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DE60223041T2 - Diagnostiktestvorrichtung und verfahren - Google Patents

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DE60223041T2
DE60223041T2 DE60223041T DE60223041T DE60223041T2 DE 60223041 T2 DE60223041 T2 DE 60223041T2 DE 60223041 T DE60223041 T DE 60223041T DE 60223041 T DE60223041 T DE 60223041T DE 60223041 T2 DE60223041 T2 DE 60223041T2
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DE
Germany
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zone
contraption
reagent
reaction zone
buffer
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DE60223041T
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Hermes K.W. Halifax CHAN
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Medmira Inc
Original Assignee
Medmira Inc
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Publication date
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Publication of DE60223041T2 publication Critical patent/DE60223041T2/de
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Eine verbesserte Vorrichtung für die schnelle Diagnose, Assay und ein multifunktioneller Puffer werden für den Nachweis eines Zielanalyten in einer Fluidtestprobe bereitgestellt. Der Assay verwendet ein multifunktionelles Pufferreagenz und eine Durchflussvorrichtung, das aus einer Testeinheit mit einer abnehmbaren Nachfiltereinheit besteht. Ein Verfahren zum Einsatz der Durchflussvorrichtung, ein Test-Kit und eine Formulierung zur Erzeugung des multifunktionellen Puffers werden ebenfalls bereitgestellt.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Diagnostische Assays sind auf medizinischen und Forschungsgebieten zu einer unverzichtbaren Hilfe beim Nachweis einer Vielfalt von Komponenten in biologischen flüssigen Substanzen und Gewebeproben, wie z. B. Drogen, Hormone, Enzyme, Proteine, Antikörper und Krankheitserreger, geworden. Ein grundsätzliches Prinzip, das der Durchführung einer Anzahl dieser Assays zugrunde liegt, ist eine spezifische Erkennungs- und Bindungsreaktion, die zwischen zwei oder mehr Partnern erfolgt und einen Komplex bildet, der anschließend nachgewiesen werden kann. Gewöhnlich gehört zu den Partnern ein Fängerreagenz („Capture-Reagent") (zum Beispiel ein Rezeptor), der in einer flüssigen Testprobe (z. B. Vollblut, Blutplasma, Serum, Urin, Speichel usw.) einen spezifischen interessierenden Zielanalyten (z. B. einen Ligand) erkennt und sich daran bindet. Darüber hinaus ist ein optisch erkennbarer Indikator an der Reaktion beteiligt, der jeden Analyten erkennt und sich daran bindet, der mit dem Fängerreagenz einen Komplex gebildet hat und ein Signal erzeugt, das anzeigt, dass eine positive Reaktion stattgefunden hat. Insbesondere basiert die Funktionsweise immunologischer Assays vom Ansatz her auf der Erkennung von Antikörpern und der selektiven Bindung an Antigene, und dementsprechend haben sie sich im jahrelangen klinischen Einsatz als äußerst wertvoll bei der Aufdeckung zahlreicher infektiöser Krankheitszustände erwiesen.
  • Um allerdings genaue Ergebnisse zu erhalten, verlangen Immunoassays häufig die präzise Ausführung einer Reihe von zeitaufwändigen Arbeitsschritten ebenso, wie technische Kenntnisse zur Bedienung einer hoch entwickelten Laborgerätschaft. Dementsprechend ist ihre Anwendung bei der Diagnose von Infektionskrankheiten im Wesentlichen auf klinische Einrichtungen mit den erforderlichen Möglichkeiten zur Durchführung solcher Bestimmungen beschränkt, einschließlich einem gut ausgebildeten technischen Personal und einem mit den geeigneten Geräten ausgestatteten Labor.
  • Auf dieser Grundlage entwickelt sich die Immunodiagnostik, wie viele Technologien, zu einfacheren Ansätzen zur schnellen Identifizierung und Diagnose infektiöser Krankheitszustände hin. Der Bedarf nach einem vereinfachten qualitativen Assay zum Nachweis von Analyten in einer biologischen Probe wird um so dringender, weil er eine reizvolle Möglichkeit zu einer Anwendung in weniger konventionellen Umfeldern mit begrenzten Möglichkeiten, z. B. in einer Arztpraxis oder in einem Privathaushalt bietet. In einer Klinik des öffentlichen Gesundheitsdienstes, ebenso, wie in einem ländlichen Umfeld, ist es wünschenswert, dass ein Assay zum Nachweis eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe ohne die Hilfe komplizierter Instrumente durchgeführt werden kann, und ohne dass die Fertigkeiten und Kenntnisse eines fachlich ausgebildeten Personals erforderlich sind.
  • Ein anderer wichtiger Faktor, der bei der Suche nach verbesserten diagnostischen Prüfverfahren in Betracht gezogen werden muss, ist das Fehlen oder die begrenzte Verfügbarkeit von Gefrier- oder Kühleinrichtungen in Ländern der Dritten Welt. Auf dieser Grundlage ist es zunehmend wünschenswert geworden, Assay-Reagenzien zu entwickeln, deren Stabilität und Unversehrtheit bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum erhalten bleiben. Zur Zeit erfordern einige Diagnosevorrichtungen und -verfahren den Einsatz mehrerer Assay-Reagenzien, die in Abhängigkeit von der Temperatur, bei der sie aufbewahrt und gehandhabt werden, eine unterschiedliche Stabilität aufweisen. Einige dieser Reagenzien sind bei Raumtemperatur stabil und können über kurze Zeiträume gelagert werden, während andere relativ unstabil sind und schnell anfangen, sich zu zersetzen, wodurch die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Assays insgesamt ungünstig beeinflusst wird. Daher erfordern die meisten im Handel erhältlichen Diagnosevorrichtungen, dass mindestens eines oder mehrere der benötigten Reagenzien bei niedrigen Temperaturen aufbewahrt werden, um ihre Stabilität zu gewährleisten. Dementsprechend würde eine Diagnosevorrichtung, die Reagenzien einbezieht, welche bei Umgebungstemperaturen gelagert werden können und über einen längeren Zeitraum stabil bleiben, wobei sie ihre ursprüngliche Aktivität vollständig oder größten Teils bewahren, einen deutlichen Vorteil aufweisen gegenüber solchen Vorrichtungen, wie sie derzeit Stand der Technik sind. Auf dieser Grundlage ist ein Faktor, den für die Vereinfachung diagnostischer Tests, die dadurch praktikabler und in breitem Rahmen durchführbar werden, in Betracht zu ziehen sich lohnt, die Reduzierung der Anzahl der Assay-Reagenzien und der zugehörigen Arbeitsschritte im Assayprotokoll (z. B. das Mischen, Waschen, oder Verdünnung von Lösungsmitteln usw.) auf ein Minimum.
  • Ein immunodiagnostischer Assay, der einfach anzuwenden, schnell und zuverlässig ist, wäre außerdem von Vorteil bei der Verbesserung von Screening- und diagnostischen Dienstleistungen. Laut dem Bericht des U. S. Center for Disease Control and Prevention, versetzen schnelle diagnostische Test die Healthcare-Anbieter in die Lage, innerhalb von Minuten nach einer Testdurchführung den Patienten das Testergebnis zu präsentieren, wodurch die Möglichkeit besteht, die Wirksamkeit von Beratungen und Testprogrammen im Ganzen zu erhöhen. Es ist ebenfalls zu erwarten, dass vereinfachte Diagnosevorrichtungen und Assays kostengünstiger herzustellen bzw. durchzuführen sind, als andere konventionelle Vorrichtungen, wodurch sie wirtschaftlich praktikabler und als vorläufige Anwendung eher bezahlbar werden. Dies ist in besonderem Maße wünschenswert in Ländern der Dritten Welt, wo eine einfache, empfindliche und wirtschaftliche Diagnosevorrichtung und ein entsprechender Assay ideal wären.
  • Zu diesem Zweck wurden zahlreiche analytische Vorrichtungen in einem breiten Sortiment von Formen, Konfigurationen und Formaten entwickelt, um das Vorhandensein eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe nachzuweisen, einschließlich chromatographischer Teststreifen, Messstäbchen, Lateral-Flow- und Durchfluss-Systemen, um einige wenige zu nennen. In vielen dieser Vorrichtungen kommen Reaktionsmembranen zum Einsatz, auf denen ein Fängerreagenz, das in der Lage ist, den Zielanalyten zu erkennen und zu binden, fixiert wird. Im Wesentlichen besteht das Verfahren zur Durchführung des Assays typischer Weise darin, eine flüssige Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Zielanalyten enthält, direkt oder indirekt durch Filtrierung, auf die Reaktionsmembran zu applizieren. Wenn der Zielanalyt in der Probe vorhanden ist, wird er an das Fängerreagenz gebunden. Im Anschluss kommen dann Methoden zum Einsatz, mit denen bestimmt wird, ob der Zielanalyt von Fängerreagenz gebunden wurde, wodurch sein Vorhandensein in der Probe angezeigt wird.
  • In dem U.S. Patent No. 4,517,288 (Giegel et al.) werden Methoden zur Durchführung von Liganden bindenden Assays offengelegt, bei denen inerte porenhaltige Materialien zum Einsatz kommen. Insbesondere wird in dem Patent die Fixierung einer immunologischen bindenden Substanz (z. B. ein Antikörper), die für den interessierenden Liganden (z. B. ein Antigen) spezifisch ist, innerhalb einer begrenzten Zone des porenhaltigen Materials dargelegt, sowie die Auftragung des Liganden in der Testzone, wo er von dem fixierten bindenden Material festgehalten wird. Die Fixierung der bindenden Substanz auf dem porenhaltigen Material kann durch jede beliebige konventionelle Methode einschließlich Adsorption, kovalente Bindung, Verwendung eines Coupling-Agent usw. erreicht werden. Ein mit einem Enzym markiertes Indikatorreagenz, das ebenfalls den Liganden erkennt und mit ihm eine Bindung eingeht, wird dann in der Testzone appliziert, wo es in einer Menge immobilisiert wird, die direkt proportional ist zu der des Liganden in der Zone. Ein Lösungsmittel wird dann in der Mitte der Testzone aufgetragen, um jegliches ungebundene Indikatorreagenz zu entfernen, wodurch die Bestimmung eines Signals mit oder ohne die Hilfe von geeigneten analytischen Instrumenten ermöglicht wird.
  • Eine ausgefeiltere Version eines spezifischen Bindungsassays wird in den U.S. Patenten Nr. 4,094,647 , 4,235,601 und 4,361,537 (Deutsch et. al) beschrieben, die einen chromatographischen Teststreifen einbezieht, auf der eine Entwicklerflüssigkeit durch Kapillarkräfte transportiert wird. Der Teststreifen ist so gestaltet, dass er eine erste Zone aufweist, um eine Probe aufzunehmen, eine zweite Zone, die mit einem ersten Reagenz imprägniert wird, das von der Entwicklungsflüssigkeit transportiert werden kann und eine dritte Zone, die mit einem dritten Reagenz imprägniert ist. Zusätzlich umfasst die Vorrichtung eine Messzone und ein Verzögerungselement, das entweder das zweite Reagenz sein kann oder das Material des Streifens. Das erste Reagenz ist in der Lage, mit einer der Varianten aus einer Gruppe zu reagieren, die aus (1) der Probe, (2) der Probe und dem zweiten Reagenz oder (3) dem zweiten Reagenz in Konkurrenz mit der Probe besteht, um ein Produkt in einer Menge zu bilden, die von den Eigenschaften abhängt, die bestimmt werden sollen. Eine Probe wird mit der ersten Zone in Kontakt gebracht, dann wird der Streifen in die Entwicklerflüssigkeit getaucht, um den Transport der Probe und des ersten Reagenzes zur Bildung des Reaktionsproduktes herbeizuführen. Das Verzögerungselement verlangsamt den Transport entweder des Produktes oder des ersten Reagenzes (des sich bewegenden Reagenzes), um beide räumlich zu trennen, und die Menge der bewegten Elemente wird dann an der Messstelle bestimmt.
  • Eine Abwandlung der Vorrichtung von Deutsch et al. zur Analyse von Antigenen, Antikörpern oder Polynukleotiden, die ebenfalls ein längliches chromatographisches Material (d. h. einen Teststreifen), einen Lösungsträger und mobile Reagenzien verwendet, wird im U.S Patent No. 4,960,691 (Gordon et al.) beschrieben. Im Wesentlichen weist der Streifen getrennte Zonen auf, nämlich eine erste Zone, die mit einem mobilen Reagenz imprägniert ist, das mit dem interessierenden Analyten reagieren kann, eine zweite Zone, um eine Testprobe aufzunehmen, in der der Analyt vermutet wird und eine dritte Zone, die mit einem fixierten Reagenz imprägniert ist, das den Analyten selektiv bindet und dadurch den Analyten in eine immobilisierte Form überführt. Alle Zonen sind hintereinander in gleichem Abstand von den jeweiligen Nachbarn entlang der Längsachse des Teststreifens angeordnet. Die Vorrichtung weist wahlweise eine vierte und fünfte Zone auf, die mit Indikatorreagenzien imprägniert sind, welche ein Mittel zum Nachweis des Analyten bereitstellen. Die Methode beinhaltet die Einbringung der Testprobe in die zweite Zone, gefolgt von der Zugabe eines Lösungsmittels an dem Ende des Streifens, wo sich die erste Zone befindet, so dass der Analyt und das erste Reagenz sich der Reihe nach fortbewegen und schließlich in der dritten Zone angelangen. Die zweite und die dritte Zone sind im Verhältnis zueinander so angeordnet, dass der Analyt in der dritten Zone immobilisiert und von dem Lösungsmittel nicht mehr transportiert wird, bevor das erste Reagenz die dritte Zone erreicht. Alle störenden Komponenten der Probe, die nicht zu dem Analyten gehören, aber mit dem ersten Reagenz reagieren können, werden durch das Lösungsmittel aus der dritten Zone forttransportiert, bevor das erste Reagenz in der dritten Zone ankommt. Mehrwege- und Einweg-Vorrichtungen zur Ausführung einer Vielfalt von Mehrschritt-Assay-Verfahren werden ebenfalls dargelegt.
  • Im U.S. Patent No. 4,168,146 (Grubb et al.) wird die Verwendung von Teststreifen zur Durchführung von Sandwich-Immunoassays dargestellt. Die Streifen werden aus saugstarken Trägermaterialien gebildet, an die die Antikörper durch Adsorption, Absorption oder Kovalenzbindung gebunden wurden. Zu den bevorzugten Teststreifen-Materialien gehören Zellulosefasern enthaltende Materialien, wie Filterpapier, Ionenaustauscherpapier und Chromatographie-Papier. Ebenfalls dargestellt wird die Verwendung von Materialien, wie Dünnschichtchromatographie-Scheiben aus Zellulose, Zelluloseacetat-Scheiben, Stärke und dreidimensionalen, vernetzten Materialien, wie Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden). Der Immunoassay wird durchgeführt durch Befeuchten des Teststreifens mit einer abgemessenen Menge einer Testprobe, in der das Antigen vermutet wird. Jedes in der Testprobe vorhandene Antigen migriert durch Kapillarität den Teststreifen entlang. Wie weit das Antigen innerhalb eines bestimmten Zeitraums migriert, wird jedoch von der Konzentration des Antigens in der Testprobe bestimmt, weil die gebundenen Antikörper die Migration des Antigens, für das sie spezifisch sind, verzögern. Anschließend werden die Bereiche der Diagnosevorrichtung, in denen Antigene vorhanden sind, durch die Zugabe von markierten Antikörpern angezeigt.
  • Ein immunodiagnostisches Durchfluss-System, das eine Reihe von Verfahrensschritten umfasst, wird im U.S. Patent No. 4,632,901 (Valkirs et al.) offen gelegt. Zum ersten Schritt gehört eine flüssige Testprobe, in der der erste Partner eines spezifischen Bindungspaares (z. B. ein Antigen) vermutet wird, und die auf ein porenhaltiges Material gegossen wird, auf dem der zweite Partner des spezifischen Bindungspaares (z. B. ein Antikörper) fixiert ist. Unter Einfluss der kapillaren Eigenschaften eines absorbierenden Materials wird die flüssige Testprobe durch das porenhaltige Material senkrecht nach unten und an dem fixierten Antikörper (zur Verwendung der Einzahlform, siehe Paragraph 42, Anm. d. Übers.) vorbeigezogen. Jedes in der Probe vorhandenes Antigen wird daraufhin von dem fixierten Antikörper eingefangen. Der zweite Schritt besteht darin, eine getrennte Lösung mit markierten Antikörpern durch das porenhaltige Material zu leiten, so dass die markierten Antikörper sich an die Antigene, die schon von den fixierten Antikörpern eingefangen wurden, binden und einen dreigliedrigen Komplex bilden können. Jeder Antikörper, der nicht reagiert hat oder nicht gebunden wurde, wird dann in einem dritten Schritt, der üblich als Waschschritt bezeichnet wird, aus dem porenhaltigen Material ausgespült, wobei ein geeignetes Reagenz verwendet wird, worauf dann eine Inkubationsperiode folgen kann. Zu einem vierten Schritt gehört schließlich eine getrennte Lösung, in der ein Substrat enthalten ist, das mit der Markierung auf dem Antikörper der zweiten Lösung reagieren kann, und die zugegeben wird, um einen sichtbaren Farbumschlag herbeizuführen und dadurch das Vorhandensein des interessierenden Antigens anzuzeigen. Um die genaue Ausführung dieses Verfahrens zu erleichtern, ist die Vorrichtung so gestaltet, dass sie die Probe in das absorbierende Material einleitet, welches die Probe durch Kapillarkräfte durch das Material und auf den Boden des Apparates zieht.
  • Ein immunodiagnostisches Durchfluss-System, das von Liotta im U.S. Patent No. 4,446,232 beschrieben wird, verwendet eine Kombination aus zwei verschiedenen Reaktionszonen, die in drei getrennten Schichten angeordnet sind. Die erste Reaktionszone besteht aus zwei aus einem porenhaltigen Material hergestellten Schichten, wobei die erste Schicht mit einem löslichen, an ein Enzym gebundenen Antikörper und die zweite mit einem fixierten Antigen imprägniert wurden. Die dritte Schicht, bzw. zweite Reaktionszone enthält ein fixiertes Indikatorreagenz, das mit dem Enzym, das an den Antikörper der ersten Reaktionszone geknüpft ist, reagiert und eine Farbreaktion hervorruft. Wenn eine flüssige Probe das interessierende Antigen enthält, geht dieses Antigen, nachdem die Probe auf die erste Reaktionszone aufgetragen wurde, in eine Bindung mit dem löslichen, an ein Enzym gebundenen Antikörper ein und diffundiert nach einer kurzen Inkubationszeit in die zweite Reaktionszone. Das Vorhandensein eines Antigens wird nachgewiesen, wenn das Enzym mit dem Indikatorreagenz reagiert und einen Farbumschlag hervorruft. Wenn hingegen eine flüssige Probe keinerlei Antigen enthält, migrieren die an ein Enzym gebundenen Antikörper zur zweiten Schicht der ersten Reaktionszone, unterstützt durch die Diffusion der flüssigen Testprobe, wo sie an die fixierten Antigene gebunden werden. Durch das Eingehen in eine Bindung wird verhindert, dass jegliche an ein Enzym gebundenen Antikörper die zweite Reaktionszone erreichen, wo sie mit dem Indikatorreagenz reagieren würden. Daher wird in diesem speziellen Szenario keine Farbreaktion beobachtet, was das Fehlen von Antigen in der flüssigen Testprobe anzeigt.
  • Während die oben beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen handliche und durchaus verlässliche Mittel zur Durchführung immunodiagnostischer Assays bereitstellen können, bleiben mehrere Probleme bezüglich ihrer Anwendung bestehen. Einer der Nachteile, der bei der Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Zielanalyten bei der Mehrheit der Fälle in besonderem Maße auftritt, ist die Notwendigkeit, mehrere Zugabe- und Waschschritte durchzuführen, die eine breite Palette von Lösungsmitteln. verwenden. Die Waschschritte sind bei verschiedenen Stufen des Assayprotokolls unabdingbar, um unerwünschte Kreuzreaktionen zu verhindern und um jegliche überschüssigen, ungebundenen Reagenzien und Substanzen zu entfernen, die in der Folge das Ergebnis stören könnten. Daher hat die Notwendigkeit, mehrere Zugabe-, Wasch- und Inkubationsschritte beizubehalten, diese Prozeduren weitgehend auf klinische Einrichtungen beschränkt, wo ausgebildetes Personal und hoch entwickelte Geräte zur Verfügung stehen, um den Assay mit höchster Präzision zu verfolgen und durchzuführen.
  • Darüber hinaus leiden immunodiagnostische Assays, die chromatographische Teststreifen oder -stäbchen verwenden, an einem Problem, das die aufeinander folgende Behandlung mit einem oder mehreren Lösungsmitteln während verschiedener Schritte der Assay-Prozedur betrifft. Da jede Lösung der Vorrichtung zugegeben wird, bzw. jede Vorrichtung nacheinander in Lösungen getaucht wird, ist die Möglichkeit, dass etwas verschüttet wird oder der Anwender mit der Lösung in Kontakt gerät, erhöht, was zu einer möglichen Verschmutzung und einer verringerten Verlässlichkeit des Tests führt.
  • In Abhängigkeit von dem Assay und der verwendeten Vorrichtung, ist es für gewöhnlich erforderlich, dass die Testprobe vor der Anwendung mit einem geeigneten Reagenz verdünnt wird, so dass sie leichter durch das porenhaltige Material diffundiert und/oder nicht die Konzentration des markierten Reagenzes überdeckt. Allerdings verringert eine Verdünnung der Testprobe nicht nur die Geschwindigkeit und Einfachheit der Durchführung eines Assays, da ein zusätzlicher Schritt und ein zusätzliches Reagenz eingeführt werden, sondern es kann auch aufgrund des Zusammenhangs zwischen Analytkonzentration und dem erzeugten Nachweissignal die Empfindlichkeit eines Assays herabsetzen.
