandelt worden sind, können mit gleichwertigen Ergebnissen verwendet werden. Die Begriffe "hydrophob" und "nicht-porös" sollen für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung bedeuten, dass die Materialien wasserabstoßend sind und nichts von der flüssigen Testprobe absorbieren. Die hydrophobe Oberfläche absorbiert keine fluide Testprobe, die wässriger Natur ist, wodurch sich ein maximales Probenvolumen für den Transport quer durch den Reagensbereich ergibt. Dies ist besonders erwünscht, wenn das Probenvolumen eingeschränkt ist. Stromaufwärts in Richtung des fluiden Testprobenflusses liegt die Konjugat-Unterlage 1 vor, die in direkter fluider Verbindung mit der hydrophoben, nicht-porösen Aufbringzone 9a steht. Die Konjugat-Unterlage ist in typischer Weise aus einem absorbierenden, porösen Material, wie aus Glasfaser, Polyester oder weiterem gewebten oder Vlies-Synthesematerial hergestellt, durch welches die fluide Testprobe fließen kann, und sie enthält mobiles Konjugat eines oder mehrerer markierter spezifischer Bindungspartner. Der spezifische Bindungspartner, der in typischer Weise ein Antikörper ist, kann mit einem Enzym, Fluorophor, radioaktivem Isotop oder vorzugsweise mit einer direkten teilchenförmigen Markierung wie mit einem Gold-Sol oder mit gefärbten Latexpartikeln markiert sein. Wird die fluide Testprobe auf die hydrophobe, nicht-poröse Aufbringzone in direktem physikalischen Kontakt mit der Konjugat-Unterlage aufgebracht, wird sie in der Konjugat-Unterlage absorbiert, wo sie in Kontakt mit dem markierten spezifischen Bindungspartner gelangt und weiter aufwärts in der Vorrichtung hin zu einer Brücken-Unterlage 3 befördert wird. Der Fluid-Transfer zwischen der Aufbringzone und Reagenszone (in diesem Fall der Konjugat-Unterlage) ist gegenüber demjenigen Fall verbessert, der zu beobachten ist, wenn die Aufbringzone aus einem anderen Material als einem hydrophoben, nicht-porösen Material hergestellt ist, weil die Grenzfläche zwischen der Aufbringung-Unterlage und der Konjugat-Unterlage eliminiert ist. Unregelmäßigkeiten durch diese Grenzfläche können nicht-einheitliche Fließmuster verursachen, die zu Abweichungen beim Testergebnis führen. Diese Konfiguration benötigt auch ein nur kleineres Probenvolumen. Die hydrophoben Eigenschaften der Proben-Aufbringzone verhindern, dass sich die Probe weit ausbreitet, so dass sie durch die Konjugat-Unterlage fließen kann, was den am wenigsten Widerstand leistenden Weg darstellt.
Stromaufwärts auf der Vorrichtung, ausgehend von der Konjugat-Unterlage, befindet sich die Brücken-Unterlage 3, die dem Zwecke dient, eine Vermisch-Pforte bereitzustellen, um die einheitliche Vermischung reaktiver Reagenzien zu gewährleisten, die die Reaktionszonen erreichen. Sie dient auch dazu, überschüssige rote Blutzellen, die nicht in der vorherigen Zone fixiert worden sein mögen, am Eintritt in die Nachweiszonen zu hindern, und sie kann aus einem Material wie Polyester oder Glasfaser hergestellt sein. Stromabwärts von der Brücken-Unterlage 3 befindet sich der Ablesebereich 5, der aus einem Material wie Nitrocellulose, Cellulose oder Polyethylensulfonat hergestellt sein kann, durch welchen die fluide Testprobe, die die Reagenzien (den markierten spezifischen Bindungspartner und Analyt, mit dem der spezifische Bindungspartner reagiert hat) aufweist, und an welchen die Einfangmittel anhaften. Somit kann die Nachweiszone 11 daran immobilisiert entweder Analyt (oder ein Bindungsanalogon davon) im Fall eines kompetitiven (konkurrierenden) Immunoassay aufweisen, wobei markierter Bindungspartner, der spezifisch für den Analyt ist, mit Analyt konkurriert, der mit der Testprobe in der Nachweiszone immobilisiert wird. Alternativ dazu, kann in der Nachweiszone ein spezifischer Bindungspartner immobilisiert sein, der spezifisch für ein Epitop des Analyt ist, das sich von demjenigen Epitop unterscheidet, zu welchem der markierte spezifische Bindungspartner spezifisch ist, so dass ein markierter spezifischer Bindungspartner-Analyt/immobilisierter spezifischer Bindungspartner-Sandwich in der Gegenwart von Analyt gebildet wird. Die Konkurrenz (Bindungsinhibierung) und Sandwich-Bildung könnten in der Konjugat-Unterlage stattfinden, in welchem Fall die Nachweiszone als eine universelle Einfangzone dienen würde.
Der Ablesebereich 5 kann auch eine Vergleichszone 13 enthalten, worin markierter Antikörper eingefangen wird, um für den Anwender anzuzeigen, dass der Assay ordnungsgemäß durchgeführt worden ist. Im typischen Fall weist die Vergleichszone darauf immobilisiert Bindungspartner auf, die spezifisch zum markierten Bindungspartner wie anti-Maus IgG sind, wenn der markierte spezifische Bindungspartner ein Maus-Antikörper ist. Der Vergleichs-Bindungspartner kann an einer getrennten Markierung wie Latex oder an der gleichen Markierung wie an derjenigen angebracht und befestigt sein, die für den Nachweis des Analyt verwendet wird. Schließlich gibt es eine absorbierende Unterlage 7, deren Funktion es ist, als eine Senke zur Beseitigung überschüssiger unreagierter Reagenzien zu wirken und als eine Pumpe zum effizienten Kapillarfluss durch den Teststreifen zu dienen. Die absorbierende Unterlage kann aus absorbierenden Materialien wie aus Cellulose, mit einem Trocknungsmittel behandelter Cellulose und aus mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelten porösen Polymeren abgeleitet sein.
Die einzigen 2 Elemente, die bezüglich der Durchführbarkeit der vorliegenden Erfindung kritisch sind, sind die feste Trägerunterlage und das feste Teilstück des Streifens in fluider Verbindung mit der festen Trägerunterlage. Wird die feste Trägerunterlage nicht durch das Reagens-Teilstück abgedeckt, dient sie als das Aufnahmeelement der Streifenvorrichtung. Somit dient in dieser Ausgestaltungsform, der feste Träger 9 auch als das Aufnahmeelement 9a, wenn es aus einem nicht-porösen, hydrophoben Material konstruiert ist. Alternativ dazu, kann ein getrenntes Aufnahmeelement auf die feste Trägerunterlage aufgebracht und eng dem Reagens-Teilstück des Streifens zugewandt sein, so dass es in fluider Verbindung mit dem Reagens-Teilstück steht. Während das Reagens-Teilstück des Streifens so dargestellt ist, als ob es aus getrennten Stücken in den Zeichnungen zusammengesetzt wäre, ist es klar und verständlich, dass dies die bevorzugte Ausgestaltungsform der Erfindung darstellt und ein Einzelstreifen auch verwendet werden könnte, unter der Voraussetzung, dass er mit einem Material konstruiert ist, durch welches die fluide Testprobe zu fließen vermag, und welches die Befähigung aufweist, die entsprechenden Reagenzien (den mobilen markierten Bindungspartner, der für Analyt in der Testprobe spezifisch ist, und einen immobilisierten Einfangmechanismus für den Analyt oder den markierten Bindungspartner) aufzunehmen und zu halten. Dies könnte durch Befestigung einer Einzelunterlage aus absorbierendem Material wie aus Nitrocellulose am Stützelement 9 bewerkstelligt werden, welches das mobile Konjugat enthalten und die Nachweisstelle 11 und Vergleichsstelle 13 aufweisen würde. Im Allgemeinen ist die Reagenszone der Vorrichtung aus einem absorbierenden Material wie Papier oder einer weiteren Membran hergestellt, welche mit einem entsprechenden Reagens behandelt worden sind, das mit einem besonderen Assay, der durchgeführt werden soll, zusammenhängt. Die Immunoassay-Komponenten können auf eine Platte des absorbierenden Materials aufgebracht werden, die dann in Streifen entsprechender Größe geschnitten und auf das Stützmaterial in solch einer Weise geklebt werden, dass sich ein direkter physikalischer Kontakt zwischen der hydrophoben, nicht-porösen Aufbringzone der Vorrichtung und ihrer Reagenszone ergibt.