  • US 5,879,951 , US 5,877,028 , WO 01/55723 und EP 0 806 666 beschreiben Lateral-Flow-Vorrichtungen.
  • In Abhängigkeit von der relativen Mobilität des interessierenden Analyten, der Art der verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel und der Anordnung der verschiedenen Reaktionszonen, ist eine angemessene Zeit unabdingbar, um eine effiziente Migration all der verschiedenen Komponenten entlang der chromatographisch stationären Phase zu ermöglichen. Wegen der Tendenz mobiler Reagenzien, sich am Rand der Reaktionszone anzusammeln anstatt ihn freizuräumen, trägt die Lateral-Flow-Methode außerdem häufig zu einem vermehrten Auftreten ungenauer Ergebnisse bei. Als Folge reagieren diese Reagenzien häufig in der Zone und erzeugen Farbprodukte, die leicht mit einem echten positiven oder negativen Ergebnis verwechselt werden.
  • Verschiedene Puffer und Zusätze sind für solche immunodiagnostischen Assays bekannt, einschließlich der Pufferzusammensetzungen und Zusätze die in US 5,185,264 , US 4,087,567 und US 5,879,951 offen gelegt werden.
  • Demgemäß bietet die vorliegende Erfindung eine verbesserte schnelle Diagnosevorrichtung, einen Assay und einen multifunktionellen Puffer für den Nachweis eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe an, der effizient, verlässlich und leicht durchzuführen ist. Der vereinfachte zweischrittige Assay verwendet ein multifunktionelles Pufferreagenz und eine Zweikomponenten-Durchflussvorrichtung, die aus einer Testeinheit zusammen mit einer abnehmbaren Nachfiltereinheit besteht, welche jeweils die flüssige Testprobe bzw. den multifunktionellen Puffer aufnehmen können.
  • Der multifunktionelle Puffer dient als kombiniertes Wasch-, Verdünnungs-, Befeuchtungs- und Lösungsreagenz, ohne dass an der Empfindlichkeit oder Spezifität des diagnostischen Assays Abstriche gemacht werden. Zusätzlich setzt sich der Puffer formelmäßig so zusammen, dass die Proteinstabilität erhalten bleibt und optimiert wird und ebenso nichtspezifische Wechselwirkungen, die zu der Erzeugung eines falschen Signals führen könnten, minimiert, wenn nicht ausgeschlossen werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile, die mit den existierenden schnellen diagnostischen Assays verbunden sind, durch die Bereitstellung einer verbesserten Vorrichtung, Methode und eines multifunktionellen Pufferreagenz zu überwinden.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch einen abwärts gerichteten oder vertikalen Fluss durch die Testvorrichtung entsprechend Anspruch 1, eine Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Zielanalyten entsprechend Anspruch 51, eine Methode zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielananalyten gemäß Anspruch 53 und ein Test-Kit entsprechend Anspruch 55. Bevorzugte Ausführungsformen werden in den entsprechenden Unteransprüchen offen gelegt.
  • Durch Verwendung der vereinfachten Vorrichtung und des einzelnen Pufferreagenzes der vorliegenden Erfindung liegt ein qualitativer und halbquantitativer Assay vor, der (1) leicht ausgeführt und ausgewertet werden kann, (2) eine minimale Zahl an Arbeitsschritten erfordert, (3) keine längeren Inkubationszeiten erfordert und (4) hoch sensibel, spezifisch und zuverlässig ist. Typisch wird nicht mehr als ein einziger Tropfen (50 μl) einer flüssigen Testprobe benötigt, um den Assay durchzuführen. Außerdem bieten Vorrichtung und Assay der vorliegenden Erfindung einen besonderen Vorteil dadurch, dass sie nicht nur bequem und einfach zu verwenden sind, sondern Vorrichtung und Reagenzien können bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum gelagert werden, ohne dass die Aktivität oder Sensibilität des Assays vermindert wird.
  • Die Kombination der Merkmale, die mit der vorliegenden Erfindung verbunden werden, betrifft die Ausführung einer Durchfluss-Technik bei der Durchführung von diagnostischen Assays, die auf spezifischen Bindungsreaktionen zwischen zwei oder mehr komplementären Partnern beruhen. Auf dieser Grundlage finden die schnelle Diagnosevorrichtung, der Assay und der multifunktionelle Puffer der vorliegenden Erfindung ein breites Anwendungsfeld in einer Vielfalt von spezifischen Bindungspaar-Assay-Verfahren, die im Wesentlichen ein Fängerreagenz einsetzen, das einen interessierenden Zielanalyten erkennt und bindet. Die Vorrichtung dieser Erfindung kann zum Beispiel bei einem immunodiagnostischen Assay verwendet werden, um in einer flüssigen Testprobe entweder Antigene oder Antikörper nachzuweisen und kann für die Verwendung in ein Sandwich oder in ein kompetitives Nachweisverfahren angepasst werden.
  • Die Reaktion zwischen dem Zielanalyten und dem Indikatorreagenz läuft von der Kinetik her extrem schnell und vollständig ab, weil der Vorrichtung und der Prozedur des Assays ein Durchfluss-Format zugrunde liegt. Überdies verbessert das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Genauigkeit des Assays im Vergleich zu konventionellen Assays, da der letzte Schritt des Assays die Zugabe eines wieder gelösten Indikatorreagenz zu dem Zielanalyten einbezieht, nachdem der Analyt bereits einen Komplex mit dem Fängerreagenz gebildet hat. Die meisten konventionellen Assays erfordern jedoch eine vorab Mischung des Indikatorreagenz mit einer flüssigen Testprobe vor der Zugabe zu dem Fängerreagenz. Das führt dazu, dass die Empfindlichkeit des Assays insgesamt reduziert wird, weil das Indikatorreagenz während der Anfangsphase des Assayprotokolls wahrscheinlich mit Verschmutzungen in der Testprobe in Berührung kommt und nicht nur mit dem interessierenden Analyten.
  • Die verbesserte Diagnosevorrichtung wird vorteilhaft in Verbindung mit einem multifunktionellen Pufferreagenz eingesetzt, um einen Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe auf Grundlage des Prinzips einer spezifischen Bindungsreaktion zwischen zwei oder mehr komplementären Partnern nachzuweisen. Zu der Vorrichtung der Erfindung gehört als erste Komponente eine Testeinheit, die eine flüssige Testprobe aufnehmen kann, zusammen mit einer zweiten Komponente, nämlich einer Nachfiltereinheit, die den multifunktionellen Puffer aufnehmen kann. Die Testeinheit besteht aus (1) einer Reaktionszone, die das fixierte Fängerreagenz enthält, welches den Zielanalyten spezifisch erkennen und binden kann, (2) einer Absorptionszone, auf der die Reaktionszone aufliegt und, optional, (3) einer Bluttrennungszone in lateralem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone. Die Nachfiltereinheit besteht aus einer Markierungszone, die von einem (ein)getrockneten Indikatorreagenz durchdrungen ist, das durch Zugabe des multifunktionellen Puffers resolubilisiert wird. Die Reaktionszone der Testeinheit ist so ausgerichtet, dass ein Flüssigkeitsaustausch mit der Markierungszone der Nachfiltereinheit stattfinden kann, nachdem die flüssige Testprobe auf die Testeinheit aufgetragen wurde.
  • Bei einem immunodiagnostischen Assay, zum Beispiel, bei dem der interessierende Analyt ein Antigen ist, wird ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper oder ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper für das Antigen, als Fängerreagenz an die Reaktionszone gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Reaktionszone aus einer porenhaltigen Membran, die geeignet für die Fixierung des Fängerreagenzes ist und eine geringe nichtspezifische Bindungsfähigkeit für das Indikatorreagenz aufweist. Jegliche nichtspezifische Bindungsstellen auf der Oberfläche der porenhaltigen Reaktionsmembran werden durch Anwendung eines Proteinblockers inaktiviert. Die Spezifität und Affinität des fixierten Fängerreagenz ist solcher Art, dass es jeglichen in der flüssigen Testprobe enthaltenen Analyten innerhalb einer bestimmten Region effizient bindet und aufkonzentriert, während die Probe durch Kapillarkräfte von der Reaktionsmembran zu der sich direkt darunter befindlichen Absorptionszone diffundiert.
  • Die Empfindlichkeit von Immunoassays des Reaktionsmembran-Typs (d. h. die Fähigkeit, sehr geringe Mengen des Zielanalyten nachweisen zu können), kann erhöht werden, wenn die Probe durch die Reaktionsmembran aufkonzentriert wird. Daher wird eine Hufkonzentration des Analyten auf der Reaktionsmembran durch Verwendung eines absorbierenden Materials erreicht, das die absorbierende Zone definiert, die direkt unterhalb der Reaktionsmembran angeordnet ist, welche die flüssige Testprobe aufnimmt, wodurch lediglich der eingefangene Analyt auf der Oberseite der Reaktionsmembran zurückbleibt. Da das absorbierende Material mit der Reaktionsmembran Flüssigkeit austauscht, werden solche Materialien ausgewählt, die aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften (z. B. Porengröße, Saugkraft usw.) den Flüssigkeitsfluss durch die Reaktionsmembran effektiv anregen, Assayprobe und Reagenzflüssigkeit genügend festhalten und der Membran als Auflage dienen.
  • Um den Nachweis eines Zielanalyten in einer Vollblutprobe zu erleichtern, bietet eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Testeinheit, die in der Lage ist, den flüssigen Anteil einer Vollblutprobe aufzunehmen und von den roten Blutkörperchen zu trennen, während die von roten Blutkörperchen freie flüssige Fraktion der Probe zu der Reaktionszone transportiert wird, um den Analyten nachzuweisen. Diese besondere Eigenheit ist nützlich, um irgendwelche Störungen bei der Sichtbarmachung einer Farbreaktion zum Nachweis des Analyten (z. B. die Verwendung von „direkten" Markern, die ein optisch erkennbares Signal direkt und ohne Hilfsinstrumente liefern) zu verhindern, und sie umgeht außerdem die Notwendigkeit einer vorausgehenden Extraktion von Serum oder Plasma in Aufstellungen, wo eine geeignete Gerätschaft zur Durchführung solcher Prozeduren nicht verfügbar ist.
  • Daher weist in dem Fall, dass die zu untersuchende flüssige Testprobe eine Vollblutprobe ist, die Testeinheit optional eine gesonderte Bluttrennungszone beim lateralen Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone auf. Die Funktion der Bluttrennungszone besteht allgemein darin, die in der Vollblutprobe enthaltenen zellulären Komponenten (d. h. rote Blutkörperchen – RBK) selektiv zurückzuhalten und die übrigen Komponenten der Blutprobe, einschließlich jedweden Analyten, an die Reaktionszone weiterzugeben. Das vordere Ende der Bluttrennungszone, das sich in kurzem lateralem Abstand von der Reaktionszone befindet, definiert eine Region zur Aufnahme der Vollblutprobe, bevor der Analyt in die Reaktionszone eingeführt wird. Das hintere Ende der Bluttrennungszone schließt an die Reaktionszone an und steht damit in direktem Flüssigkeitsaustausch mit ihr, wodurch die kapillare Bewegung der RBK-freien Fraktion der Blutprobe vom vorderen Ende zur Reaktionszone zur direkten Analyse des Zielanalyten unterstützt wird. Daher funktioniert das Bluttrennungsmaterial effektiv als Lateral-Flow-Material für die selektive Entfernung einer wirksamen Menge an roten Blutkörperchen, um eine Störung des optischen Nachweises des Analyten zu verhindern, während anderen Komponenten der Probe ermöglicht wird, relativ ungehindert durch die Testeinheit zu fließen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bluttrennungszone ein langgestreckter oder rechteckiger Streifen eines porenhaltigen Materials, für das eine hydrophobe Halterung oder Stütze verwendet wird, und das charakteristische Eigenschaften hat, die es ihm ermöglichen, innerhalb der Bluttrennungszone bevorzugt die roten Blutkörperchen in der Probe einzufangen oder zurückzuhalten. Die Halterung oder Stütze bietet dem Bluttrennungsmaterial Halt und verringert das Aussickern der Vollblutprobe, während der von roten Blutkörperchen freie flüssige Anteil das Material entlang zu der Reaktionszone migriert.
  • Die zweite Komponente der Vorrichtung, nämlich die Nachfiltereinheit, besteht aus einer Markierungszone, die von einem eingetrockneten Indikatorreagenz durchdrungen ist. Die Markierungszone der Nachfiltereinheit ist in der Lage zu einem kurzfristigen Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone der Testeinheit versetzt zu werden, kurz nachdem die flüssige Testprobe auf die Testeinheit appliziert wurde.
  • Durch die Imprägnierung der Markierungszone der Nachfiltereinheit mit einem dauerhaft nachweisbaren Indikatorreagenz erübrigt sich die Notwendigkeit, getrennte Resolubilisierungsschritte durchzuführen, zu denen genaue Abmessung, Zugabe und Vormischung mit einem geeigneten Lösungsmittel gehören, was die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Anwenderfehlern erhöht. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Markierungszone aus einem Filtermedium, das anhand der Porengröße ausgewählt wird, die groß genug sein muss, dass das getrocknete Indikatorreagenz, nachdem es durch Zugabe des multifunktionellen Puffers resolubilisiert wurde, leicht durch einen exponierten Bereich des porenhaltigen Filtermaterials diffundieren kann. Die Form und die Abmessungen der Nachfiltereinheit sind solcher Art, dass sie den multifunktionellen Puffer hält und effektiv durch das porenhaltige Filtermedium leitet, wenn die Markierungszone im Verlauf des Assays in einen Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone der Testeinheit gebracht wird.
  • Gemäß einem anderen wichtigen Aspekt der Erfindung, werden Verfahren und Vorrichtungen unter Verwendung von „direkt" markierten spezifischen Bindematerialien (d. h. mit kolloidalen Partikeln markierte Materialien) bereitgestellt, die an einem Filtermedium angetrocknet werden und daher in der Lage sind, in Gegenwart des multifunktionellen Puffers schnell resolubilisiert und zu der Reaktionszone transportiert zu werden. Direkte Marker sind in der Fachwelt wohl bekannt und äußerst vorteilhaft bei der Verwendung in schnellen Diagnosesystemen. Direkte Marker sind in der Lage, ohne Zuhilfenahme von Gerätschaften oder den Zusatz von ergänzenden Reagenzien ein optisch erkennbares Signal zu erzeugen, und sie sind stabil, wenn sie in trockenem Zustand gelagert werden. Durch die Bereitstellung des Indikatorreagenzes in dem es in getrockneter Form in das Filtermedium integriert wird, lässt sich ein solches Reagenz auf kostengünstige und bequeme Weise lagern. Bevorzugte Marker zur Durchführung von diagnostischen Assays sind kolloidale Metallpartikel, insbesondere kolloidales Gold, obwohl auch andere Marker eingesetzt werden können, zu denen, ohne weitere auszuschließen, nicht-metallische Kolloidlösungen, Farbstoff-Kolloidlösungen, Latexpartikel, Kohlenstoff-Kolloidlösungen und in Liposome eingeschlossene Farbkörper gehören.
  • Gemäß einem weiteren wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine wässrige Mischung bereitgestellt, die zur Verwendung als multifunktionales Reagenz in einem diagnostischen Assay geeignet ist und sich wie folgt zusammensetzt: (1) Ein biologischer Puffer, um den pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 10,0 zu halten; (2) wenigstens ein oberflächenaktives Mittel, um die nicht-spezifische Bindung von Assay-Reagenzien zu reduzieren und zugleich die Blockierung einer spezifischen Bindungswechselwirkung zu vermeiden; (3) ein Polymer mit hohem Molekulargewicht als Dispersions- und Suspensionsmittel, der ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 × 102 bis etwa 2 × 106 Da hat; (4) ein pH-Stabilisator, um den pH des multifunktionalen Puffers zwischen pH 7,0 und 10,0 zu halten; (5) ein ionisches Salz, um die nicht-spezifische Bindung von Antikörpern zu reduzieren; (6) mindestens ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Bakterien und Mikroben zu reduzieren und (7) ein Kalziumchelator, um das Verklumpen einer Vollblut-Testprobe zu verhindern, wobei biologischer Puffer, oberflächenaktives Mittel, Polymer mit hohem Molekulargewicht, ph-Stabilisator, ionisches Salz, Konservierungsmittel und Kalziumchelator alle in wirksamen Konzentrationen vorliegen.
  • Die verbesserte Pufferformel verlangt keine ergänzenden Zutaten oder eine Wartung und Inspektion mit Laborgeräten. Wichtiger noch ist allerdings die multifunktionelle Beschaffenheit des Pufferreagenzes, wodurch es als eine Kombination aus Waschlösung, Verdünner, Resolubilisierungs- und Lösungsmitteltransportreagenz dienen kann und sich die Notwendigkeit von mehreren getrennten Lösungen und Schritten, die im Verlauf des Assayprotokolls auszuführen sind, erübrigt. Die Entwicklung eines einzelnen multifunktionellen Puffers vereinfacht in hohem Maße den Ablauf des Assays, indem die Zeit und die manuellen Schritte, die zur Durchführung des Assays erforderlich sind, reduziert werden, wobei die Wahrscheinlichkeit von Anwenderfehler minimiert wird. Außerdem fördert die Verwendung des multifunktionellen Puffers in einem Durchfluss-Format die schnelle Freigabe und eine mengenmäßig verstärkte Übertragung des getrockneten Indikatorreagenzes von der Nachfiltereinheit zu der Testeinheit unmittelbar im Anschluss an die Resolubilisierung. Andere funktionelle Eigenschaften, die der multifunktionelle Puffer aufweist, sind die Aufrechterhaltung der Proteinstabilität, wodurch die spezifische Bindungsreaktion, die zwischen komplementären Bindungspartnern, also Fängerreagenz und Zielanalyt, stattfindet, erhalten bleibt und optimiert wird. Überdies ist nach der Wiederauflösung des getrockneten Indikatorreagenzes der Puffer bei spezifischen Bindungsreaktionen hilfreich bei der Maximierung der Signalerzeugung und bei der Minimierung von nicht-spezifischen Anbindungen an die Reaktionsmembran, was andernfalls zur Erzeugung eines falschen Signals führen könnte.
  • Gemäß einem abermals weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein einfaches 2-Schritt Verfahren zur Durchführung eines diagnostischen Assays bereitgestellt, bestehend aus (1) Einbringung einer flüssigen Testprobe in die Reaktionszone der Testeinheit oder, im Falle einer Vollblutprobe, in das vordere Ende einer Bluttrennungszone, und gleich darauf Herbeiführung einer funktionsfähigen Zueinanderordnung der Testeinheit und der Nachfiltereinheit in einer Weise, dass zwischen der Markierungszone der Nachfiltereinheit und der Reaktionszone der Testeinheit ein vorübergehender Flüssigkeitsaustausch besteht und (2) Zugabe des multifunktionellen Puffers zu der Nachfiltereinheit gefolgt von der Entfernung der Nachfiltereinheit, um das Testergebnis zu beobachten. Im Anschluss an die Zugabe des multifunktionellen Puffers zu der Nachfiltereinheit, diffundiert das Pufferreagenz durch die Markierungszone, um das Indikatorreagenz wiederherzustellen und es in die Reaktionszone zu transportieren, wo es sich mit jeglichem eingefangenen Analyten verbindet. Wenn ein Analyt in der flüssigen Testprobe vorhanden ist, erscheint ein erkennbares Signal in der Reaktionszone, das optisch auf Farben überprüft werden kann, und so kann eine Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens eines Analyten im Anschluss an die Entfernung der Nachfiltereinheit durchgeführt werden. Ein wichtiger, von der vorliegenden Erfindung gebotener Vorteil, besteht darin, dass die Bindungsaffinität des Fängerreagenzes es möglich macht, den Analyten zu fixieren und ihn dem Durchfluss des wieder aktivierten Indikatorreagenzes in optimaler Weise auszusetzen, so dass es sich in der Reaktionszone ansammelt und so wirksam von dem Hintergrundstrom von nicht konzentriertem Indikatorreagenz getrennt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein diagnostisches Test-Kit zum Gebrauch für den Nachweis eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe bereit, in welcher der Analyt vermutet wird. Im Wesentlichen ist das Kit ein Paket in folgender Zusammensetzung: (1) Die Vorrichtung für einen schnellen diagnostischen Assay, zu der sowohl die Testeinheit als auch die Nachfiltereinheit, wie oben beschrieben, gehören; (2) ein multifunktionelles Pufferreagenz für die Wiederherstellung des getrockneten Indikatorreagenz; (3) Anleitungen zur Durchführung des diagnostischen Assays Vorzugweise gehört zu den Test-Kit ein geeigneter Behälter, um die Testeinheit und die Nachfiltereinheit aufzubewahren und die festen Materialien und das getrocknete Indikatorreagenz sicher vor Verschmutzung zu schützen, wie auch eine einfache und bequeme Handhabung der Assay-Vorrichtung zu bieten. Optional gehört zu dem Test-Kit auch ein Mittel, um die Testprobe und den multifunktionellen Puffer auf die Testeinheit bzw. die Nachfiltereinheit aufzutragen (z. B. Einweg-Pipetten).
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A ist ein Diagramm zur Veranschaulichung einer ersten Ausführungsform der Durchfluss-Diagnosevorrichtung der vorliegenden Erfindung, die aus Testeinheit und Nachfiltereinheit besteht.
  • 1B ist ein Diagramm zur Veranschaulichung einer zweiten Ausführungsform der Durchfluss-Diagnosevorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Analyse einer Vollblut-Testprobe, die aus der Test und der Nachfiltereinheit besteht.
  • 2A ist ein Diagramm zur Veranschaulichung, wie eine Testprobe, die den Zielanalyten enthält, auf die Reaktionszone der Testeinheit aufgetragen wird.