Obwohl sich die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Durchführung von Immunoassayverfahren mit verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Urin, Speichel, Schweiß und Schleim eignet, ist sie besonders geeignet für Assayverfahren, in denen Blut das Testfluid ist. Dies deshalb, weil es einen Bedarf für einen Test gibt, der eines nur kleinen Probenvolumens bedarf, und zwar für den Fall, dass das Blut durch eine Maßnahme wie einen Stich in den Finger gewonnen wird.
Die Vorrichtung kann so, wie sie ist, eingesetzt und angewandt werden, oder sie kann in ein Gehäuse wie das in der vorher genannten EP 0 291 194 beschriebene eingeschlossen werden. In jeder Ausgestaltungsform wird die Vorrichtung angewandt, wobei eine Probe der fluiden Testprobe auf die Aufbringzone entweder direkt oder durch eine Aufbringpforte im Gehäuse aufgebracht wird. Durch Aufbringung der fluiden Probe auf die hydrophobe nicht-poröse Aufbringzone in teilweisem Kontakt mit dem absorbierenden Reagens-Teilstück der Vorrichtung wird die Probe in und durch die Reagenszone effizienter sorbiert, als wenn sie direkt auf das absorbierende Reagensmaterial aufgebracht würde. Dies deshalb, weil durch Aufbringung der Probe auf die hydrophobe Proben-Aufbringzone, in Kontakt mit dem absorbierenden Teilstück der Vorrichtung, die Flüssigkeit stromaufwärts hin zur Nachweiszone bewegt wird, was zu einer einheitlicheren Freisetzung der Reagenzien führt. Wird dagegen die Probe direkt auf die Reagenszone aufgebracht, erreicht sie die Nachweisfläche. Dadurch entsteht eine Tendenz, dass sich die Freisetzung der Reagenzien verlangsamt. Dies führt zu längeren Testzeiten und beachtlichem nicht freigesetzten Reagens, das im absorbierene Reagens enthaltenden Material zurückbleibt, was wiederum zu einer geringeren Reaktion auf den in der Testprobe enthaltenen Analyt führt.
Viele klinisch signifikante Ziel-Analyte sind in Körperflüssigkeiten vorhanden und können mit der Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert werden. So können in Urin Analyte wie Deoxypyridinolin, Humanserumalbumin, Missbrauchsdrogen, Protein-Marker wie Prostata-spezifisches Antigen, Nierenkrankheitsproteine wie Lactat-Dehydrogenat, N-Acetyl-β-D-glucosamin, mit Schwangerschaft oder Fruchtbarkeit zusammenhängende Hormone wie menschliches chorinisches Gonadotropin und Marker einer Harntraktinfektion analysiert werden. Die Bestimmung von Blut-gestützten Analyten wie von therapeutischen Arzneimitteln, Hormonen, Krebsmarkern wie Prostata-spezifischem Antigen, Herzmarkern (Troponin I, Troponin T, CKMB) und von α-Fötoprotein lässt sich in besonders geeigneter Weise mit der vorliegenden Erfindung durchführen.