  • 2B ist ein Diagramm zur Veranschaulichung der Komplexbildung des Zielanalyten mit dem Fängerreagenz, nachdem die Testprobe vollständig durch die Reaktionszone und in die Absorptionszone der Testeinheit hinein diffundiert ist.
  • 2C ist ein Diagramm zur Veranschaulichung des Flüssigkeitsaustausch der Nachfiltereinheit mit der Reaktionszone der Testeinheit, der der multifunktionelle Puffer zugegeben wird.
  • 2D ist ein Diagramm zur Veranschaulichung des resolubilisierten Indikatorreagenzes, das nach Zugabe des multifunktionellen Puffers zu der Nachfiltereinheit mit dem Komplex aus Fängerreagenz und Analyt reagiert hat.
  • 3A ist ein Diagramm zur Veranschaulichung des Auftragens einer Testprobe, die den Zielanalyten nicht enthält, auf die porenhaltige Reaktionsmembran der Testeinheit.
  • 3B ist ein Diagramm zur Veranschaulichung von Fängerreagenz, das nach der Diffusion der Testprobe durch die Reaktionsmembran in das absorbierende Material der Testeinheit keinen Komplex gebildet hat.
  • 3C ist ein Diagramm zur Veranschaulichung des Flüssigkeitsaustauschs zwischen der Nachfiltereinheit und der Reaktionszone der Testeinheit, der der multifunktionelle Puffer zugegeben wird.
  • 3D ist ein Diagramm zur Veranschaulichung von Fängerreagenz, das nach Resolubilisierung durch den multifunktionellen Puffer und Diffusion durch die Reaktionszone nicht reagiert hat.
  • 4 zeigt in Explosionsdarstellung den Querschnitt eines Beispiels für einen geeigneten Behälter, der die Testeinheit und die Nachfiltereinheit aufnimmt.
  • 5 zeigt in vergrößerter Ansicht den Querschnitt des Behälters aus 4 in seiner zusammengesetzten Gestalt.
  • 6 zur Veranschaulichung einer zweiten Ausführungsform eines Teils der Testeinheit, bestehend aus einem Material, das die Bluttrennungszone definiert, die mit der Reaktionszone in Flüssigkeitsaustausch steht.
  • 7A ist ein Diagramm, das eine Aufsicht auf das Oberteil einer 2-Kammer-Testkartusche zur Aufnahme und Analyse einer Vollblutprobe wiedergibt; und
  • 7B ist ein Diagramm, das eine Aufsicht auf das Unterteil einer 2-Kammer-Testkartusche zur Aufnahme und Analyse einer Vollblutprobe wiedergibt.
  • Während diese Erfindung durch Ausführungen in vielen verschiedenen Formen abgegolten wird, werden hier im Detail die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, wobei als verstanden vorausgesetzt wird, dass die vorliegende Offenlegung als Beispiel gebend für die Prinzipien der Erfindung zu betrachten ist und die Erfindung nicht auf die veranschaulichten und beschriebenen Ausführungsformen beschränken soll. Der Anwendungsbereich der Erfindung wird durch die Ansprüche im Anhang und ihren Entsprechungen abgesteckt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Sofern nicht anderweitig festgelegt, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie von einem Fachmenschen mit den üblichen Kenntnissen in dem Gebiet, dem diese Erfindung zuzuordnen ist, verstanden wird. Es muss außerdem angemerkt werden, dass die Singularformen „ein", „das" und „der", wie sie in der Spezifikation und in den angehängten Ansprüchen gebraucht werden, den pluralen Bezug mit einschließen, sofern aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht. Zum Beispiel soll der Verweis auf „ein Antigen" oder „einen Antikörper" für eine Menge von Antigenmolekülen bzw. Antikörpern gelten.
  • Wertebereiche können hier ausgedrückt werden als „von ,etwa' oder ,ungefähr" einem bestimmten Wert und/oder bis ,etwa' oder ,ungefähr' einem anderen bestimmten Wert". Wenn ein solcher Bereich genannt wird, gilt „von dem einen bestimmten Wert und/oder bis zu dem anderen bestimmten Wert" auch für eine andere Ausführungsform. Auf die gleiche Weise, wenn Werte durch den Gebrauch eines vorangehenden „etwa" als Annäherungen ausgedrückt werden, ist damit gemeint, dass der bestimmte Wert zu einer anderen Ausführungsform gehört.
  • So wie sie in der Offenlegung verwendet werden, sollen die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen haben:
    Absorbierende Zone – der Begriff „absorbierende Zone" soll eine oder mehrere Schichten eines durchlässigen (d. h. porenhaltigen oder faserigen) Materials umfassen, wobei diese Schichten gleichartig oder unterschiedlich sein können und in der Lage sind, Flüssigkeit durch Kapillarkraft einzuziehen oder aufzusaugen. Die absorbierende Zone sollte außerdem in der Lage sein, eine beträchtliche Menge an Flüssigkeit zu absorbieren, deren Volumen gleich oder größer ist, als die gesamte Volumenkapazität des Materials selbst, und daher eine hohe Absorptionskapazität haben.
  • Analyt (oder Zielanalyt) – die interessierende Verbindung oder Struktur, die in einer flüssigen Testprobe biologischen Ursprungs nachgewiesen werden soll. Beispiele für Analyten können sein: Drogen, Hormone, Polypeptide, Proteine, einschließlich Immunoglobuline, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen davon.
  • Antikörper – ein Immunoglobulin, entweder natürlichen Ursprungs oder teilweise oder vollständig synthetisch erzeugt. Der Begriff umfasst auch alle Polypeptine oder Proteine, die einen Bindungsbereich haben, der ein Antikörper-Bindungsbereich ist oder homolog dazu. Diese können aus natürlichen Quellen bezogen werden, oder sie können teilweise oder vollständig synthetisch erzeugt sein. Beispiele für Antikörper sind Immunoglobulin-Isotypen und ihre isotypischen Unterklassen; Fragmente, die aus einem Antigen-Bindungsbereich bestehen, wie z. B. Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; und Diabody-Moleküle.
  • Zu den Antikörpern die bei der Durchführung des Immunoassays der vorliegenden Erfindung nützlich sind, gehören solche, die spezifisch mit den verschiedenen Analyten reagieren, deren Nachweis in biologischen Flüssigkeiten gewünscht ist. Solche Antikörper sind vorzugsweise IgG- oder IgM-Antikörper oder Mischungen davon, die im Wesentlichen frei von Anteilen an Antikörpern sind, die mit Nicht-Analyten Bindungen eingehen können. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und sind im Handel erhältlich oder können durch Maus-Aszites, Gewebekulturen oder andere bekannte Techniken gewonnen werden. Eine typische Beschreibung des Hybridoma-Verfahrens zur Erzeugung monoklonaler Antikörper kann in Wands, J. R., und V. R. Zurawski, Gastroenterology 80:_225 (1981); Marshak-Rothstein, A., et al.; J. Immunol. 122:2491 (1979); Oi, V. Y. und L. A. Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell B. B. und S. M. Shiigi (ed) Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco: W. H. Freeman Publishing, 1979; und U.S. Patent No. 4,515,893 , das an Kung, et al. erteilt wurde, gefunden werden. Die Verwendung von Mischungen monoklonaler Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten für Antigene oder von monoklonalen Antikörpern und polyklonalen Antikörpern kann erwünscht sein. Es wird ferner in Betracht gezogen, dass Fragmente von Antikörper-Molekülen gemäß der Erfindung als spezifische Bindungsreagenzien verwendet werden können, einschließlich Halb-Antikörpermoleküle und Fab, Fab' oder F(ab')2-Fragmente, die unter Fachleuten bekannt sind. Ungeachtet der speziellen Quelle oder des Typs der Antikörper ist es jedoch generell vorzuziehen, dass sie frei von Unreinheiten sind. Die Antikörper können mittels Säulenchromatographie oder anderer konventioneller Methoden gereinigt werden, vorzugsweise werden sie aber gemäß bekannter Affinitätsreinigungsmethoden gereinigt. Antikörper-Materialien können auch mit kolloidalen Partikeln gemäß der Erfindung markiert und in Sandwich-Assays zum Nachweis von Antigen-Analyten oder in kompetitiven Assays zum Nachweis von Antikörper-Analyten eingesetzt werden.
  • Antigen
  • Zu den Antigenen und Haptenen, die bei der Ausführung des Immunoassays der vorliegenden Erfindung nützlich sind, gehören solche Materialien, natürlichen Ursprungs oder synthetisiert, die antigenische Determinanten präsentieren, für welche die Antikörper-Analyten spezifisch reaktiv sind, wenn sie entsprechend der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zu den synthetisierten Antigenen gehören solche, die gemäß konventioneller chemischer Synthese, ebenso wie solche, die nach rekombinanten DNS-Methoden konstruiert wurden. Antigen-Materialien können auch mit kolloidalen Partikeln gemäß der Erfindung markiert werden und in Sandwich-Assays zum Nachweis von Antikörper-Analyten oder in kompetitiven Assays zum Nachweis von Antigen-Analyten.
  • Bluttrennungszone
  • Unter dem Begriff „Bluttrennungszone" soll ein porenhaltiges und/oder faserartiges Material verstanden werden, das in der Lage ist, rote Blutkörperchen (RBK) aus einer Vollblutprobe zurückzuhalten und der RBK-freien Flüssigkeit, einschließlich jeglichen Zielanalyten, zu ermöglichen, durch Kapillarkräfte in einem Lateral-Flow zu migrieren.
  • Kapillarkraft
  • So, wie er hier verwendet wird, ist unter dem Begriff „kapillar" eine Kapillare oder ein anderer Kanal oder Pfad, der einer Flüssigkeit erlaubt, ein porenhaltiges, faseriges oder absorbierendes Material zu durchfließen, zu verstehen. Das Material in kapillarer Verbindung mit der Reaktionsmembran der Testeinheit wird danach ausgewählt, dass es wesentliche Eigenschaften hat, die ihm ermöglichen, ohne die Verwendung äußerer Mittel die Bewegung einer Flüssigkeit, entweder vertikal oder lateral, anzuregen.
  • Fängerreagenz
  • Jede Verbindung oder Struktur, die in der Lage ist, eine spezielle räumliche oder chemische Struktur eines Analyten zu erkennen. Im Fall eines Analyten, der eine spezifische Immunoglobulin-Art ist, kann das Fängerreagenz das spezifische Protein oder Epitop sein, das von dem Immunoglobulin erkannt wird. Andere Typen von Fängerreagenz sind natürlich vorkommende Rezeptoren, Antikörper, Antigene, Enzyme, Fab-Fragmente, Lektine, Nukleinsäuren, Avidin, Protein A und dergleichen.
  • Flüssige Testprobe
  • Die flüssige Testprobe wird darauf untersucht, ob sie ein nachweisbares Reaktionsprodukt auf der Reaktionsmembran der Testeinheit bildet. In bevorzugten Ausführungen des Assays stammt die flüssige Testprobe aus einer biologischen Quelle (z. B. Vollblut, Plasma, Serum, Urin, Speichel usw.) und enthält vermutlich den Zielanalyten, typischerweise ein Antigen, Antikörper oder Hapten, das von dem Fängerreagenz gebunden werden kann, das auf der Reaktionsmembran fixiert wurde.
  • Indikatorreagenz
  • Ein Verbund, bestehend aus einem spezifischen Bindungspartner für den Zielanalyten und ein einem Marker, der an den spezifischen Bindungspartner gekoppelt ist, und der optisch nachgewiesen werden kann. Zusätzlich kann das Indikatorreagenz aus einem allgemeinen Markerprotein bestehen, d. h. Protein A, Protein G oder anti-IgG, das mit einem Marker verbunden ist. Bei einem Assay, zum Beispiel, der Antikörper als Zielanalyten nachweisen soll, wäre ein bevorzugtes Indikatorreagenz Protein A, das mit kolloidalem Gold markiert wurde. Andere Indikatorreagenzien können auch ein markierter anti-humaner Antikörper, der auf den interessierenden Antikörper gerichtet ist, sein, z. B. antihumanes IgG (Ziege), das mit kolloidalem Gold markiert wurde, zum Nachweis von menschlichen Antikörpern in einer flüssigen Testprobe.
  • Marker
  • Ein Marker kann jedes mit einem spezifischen Bindungspartner oder ein allgemeines Marker-Protein verbundenes oder konjugiertes Molekül sein, das ein Signal erzeugen kann. In der vorliegenden Erfindung ist der Marker vorzugsweise ein „direkter" Marker, der in der Lage ist, selbstständig und ohne Zugabe von Hilfsreagenzien ein erkennbares Signal zu erzeugen und sich ohne die Zuhilfenahme von Geräten optisch leicht nachweisen lässt. Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung verwendet kolloidale Goldpartikel als Marker. Andere geeignete Marker können andere Arten von kolloidalen Metallpartikeln, winzige Farbpartikel, wie Farbstofflösungen und farbige Latex-Partikel sein. Viele solcher Substanzen sind den Fachleuten vertraut.
  • Markierungszone
  • Unter dem Begriff „Markierungszone" ist ein porenhaltiges Material zu verstehen, das mit einem getrockneten Indikatorreagenz imprägniert ist, das nach Zugabe eines Pufferreagenzes leicht resolubilisiert werden kann.
  • Reaktionszone
  • Unter dem Begriff „Reaktionszone" ist ein porenhaltiges Material zu verstehen, an welches das Fängerreagenz und andere für den analytischen Assay verwendete Moleküle gebunden werden, ebenso, wie weiteres porenhaltiges Material, sofern vorhanden, das die Unterseite der Reaktionszone bildet.
  • Spezifischer Bindungspartner
  • Dies beschreibt zwei oder mehr komplementäre Partner einer spezifischen Bindungsreaktion, die eine gegenseitige Bindungsaffinität besitzen. Die spezifischen Bindungspartner können natürlichen Ursprungs oder synthetisch erzeugt sein. Ein Partner der spezifischen Bindungsreaktion hat an seiner Oberfläche einen Bereich oder eine Höhlung, die spezifisch bindungsfähig und damit komplementär zu einer speziellen räumlichen oder chemischen Struktur des anderen komplementären Partners ist. Beispiele für die Arten von spezifischen Bindungspaaren sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin/Streptavidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat und dergleichen.
  • 1.0 EINFÜHRUNG
  • Die vorliegende Erfindung bietet eine verbesserte Schnelltestvorrichtung, einen Assay und einen multifunktionellen Puffer zum Nachweis eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe, etwa einer Körperflüssigkeit. Die Schnelltestvorrichtung ist nicht nur einfach anzuwenden und kostengünstig herzustellen, sondern ist auch zuverlässig genug für den Einsatz in empfindlichen analytischen Assays, ohne dass langwierige Inkubationszeiten, extra Waschschritte oder eine Verdünnung der Probe erforderlich sind. Da der Assay dem fraglichen Zielanalyten entsprechend angepasst werden kann, lässt sich die vorliegende Erfindung für eine breite Vielfalt von biologischen Assays verwenden. Zum Beispiel kann eine flüssige Testprobe (z. B. Serum, Plasma, Vollblut, Speichel, Urin usw.) schnell und genau auf Antigene, Antikörper, natürliche oder synthetische Steroide, Hormone und dergleichen untersucht werden.
  • Die Schnelltestvorrichtung, die für den praktischen Gebrauch der Erfindung nützlich ist, ist ein Zweikomponenten-Durchfluss-System, das aus einer Testeinheit und einer Nachfiltereinheit besteht, die in der Lage sind, die flüssige Testprobe bzw. den multifunktionellen Puffer aufzunehmen. Die Testeinheit besteht aus einer Reaktionszone, die ein immobilisiertes Fängerreagenz enthält, das den Zielanalyten spezifisch erkennen und binden kann, sowie einer Absorptionszone, auf der die Reaktionszone aufliegt. Die Reaktionszone der Testeinheit ist so ausgerichtet, dass die Markierungszone der Nachfiltereinheit in einen vorübergehenden Flüssigkeitsaustausch mit ihr gebracht werden kann, kurz nachdem die flüssige Testprobe auf die Reaktionszone der Testeinheit aufgetragen wurde. Um den Nachweis eines Zielanalyten in einer Vollblutprobe zu erleichtern, bietet eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Testeinheit, zu der darüber hinaus eine Bluttrennungszone in lateralem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone gehört, wobei das vordere Ende der Bluttrennungszone, das in einem kurzen lateralen Abstand von der Reaktionszone angeordnet ist, einen Bereich zur Aufnahme der Vollblutprobe definiert. Das hintere Ende der Bluttrennungszone kann sich leicht mit der Reaktionszone überlappen, um einen direkten Flüssigkeitsaustausch mit ihr zu gewährleisten. Die Nachfiltereinheit besteht aus einer Markierungszone, die ein getrocknetes Indikatorreagenz enthält und kann im Verlauf des Assays in einen vorübergehenden Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone der Testeinheit versetzt werden.
  • Das Assayprotokoll ist eine einfache Prozedur in zwei Schritten, nämlich (1) Auftragen einer flüssigen Testprobe auf die Reaktionszone der Testeinheit oder, im Falle einer Vollblutprobe, auf das vordere Ende der Bluttrennungszone und kurz darauf Einrichten einer funktionsfähigen Verbindung von Testeinheit und Nachfiltereinheit, so dass sich die Markierungszone der Nachfiltereinheit in vorübergehendem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone der Testeinheit befindet, und (2) Zugabe des multifunktionellen Puffers zu der Nachfiltereinheit und Entfernung der Nachfiltereinheit, um das Testergebnis zu beobachten. Der multifunktionelle Puffer diffundiert passiv durch die Markierungszone der Nachfiltereinheit, um das Indikatorreagenz zu resolubilisieren und zu der Reaktionszone der Testeinheit zu transportieren, wo es sich an den entsprechenden Analyten bindet, der mit dem Fängerreagenz einen Komplex gebildet hat. Wenn ein Analyt in der flüssigen Testprobe vorhanden ist, erscheint ein deutliches Signal in der Reaktionszone, das im Anschluss an die Entfernung der Nachfiltereinheit von der Testeinheit leicht sichtbar gemacht werden kann. Ein Vorteil der Methodologie der vorliegenden Erfindung ist die verbesserte Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Tests. Dies wird erreicht, indem die Möglichkeit für ein gründliches Abfangen des Analyten selbst bei niedrigen Konzentrationen maximiert wird. Zusätzlich erübrigt sich die Ausführung von Assay-Schritten, die die Wahrscheinlichkeit einer Verschmutzung der Probe und der Reagenzien erhöhen, durch die vorliegende Erfindung gänzlich.
  • 2.0 SPEZIFISCHE BINDUNGSREAKTION
  • Die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um qualitativ und semiquantitativ das Vorhandensein eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe nachzuweisen. Analyten, die zum Nachweis in der Assay-Vorrichtung geeignet sind, sind im Wesentlichen Partner in einer spezifischen Bindungswechselwirkung von der Art, dass einer der Partner in der Lage ist, einen komplementären, nicht identischen Partner zu erkennen und, üblicherweise nichtkovalent, zu binden, und ein stabiler Komplex gebildet wird, der entweder direkt oder indirekt leicht nachgewiesen werden kann. Die Partner der spezifischen Bindungsreaktion können als Zielanalyt und als Fängerreagenz bezeichnet werden und eine breite Vielzahl von Substanzen biologischen Ursprungs, die an einer immunologischen Reaktion beteiligt sein können, umfassen, z. B. Antigen-Antikörper, oder an einer nicht immunologischen Reaktion, z. B. Avidin und Biotin, Zelloberflächenrezeptor und ein Effektor-Agens, DNS und RNA, und so weiter. Bezüglich Offenlegung spezifischer Bindungspartner, siehe US Patent Nr. 3,996,345 (Ullman et al.).
  • Bei Verwendung in einem Bindungsassay kann die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung für den Nachweis einer beliebigen Anzahl von Zielanalyten gestaltet sein, für die ein spezifischer Bindungspartner existiert. Der Analyt ist für gewöhnlich ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches oder anorganisches Molekül, für das in einem biologischen System ein spezifischer Bindungspartner existiert oder synthetisiert werden kann. Der Bindungsassay umfasst im Wesentlichen die spezifische Bindung des Analyten (d. h. des ersten spezifischen Bindungspartners) an ein Fängerreagenz (d. h. des zweiten spezifischen Bindungspartners), das auf einem Material mit einer festen Phase fixiert wurde, und zusätzlich an ein Indikatorreagenz (das aus einem Marker, der an einen zusätzlichen zweiten spezifischen Bindungspartner gekoppelt ist, oder einem allgemeinen Markerprotein besteht). Die Fixierung des Fängerreagenzes an dem Festphasenmaterial bildet einen „Capture-Situs" und erleichtert so die Trennung oder Entfernung des Zielanalyten von anderen Komponenten der Testprobe. Der Marker, der dem Indikatorreagenz ermöglicht, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, welches das Vorhandensein des Analyten in der flüssigen Testprobe anzeigt, wird durch direkte oder indirekte Bindung des Bindungspartners des Indikatorreagenzes gewonnen. Allgemein bindet sich der zusätzliche zweite spezifische Bindungspartner an den Zielanalyten an einer Stellte, die nicht bei spezifischen Bindungswechselwirkung zwischen dem Zielanalyten und dem Fängerreagenz stört. Beispielhaft aber nicht ausschließend für die vorliegende Erfindung, ist die spezifische Bindungsreaktion, die als Ergebnis der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung stattfindet.