Während die Mittel zum Nachweis des oder der Signale aus der Reagenszone der vorliegenden Erfindung vom Typ der nachweisbaren Markierung abhängen, die am markierten Bindungspartner angebracht ist, wird ein Reflexionsspektrometer in typischer Weise angewandt, wenn die nachweisbare physikalische Eigenschaft der Markierung die Reflexion von Licht bei einer vorbestimmten Wellenlänge ist. In einer bevorzugten Ausgestaltungsform zur Anwendung der Vorrichtung wird ein Reflexionsmessgerät mit Mitteln zum Bewegen des Teststreifens oder zum Bewegen des Detektorelements des Messgeräts relativ zueinander wie durch die Anwendung eines Spezimen-Tisches für den Streifen bereitgestellt, der seitlich unter dem Lesekopf des Detektors bewegt werden kann. Die Reflexion aus der Nachweiszone des Ablesebereichs kann abgelesen werden, um die Konzentration des Analyt in der fluiden Probe zu erhalten, worauf die Vorrichtung auf dem Spezimen-Tisch zur Ablesung der Reflexion der Vergleichszone verschoben werden kann. Das Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird durch das folgende Beispiel noch besser erläutert:
Beispiel I
Teststreifen wurden gemäß dem Design der 1A und 1B in einem Muschel-Schale-Laminator hergestellt. Auf einem Polystyrol-Stützteil (5,6 × 0,765 cm) wurde ein Nitrocellulose-Streifen (2,5 cm lang) angebracht, und stromaufwärts von diesem Streifen wurden eine 0,7 cm lange Brücken-Unterlage aus vorlaminierter Glasfaser (Whatman F075-075) und eine 0,9 cm lange Konjugat-Unterlage aus lose konsolidierter amorpher Glasfaser aufgebracht, die anti-PSA-Monoclonal-Antikörper enthielt, der mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiert war. Diese Abschnitte wurden so angeordnet, dass 0,4 cm des Polystyrol-Stützteils freigelegt zurückblieben, um als hydrophobe Plattform zur Aufbringung der flüssigen Testprobe zu dienen. Stromabwärts vom Nitrocellulose-Streifen wurde ein 1,0 cm langes Stück aus mit Trocknungsmittel imprägniertem absorbierenden Cellulosepapier als absorbierende Unterlage aufgebracht.
Der Nitrocellulose-Streifen war mit Test- und Vergleich-Linien versehen, welche durch Aufbringen von 3,0 mg/mL monoclonalem Maus-anti-FITC als Test-Linie und von 3,75 mg/mL Glucose-Oxidase (GO) als Vergleich-Linie (als Test- und Vergleich-Linie-Proteine) auf den Streifen mit einem IVEK-Streifer hergestellt wurden. Die Konjugat-Unterlage wurde mit einer Mischung aus 125 μg/mL anti-GO-Latex, 350 mg/mL anti-PSA-Latex, 5 μg/mL FITC-anti-PSA, 3,16 mg/mL Chremophor, 0,23% Kasein, 20,9 mg/mL HEPES, 23,3 mg/mL Maltose, 9,32 mg/mL BSA, 1,45 mg/mL Ziege-IgG und aus 1,1 mg/mL Kartoffellectin imprägniert und mit einem Auflage-Trockner bei Zonen von 70, 60 und 50°C mit einer Geschwindigkeit von 120 cm/min getrocknet.
Die Vorrichtung wurde durch Aufbringung von 75 μL Vollblut, gespickt mit Komplex-PSA-Kalibrator, auf den Teststreifen durch Pipettieren auf die hydrophobe Plattform aus Polystyrol, auf die Konjugat-Unterlage oder auf eine poröse Puffer-Unterlage getestet, die in Front der Konjugat-Unterlage angeordnet war. Die Blutprobe wurde in die Konjugat-Unterlage und durch die Reaktionszonen des Teststreifens sorbiert, die dazu dienten, rote Zellen aus dem Vollblut abzutrennen, als das Blut durch die verschiedenen Zonen des Streifens wanderte. Die Brücken-Unterlage dient zur Gewährleistung einer effizienten Vermischung des Konjugats und der Blutprobe und trägt dazu bei, rote Blutzellen am Eintritt in die Nitrocellulose-Fläche zu hindern, wo sie das Signal aus den Test- und Vergleichszonen verdunkeln könnten. Die entwickelten Streifen wurden durch Bestimmung der Reflexion aus der Testzone bei 625 nm mit einem CLINITEK^®-Reflexionsmessgerät 10 min nach Aufbringung der Blutprobe abgelesen.