  • Fachleute werden abschätzen können, dass es, während der hier beschriebene schnelle diagnostische Assay vorgesehen ist, um in erster Linie entweder Antigene oder Antikörper durch die Bildung eines Immunkomplexes nachzuweisen, tatsächlich erheblich mehr Anwendungsmöglichkeiten gibt, die nicht auf diese Moleküle beschränkt sind. In der Minimalform erfordert die Vorrichtung lediglich einen ersten Partner, der einen zweiten Partner erkennt und mit ihm in eine spezifische Bindungsreaktion eingeht. Der erste Partner kann zweckdienlich als Zielanalyt bezeichnet werden und der zweite Partner als Fängerreagenz. Während Antigene und Antikörper bevorzugte Verkörperungen von Zielanalyt und Fängerreagenz sind, wobei sie jeweils für beide Rollen gut sind, kann die Vorrichtung mit einer Vielzahl von Fängerreagenz und Analyt-Molekülen verwendet werden. Zum Beispiel sind Hormonrezeptor-Moleküle eine Art von Fängerreagenz-Molekül und können auf der Reaktionszone der Testeinheit fixiert und für eine Untersuchung auf den entsprechenden Hormon-Analyten verwendet werden. Alternativ könnte ein Hormon an die Reaktionszone gebunden und zur Untersuchung auf Hormonrezeptoren verwendet werden (Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press).
  • Das System lässt sich auch für die Erkennung von DNS-Sequenzen anpassen. Zum Beispiel wird eine flüssige Testprobe, in der eine DNS-Sequenz als Zielanalyt vermutet wird, auf die Reaktionszone aufgetragen und von einer bekannten komplementären DNS-Sequenz gebunden, die als Fängerreagenz auf der Reaktionszone fixiert wurde. Dann wird eine markierte DNS-Sonde mittels multifunktionellen Puffers zu der Reaktionszone transportiert. Wenn eine Hybridisierung stattfindet, wird die markierte DNS-Sonde in einer optisch nachweisbaren Form auf der Oberfläche der Reaktionszone zurückgehalten. Dieses System wird in Polsky-Cynkin, R., et al., Clin. Chem. 31/9, 1438 (1985) beschrieben.
  • Daher ist für Fachleute leicht ersichtlich, dass es viele solcher Kombinationen von Fängerreagenz-Zielanalytpaaren gibt, die für eine Verwendung in der vorliegenden Diagnosevorrichtung und Methode geeignet sind.
  • 3.0 ASSAY-VORRICHTUNG UND METHODOLOGIE
  • 3.1 SANDWICH-VERFAHREN
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt ein Direktbindungs-(Sandwich)Assayformat ein. Das Format basiert auf dem Prinzip einer spezifischen Bindungswechselwirkung, die zwischen einem Zielanalyten, der aus dem ersten spezifischen Bindungspartner besteht, einem Fängerreagenz, das aus einem zweiten spezifischen Bindungspartner besteht, der auf einem festen Material fixiert ist, und einem getrockneten Indikatorreagenz, das aus einem zusätzlichen zweiten spezifischen Bindungspartner oder einem allgemeinen Markerprotein besteht. Die genannten Partner bilden einen dreigliedrigen Komplex, wenn die Bestandteile einer flüssigen Testprobe, die den Zielanalyten enthält, mit dem fixierten Fängerreagenz reagiert haben, gefolgt von der Zugabe des Indikatorreagenzes. Allgemein hängt der diagnostische Assay daher von der Fähigkeit eines zweiten spezifischen Bindungspartners ab, den ersten Bindungspartner spezifisch zu erkennen und zu binden. Je nach der Art des Zielanalyten, der nachgewiesen werden soll, wird ein Indikatorreagenz, das aus einem zusätzlichen zweiten Bindungspartner besteht, der mit einer optisch nachweisbaren Komponente markiert wurde, eingesetzt, um die Existenz einer solchen Bindung festzustellen. Die Menge an Indikatorreagenz, die nach der Reaktion nachgewiesen und gemessen wird, kann in Korrelation gebracht werden mit der Menge an Analyt, die in der Testprobe vorhanden war. In einem Sandwich-Immunoassay wird zum Beispiel eine Testprobe, die ein Antigen enthält, der Analyt also, in Kontakt gebracht mit einem primären Antikörper, der auf einem Festphasenmaterial fixiert wurde, also dem Fängerreagenz. Das Festphasenmaterial wird daraufhin mit dem Indikatorreagenz, nämlich einem sekundären Antikörper, der mit einer optisch nachweisbaren Komponente markiert wurde, behandelt. Der sekundäre Antikörper, wird dann an das korrespondierende Antigen gebunden, das durch den primären Antikörper immobilisiert worden war, der auf dem Festphasenmaterial fixiert worden war, und jeglicher Farbumschlag wird dann optisch erkannt, was das Vorhandensein von Antigen in der Testprobe anzeigt.
  • 1A bietet daher ein Diagramm zur Veranschaulichung der einfachsten Ausführungsform der Assay-Vorrichtung 1 der vorliegenden Erfindung, die aus zwei getrennten Komponenten besteht, einer Testeinheit 2 und einer Nachfiltereinheit 3. Die Testeinheit 2 besteht aus einer Reaktionszone 5, deren Unterseite auf einer Absorptionszone 4 aufliegt. Die Reaktionszone 5 nimmt die flüssige Testprobe 9 direkt auf und liefert ein optisch deutlich erkennbares Testresultat auf Grund eines dort vorhandenen immobilisierten Fängerreagenzes 6, das in der Lage ist, den interessierenden Zielanalyten durch eine spezifische Bindungswechselwirkung zu erkennen und zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Reaktionszone 5 aus einer porenhaltigen Membran, die zur Fixierung des Fängerreagenzes 6 geeignet ist, und eine geringe nicht-spezifische Bindungsfähigkeit für das Indikatorreagenz 8 hat. Die Absorptionszone 4 ist vorzugsweise aus einem durchlässigen Material hergestellt, das über intrinsische Eigenschaften verfügt, welche es ihm ermöglichen, Flüssigkeit durch Kapillarkraft einzuziehen, in ausreichender Form Reagenz und Probenflüssigkeiten zu halten, und zusätzlich als Auflage für die Reaktionszone 5 zu dienen. Die Nachfiltereinheit 3 besteht aus einer Markierungszone 7, die von einem getrockneten Indikatorreagenz 8 durchdrungen ist. Das getrocknete Indikatorreagenz 8 besteht aus einem Marker und einem spezifischen Bindungspartner, der ebenfalls den interessierenden Analyten erkennt und bindet, jedoch an einer Stelle, die bei der spezifischen Bindungsinteraktion zwischen dem Zielanalyten und dem Fängerreagenz nicht stört. Die Markierungszone 7 besteht vorzugsweise aus einem Filtermedium, das danach ausgewählt wird, dass die Porengröße die es aufweist, groß genug ist, dass das getrocknete Indikatorreagenz 8, nachdem es durch Zugabe des multifunktionellen Puffers 12 resolubilisiert wurde, mit Leichtigkeit durch ein exponiertes Areal der Markierungszone 7 diffundiert. Form und Abmessungen der Nachfiltereinheit 3 sind derart, dass sie den multifunktionellen Puffer hält und wirksam durch die Markierungszone 7 leitet, wenn sie während des abschließenden Schritts der Assay-Prozedur in vorübergehenden Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone 5 der Testeinheit 2 versetzt wird.
  • 1B bietet ein Diagramm zur Veranschaulichung der Assay-Vorrichtung 1 einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die aus zwei getrennten Komponenten besteht, einer Testeinheit 2 und einer Nachfiltereinheit 3, wobei zur Testeinheit 2 zusätzlich eine Bluttrennungszone 100 gehört, die in der Lage ist, eine Vollblutprobe 9' aufzunehmen und deren flüssigen Anteil von den roten Blutkörperchen zu trennen, während die von roten Blutkörperchen freie Flüssigkeit, einschließlich eines etwaigen Analyten, zur direkten Analyse in die Reaktionszone 5 transportiert wird. Das bevorzugte Material für die Bluttrennungszone 100 wird nach charakteristischen Eigenschaften ausgewählt, die ihm ermöglichen, vorzugsweise die roten Blutkörperchen in der Probe 9' einzufangen oder zurückzuhalten, während der flüssige Anteil in lateraler Richtung zur Reaktionszone 5 migriert.
  • 2 ist ein Diagramm zur Veranschaulichung der Methode der Erfindung, die die Vorrichtung aus 1A verwendet. In diesem speziellen Beispiel zeigt 2A eine flüssige Testprobe 9, die den Zielanalyten 10 sowie andere nicht-essentielle Komponenten 11 enthält, und die auf die Reaktionszone 5 der Testeinheit 2 aufgetragen wird. Da die flüssige Testprobe 9 durch die Reaktionszone 5 in die darunter liegende Absorptionszone 4 diffundiert, kommt der freie Analyt 10 mit den verfügbaren Bindungsstellen des Fängerreagenzes 6 in Berührung und bildet einen Komplex, während die ungebundene nicht-essentielle Komponente 11 weiterhin in die Absorptionszone 4 darunter gezogen wird (2B). Wie in 2C dargestellt, wird die Markierungszone 7 der Nachfiltereinheit 3 nachfolgend in Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone 5 der der Testeinheit 2 gebracht, bevor der multifunktionelle Puffer 12 zugegeben wird. Unmittelbar im Anschluss an die Resolubilisierung des getrockneten Indikatorreagenzes 8 durch den Puffer 12, wird das Indikatorreagenz 8 zur Reaktionszone 5 der Testeinheit 2 transportiert, wo sie sich mit dem Analyten 10 verbindet, der mit dem Fängerreagenz 6 einen Komplex gebildet hat. Die Bindungsreaktion des Indikatorreagenzes 8 mit dem Analyten 10 erzeugt ein optisch erkennbares Signal, wodurch ein positives Ergebnis angezeigt wird, das nach dem Abnehmen der Nachfiltereinheit 3 leicht beobachtet werden kann, wie in 2D gezeigt.
  • 3A ist ein Diagramm zur Veranschaulichung der Methode der Erfindung, die die Vorrichtung aus 1A verwendet, wenn eine flüssige Testprobe 9 ohne einen Zielanalyten auf die Reaktionszone 5 der Testeinheit 2 aufgetragen wird. Indem die flüssige Testprobe 9 durch die Reaktionszone 5 und in die darunter liegende Absorptionszone 4 diffundiert, fließen die nicht-essentiellen Komponenten 11 vollständig an dem Fängerreagenz 6 vorbei und lassen die Bindungsstellen unbesetzt (3B). Wie in 3C gezeigt, wird die Markierungszone 7 der Nachfiltereinheit 3 anschließend in einen Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone 5 der Testeinheit 2 gebracht, bevor der multifunktionelle Puffer 12 zugegeben wird. Unmittelbar im Anschluss an die Resolubilisierung des getrockneten Indikatorreagenzes 8 durch den Puffer 12 wird das Indikatorreagenz 8 zur Testeinheit 2 transportiert, wo es wegen des Fehlens eines Zielanalyten, der mit dem Fängerreagenz 6 einen Komplex gebildet hätte, durch die Reaktionszone 5 hindurch, an dem Fängerreagenz 6 vorbei und in die Absorptionszone 4 darunter diffundiert. Nach dem Abnehmen der Nachfiltereinheit 3 ist wegen des Fehlens einer Bindung des Indikatorreagenzes 8 an einen Analyten in einem Komplex kein Farbsignal zu erkennen, wodurch ein negatives Ergebnis angezeigt wird.
  • Um den Nachweis eines Zielanalyten in einer Vollblutprobe zu erleichtern, bietet eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Testeinheit an, die über eine Bluttrennungszone verfügt, die in der Lage ist, eine Vollblutprobe aufzunehmen, den flüssigen Anteil von den roten Blutkörperchen (RBK) zu trennen und den von RBK-freien flüssigen Anteil, einschließlich jedweden Analyten, zur Reaktionszone zur direkten Analyse zu transportieren. Wie in 6 gezeigt, ist die Bluttrennungszone 100 vorzugsweise ein länglicher Streifen aus einem porenhaltigen Material, das nach solchen charakteristischen Eigenschaften ausgesucht wird, die ihm ermöglichen, vorzugsweise die roten Blutkörperchen in der Probe 9' einzufangen oder zurückzuhalten, während der flüssige Anteil in lateraler Richtung zur Reaktionszone 5 migriert. Obwohl die Form und die Abmessungen nicht entscheidend sind, hat die Bluttrennungszone vorzugsweise eine rechteckige Form mit Abmessungen, die geeignet sind, die Entfernung einer wesentlichen Menge an roten Blutkörperchen aus der Vollblutprobe 9' zu ermöglichen, bevor der RBK-freie flüssige Anteil der Probe 9' in der Reaktionszone 5 ankommt. Daher fungiert das Bluttrennungsmaterial tatsächlich als Lateral-Flow-Material zur selektiven Entfernung einer wirksamen Menge an roten Blutkörperchen aus der Vollblutprobe 9', damit Störungen bei dem optischen Nachweis des Analyten vermieden werden, während anderen Komponenten der Probe, einschließlich eines Analyten, ermöglicht wird, relativ ungehindert zu der Reaktionszone 5 zu fließen. Vorzugsweise wird ein hydrophober Träger 103 an der Unterseite der Bluttrennungszone 100 befestigt, um für eine Auflage zu sorgen und das Aussickern der flüssigen Phase zu reduzieren, während der RBK-freie flüssige Anteil der Vollblutprobe zur Reaktionszone 5 migriert. Vorzugsweise gleicht der Untersatz 103 in Form und Größe der Bluttrennungszone 100.
  • Das vordere Ende 101 der Bluttrennungszone 100, das sich in kurzem lateralem Abstand von der Reaktionszone 5 entfernt befindet, definiert einen Bereich zur Aufnahme der Vollblutprobe 9', bevor der Analyt in die Reaktionszone 5 eingeleitet wird. Das andere Ende 102 der Bluttrennungszone 100 schließt an die Reaktionszone 5 an und kann sich leicht mit ihr überlappen, damit ein direkter Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone 5 besteht und so die kapillare Bewegung des RBK-freien Anteils der Blutprobe 9' vom vorderen Ende der Bluttrennungszone 100 zu der Reaktionszone 5 gefördert wird. Die Bluttrennungszone 100 und die Reaktionszone 5 müssen miteinander in Kontakt stehen, um einen optimalen Übergang der Probe von einer Zone zu der anderen zu gewährleisten. Daher ist es vorzuziehen, dass sich die Bluttrennungszone 100 und die Reaktionszone 5 leicht überlappen, anstatt dass sie bündig an einander anschließen.
  • Daher erfolgt während des zweischrittigen Assayprotokolls optional zugleich eine Trennung von roten Blutkörperchen aus einer Vollblutprobe 9', um eine Prüfung auf einen gesuchten Analyten ohne die Erfordernis zusätzlicher Schritte zuzulassen. In dem Fall, zum Beispiel, dass eine Vollblutprobe 9' einen Analyten enthält, wird die Probe 9' einfach auf das vordere Ende der Bluttrennungszone 100 der Testeinheit aufgetragen, anstatt auf die Reaktionszone 5. Indem der RBK-freien Anteil der Blutprobe 9' in lateraler Richtung zur Reaktionszone 5 migriert, kommt der freie Analyt schließlich in Berührung mit den verfügbaren Bindungsstellen auf dem Fängerreagenz und bildet einen Komplex. Daher werden, ähnlich wie bei den Schritten der in 2 dargestellten Methode, ungebundene nicht-essentielle Komponenten in die Absorptionszone unterhalb der Reaktionszone eingezogen. Die Markierungzone der Nachfiltereinheit wird anschließend in einen Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone der Testeinheit gebracht, bevor der multifunktionelle Puffer zugegeben wird. Unmittelbar nach der Resolubilisierung des getrockneten Indikatorreagenzes mit dem Puffer, wird das Indikatorreagenz zu der Reaktionszone der Testeinheit transportiert, wo es sich an jeglichen Zielanalyten bindet, der mit dem Fängerreagenz einen Komplex gebildet hat. Die Bindungsreaktion des Indikatorreagenz mit dem Zielanalyten erzeugt ein optisch erkennbares Signal und zeigt dadurch ein positives Ergebnis an, das leicht beobachtet werden kann, nachdem die Nachfiltereinheit entfernt wurde.
  • 3.2. KOMPETITIVES VERFAHREN
  • Fachleute können die Anwendung der vorliegenden Erfindung bei kompetitiven als auch bei nicht-kompetitiven (d. h. Sandwich-) Assays für geeignete interessierende Zielanalyten ableiten. In der kompetitiven Form ist es ein zusätzlicher erster spezifischer Bindungspartner, für das Indikatorreagenz (anders als der zusätzliche zweite spezifische Bindungspartner bei der „Sandwich"-Methode), der in der Lage ist, mit dem zweiten spezifischen Bindungspartner, also dem Fängerreagenz, eine Bindung einzugehen. In anderen Worten, der zusätzliche erste spezifische Bindungspartner für das Indikatorreagenz tritt in Konkurrenz mit dem Zielanalyten, also dem ersten spezifischen Bindungspartner, um sich an die Bindungsstellen des Fängerreagenzes zu binden. Der zusätzliche erste spezifische Bindungspartner besteht zum Beispiel aus einer analogen oder anderen authentischen Probe des Zielanalyten, der eine mit dem ersten spezifischen Bindungspartner vergleichbare Affinität aufweist. Wenn die flüssige Testprobe auf die Reaktionszone aufgetragen wird, bindet sich jeder Zielanalyt, sofern vorhanden, an die verfügbaren Bindungsstellen des Fängerreagenzes, des zweiten Bindungspartners also, an und blockiert daher möglicher Weise nach seiner Zugabe eine Bindung des zusätzlichen ersten Bindungspartners für das Indikatorreagenz an das Fängerreagenz. Sollte die flüssige Testprobe den Zielanalyten enthalten, zeigt das Fehlen eines Farbsignals ein positives Ergebnis an, weil das Indikatorreagenz nicht in der Lage ist, sich an das Fängerreagenz zu binden. Anders herum, wenn die Testprobe keinerlei Zielanalyten enthält, zeigt das Auftreten eines Farbumschlags eine negatives Ergebnis an, weil das Indikatorreagenz in der Lage ist, sich an die unbesetzten Bindungsstellen des Fängerreagenzes zu binden.
  • 4.0 TESTEINHEIT
  • Wie oben beschrieben, ist die erste Komponente, aus der die Diagnosevorrichtung der vorliegenden Erfindung besteht, eine Testeinheit, die über eine Reaktionszone mit dort fixiertem Fängerreagenz verfügt, das den Zielanalyten spezifisch erkennen und binden kann, eine Absorptionszone, auf der die Reaktionszone aufliegt, und, optional eine Bluttrennungszone in lateralem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone. Die Reaktionszone der Testeinheit ist so angeordnet, dass die Markierungszone der Nachfiltereinheit in vorübergehenden Flüssigkeitsaustausch mit ihr gebracht werden kann, kurz nachdem die flüssige Testprobe auf die Testeinheit aufgetragen wurde.
  • 4.1 REAKTIONSZONE
  • Unter dem Begriff „Reaktionszone" soll das porenhaltige Material verstanden werden, an welches das Fängerreagenz und andere für den analytischen Assay eingesetzte Moleküle gebunden werden, ebenso wie zusätzliches porenhaltiges Material als Auflage, das sofern vorhanden, die Unterseite der Reaktionszone bildet.
  • Die Auswahl des Materials für die Reaktionszone ist nicht von entscheidender Bedeutung für die Erfindung. Die Materialien, die verwendet wurden, um die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung herzustellen, sind in der Fachwelt wohlbekannt. Porenhaltiges Material, so wie es in den U.S. Patenten Nr. 4,670,381 , 4,632,901 , 4,666,863 , 4,459,361 , 4,517,288 , und 4,552,839 beschrieben wird, kann einzeln zusammengesetzt sein oder aus Kombinationen von Glasfasern, Zelluloseacetat, Nylon oder verschiedenen synthetischen oder natürlichen Materialien.
  • Das bevorzugte Material der Reaktionszone ist eine Membran mit einer Porengröße, die die Abtrennung und Herausfilterung von anderen nicht-essentiellen Komponenten der flüssigen Testprobe, die untersucht wird, zulässt. Der Fluss der wässrigen Reagenzien wird durch Diffusion gelenkt, und die Membran sollte eine niedrige nicht-spezifische Bindungsfähigkeit für das Indikatorreagenz haben, vor oder nach einer Behandlung mit Reagenzien, wie z. B. Proteinen, Detergenzien oder Salzen. Viele porenhaltige Membrane, Filme oder Papiere, die eine festgelegte Hydrophobizität haben und sich für den praktischen Einsatz der Erfindung eignen, sind im Handel erhältlich. Die Reaktionsmembran kann eine beliebige Form oder Dicke haben, aber für gewöhnlich ist sie flach und dünn. Die Trennung der flüssigen Phase des Ausgangsstoffs von den Festphasepartikeln durch Absorption, Diffusion oder Filtration im Trennungsschritt des Assays kann erleichtert werden, dass zusätzlich hydrophiles Material (ein absorbierendes Kissen) mit der Unterseite der Reaktionsmembran in Kontakt gebracht wird. Die Größe des Bereichs, der den Festphasepartikeln ausgesetzt ist, kann durch Verwendung eines hydrophoben Materials, wie etwa Kunststoff, Kunststofflaminat oder ähnlichen Substanzen eingestellt werden, das mit der Reaktionsmembran in Kontakt gebracht wird und die Reaktionszone versiegelt, so dass lediglich ein Oberflächenbereich von nicht mehr als etwa 150 mm2 den Festphasepartikeln ausgesetzt wird.
  • Die Porosität der Membran hat großen Einfluss auf die Fließrate der Flüssigkeit und die Empfindlichkeit des Assays. Je größer die Porengröße der Membran ist, desto höher ist die Flussrate für eine bestimmte Flüssigkeit. Wenn die Fließrate höher wird, verkürzt sich die Zeit für die Wechselwirkung zwischen dem Zielanalyten in der Probe und dem auf der Reaktionsmembran fixierten Rezeptor, wodurch sich die Empfindlichkeit des Assays verringert. Darüber hinaus steht bei einer großen Porengröße weniger Oberfläche zur Fixierung des Rezeptormoleküls zur Verfügung, was ein weiterer Parameter ist, der zu einer verminderten Assay-Empfindlichkeit beiträgt. Für die meisten Assays liegt die Porengröße der Membran vorzugsweise in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 12,0 Mikrometer, hier besonders in einem Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,8 Mikrometer.
  • Die Saugkraft der Membran kann ebenfalls die Empfindlichkeit des Assays beeinflussen und hängt von der Dicke und der Art des Membranmaterials ab. Die Saugkraft kann gemessen werden als die Migration einer Standardlösung über eine bestimmte Strecke pro Zeiteinheit. Häufig kann die Assay-Empfindlichkeit durch Wahl einer Membran mit einer relativ geringen Saugkraft gesteigert werden. Daher kann zusätzlich zur Porosität die Gesamtdicke der Reaktionsmembran die Empfindlichkeit des Assays beeinflussen und ist ebenfalls zu beachten.
  • Die Dicke der Reaktionsmembran, das ist der Abstand zwischen Oberseite und Unterseite der Reaktionsmembran, kann variieren in Abhängigkeit von den Fließeigenschaften, die für einen bestimmten diagnostischen Assay benötigt werden. Typischerweise liegt die Dicke in einem Bereich von etwa 0,05 mm bis etwa 3,0 mm, am weitesten verbreitet in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1,0 mm. Bei einigen speziellen Immunoassays wurde festgestellt, dass wenn die Dicke der Reaktionsmembran größer ist etwa 0,1 mm und vorzugsweise im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 1,0 mm liegt, eine höhere Empfindlichkeit erreicht werden kann. Überdies wird vermutet, dass Vorrichtungen nach dem früheren Stand der Technik, die relativ dünne Reaktionsmembranen haben, wie etwa Nitrozellulose-Membranen, die weniger als 0,1 mm dick sind und an der Rückseite keine Papierschicht aufweisen, dazu neigen, die Probe an den Seiten entlang durch die Reaktionsmembran fließen zu lassen, anstatt abwärts durch die Mitte der Reaktionsmembran. Andererseits kann eine dickere Reaktionsmembran dafür sorgen, dass mehr Reaktionsreagenz für die Bindung an dem Zielanalyten verfügbar ist und dadurch die Empfindlichkeit des Assays erhöhen. Daher sollte die Dicke der Membran so gewählt werden, dass eine genügende Menge an Bindungsreagenzien fixiert werden kann, um die Probenkomponente einzufangen. Wenn allerdings die Membran zu dick ist, kann sie eine unangemessene Verzögerung des Durchgangs der flüssigen Testprobe durch die Membran bewirken.
  • Ein anderer Faktor, der zu beachten ist, ist dass das Material für die Reaktionsmembran danach auszuwählen ist, dass es sich für die Immobilisierung des Fängerreagenzes eignet. Die Reaktionsmembran kann aus jedem beliebigen geeigneten porenhaltigen Material bestehen, das in der Lage ist, das Fängerreagenz zu fixieren, welches für den diagnostischen Assay eingesetzt wird, solange die Durchführung des Assays nicht beeinträchtigt wird. Zu den geeigneten Materialien gehören Nitrozellulose (verstärkt oder nicht verstärkt), Glasfaser, Polyester, Polykarbon, Nylon und andere natürliche oder synthetische Materialien, die eine direkte oder indirekte Bindung mit dem Fängerreagenz der Wahl eingehen können. Gewöhnlich enthält die Membran negative Ladungen, die eine Bindung des Fängerreagenzes zulassen. Bestimmte Membranmaterialien mit einer Ladung enthalten Zellulosenitrat, das über partielle negative Ladungen verfügt, die von den Nitrogruppen herstammen.
  • In einigen Fällen sind im Handel Filter erhältlich, an deren inneren oder äußeren Oberflächen ein Reaktionspartner fixiert wurde, um biologische Moleküle, wie Antikörper oder Antigene an die Oberfläche zu binden. Beispiele für verschiedene Filter sind Zellulosefilter (Filterpapier), Polyamidmembranen (zahlreiche Varianten Polyamidmembranen werden z. B. von der Pall Corporation hergestellt) und verschiedene andere Mikroporenmembranen, etwa solche, die im Handel erhältlich sind von Amicon, Geleman und Schleicher & Schuell. Die folgenden Membranen sind zum Beispiel von Pall Corporation erhältlich: Biodyne® , eine N66 Polyamid-Mikroporenmembran ( U.S. Patent No. 4,340,479 , erteilt an Pall); Carboxydyne®, eine hydrophyle, mikroporenhaltige, unbeschichtete Nylon 66 Membran mit Kontrolloberflächeneigenschaften, gekennzeichnet durch funktionelle Carboxylgruppen an der Oberfläche; und ImmunodyneTM, eine modifizierte Carboxydyne® Membran, hergestellt durch Behandlung einer Carboxydyne®-Membran mit Trichlorotriazin. Andere Mikroporenmembranen, die von Millipore Corporation hergestellt werden, werden in U.S. Patents Nos. 4,066,512 und 4,246,339 beschrieben.
  • Andere Materialien können vorbehandelt sein, um eine geladene Membran bereitzustellen. Zum Beispiel kann Polyester mit Carboxyl- oder Aminogruppen derivatisiert werden, um eine negativ bzw. positiv geladene Membran bereitzustellen. Nylon kann mit Säure behandelt werden, um Peptidbindungen zu spalten und für positive Ladungen (von den Aminogruppen) negative Ladungen (von den Carboxylgruppen) zu sorgen.
  • Ein bevorzugtes Material für den Gebrauch als Reaktionsmembran ist eine Nitrozellulosemembran, die durch porenhaltiges Papier ähnlich Filterpapier verstärkt ist, oder andere Arten von Nitrozellulose-Membranen. mit ähnlichen Eigenschaften. Ein typisches Beispiel ist unter dem Handelsnamen BAC-T-KOTE von Schleicher & Schuell erhältlich. Dieses Material ist wesentlich dauerhafter als reine Nitrozellulose und kann ohne weitere unterstützende Komponente eingesetzt werden, während die Handhabung und der Zusammenbau der Vorrichtung vereinfacht werden. Zusätzlich wurde festgestellt, dass Analysevorrichtungen, die Papier verstärkte Nitrozellulose für die Reaktionszone einsetzen, bei bestimmten Immunoassays eine erhöhte Empfindlichkeit aufweisen.
  • Andere im Handel erhältliche Materialien stammen von EY Laboratories Inc. (San Mateo, Calif.; Cat. Nos. PBNC15-1, PBNC15-10, PBNC15M-1, and PBNC15M-10).
  • 4.2. IMMOBILISIERUNG DES FÄNGERREAGENZES
  • In einem typischen System wird das Fängerreagenz, das einen in der flüssigen Testprobe vorhandenen Zielanalyten spezifisch erkennt und bindet, auf der porenhaltigen Membran der Reaktionszone fixiert. Solch ein Reagenz, typischerweise ein immunologisches Protein, wie ein Antikörper oder Antigen, kann auf solchen Materialien, wie etwa Nitrozellulose, durch Absorption, Adsorption oder kovalente Bindung direkt oder indirekt fixiert werden. Wenn eine flüssige Testprobe, in der der interessierende Analyt der spezifischen Bindungswechselwirkung vermutet wird, auf die Reaktionszone mit dem immobilisierten Fängerreagenz aufgetragen wird, wird er nicht-diffusiv an die Reaktionszone gebunden. Daher kann bei einer sachgemäßen Auftragung einer flüssigen Testprobe, in der der Zielanalyt vermutet wird, eine hohe Konzentration des Zielanalyten in einer gut definierten Region in der Mitte der Reaktionszone gewonnen werden. In entsprechenden Fällen kann das Fängerreagenz eine Schicht auf der Oberseite der Reaktionszone bilden, oder es kann in Partikeln vorliegen, die in der Matrix des porenhaltigen Materials der Reaktionszone festgehalten werden. Daher soll unter dem Begriff „immobilisiert", wie er hier verwendet wird, jedes Mittel mit einbezogen werden, durch welches das Fängerreagenz auf dem porenhaltigen Material fixiert wird.
  • Ein erster Schritt der vorliegenden Methode besteht darin, das Fängerreagenz innerhalb einer begrenzten Zone der Reaktionszone zu fixieren. Die Immobilisierung kann durch Methoden wie Adsorption, Absorption, Beschichtung durch Verdampfung eines flüchtigen Lösungsmittels, kovalente Bindung zwischen dem Fängerreagenz und der Reaktionsmembran oder immunologische Immobilisierung erreicht werden. Die kovalente Bindung kann zum Beispiel die Bindung des Fängerreagenzes an die Reaktionszone durch ein Kopplungsagens sein, wie etwa einem Cyanogenhalogenid, z. B. Cyanogenbromid oder durch die Verwendung von Gluteraldehyd, wie sie von Grubb et al. in U.S. Patent No. 4,186,146 beschrieben wird. Immunologische Immobilisierung auf der Reaktionsmembran kann durch Absorption oder durch kovalente Bindung, direkt oder durch einen Verbinder der Art, wie sie Fachleuten wohlbekannt ist, erfolgen. Geeignete Methoden zur Ausführung dieser Prozeduren geben zum Beispiel Iman and Hornby in Biochemical Journal (Volume 129; Page 255; Campbell, Hornby, und Morris In Biochem. Biophys. Acta (1975), Volume 384; Page 307; und Mattisson and Nilsson in F.E.B.S. letters, (1977) Volume 104, Page 78. Siehe auch U.S. Patente Nr. 4,376,110 und 4,452,901 z. B. Außerdem ist chemisch vorbehandeltes Material, das geeignet ist, um Antikörper zu binden, im Handel käuflich zu erwerben.
  • Für den praktischen Gebrauch der vorliegenden Erfindung wird der immunologischen Immobilisierung den Vorzug gegeben. Wenn zum Beispiel in die vorliegende Vorrichtung ein Sandwich-Immunoassay eingesetzt wird, bei dem Antikörper als das Fängerreagenz verwendet werden, dann wird die Reaktionsmembran mittels Adsorption mit Antikörpern imprägniert, wobei eine Dispenser/Printer-Methode (BioDot, California, USA) zum Einsatz kommt. Dazu gehört, dass ein oder mehrere bestimmte Antikörper auf die Membran appliziert werden, indem die direkt auf die Reaktionsmembran aufgesprüht werden. Die obige Methode wird am einfachsten ausgeführt unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Dispenser-Vorrichtung mit der Bezeichnung BIOJET QUANTI 3000, und liefert einen Fluss des immunologischen Proteins unter einer Vielzahl von Bedingungen und mit variierender Flussbreite. Bei Verwendung dieser Methode ist es möglich, schnell eine Reihe von Linien oder anderer bestimmter Muster auf die Reaktionsmembran aufzubringen, wobei jedes einen Antikörper mit unterschiedlicher antigenischer Spezifität zur Bindung von einem oder mehr Antigenen enthält. Daher ist die Anzahl der Antigene, die untersucht werden kann, eine Funktion der Anzahl der der verschiedenen Antikörper, die in bestimmten Mustern aufgetragen werden können.
  • Abhängig von den Nachweisgrenzen, die der Anwender dem diagnostischen Assay auferlegen will, kann das Fängerreagenz in einer Vielzahl von Konfigurationen einzeln oder in verschiedenen Kombinationen in die Reaktionszone eingebracht werden, um Nachweis- oder Messdaten in verschiedenen Formaten zu erzeugen. Zum Beispiel kann eine Palette mit zwei oder mehr verschiedenen spezifischen Bindungspartnern, die für den diagnostischen Assay als Fängerreagenzien gewählt wurden, auf verschiedene Bereiche der selben Reaktionsmembran aufgetragen werden, so dass das Vorhandensein mehrerer Analyten in einer einzigen flüssigen Testprobe zugleich untersucht werden kann, z. B. zum Nachweis von HIV und HCV. Vorzugsweise wird das Fängerreagenz in eine abgegrenzte Testzone eingebracht, deren Fläche wesentlich kleiner ist, als die gesamte Oberfläche des für die Reaktionszone verwendeten porenhaltigen Materials. Verschiedene Muster, die für die Verteilung des Fängerreagenzes geeignet sind, können, ohne weitere auszuschließen, Ziffern, Buchstaben, Punkte, Linien, Symbole und dergleichen sein, die dann das erkennbare Signal nach Abschluss des Assays wiedergeben. Vorzugsweise wird das Muster der diskreten Testzone aus einer einfachen Linie gebildet, um die optische Erkennbarkeit des Testergebnisses zu verbessern.
  • 4.3 FÄNGERREAGENZ
  • Da die vorliegende Apparatur für die Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe gestaltet wurde, muss ein Fängerreagenz bereitgestellt werden, das den Zielanalyten erkennt und sich spezifisch an ihn binden kann. Jemandem, der auf dem Fachgebiet über durchschnittliche Kenntnisse verfügt, wird verständlich sein, dass der Begriff „spezifische Bindung" sich auf die Wechselwirkung bezieht, die zwischen zwei oder mehr komplementären, nicht identischen Komponenten stattfindet und zur Bildung eines Komplexes führt. Beispiele für solche Bindungspaare sind Antigene und Antikörper, Hormone (und andere intrazelluläre Botenstoffe) und Zellrezeptoren, Zucker und Lektine. Ein jeder Partner des spezifischen Bindungspaars kann auf der Reaktionszone fixiert werden, wobei dann der andere Partner der Analyt ist, der in der Testprobe nachgewiesen wird. Ein Beispiel für die vorliegende Erfindung, ohne andere auszuschließen, ist die spezifische Bindungswechselwirkung, die als Ergebnis von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen auftritt. Es sollte allerdings verstanden werden, dass Begriffe, wie Antigen und Antikörper sich im Gebrauch nicht gegenseitig ausschließen, denn Antikörper können als Antigene für andere Antikörper agieren.
  • Wegen der relativen Leichtigkeit, mit der spezifische Antikörper jetzt gegen Antigene hergestellt werden können, dürfen oder können bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung monoklonale Antikörper verwenden, die an die Reaktionsmembran gebunden werden, um das Vorhandensein ihres spezifischen Antigens in einer flüssigen Testprobe nachzuweisen. Die monoklonalen Antikörper können einer beliebigen Klasse oder Unterklasse von Antikörpern angehören, einschließlich IgA, IgD, UdE, IgG (Unterklassen 1–4, wenn menschlich, 1, 2a, 2b, 3, wenn von Mäusen) oder IgM. Aktiv bindende Fragmente von Antikörpern können ebenfalls eingesetzt werden, wie z. B. Fab, Fv F(ab')2 oder dergleichen. Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist in der Fachwelt wohl bekannt und erfolgt entsprechend bekannter Methoden durch Fusionierung von Milzzellen eines Wirtes, der gegenüber das Antigen sensibilisiert wurde, mit Myelomzellen oder durch Transformierung der Milzzellen mit einem geeigneten Vektor zur Erzeugung einer unsterblichen Zelllinie. Die Zellen können in einem selektiven Medium kultiviert, kloniert und gescreent werden, um monoklonale Antikörper zu selektieren, welche die ausersehenen Antigene binden. Zur Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper können zahlreiche Verweise gefunden werden: (z. B. Kohler and Milstein, (1975) Nature (London) 256, 495–497; Kennet, R., (1980) in Monoclonal Antibodies (Kennet et al., Eds. pp. 365–367, Plenum Press, NY).
  • 4.4 KONTROLLZONE
  • Zusätzlich zu dem Fängerreagenz kann ein bestimmter Bereich der exponierten Reaktionszone außerdem ein Kontrollmolekül enthalten. Unter diesem Gesichtspunkt kann die Farbentwicklung an der Teststelle verglichen werden mit der Farbe aus einer oder mehreren Standardprüfungen, um zu bestimmen, ob die Reagenzien stabil sind und der Test sauber verläuft. Im Allgemeinen hat bei einem Test auf das Vorhandensein eines Zielanalyten die Diagnosevorrichtung eine eingebaute Kontrolle durch einen Antikörper, der auf menschliches Immunglobulin G (IgG), IgM. IgE oder IgA gerichtet ist. Wenn daher eine flüssige Testprobe der Diagnosevorrichtung zugeführt wird, wird Immunglobulin im Kontrollbereich gebunden, unabhängig davon, ob der Zielanalyt in der Probe vorhanden ist oder nicht. Eine geeignete Kontrolle kann z. B. eingerichtet werden durch die Verwendung von Protein A, wie in U.S. Patent Nr. 5,541,059 (Chu) dargelegt. Weitere geeignete Kontrollenverfahren sind in der Fachwelt wohlbekannt.
  • 4.5 BLOCKIERUNG DER REAKTIONSZONE
  • Wie oben angemerkt, werden das Fängerreagenz und das optionale Kontrollmolekül typischerweise nur auf eine definierte Region der exponierten Oberfläche der Reaktionszone aufgetragen. Das Fängerreagenz wird häufig auf einen Bereich in der Mitte der Reaktionszone aufgetragen, so dass der Randbereich der exponierten Oberfläche der Reaktionszone keinerlei dort gebundenes Fängerreagenz aufweist. Andererseits kann es in einigen Situationen sinnvoll sein, die gesamte exponierte Oberfläche der Reaktionszone mit dem Fängerreagenz abzudecken. Wenn jedoch das Fängerreagenz in einem begrenzten Bereich der exponierten Oberfläche der Reaktionszone fixiert wird, kann das porenhaltige Material oder die Membran, aus der die Zone hergestellt wurde, mit einer blockierenden Mischung behandelt werden, die den Zielanalyten und andere Komponenten der Probe von einer nicht-spezifischen Bindung an die Reaktionszone abhält. Bei Assays, bei denen nicht-spezifische Bindungen kein Problem darstellen, ist ein Blockierungsschritt nicht erforderlich. Auch die Verwendung von Nitrozellulose, die mit Papier von guter Qualität verstärkt ist, kann bei einigen Assays den Blockierungsschritt überflüssig machen. Wenn allerdings ein Blockierungsschritt erforderlich ist, können die üblichen Blockierungslösungen aus Rinderserumalbumin (BSA/RSA) oder anderen Proteinen, die die Reagenzien des Assays nicht beeinträchtigen oder in keine Kreuzreaktionen mit ihnen eingehen, verwendet werden. BSA/RSA wird gewöhnlich in Mengen von etwa 1 bis 10% eingesetzt.
  • Die Blockierungsbehandlung erfolgt typischerweise, nachdem die Analysevorrichtung bereits zusammengesetzt und das Fängerreagenz in der Reaktionszone fixiert wurde. Eine genügende Menge der blockierenden Mischung wird aufgetragen, um die exponierte Oberfläche der Reaktionszone zu bedecken. Nachdem die blockierende Mischung getrocknet ist, ist die Analysevorrichtung gebrauchsbereit.
  • 4.6 ABSORPTIONSZONE
  • Die Empfindlichkeit (d. h. die Fähigkeit, sehr kleine Mengen der Zielsubstanz nachzuweisen) von Immunoassays des Reaktionsmembran-Typs kann erhöht werden, wenn die Probe in der Reaktionszone aufkonzentriert wird. Bei einigen Vorrichtungen wird eine Hufkonzentration der Probe in der Reaktionszone dadurch erreicht, dass sich unter der Reaktionszone ein absorbierendes Material oder ein Kissen befindet, welche die der Oberfläche der Reaktionszone zugeführte Probe in das absorbierende Material darunter zieht. Die Absorptionszone kann aus jedem beliebigen Material erzeugt werden, das Flüssigkeiten durch Kapillarkraft aufsaugen kann, wie z. B. Baumwolle oder Papier. Immunoassays des Membranen-Typs, die verschiedene absorbierende Materialien verwenden, um die Probe zu konzentrieren, werden in den U.S. Patenten Nr. 5,185,127 , 5,006,464 , 4,818,677 , 4,632,901 , and 3,888,629 exemplarisch vorgestellt.
  • Ein absorbierendes Material wird unter der Unterseite der Reaktionszone angebracht, so dass es in direktem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone steht. Die Oberseite des absorbierenden Materials schließt daher unmittelbar an die Unterseite der Reaktionszone an. Der Flüssigkeitsaustausch durch direkten physischen Kontakt des absorbierenden Materials mit der Reaktionszone kann optional dadurch erfolgen, dass ein Teil des absorbierenden Materials durch eine eingeschobene Trennschicht mit einer darin befindlichen Öffnung von der Reaktionszone getrennt wird. Dementsprechend lässt die Trennschicht weiterhin den direkten Kontakt zwischen der Reaktionszone und der Absorptionszone zu und versetzt dadurch die Assay-Reagenzien in die Lage, gleichmäßig von der Oberseite abwärts zur Unterseite der Assay-Vorrichtung zu fließen. Obwohl für die Leistung des Apparates nicht entscheidend, dient die Trennschicht auch dazu, die porenhaltige Membran der Reaktionszone zu stützen. Die Trennschicht kann aus einem beliebigen festen oder halbfesten Material gemacht sein, das keine Bindung mit den Assay-Reagenzien eingeht, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden. Beispiele für Materialien für die Trennschicht 25 sind Glasfaser, Papier, hydrophiles Polypropylen oder Zellulose. Die Dicke der Trennschicht 26 ist allgemein im Bereich von etwa 0,1 mm bis 1 mm. In Ausführungen der Erfindung, bei denen einfache Herstellung und verringerte Kosten erwünscht sind, wird die Oberseite des absorbierenden Materials typischerweise direkt anschließend an die Unterseite der Reaktionszone angebracht.