3 Formate wurden bezüglich der Fluid-Durchlaufcharakteristika und der Gesamt-Testleistung verglichen. In Format "A" wurde die Probe auf die Mitte der Polystyrol-Plattform bei 1 bis 2 mm von der Konjugat-Unterlage aufgebracht, so dass das Testfluid die Unterlage berührte. In Format "B" wurde die Blutprobe auf die Mitte der porösen Konjugat-Unterlage aufgebracht. In Format "C" wurde die Probe auf eine poröse Puffer-Unterlage aus Glasfaser aufgebracht, die in Front der Konjugat-Unterlage angeordnet war. Dies stellt das üblichste Format dar, das in Immunochromatografie-Streifen angewandt wird. In Tabelle 1 sind die Vergleichs- und Testlinienintensität und der mit jedem der drei Formate zusammenhängende Fehler dargestellt. Die Test- und Vergleichsbandenreflexionswerte (% R) wurden in Triplikaten in einem CLINITEC^®-Reflexionsmessgerät gemessen. Die Signal-STDs und -CVs wurden durch Einsetzen der um den Hintergrund verringerten Peak-Reflexionswerte (n = 3) berechnet, um den Fehler in jedem Fall zu bestimmen: Tabelle 1
Aus Tabelle 1 ist ermittelbar, dass das Format A, worin gemäß der vorliegenden Erfindung die nicht-poröse hydrophobe Plattform angewandt wird, eine signifikante Überlegenheit bezüglich verbesserter Genauigkeit (niedrigerer CV) und der reproduzierbaren Bildung der Vergleich-Linie zeigt und ergibt. Format B bildet keine Vergleich-Linie, und Format C ergibt einen hohen Grad an Ungenauigkeit (hoher CV) für die Vergleich-Linie.

Claims

Teststreifen zur Bestimmung eines Analyt in einer fluiden Testprobe, welcher ein Basiselement aus einem nicht-porösen, hydrophoben Material umfasst, wobei das Basiselement auf seiner Oberfläche eine Unterlage aus absorbierendem Material aufweist, durch welches die fluide Testprobe und darin enthaltene Reagenzien zu fließen vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass das Basiselement eine hinreichende Oberflächenfläche, die nicht von der Unterlage aus dem absorbierenden Material bedeckt wird, zur Aufbringung der fluiden Testprobe direkt auf das Basiselement aufweist.
Teststreifen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Basiselement aus dem hydrophoben Material in direkter fluider Verbindung mit einem Reagensbereich aus einem absorbierenden Material steht.
Teststreifen gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Reagensbereich markierte spezifische Bindungspartner für den Analyt enthält, die frei sind, um durch den Reagensbereich mit der fluiden Testprobe zu fließen, und der Reagensbereich auch einen immobilisierten Binder mit der Befähigung zur Bindung des spezifischen Bindungspartners enthält.
Teststreifen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der markierte spezifische Bindungspartner ein Antikörper ist, der spezifisch für 1 Epitop des Analyt ist, und der immobilisierte Binder ein Antikörper ist, der spezifisch für ein anderes Epitop des Analyt ist.
Teststreifen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-poröse Basiselement Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen oder ein Material umfasst, dessen Oberfläche mit einem hydrophoben Material wie Polyfluorethylen oder einem Silanierungsmittel behandelt worden ist.
Teststreifen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Streifen eine Konjugat-Unterlage zwischen dem Basiselement und dem Reagensbereich aufweist, wobei die Konjugat-Unterlage einen oder mehrere markierte spezifische Bindungspartner enthält, von denen zumindest einer spezifisch für zumindest 1 Epitop des Analyt ist.
Teststreifen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Brücken-Unterlage vorliegt, welche eine Zone zur Vermischung der fluiden Testprobe und eines markierten spezifischen Bindungspartners bereitstellt, bevor sie den Reagensbereich des Streifens erreichen.
Teststreifen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Brücken-Unterlage aus Polyester oder Glasfaser zusammengesetzt ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Teststreifen einen getrennten Ablesebereich stromabwärts von der Brücken-Unterlage aufweist, wobei der Bereich mindestens 1 Zone aufweist, in welcher Immunoreaktanden für zumindest 1 Epitop des Analyts oder Analyt oder ein Bindungsanalogon davon immobilisiert sind.
Teststreifen gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Ablesebereich eine separate Zone aufweist, worin ein Immunoreaktand für den markierten spezifischen Bindungspartner in der Konjugat-Unterlage immobilisiert ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Ablesebereich aus Cellulose oder Polyethylensulfonat zusammengesetzt ist.
Teststreifen gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Streifen eine absorbierende Unterlage stromabwärts von und in Kontakt mit dem Ablesebereich aufweist, welche dazu dient, die fluide Testprobe durch den Streifen durch Kapillarwirkung zu ziehen.
Verwendung der Teststreifen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder der Konzentration eines Analyt in der fluiden Testprobe.
Verwendung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Testprobe Blut umfasst.