  • Die Wahl des Materials für die Absorptionszone ist nicht von entscheidender Bedeutung, und eine Vielfalt von faserhaltigen Filtermaterialien kann verwendet werden, einschließlich einer oder mehrerer Schichten desselben oder verschiedener Materialien, vorausgesetzt, dass das gewählte Material mit dem Zielanalyten und den Assay-Reagenzien kompatibel ist. Jedes in üblicher Weise eingesetzte absorbierende Material das in der Lage ist, Flüssigkeit durch eine porenhaltige Membran zu ziehen oder zu saugen, zum Beispiel durch Kapillarkraft, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Das absorbierende Material sollte in der Lage sein, eine Menge der flüssigen Testprobe zu absorbieren, die gleich oder größer ist, als die gesamte Volumenkapazität des Materials selbst. Brauchbare bekannte Materialien sind Zelluloseacetatfasern, Polyester, Polyolefin oder andere solche Materialien. Das absorbierende Material bietet ein Mittel, die Probe zu sammeln, indem es für ein gleichförmiges „Saugen" sorgt, und die Probe von ihrem Ausgangsort durch die Reaktionszone hindurch und in das absorbierende Material hinein transportiert. Damit fungiert der Absorptionskörper zugleich als Reservoir zur Aufnahme der Probe und verschiedener Reagenzien, die bei der Durchführung des Assays verwendet werden. Dementsprechend sollte bei der Verwendung in Assays, bei denen relativ große Flüssigkeitsmengen zum Einsatz kommen, das absorbierende Material eine hohe Absorptionskapazität haben, um die Möglichkeit eines Rückflusses von Probe und Reagenzien aus dem Absorptionskörper zurück in die Reaktionsmembran auszuschließen oder zu minimieren.
  • Wie bei dem Material für die Reaktionszone, kann die Kapillarität des absorbierenden Materials ein wichtiger Parameter sein. Die Saugwirkungszeit (Wicking-Zeit) ist definiert als die Zeit, die Wasser benötigt, um sich über eine bestimmte Distanz durch das absorbierende Material zu bewegen und steht mit der Dicke und Porosität des Materials in Zusammenhang. Die Kapillarität kann sich bei verschiedenen Materialien stark unterscheiden, und daher können die Eigenschaften der Analysevorrichtung und die Fließgeschwindigkeit von Probe und Reagenzien durch Verwendung eines anderen absorbierenden Materials modifiziert werden.
  • 4.7 BLUTTRENNUNGSZONE
  • Um den Nachweis eines Zielanalyten in einer Vollblutprobe zu erleichtern, bietet eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Testeinheit an, die in der Lage ist, eine Vollblutprobe aufzunehmen und den flüssigen Anteil von den roten Blutkörperchen zu trennen, wozu sie eine Bluttrennungszone aufweist, die sich in lateralem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone befindet. Die Bluttrennungszone hat die Funktion, zelluläre Komponenten (d. h. rote Blutkörperchen), die in der Vollblutprobe enthalten sind, selektiv zurückzuhalten und die restlichen Komponenten des von RBK-freien flüssigen Anteils der Blutprobe, einschließlich eines Analyten, an die Reaktionszone zur möglichen Analyse zu übergeben. Diese besondere Eigenschaft ist nützlich, um jegliche Störung während der Visualisierung einer Farbreaktion zu verhindern und die Notwendigkeit, das Serum oder Plasma im voraus zu extrahieren, wird in Situationen, in denen die dazu geeignete Gerätschaft nicht verfügbar ist, umgangen.
  • Verschiedene Methoden zur Trennung von Blutzellen vom flüssigen Anteil von Blut werden beschrieben, wobei Trennbeschichtung, Erythrocyten-Aggregatbildung und Hämagglutine, Materialien mit asymmetrischen Porengrößen, Polymer-Matrizen und Mehrschichtsysteme zum Einsatz kommen, um einige zu nennen, z. B. U.S. Pat. Nr. 3,768,978 an Grubb et al., U.S. Pat. Nr. 3,902,964 an Greenspan, U.S. Pat. Nr. 4,477,575 an Vogel et al., U.S. Pat. Nr. 4,594,372 an Zuk, U.S. Pat. Nr. 4,753,776 an Hillman et al., U.S. Pat. Nr. 4816,224 an Vogel et al., U.S. Pat. Nr. 4,933,092 an Aunet et al., U.S. Pat. Nr. 5,055,195 an Trasch et al., U.S. Pt. Nr. 5,064,541 an Jeng et al., U.S. Pat. Nr. 5,076,925 an Roesink et al., U.S. Pat. Nr. 5,118,428 an Sand et al., U.S. Pat. Nr. 5,118,472 an Tanaka et al., U.S. Pat. Nr. 5,130,258 an Makino et al., U.S. Pat. Nr. 5,135,719 an Hillman et al., U.S. Pat. Nr. 5,209,904 an Forney et al., U.S. Pat. Nr. 5,212,060 an Maddox et al., U.S. Pat. Nr. 5,240,862 an Koenhen et al., U.S. Pat. Nr. 5,262,067 an Wilk et al., U.S. Pat. Nr. 5,306,623 an Kiser et al., U.S. Pat. Nr. 5,364,533 an Ogura et al., und U.S. Pat. Nr. 5,397,479 an Kass et al.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bluttrennungszone ein länglicher oder rechteckiger Streifen aus einem porenhaltigen Material, das über besondere physikalische Eigenschaften verfügt, die es in die Lage versetzen, vorzugsweise und in ausreichender Menge die roten Blutkörperchen in der Probe innerhalb der Bluttrennungszone einzufangen oder zurückzuhalten. Das vordere Ende der Bluttrennungszone, das in sich in kurzem lateralen Abstand von der Reaktionszone befindet, bestimmt einen Bereich zur Aufnahme der Vollblutprobe während des ersten Schritts des Assayprotokolls und als Vorstufe zur Einbringung des Zielanalyten in die Reaktionszone. Das hintere Ende der Bluttrennungszone, in direktem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone, unterstützt die Anregung der Bewegung des von roten Blutkörperchen freien Flüssigkeitsanteils der Blutprobe vom vorderen Ende der Bluttrennungszone zur Reaktionszone, wo er schließlich analysiert wird. Die Bluttrennungszone und die Reaktionszone müssen in Kontakt miteinander sein, damit ein optimaler Übergang der Probe von einer Zone zur anderen gewährleistet ist. Dementsprechend können sich die Materialien, die für die Bluttrennungszone und die Reaktionszone gewählt worden sind, leicht überlappen, um eine Migration des von RBK-freien Anteils der Vollblutprobe in genügender Menge sicherzustellen.
  • Eine Vielfalt von Materialien kann für die Bluttrennungszone eingesetzt werden, wie z. B. Glasfasern, Glasfaser/Zellulose-Mischungen, Zellulose oder anderen geschützten Materialien, einschließlich synthetischer Materialien, z. B. Nylon. Vorzugsweise kommt eine durchlässige Glasfasermatrix als Bluttrennungsmaterial zum Einsatz, um die Trennung von roten Blutkörperchen aus Vollblut zu erleichtern. Glasfasermaterialien sind in einer Vielzahl unterschiedlicher Stärken und Absorptionsvermögen im Handel erhältlich, dazu gehören zum Beispiel GF–24, GF–25, und #33, erhältlich von Schleicher & Schuell (Keene, N.H., USA); G143, G144, und G167, erhältlich von Ahlstrom (Mount Holly Springs, Pa., USA); GFQA30VA, GF/P 30, GF/DE 30, GF/SE 30, GF/CM30VA, GF/CM 30, F 075–14, F487–09, GF DVA, GFVA 20, und GD-2, erhältlich von Whatman (Fairfield, N.J., USA).
  • Brauchbare Glasfaser/Zellulosemischmaterialien sind F255–07 90 Glass/10 Zellulose, F255–09 70 Glas/30 Zellulose, F255–11 50 Glas/50 Zellulose, and F255–12 50 Glas/50 Zellulose, erhältlich von Whatman.
  • Brauchbare Zellulosematerialien sind 598, erhältlich von Schleicher & Schuell. Verschiedene oder andere Materialien, die nicht in die oben genannten Kategorien fallen, können ebenfalls verwendet werden, einschließlich HemaSep V und Leukosorb, welches ein Erzeugnis entsprechend der vorliegenden Erfindung ist, das von Pall BioSupport (Port Washington, N. Y., USA) erhältlich ist.
  • Ein brauchbares Nylonmaterial ist Nylon 6.6 Transfer Membrane, das unter dem Handelsnamen Biodyne B (Pall Specialty Materials, Port Washington, N. Y.) erhältlich ist. Außerdem kann das als „PlasmaSep" bekannte Material, erhältlich von Whatman, verwendet werden.
  • Obwohl Form und Abmessungen der Bluttrennungszone nicht von entscheidender Bedeutung sind, ist eine schmale, rechteckige Form zu bevorzugen, mit Abmessungen, die geeignet sind, die Entfernung einer wesentlichen Menge an roten Blutkörperchen aus der Vollblutprobe während der Migration des flüssigen Anteils der Probe vom vorderen Ende zum hinteren Ende der Zone zu ermöglichen. Während daher eine schmale, rechteckige Form zu bevorzugen ist, um den flüssigen Anteil der Blutprobe zu der Reaktionszone zu leiten, können die Maße in Abhängigkeit von den charakteristischen Eigenschaften (z. B. Absorptionsvermögen, Migrationsgeschwindigkeit, usw.) des Materials, das für die Bluttrennungszone gewählt wurde, tatsächlich variieren. In einer bevorzugten Ausführungsform, wird die Bluttrennungszone unter Verwendung des Glasfasermaterials F487–09, erhältlich von Whatman, hergestellt und hat Abmessungen zwischen ungefähr 4 bis 7 mm in der Breite, zwischen ungefähr 10 und 15 mm in der Länge und ungefähr 0,2 mm und 1 mm in der Dicke. Diese Abmessungen werden optimiert, um eine Aufnahme und Trennung der gesamten Menge einer Vollblutprobe zu ermöglichen, z. B. zwei Tropfen Blut.
  • Das Bluttrennungsmaterial hat vorzugsweise eine feste oder halbfeste Unterlage oder Verstärkung, die an seiner Unterseite befestigt ist, um für eine Auflage zu sorgen und ein Aussickern des RBK-freien Anteils der Vollblutprobe zu reduzieren, während er zur Reaktionszone migriert. Geeignete Materialien zum Gebrauch als Unterlage oder Verstärkung sind, zum Beispiel, hydrophobe Materialien wie Polykarbonat, Polyethylen, Mylar, Polypropylen, Vinyl, Zellofan, Polystyrol usw., wie auch wasserfeste oder feuchteresistente Pappe oder ähnliche Materialien. Die Auflage oder Verstärkung kann mit einem feuchteresistenten Kleber entweder direkt oder indirekt an dem Bluttrennungsmaterial befestigt werden.
  • Geeignete Klebstoffe sind in der Fachwelt wohl bekannt. Die Unterlage kann eine beliebige Form und fast jede beliebige Größe haben, die sich bequem handhaben lässt. Vorzugsweise hat die Unterlage jedoch eine ähnliche Form und Größe, wie das Bluttrennungsmaterial. Daher hat die Unterlage vorzugsweise die Form eines länglichen oder rechteckigen Streifens, der eine ähnliche oder die gleiche Länge und Breite hat, wie das Bluttrennungsmaterial.
  • 5.0 NACHFILTEREINHEIT
  • Wie oben besprochen, gehört zu der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, als zweite Komponente, eine Nachfiltereinheit, die aus einer Markierungszone besteht, die von einem getrockneten Indikatorreagenz durchdrungen ist.
  • Die Wahl des Materials für die Markierungszone ist nicht von entscheidender Bedeutung, und es kann jedes geeignete absorbierende, poren- oder kapillarhaltige Material sein, durch das der multifunktionelle Puffer und das resolubilisiertes Indikatorreagenz durch Kapillarkraft transportiert werden können. Das Kriterium für die Auswahl ist, dass das Material die Resolubilisierung und Mischung des getrockneten Indikatorreagenzes nach Zugabe des multifunktionellen Puffers ermöglicht, und ebenso, dass es den Übergang des Puffers und des neu gelösten Indiktorreagenzes zu der Reaktionszone der Testeinheit initiiert.
  • Natürliche, synthetische oder natürlich vorkommende Materialien, die synthetisch modifiziert wurden können als Filtermedium verwendet werden, einschließlich, ohne andere auszuschließen, Zellulosematerialien, wie etwa Papier, Zellulose und Zellulosederivate, wie etwa Zelluloseacetat und Nitrozellulose, Fiberglas, Stoff, Polyvinylchlorid-Filme und dergleichen. Obwohl ein bevorzugtes Filtermedium Nitrozellulose ist, sollte das Material nach seiner Fähigkeit ausgewählt werden, das Indikatorreagenz freizugeben, nachdem es mit dem multifunktionellen Puffer wieder verfügbar gemacht wurde. Überdies sollte die Fließbewegung durch das Filtermedium laminar erfolgen im Gegensatz zu turbulenten Fließeigenschaften, was eine genügende erste Mischung des Puffers mit dem Indikatorreagenz zulässt.
  • 5.1 INDIKATORREAGENZ
  • Die Verwendung eines Indikatorreagenzes zum Nachweis des Vorhandenseins eines Zielanalyten in einer Testprobe ist in der Fachwelt wohlbekannt. Abhängig von der Art des eingesetzten diagnostischen Assays, ist der in dem Indikatorreagenz verwendete Marker mit einem spezifischen Bindungspartner oder einem gewöhnlichen Markerprotein (z. B. Protein A, Protein G, anti-IgG) verknüpft, das sich direkt oder indirekt an den Zielanalyten bindet. Die Bildung eines Indikatorreagenzes zwischen einem spezifischen Bindungspartner, und der Marker kann von einer beliebigen herkömmlichen Art sein, einschließlich Metallkomplex-Marker, radioaktive Marker, Enzymmarker, fluoreszierende Marker, radioaktive Marker, chemolumineszente Marker o. ä. sein.
  • Ein wichtiger Gesichtspunkt bei der Gestaltung einer schnellen Diagnosevorrichtung ist, dass der Marker, der bei der Erzeugung des Indikatorreagenzes gewählt wird, ein deutlich erkennbares Signal bewirken sollte, zum Beispiel ein kräftig gefärbter Bereich, der leicht per Sichtkontrolle erkannt werden kann. Daher ist eine wichtige bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Verwendung von „direkten Markern", die an einen der spezifischen Bindungspartner gebunden werden. Direkte Marker sind in der Fachwelt wohlbekannt und äußert vorteilhaft bei einer Verwendung in schnellen Diagnosesystemen. Beispiele für direkte Marker sind, jedoch nicht ausschließlich, Metalllösungen, Lösungen von Nichtmetallen, Farbstofflösungen, Latexpartikel, Kohlenstofflösungen und Liposome mit eingeschlossenen Farbstoffen. Einige ihrer Vorteile sind, dass sie verwendet werden können, um ein optisch erkennbares Signal erzeugen zu können, ohne dass die Zugabe weiterer Reagenzien erforderlich ist, dass sie dem bloßen Auge ohne Zuhilfenahme von Geräten deutlich sichtbar sind, und dass sie leicht in Diagnosevorrichtungen verwendet werden können, denn bei Lagerung in trockenem Zustand sind sie stabil. Was das letztere betrifft, kann ihre Stabilität und unmittelbare Freisetzung bei Kontakt mit dem Pufferreagenz durch die Verwendung löslicher Glasuren erreicht werden. Angesichts der obigen Bemerkungen, sind indirekte Marker, wie Enzyme, z. B. alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase weniger vorzuziehen, weil sie gewöhnlich die Zugabe von einer oder mehreren Substanzen erfordern, bevor ein sichtbares Signal erkannt werden kann.
  • Lösungen von Nichtmetallen, wie etwa Selen, Tellur und Schwefel können nach Methoden hergestellt werden, wie sie in U.S Patent No. 4,954,452 (Post et al.) beschrieben sind. Lösungen von Farbstoffpartikeln können hergestellt werden wie von Gribnau et al., in U.S. Patent Nr. 4,373,932 und May et al., WO 88/08534 beschrieben, gefärbtes Latex wie von May, supra, Snyder, EP-_A 0 280 559 und 0 281 327 und in Liposome eingekapselte Farbstoffe wie von Campbell et al., U.S. Patent Nr. 4,703,017 beschrieben. Die Verwendung von polymerisierten farbigen Materialien in kolloidaler Form für spezifische Bindungsassays wird auch von Hirschreid in U.S. Patent Nr. 4,166,105 beschrieben, das sich mit markierten spezifischen Bindungsreagenzien befasst, die mit spezifischen Antigenen reagieren können, die durch Verknüpfung von fluoreszierenden Farbmolekülen präpariert wurden, um spezifische Antikörper durch Polymere mit reaktiven funktionellen Gruppen zu analysieren. Ebenfalls von Interesse ist U.S. Patent Nr. 4,313,734 von Leuvering, das sich mit Metalllösungen befasst; Leuvering, et al., "Sol Particle Immunoassay (SPIA)", Abstract, Journal of Immunoassay, 1(1), pp. 77–91 (1980); Leuvering Dissertation (1984), Sol Particle Immunoassay (SPIA): The Use of Antibody Coated Particles as Labeled Antibodies in Various Types of Immunoassay; Uda et al., Anal. Biochem. 218 (1994), 259–264, DE_OS 41 32 133 , Page 3, lines 16–18, in der Anwendung als Marker und Tang et al., Nature 356 (1992), 152–154; Eisenbraun et al., DNA and Cell Biology 12 (1993), 791–797. Weiterhin ist auch bekannt, dass nichtmetallische kolloidale Partikel, wie Kohlenstoffpartikel (van Amerongen, Anabiotic '92 (1993), 193–199). Moeremans, et al., ebenfalls verwendet werden können. EPO Application Nr. 158,746 legt die Verwendung von kolloidalen Metallpartikeln als Marker in Sandwich-Blot-Overlay-Assays dar. Gegenwärtig werden kolloidale Goldpartikel am häufigsten eingesetzt.
  • Unter den direkten Markern sind Metalllösungen zu bevorzugen, insbesondere Partikel in Goldlösungen, wie von Leuvering in U.S. Patent Nr. 4,313,734 beschrieben. Leuvering legt die Verwendung von Partikeln in Metalllösungen als Marker für die in vitro-Bestimmung von immunologischen Komponenten in einem wässrigen Testmedium offen. Insbesondere werden Immunoassay-Test-Kits zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern offen gelegt, bei denen eine oder mehrere markierte Komponenten eingesetzt werden, die durch Kopplung der Komponente an Partikel in einer wässrigen Dispersionslösung eines Metalls, einer Metallverbindung oder von mit einem Metall oder einer Metallverbindung umhüllten Polymerkernen mit einer Partikelgröße von mindestens 5 nm erhalten wurden.
  • Die Metall-Sol-Partikel, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden sollen, können durch Verfahren hergestellt werden, die in der Fachwelt bereits wohl bekannt sind. Die Herstellung von Goldlösungspartikeln wird zum Beispiel von G. Frens, Nature, 241, 20–22 (1973) dargestellt. Zusätzlich können die Metalllösungspartikel Metalle oder Metallverbindungen oder mit Metallen oder Metallverbindungen umhüllte Polymerkerne sein, wie in dem oben erwähnten Leuvering-Patent beschrieben. In dieser Hinsicht können die Metalllösungspartikel Platin, Gold, Silber oder Kupfer oder eine beliebige Metallverbindung sein, die eine charakteristische Farbe aufweist.
  • 5.2 KOLLOIDALE GOLDPARTIKEL
  • Zu den kolloidalen Partikeln, die sich entsprechend der Erfindung als Marker eignen, gehören solche, die mit spezifischen Bindungspartnern oder gewöhnlichen Markerproteinen verknüpft werden können, ohne die Aktivität solcher Reagenzien oder anderer Reagenzien oder Analyten zu beeinträchtigen.
  • Kolloidale Metallpartikel sind entsprechend der vorliegenden Erfindung als Marker besonders geeignet und sind solche Partikel, die aus Metallen oder Metallverbindungen bestehen, die zu der folgenden Gruppe gehören: Den Metallen Platin, Gold, Silber und Kupfer und den Metallverbindungen Silberjodid, Silberbromid, Kupferhydroxid, Eisenoxid, Eisenhydroxid oder wasserhaltiges Eisenoxid, Aluminium oder wasserhaltiges Aluminiumoxid, Chromhydroxid oder wasserhaltiges Hydroxid, Bleisulfid, Quecksilbersulfid, Bariumsulfat und Titandioxid. Bevorzugte kolloidale Metallpartikel sind solche, die aus Gold hergestellt wurden.
  • Kolloidale Goldpartikelmarker sind einfach im Gebrauch verglichen mit anderen gebräuchlichen Markern. Zum Beispiel benötigen sie keine Geräte, wie sie zum Nachweis anderer Marker, wie z. B. radioaktive Isotope erforderlich sind, und anders als Enzyme erfordern sie nicht im zusätzlichen Schritt die Zugabe eines Substrats.
  • Kolloidale Goldpartikel können nach Verfahren hergestellt werden, die in der Fachwelt allgemein bekannt sind. Von Interesse für die vorliegende Erfindung sind solche Verweise, die sich mit der Verwendung von Dispersionen von kolloidalen Partikeln in immunologischen Assayverfahren befassen. Insbesondere legt Frens, Nature, 241, 20–22 (1973) Methoden für die Herstellung von Goldlösungspartikeln verschiedener Größe durch Reduktion von Goldchlorid mit wässrigem Natriumcitrat dar. Die Farbe des optisch erkennbaren Signals des Metallpartikel-Markers hängt von Identität und der Partikelgröße des Metallpartikels ab, die durch Variation der Konzentration der Reaktionspartner eingestellt werden kann. Zum Beispiel erzeugen Goldpartikel Farben im Bereich von Orange bis Rot bis Violett, abhängig von der Partikelgröße der Lösung.
  • Das kolloidale Goldreagenz wird wegen seiner ungewöhnlichen Eigenschaften gewählt, einschließlich der Fähigkeit, die Farbe für das bloße Auge deutlicher zu machen, wenn es auf festen Oberflächen aufkonzentriert wird, sich nur minimal nicht-spezifisch an feste Oberflächen zu binden, in relativ gleichförmigen Partikelgrößen hergestellt zu werden und leicht lyophilisiert und resolubilisiert zu werden. Kolloidale Goldpartikel können auf vielerlei Weise durch die Reduktion von Tetrachlorgoldsäure hergestellt werden, wodurch eine Vielfalt von Partikelgrößen im Bereich von 5 nm bis 100 nm erzeugt werden. Die bevorzugte Partikelgröße liegt zwischen 15 und 20 nm. Die kolloidalen Goldpartikel können einen vermittelnden Binder besitzen, der vor der Zugabe der bindenden Substanz an ihre Oberfläche adsorbiert wird, aber eine direkte Anbindung ist ausreichend. Die Absorption der gewählten bindenden Substanz wird erreicht durch sorgfältige Kontrolle der Konzentration, Ionenstärke und des pH-Wertes der Reaktionsmischung. Die Auswahl an Methoden zur Erzeugung des kolloidalen Gold-Rohmaterials oder an Methoden zur Anbindung der bindenden Substanz ist Fachleuten wohl bekannt. Nach Durchführung der Markierung mit kolloidalem Gold wird das Reagenz unterschiedlich zentrifugiert oder gefiltert, um die Partikelgröße einzustellen. Partikelgrößeneinstellung durch Gelfiltrationsmethoden sind ebenfalls wohl bekannt. Das mit kolloidalem Gold markierte Reagenz kann als kolloidale Suspension oder als lyophilisiertes Reagenz mit oder ohne Vorhandensein der erwähnten Festphasenpartikel als Indikatorreagenz verwendet werden.
  • Die resultierenden beschichteten und stabilisierten kolloidalen Metallpartikel können dann an verschiedene Proteine geknüpft werden. Jedes Protein, das durch Gefriertrocknung oder einer anderen Form der Trocknung, wie durch einen Inkubator, Lufttrocknung oder Sprühtrocknung behandelt werden kann, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Beispiele für Proteine zur Verwendung für die vorliegende Erfindung sind, ohne andere auszuschließen, polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antigene, Lektin, Protein A, Protein G, bakterielles Protein und dergleichen. In solchen Fällen, bei denen bei einem immunodiagnostischen Assay im Sandwich-Format ein Antikörper als Fängerreagenz eingesetzt wird, um ein Antigen als Zielanalyten nachzuweisen, ist der Bindungspartner des Indikatorreagenzes gewöhnlich ein zweiter Antikörper, der spezifisch ist für das Antigen, das an den ersten Antikörper gebunden ist, der sich aber an einer Stelle des Antigens anbindet, die abseits ist von der Stelle, an der der erste Antikörper angebunden ist. Andererseits ist der Bindungspartner des Indikatorreagenz gewöhnlich ein Analogon oder ein anderes authentisches Exemplar des Antigens, das sich an dem Fängerreagenz an derselben Stelle anbinden kann, wo sich der Zielanalyt im Fall eines kompetitiven Formats anbindet.
  • Für Details und Herstellungsprinzipien die bei der Synthese von Farbpartikelverbindungen involviert sind, siehe Horisberger, Evaluation of Colloidal Gold as a Cytochromic Marker for Transmission and Scanning Electron Microscopy, Biol. Cellulaire, 36, 253–258 (1979); Leuvering et al, Sol Particle Immunoassay, J. Immunoassay 1 (1), 77–91 (1980), und Frens, Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions, Nature, Physical Science, 241, pp. 20–22 (1973). Surek, et al., Biochem, and Biophys. Res. Comm., 121, 284–289 (1984) stellt die Verwendung von mit kolloidalen Goldpartikeln markiertem Protein A für den Nachweis von spezifischen auf Nitrozellulose-Membranen fixierten Antigenen dar.
  • 5.3 TROCKNUNGSPROZESS - ZUCKER/GLASIERUNGSBEHANDLUNG
  • Einem wichtigen Aspekt der Erfindung gemäß, ist unter der Markierungszone der Nachfiltereinheit im Wesentlichen das Indikatorreagenz zu. verstehen, mit dem in getrockneter Form ein porenhaltiges Material durchgehend imprägniert wurde, und das dann durch die Zugabe des multifunktionellen Puffers resolubilisiert werden kann. Auf diese Weise ermöglicht es die Integration eines der Assay-Reagenzien in die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, die Anzahl der Schritte, die für die Durchführung des Assayprotokolls erforderlich sind, zu reduzieren, dadurch dass die Zugabe oder vorausgehende Zumischung eines Indikatorreagenzes entfällt.
  • Um die freie Beweglichkeit des Indikatorreagenzes zu unterstützen, wenn die Markierungszone der Nachfiltereinheit mit dem multifunktionellen Puffer befeuchtet wird, wird die Nachfiltereinheit in dem Bereich, in dem das Indikatorreagenz aufgetragen wird, mit einem glasierenden Material behandelt. Eine Glasierung kann zum Beispiel erreicht werden durch Auftragen einer wässrigen Zucker- oder Zelluloselösung, z. B. von Saccharose oder Lactose, auf den betreffenden Bereich der Nachfiltereinheit, wo sie eintrocknet, wobei der übrige Bereich der Filtereinheit ausgelassen wird. Das Indikatorreagenz kann dann auf den glasierten Teil aufgetragen werden.
  • Der Glasierungsvorgang, bei dem ein oder mehrere Zucker einbezogen werden (z. B. Glucose, Lactose, Trehalose oder Saccharose), ist von großem Vorteil, wenn das getrocknete Indikatorreagenz der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, weil der Zucker (1) als Proteinstabilisator dient und (2) die Langzeit-Stabilität des getrockneten Indikatorreagenzes verbessert sowie (3) die schnelle Freisetzung fördert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde festgestellt, dass Saccharose im Vergleich mit anderen Zuckern am besten bei der Ausführung des Assays war, wegen ihrer (1) Löslichkeit, (2) kurzen Trocknungszeit, (3) der Gesamtempfindlichkeit des Assayergebnisses, (4) ihrer Brauchbarkeit als Konservierungsmittel und (5) ihrer geringen Gebrauchskosten.
  • 6.0 PUFFER REAGENZ
  • Konventionelle diagnostische Assays erfordern gewöhnlich die Verwendung von zwei oder mehr flüssigen Reagenzien, um verschiedene Schritte des Assayprotokolls durchzuführen, einschließlich, zum Beispiel, Resolubilisierung eines getrockneten Indikatorreagenzes, Verdünnung einer flüssigen Testprobe, Blockierung der Membranoberfläche, wo die Assay-Reaktion stattfindet, Unterstützung des Transports kritischer Reagenzien und/oder Auswaschung ungebundener Reaktionspartner aus der Reaktionszone. Da jeder dieser Schritte die Mischung oder Präparation verschiedener Reaktionspartner einbezieht, werden wegen der Unterschiede in pH-Wert, Ionenstärke, Zusätze, Art und Stärke des Puffers, Temperatur usw. wahrscheinlich unterschiedliche Zusammensetzungen der flüssigen Reagenzien verlangt. Zum Beispiel verlangt der Resolubilisierungsvorgang gewöhnlich die Verwendung eines physiologischen Puffers, etwa eine gepufferte Salzlösung oder doppelt destilliertes Wasser, der Blockierungsvorgang verwendet ein flüssiges Reagenz, das aus einer Anzahl von Tierserumalbuminen, Gelatine oder Magermilch gebildet wird, und der Auswaschungs- und/oder Verdünnungsvorgang bezieht die Verwendung einer phosphatgepufferten Salzlösung ein, die verschiedene Mengen an grenzflächenaktive Substanzen oder Detergenzien mit neutralem pH enthält, um alle nicht-spezifischen Bindungsreaktionspartner zu entfernen. Überdies müssen, um sicherzustellen, dass der Anwender jeden Schritt des Assays korrekt ausführt und das richtige flüssige Reagenz verwendet, die Reagenzien selbst deutlich beschriftet und klar von einander zu unterscheiden sein, um jede Möglichkeit von Verwechslungen und Anwenderfehlern zu vermeiden.
  • Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung beseitigt die verschiedenen oben beschriebenen Probleme, die mit der Verwendung von mehreren Assayreagenzien verbunden sind, durch die Bereitstellung eines multifunktionellen Puffers zur einzelnen Verwendung bei dem zweischrittigem Assayverfahren. Der multifunktionelle Puffer ist so zusammengesetzt, dass er als eine Kombination aus Resolubilisierungsreagenz für das getrocknete Indikatorreagenz, Transportförderungsreagenz für den Transport des resolubiliserten Indikatorreagenzes von der Markierungszone der Nachfiltereinheit zu der Reaktionszone der Testeinheit und Waschreagenz, um ungebundene Reaktionspartner von der Reaktionszone zu entfernen, dient. Um die Anzahl der Schritte und Reagenzien, die zur Durchführung des Assays erforderlich sind, zu verringern, wurde der multifunktionelle Puffer speziell so formuliert, dass er in Verbindung mit dem getrockneten Indikatorreagenz eingesetzt werden kann. Es ist daher von besonderem Vorteil, den multifunktionellen Puffer und das getrocknete Indikatorreagenz als kombiniertes System einzusetzen, da der multifunktionelle Puffer eine optimale Empfindlichkeit und das Erreichen einer höheren Spezifität während der Durchführung des Assays zulässt, während zusätzlich eine Verklumpung und Inaktivierung des getrockneten Indikatorreagenzes in der Lösung vermieden wird.
  • Wie für Fachleute ersichtlich ist, kann sich die Zusammensetzung des multifunktionellen Puffers entsprechend den Bedingungen des spezifischen Assays ändern, wie zum Beispiel das bestimmte Fängerreagenz und Indikatorreagenz, die eingesetzt werden, um das Vorhandensein eines Zielanalyten in einer Testprobe zu bestimmen, ebenso so wie die Art des Analyten selbst. Im Allgemeinen enthält der multifunktionelle Puffer Komponenten, die bei dem Assay primäre Funktionen ausüben aufgrund ihrer Fähigkeit, als Verdünnungs-, Wasch- und Resolubilisierungsagens zu dienen. Da jedoch die Reaktionszone bei der vorliegenden Erfindung nach der Immobilisierung des Fängerreagenz es schon mit konventionellen Blockierungsmitteln vorbehandelt wurde, entfällt aufgrund der Pufferzusammensetzung die Notwendigkeit, ein nicht-spezifisches Blockierungsmittel mit einzubeziehen. Eine Methode zur Verwendung des multifunktionellen Puffers, wie sie von der vorliegenden Erfindung angeboten wird, besteht im Wesentlichen in der tropfenweisen Zugabe des Puffers zu der Nachfiltereinheit im abschließenden Schritt des zweischrittigen Assays, um das getrocknete Indikatorreagenz zu resolubilisieren. Ein Kit, das den multifunktionellen Puffer als Komponente enthält, wird ebenfalls angeboten.
  • Dementsprechend bietet die vorliegende Erfindung einen verbesserten Puffer an, der als multifunktionelles Reagenz dient, ohne dass weder die Empfindlichkeit noch die Spezifität des Assays Einbußen erleiden, bestehend aus: (1) Einem biologischen Puffer, um den pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 10,0 zu halten; (2) mindestens einem oberflächenaktiven Mittel, um die nicht-spezifische Bindung von Assay-Reagenzien zu reduzieren und zugleich die Verhinderung einer spezifischen Bindungswechselwirkung zu vermeiden; (3) einem Polymer mit hohem Molekulargewicht als Dispersions- und Suspensionsmittel, der ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 × 102 bis etwa 2 × 106 Da hat; (4) einem pH-Stabilisator, um den pH des multifunktionellen Puffers zwischen etwa 7,0 und 10,0 zu halten; (5) ein ionisches Salz, um die nicht-spezifische Bindung von Antikörpern zu reduzieren; (6) mindestens ein Konservierungsmittel um das bakterielle und mikrobielle Wachstum zu vermindern, und (7) einen Kalziumchelator, um das Verklumpen einer Vollblutprobe zu verhindern; wobei biologischer Puffer, oberflächenaktives Mittel, hochmolekularer Polymer, pH-Stabilisator, ionisches Salz, Konservierungsmittel und Kalziumchelator alle in wirksamen Konzentrationen auftreten.
  • Die Zusammensetzung des verbesserten multifunktionellen Puffers der Erfindung kann einen konventionellen Puffer beinhalten, etwa einen Phosphatpuffer, MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure)-Puffer, BisTris-Puffer, Zitratpuffer, Tris-HCl-Puffer oder Boratpuffer in einer wirksamen Konzentration, die im Bereich von etwa 5 bis 100 mM sein kann, vorzugsweise im Bereich von etwa 5 bis 30 mM, 5 mM ist besonders vorzuziehen. Der bevorzugte Puffer ist ein Phosphatpuffer, vorzugsweise Natriumphosphat monobasisch und Natriumphosphat dibasisch, bei solchen Konzentrationen, dass der wirksame pH-Wert des Puffers erreicht wird. Der pH-Wert des Puffers bei der vorliegenden Erfindung kann im Bereich von etwa pH 7.0 bis etwa pH 10.0 liegen.
  • Die biologischen Detergenzien (oberflächenaktive Mittel), die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können nicht-ionische oberflächenaktive Mittel sein, anionische oberflächenaktive Mittel, zwitterionische oberflächenaktive Mittel und kationische oberflächenaktive Mittel. Zu den nicht-ionischen Detergenzien, die für die Erfindung nützlich sind, gehören Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat (Tween®20), Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat (Tween®80), Polyoxyethylen-Ether (Triton®, Brij®) und Octylphenolpolyethylenoxid (Nonidet®). Vorzugsweise werden nicht-ionische Detergenzien verwendet. Das am meisten bevorzugte nichtionische Detergenz ist Triton®X-100. Nicht-ionische Detergenzien wirken als Dispersionsmittel und reduzieren die nicht-spezifische Bindung von Antikörpern/Antigenen an die Reaktionsmembran, die als Ergebnis auftreten kann, wenn ein Analyt sich in Folge einer nicht-spezifischen Reaktion an die Festphase anhaftet und dadurch den Hintergrund des Assays verstärkt. Obwohl biologische Detergenzien das Auftreten solcher durch nichtpolare oder hydrophobe Wechselwirkungen verursachten Bindungen reduzieren, sind nicht-ionische Detergenzien wegen ihrer Fähigkeit vorzuziehen, nicht-spezifische Bindungen zu reduzieren ohne dabei spezifische Bindungen zu behindern. Wirksame Konzentrationen der biologischen Detergenzien sind im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,50%, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 0,10% und besonders vorzuziehen ist eine Konzentration von etwa 0,07% w/v.
  • Ionische Salze bieten eine Quelle für Kationen und Anionen, die hilfreich sind bei der Reduzierung der Häufigkeit der durch ionische Wechselwirkungen verursachten nicht-spezifischen Bindung von Antikörpern, die keine Analyt-Antikörper sind. Salze, die bei der Formulierung des multifunktionellen Puffers verwendet werden können, sind NaCl und KCl, NaCl ist besonders vorzuziehen. Wirksame Konzentrationen von Natriumchlorid sind im Bereich von etwa 0 bis etwa 300 mM, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 mM.
  • Das Polymer mit hohem Molekulargewicht wirkt als Dispersions- und Suspensionsmittel, während es zugleich die Bindungskapazität von Antikörpern bewahrt. Beispiele für Polymere mit hohem Molekulargewicht, die in dem Puffer verwendet werden können, sind Polyvinylpyrrolidon (PVP), Dextrane, Polyethylenglycol (PEG), und Polyvinylalkohol, um einige zu nennen. Das bevorzugte Polymer mit hohem Molekulargewicht zur Verwendung bei der Herstellung des Puffers ist PVP, besonders vorzuziehen PVP-40, bei wirksamer Konzentration. Wirksame Konzentrationen von PVP in dem Puffer der Erfindung sind im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 3,0% w/v, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 2,5% und besonders vorzuziehen ist eine Konzentration von etwa 1,4%. Das Polymer mit hohem Molekulargewicht, das für die Verwendung bei der Erfindung gewählt wurde, kann PVP sein mit Molekulargewichten von etwa 10 kDa bis etwa 2000 kDa, Dextrane mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 10 kDa bis etwa 2.000 kDa, Polyethylenglycol (PEG) mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 200 Da bis etwa 10.000 Da und Polyvinylalkohol mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 10,000 Da bis etwa 100.000 Da. Andere Beispiele für Polymere mit hohem Molekulargewicht sind noch Polybrene (Hexadimethrinbromid), Methylzellulose, Gummiarabikum, Protaminsulfat, Merquat, Celquat und Magnafloc, jeweils in einer wirksamen Konzentration.
  • Vorzugsweise wird ein Kalziumchelator bei der Zusammenstellung des multifunktionellen Puffers miteinbezogen, z. B. Ethylendiamintetraessigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat (EDTA), um ein mögliches Verklumpen einer Vollblut-Testprobe aus dem Finger durch den Blutgerinnungsprozess zu verringern oder zu verhindern. Andere Kalziumchelatoren als EDTA, wie etwa Citrat, Citratsalze und Ethylenbis(oxyethylennitrilo)-tetraessigsäure, können in gleicher Weise verwendet werden. Nicht-chelierende Biopolymere, wie etwa Heparin und sulfatisiertes Chitosan, die bestimmte Verklumpungsfaktoren während des Blutgerinnungsprozesses inaktivieren, können ebenfalls verwendet werden. EDTA ist Bestandteil der Pufferzusammensetzung in einer wirksamen Konzentration im Bereich von etwa 5 mM bis 100 mM, vorzugsweise von etwa 10 mM bis etwa 50 mM und besonders vorzuziehen mit etwa 20 mM.
  • Der pH-Stabilisator hat die Funktion, den pH-Wert des Puffers innerhalb eines Bereichs von etwa pH 7,0 bis 10,0 zu halten. Ein Beispiel für einen pH-Stabilisator ist Trisma Hydrochlorid, obwohl andere bekannte Stabilisatoren in dieser Zusammensetzung ebenfalls brauchbar sind. Die wirksame Konzentration von Trisma Hydrochlorid liegt vorzugsweise zwischen 20 und 30 mM.
  • 7.0 GEHÄUSE
  • Generell kann die Assay-Zusammenstellung, die aus der Testeinheit und der Nachfiltereinheit besteht, in einem geeigneten Behälter aufbewahrt werden und so eine analytische Apparatur bilden. Vorzugsweise sollte der Behälter die Festphasenmaterialien und das getrocknete Indikatorreagenz vor Verschmutzung schützen und eine einfache und praktische Handhabung der Assayvorrichtung bieten. Überdies sollte der Behälter auslaufsicher sein und dadurch die Aufbewahrung von Flüssigkeiten und ihre sichere Entsorgung nach Gebrauch gewährleisten.
  • Die in den 4 und 5 dargestellte Vorrichtung 13 bietet ein repräsentatives Beispiel für die Art von Behälter, die zu einem Test-Kit gehören kann, das die Flow-Through-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Vorrichtung 13 besteht aus zwei abnehmbaren Komponenten, nämlich der Testkartusche 14 und dem Nachfilteraufsatz 15, die vertikal und räumlich von einander getrennt sind, wenn sie während des Assayprotokolls in vorübergehenden Flüssigkeitsaustausch treten. Das Gehäuse ist in der Lage, die Schichten der Testeinheit unter Druck zu halten, so dass kontinuierlicher und gleichförmiger Kontakt zwischen ihnen besteht und die Flüssigkeit gleichförmig durch die Vorrichtung 13 fließt. Das Gehäuse wird aus einem inerten Material hergestellt und besteht praktischer Weise aus irgendeiner Art im Handel erhältlichen, wegwerfbaren Kunststoff, der geformt werden kann, zum Beispiel Polyethylen, Polypropylen, Styrol, ABS, Polyacrylat, Polystyrol oder dergleichen.
  • Obwohl Konfiguration und Abmessungen der beiden Komponenten der Vorrichtung 13 so sind, wie sie hier speziell beschrieben wurden, kann jede andere geeignete Gestaltung oder Modifikation eingesetzt werden, solange die Komponenten weiterhin so beschaffen sind, dass sie während des Assayprotokolls in einem Schritt vorübergehend miteinander verbunden zu werden können. Das Mittel, um die beiden Komponenten miteinander zu verbinden, ist nicht von entscheidender Bedeutung, solange sie sauber aneinander anschließen, um nach Verbindung des Nachfilteraufsatzes 15 mit der Testkartusche 14 einen optimalen Flüssigkeitsaustausch zu bewirken. Zum Beispiel kann entsprechend dem Entwurf, der in den 4 und 5 gezeigt wird, der Nachfilteraufsatz 15 kraftschlüssig mit dem Reservoir 22 der Testkartusche 14 verbunden werden. Obwohl hier nicht dargestellt, kann der Nachfilteraufsatz 15 optional durch ein Scharnier mit der Testkartusche 14 verbunden werden, um einen möglichen Verlust oder ein Verlegen der beiden Komponenten zu vermeiden. Andererseits könnten die beiden Komponenten durch Verschieben mit einer einzigen Bewegung reversibel angeordnet werden, vorausgesetzt, die Nachfiltereinheit ist über der Testeinheit sauber kraftschlüssig verbunden. In diesem besonderen Beispiel, kann eine saubere Ausrichtung der beiden Komponenten durch die Verwendung von Führungsschienen oder Ausbuchtungen erreicht werden, die so gestaltet werden, dass sie in Vertiefungen in der Vorrichtung oder dem Gehäuse passen, und die zusätzlich als Verbindungsmittel für die beiden Komponenten dienen.
  • Die genauen Abmessungen des Gehäuses sind nicht von entscheidender Bedeutung für das Funktionieren der Assay-Vorrichtung, aber im Allgemeinen hat die Vorrichtung eine Größe, die praktisch ist für Transport, Handhabung und Zusammenbau. Das Gehäuse hat generell eine Länge von etwa 2 bis 5 cm, vorzugsweise 3,5 cm. Die Breite beträgt 1 bis 3 cm, vorzugsweise 2,5 cm. Die Höhe beträgt etwa 0,5 bis 5 cm, vorzugsweise 1,3 cm.
  • 4 bietet eine Explosionsansicht der Vorrichtung 13 die aus der Testeinheit 2 und der Nachfiltereinheit 3 besteht, während 5 eine vergrößerte vertikale Querschnittsansicht der vollständig zusammengesetzten Vorrichtung 13 bietet. Die Vorrichtung 13 der vorliegenden Erfindung besteht in seiner vollständig zusammengesetzten Form aus zwei getrennten Komponenten, nämlich der Testkartusche 14, die die Testeinheit 2 enthält, und dem Nachfilteraufsatz 15, der die Nachfiltereinheit 3 enthält. Die Testkartusche 14 und der Nachfilteraufsatz 15 sind so gestaltet, dass sie während des Assayprotokolls kurz miteinander verbunden werden können. Die Vorrichtung 13 soll in Design und Konstruktion einfach sein und kann unter Verwendung leicht verfügbarer Materialien hergestellt werden.
  • Wie in 4 gezeigt, birgt die Testkartusche 14 der Vorrichtung 13 die Testeinheit 2, die aus einem Oberteil 16 und einem Unterteil 17 besteht. Der äußere Rand des Unterteils 17 hat eine leicht vertiefte Kante 18, durch die es mit dem Rand 19 des Oberteils verbunden werden, und damit die Testkartusche 14 zusammengesetzt werden. kann. Fachleute werden abschätzen können, dass, während die Testkartusche 14, die in den 4 und 5 gezeigt wird, eine rechteckige Form hat, sie nicht auf diese besondere Gestalt festgelegt ist, solange sie angepasst werden kann, um das Absorptionsmaterial oder ein Kissen 20 in direktem Kontakt mit der Reaktionsmembran 21 zu halten.
  • Im Oberteil 16 der Testkartusche 14 enthalten ist ein Reservoir 22, das direkt auf die exponierte Reaktionsmembran 21 der Testeinheit 2 ausgerichtet ist.
  • Das Reservoir 22 (a) bietet Zugang zu der Reaktionszone, um die flüssige Testprobe einzuführen, (b) sorgt für eine funktionsfähige Anbringung des Nachfilteraufsatzes 15 zur Einführung des multifunktionalen Pufferreagenzes und (c) ermöglicht eine Betrachtung des Testresultats auf der Reaktionsmembran 21 nach Entfernung des Nachfilteraufsatzes 15, d. h. die Farbe oder Fluoreszenz oder ein anderes Signal in der/den Indikatorzone(n) zu erkennen. Wie in der Zeichnung gezeigt, ist die Oberseite, die das Reservoir umgibt, leicht gewölbt und abwärts gebogen, so dass ein tassenförmiger Aufnahmebehälter gebildet wird, der zu einer Stelle auf der Reaktionsmembran 21 führt. Auf diese Weise kann die Menge an Testprobe, die in das Reservoir 22 eingeführt wird, keine Komponente der Vorrichtung 13 umgehen. Die Konfiguration der Innenwand 23 und die Abmessungen des Reservoirs 22 werden so gewählt, dass das Reservoir 22 an den Nachfilteraufsatz angeschlossen und während des Assayprotokolls in eine funktionsfähige Verbindung gebracht werden kann. Vorzugsweise haben sowohl das Reservoir 22 als auch der Nachfilteraufsatz 15 eine trichterförmige Gestaltung. Daher ermöglicht diese Konfiguration, wenn das Reservoir 22 und der Nachfilteraufsatz 15 in Betriebsposition sind und der multifunktionelle Puffer auf den Nachfilteraufsatz aufgetragen wird, dass eine geeignete Menge des Puffers mit einer kleinen Fläche an der Oberseite der Reaktionsmembran 21 in Berührung kommt und diese durchwandert. Durch gezielte Anpassung der Größe des Reservoirs 22 an den Nachfilteraufsatz 15 kann daher der Betrieb der Vorrichtung 13 vereinfacht werden, so dass, zum Beispiel, der multifunktionelle Puffer 12 in einen einzigen Schritt des Assayablaufs an das Reservoir 22 übergeben werden kann.
  • Entsprechend der Ausführungsform, die in den 4 und 5 gezeigt wird, ist der Nachfilteraufsatz 15 abnehmbar mittels Einrastverschluss kraftschlüssig zwischen der Innenwand 23 des Reservoirs 22 und der Außenwand 33' des Filteraufsatzes 15 am Reservoir 22 der Testkartusche 14 befestigt. Ähnliche Möglichkeiten, um den Nachfilteraufsatz 15 abnehmbar an der Testkartusche 14 zu befestigen, können verwendet werden. Zusätzlich ist die Höhe der Außenwand 33' des Nachfilteraufsatzes 15 geringfügig niedriger, als die Höhe der Innenwand 23 des Reservoirs 22, so dass, wenn der Filteraufsatz an dem Reservoir 22 befestigt wird, der Boden 24 des Filteraufsatzes 15 unmittelbar über der Reaktionsmembran 21 endet, ohne sie zu berühren. Die Abmessungen sowohl des Reservoirs 22 als auch des Nachfilteraufsatzes 15 können variiert werden, ohne die Leistung der Vorrichtung 13 zu beeinflussen, wenngleich die folgenden ungefähren Abmessungen als zufrieden stellend befunden wurden: Reservoir 22 – 1,5 cm Durchmesser oben und untern und 0,6 cm tief; Nachfilteraufsatz – 0,9 cm unterer Durchmesser, 1,1 cm oberer Durchmesser und 0,5 cm tief.
  • Wie oben beschrieben, besteht die Testeinheit der vorliegenden Erfindung aus einer Reaktionsmembran 21 und einem absorbierenden Kissen 20, wobei die Unterseite der Reaktionsmembran 21 auf der Oberseite des absorbierenden Kissens 20 aufliegt. Die Reaktionsmembran 21, die das Fängerreagenz enthält, das den Zielanalyten binden kann, definiert im Wesentlichen die Reaktionszone, in welcher verschiedene Bindungsreaktionen während des Assays stattfinden. Wie zuvor beschrieben, kann die Reaktionsmembran 21 aus einer Anzahl von biologisch inerten, porenhaltigen Materialien hergestellt werden.
  • Unmittelbar unter der Unterseite der Reaktionsmembran 21 und im Flüssigkeitsaustausch mit ihr befindet sich ein absorbierendes Kissen 20, das die Absorptionszone definiert. In Ausführungsformen der Erfindung, wo eine einfache Herstellung und reduzierte Kosten erwünscht sind, liegt die gesamte Oberseite des absorbierenden Kissens 20 typisch unmittelbar an der Unterseite der Reaktionsmembran 21 an. Zu der Testeinheit kann optional ein Trennungsmittel zwischen der Reaktionsmembran 21 und das absorbierende Kissen 20 gehören, das im Allgemeinen nicht in der Lage ist, den interessierenden Zielanalyten zu binden. Entsprechend der Ausführungsform, die in 4 gezeigt wird, isoliert das Trennungsmittel in Form einer Trennschicht 25 einen Abschnitt der Reaktionsmembran 21 von dem absorbierenden Kissen 20. Obwohl nicht von entscheidender Bedeutung für die Leistung der Vorrichtung 13, dient die Trennschicht dazu, die Reaktionsmembran 21 zu sichern und Assay-Reagenzien zu ermöglichen, gleichmäßig von der Oberseite zur Unterseite der Assayvorrichtung 15 zu fließen.
  • Die Trennschicht 25 hat eine Öffnung 26, die durch einen Rand 27 definiert wird, dessen äußere Abmessungen und Form ähnlich der Reaktionsmembran 21 sind, und der dadurch die Ober- und Unterseite der Reaktionsmembran 21 zugänglich macht, wenn die Reaktionsmembran 21 und die Trennschicht 25 zusammengefügt werden, um ein Presssitz-Teil zu bilden. Wie 4 zu entnehmen ist, die eine Ausführungsform von Vorrichtung 13 zeigt, ist ein Abschnitt der Oberseite von Reaktionsmembran 21 vollkommen exponiert, so dass bei Durchführung des Assays die flüssige Testprobe und die Assay-Reagenzien der Reaktionsmembran 21 direkt zugeführt werden können. Die Reaktionsmembran 21 ist so bemessen, dass sie die Öffnung 26 vollständig abdeckt. Vorzugsweise hat die Reaktionsmembran 21 dieselbe Form, wie die Öffnung 26, ist aber etwas größer als die Öffnung 26, so dass sie am Rand der Öffnung 26 an die Unterseite der Trennschicht 25 gepresst werden kann. Die Form der Reaktionsmembran 21 und die Form der Öffnung 25 können sich allerdings unterscheiden und sind nicht auf die Konfiguration beschränkt, die in 4 gezeigt wird. Daher definieren der Rand 27, der die Öffnung 26 umgibt und die exponierte Oberseite der Testmembran 21 im Wesentlichen gemeinsam eine Testregion. Überdies ist, nachdem die Testkartusche 14 der Vorrichtung 13 zusammengesetzt wurde, das absorbierende Kissen 20, das sich direkt unter der Reaktionsmembran 21 befindet, noch in der Lage, die Unterseite der Reaktionsmembran 21 zu berühren. Die Abmessungen der Trennschicht 25 und des absorbierenden Kissens 20 werden so gewählt, dass sie gut in den Boden der Testkartusche 14 passen, wobei sichergestellt wird, sich das absorbierende Kissen 20 in sauberer Ausrichtung und Flüssigkeitsaustausch mit der Unterseite der Reaktionsmembran 21 befindet, Im Allgemeinen ist die Oberfläche der Oberseite des absorbierenden Kissens größer, als die der Reaktionsmembran 21, aber gleich der der Trennschicht 25.
  • Die kapillare Porengröße des absorbierenden Kissens 20 wird so gewählt, dass sie den Fluss der flüssigen Testprobe durch die Testmembran 21 ohne die Verwendung äußerer Mittel anregt. Daher dient das absorbierende Kissen 20 praktischerweise dazu, den Fluss von Reagenzien durch die Reaktionsmembran 21 sowohl zu fördern als auch zu lenken. Das absorbierende Kissen 20 hat eine genügende Größe und ist so zusammengesetzt, dass es überschüssiges Probenmaterial, Indikatorreagenz und Puffer aufsaugen kann. Das Material, aus dem das absorbierende Kissen 20 hergestellt wird, kann jedes durchlässige, benetzbare Material sein, das im Wesentlichen inert gegenüber den Assayreagenzien ist, die bei der Durchführung eines Assays eingesetzt werden. Das absorbierende Kissen 20 hat im Wesentlichen die gleichen Randabmessungen und Form, wie die Trennschicht 25, die die Reaktionsmembran 21 trägt. Die genaue Dicke der absorbierenden Matte 20 ist nicht wesentlich für das Funktionieren der vorliegenden Erfindung, und gewöhnlich im Bereich von etwa 2 bis 10 mm.
  • Die zweite Komponente der Vorrichtung ist der trichterförmige Nachfilteraufsatz 15, der problemlos eine geeignete Menge des multifunktionellen Puffers aufnimmt, die gebraucht wird, um den Assay mit einer einzelnen Auftragung durchzuführen. Der Nachfilteraufsatz 15 besteht aus der Nachfiltereinheit 3 und einer inneren 28 und einer äußeren 29 Hülse, die an beiden Enden offen sind. Die untere Öffnung 30, 30' der Hülsen 28 und 29 ist so bemessen, dass die für den betreffenden Assay gewünschte Fließrate erreicht wird. Die Öffnung der Hülsen kann zweckdienlich einen Durchmesser im Bereich von 12,6 bis 15,2 haben. Vorzugsweise hat die Öffnung 30, 30' einen Durchmesser von 9,5 mm.
  • In zusammengesetzter Form, ist der Nachfilteraufsatz 15 ein Trichter 31, der an seinem oberen Ende nach außen ragende Flansche 32, 32' und abhängende Seitenwände 33, 33' hat. Die abhängenden Seitenwände 33 der äußeren Hülse 29 enden am Boden 24. Die Öffnung 30' am Boden 24 ermöglicht es einem Flüssigkeitsstrom, der sich durch den Trichter 31 bewegt, in die Testkartusche 14 zu fließen. Die Nachfiltereinheit 3 der vorliegenden Erfindung wird auf dem Boden 24 des Nachfilteraufsatzes 15 durch die innere 28 und äußere Hülse 29 des Nachfilteraufsatzes 15 sicher fixiert. Ein innerer Kragen 34, der aus dem unteren Ende der äußeren Hülle 29 geformt ist, kann der Nachfiltereinheit 3 als Auflage dienen, so dass, wenn die innere Hülse 28 in die äußere Hülse 29 eingeschoben wird, die Nachfiltereinheit 3 dauerhaft fixiert wird.
  • Die Nachfiltereinheit 3 besteht aus einem Filtermedium. das mit getrocknetem Indikatorreagenz imprägniert ist und die Markierungszone definiert. Das getrocknete Indikatorreagenz wird nach Zugabe des multifunktionellen Puffers zum Nachfilteraufsatz 15 durch den Puffer resolubilisiert und zur Reaktionsmembran 21 transportiert. Die Wahl des Filtermediums für die Nachfiltereinheit 3 ist nicht von entscheidender Bedeutung für die Erfindung, und es kann jedes genügend absorbierende, poren- oder kapillarenhaltige Material sein, durch das der multifunktionelle Puffer und das resolubilisierte Indikatorreagenz durch Saugkraft transportiert werden kann, Das Material wird danach ausgewählt, dass es die Resolubilisierung und Mischung des getrockneten Indikatorreagenzes nach Zugabe des multifunktionellen Puffers zulässt und ebenso den Übergang des Puffers und des neu gelösten Indikatorreagenzes zur Reaktionsmembran 21 der Testeinheit 2 einleitet.
  • Zur bequemeren Handhabung beim Gebrauch von Vorrichtung 13, ist ein Griff an dem vorstehenden Flansch 32 des Nachfilteraufsatzes 15 angebracht, so dass der Filteraufsatz 15, wenn er an dem Reservoir 22 befestigt wird, leicht über den Rand von Reservoir 22 hinausragt, zur leichteren Entfernung des Nachfilteraufsatzes 15 von der Testkartusche 14.
  • Ein repräsentatives Beispiel einer modifizierten Version der Testkartusche der Erfindung, bei der eine Bluttrennungszone in lateralem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone zum Nachweis von Analyten in einer Vollblutprobe integriert ist, wird in den 7A und 7B veranschaulicht.
  • Wie in 7A gezeigt wird, ist die Testkartusche mit einem Oberteil 16 ausgestattet, das so konstruiert und angepasst wurde, dass es bequem in das Unterteil 17 passt. In dieser besonderen Ausführungsform wird das Oberteil 16 der Testkartusche von einer ersten Öffnung oder Durchlass in der Form eines Reservoirs 22 bestimmt. Das Reservoir 22 dient dazu, (a) für eine funktionsfähige Befestigung des Nachfilteraufsatzes zur Einführung des multifunktionellen Pufferreagenzes zu sorgen und (b) die Betrachtung des Testergebnisses auf der Membran im Anschluss an die Entfernung des Nachfilteraufsatzes zu ermöglichen, d. h. die Farbe, Fluoreszenz oder ein anderes Signal in der/den Indikatorzonen zu erkennen. Daher werden Konfiguration und Abmessungen des Reservoirs 22 danach gewählt, dass es funktionsfähig mit dem Nachfilteraufsatz verbunden werden kann, um vorübergehenden Flüssigkeitsaustausch zwischen der Markierungszone der Nachfiltereinheit und der Reaktionszone der Testeinheit zu ermöglichen.
  • In kurzem lateralem Abstand von Reservoir 22 definiert das Oberteil eine zweite Öffnung in der Gestalt eines Reservoirs 104, das, wie dargestellt wird, angeschrägte Seiten haben kann, oder jede Form, Größe oder Konfiguration haben kann, die nach dem Auftragen einer Vollblutprobe einen Zugang zum vorderen Ende der Blutrennungszone bereitstellt und in genügender Form dort hinleitet. Nach Einführung einer Vollblutprobe in das Reservoir 104 und nach einer kurzen Inkubationszeit, um eine hinreichende Trennung und Migration der RBK-freien Flüssigkeit entlang der Bluttrennungszone zur Reaktionszone zu ermöglichen, wird der Nachfilteraufsatz funktionsfähig mit dem Reservoir 22 verbunden, um die Vervollständigung des zweischrittigen Assayprotokolls zu ermöglichen, so dass die abschließende Bestimmung des Vorhandenseins eines Zielanalyten durchgeführt werden kann.
  • Wie in 7B gezeigt, weist das Unterteil der Testkartusche eine erste Grundstruktur 105 mit einer Vielzahl von Stützwänden auf, die als feste Einfassung für das absorbierende Kissen dient und daher so konfiguriert ist, dass sie das absorbierende Kissen sicher fixieren kann. Zusätzlich wird eine zweite Grundstruktur 106 bereitgestellt, die eine Vielzahl von hervorstehenden Stäben von gleicher Höhe aufweist, und als erhöhter Untersatz für die Bluttrennungszone dient. Die Position der zweiten Bodenstruktur 106 in Relation zu der ersten Bodenstruktur 105, ebenso, wie ihre Konfiguration, ist derart, dass, wenn die Bluttrennungszone in das Unterteil positioniert wird, die Bluttrennungszone in direkter planarer horizontaler Ausrichtung an die Reaktionszone anschließt. Obwohl die hier dargestellte Bodenstruktur 106 eine Vielzahl von Stützstäben und/oder Wänden aufweist, die dazu dienen, den Rand und die Mitte der Bluttrennungszone zu tragen, ist jede beliebige Konfiguration oder Methode möglich, solange die Bluttrennungszone sicher und korrekt in Relation zur Reaktionszone positioniert ist, wenn die Testkartusche vollständig zusammengesetzt ist.
  • 8.0 METHODOLOGIE
  • Im Betrieb wird der Apparat der vorliegenden Erfindung weitgehend verwendet, um das Vorhandensein eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe zu bestimmen, wobei mindestens ein Fängerreagenz eingesetzt wird, um auf der Reaktionsmembran ein nachweisbares Produkt zu erzeugen als Anzeiger, dass der Analyt in der Probe vorhanden ist. Der Assayapparat und Vorrichtung eignen sich in besonderem Maße zur Anwendung in einem Immunoassay, bei dem die Probenkomponente eine der Komponenten eines immunologischen Paares ist, einschließlich Antigene, Antikörper oder Haptene. Das immunologische Paar besteht aus zwei Komponenten, die sich immunologisch aneinander binden. Spezifische immunologische Paare sind Antigene und ihre Antikörper (monoklonale Antikörper oder affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper, einschließlich Fragmente davon) oder biologisch funktionale Haptene und ihre Antikörper. Während monoklonale Antikörper bekannte Vorteile gegenüber polyklonalen Antikörpern haben, kann jegliche Art von immunologischen Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Daher werden zwecks Einfachheit der Darstellung, der Assay und die Vorrichtung der Erfindung in Hinblick auf Immunoassays beschrieben, die das Antigen-Antikörper immunologische Paar verwenden. Die flüssige Testprobe ist biologischen Ursprungs, z. B. Urin oder Serum, und das Fängerreagenz und Indikatorreagenz können ein Antikörper oder Antigen sein, je nach dem interessierenden Analyten, und ob die Sandwich oder die kompetitive Methode angewendet wird.
  • Die Immunoassays, die den Analyseapparat der vorliegenden Erfindung verwenden, können sehr einfach und schnell sein und können qualitativ oder semiquantitativ sein. Das Analysegerät kann an die Verwendung in vielen verschiedenen Typen von Assays angepasst werden. Zum Beispiel kann der Zielanalyt ein Hormon, Antikörper, Antigen, Protein usw. sein. Eine unvollständige Liste möglicher Zielanalyten wird in U.S. Patent No. 5,006,464 (Chu et al.) geboten. Das Format des Immunoassays hängt von dem Zielanalyten ab, der nachgewiesen werden soll. Um es nochmals zu sagen, diese sind in der Fachwelt bereits bekannt. Fachleute werden abschätzen können, dass, um die Empfindlichkeit für den Nachweis eines speziellen Zielanalyten zu maximieren, verschiedene Komponenten der Analysevorrichtung und oder des Assayverfahrens modifiziert werden können, wie etwa die Porosität, Dicke und Art des Materials, das für die Reaktionsmembran verwendet wird. Die Analysevorrichtung, die für die Assays eingesetzt wird, erfordert grundsätzlich keine Manipulation der Probe, und das gesamte Assayprotokoll kann in weniger als 1 Minute durchgeführt werden.
  • Die Assayvorrichtung der Erfindung ist zur Verwendung in jeder Art von Flow-Through Immunoassay gedacht, einschließlich kompetitiven und vorzugsweise Sandwich-Assays. Wie oben erwähnt, wird die Reaktionsschicht mit einem Fängerreagenz beschichtet, im Allgemeinen ein spezieller Antikörper oder ein Fragment davon. Alternativ, falls der Zielanalyt ein Antikörper ist, kann das Fängerreagenz ein spezifisches Antigen sein. In jedem Fall ist es, nachdem das Fängerreagenz auf die Membran aufgetragen wurde, vorzuziehen, alle unbesetzten Bindungsstellen mit einem inerten Protein zu füllen, um eine nicht-spezifische Bindung eines anderen Assay-Reagenzes, z. B. des Indikatorreagenzes, an die Membran zu verhindern. In der vorliegenden Offenlegung meint der Begriff „inertes Protein" ein Protein, das immunologisch nicht reaktiv ist gegenüber irgendeiner anderen Komponente des Assays, und das im Wesentlichen in keine nichtspezifischen Bindungen mit anderen Proteinen in dem Assay-Medium eingeht, mit dem Verständnis, dass das inerte Protein durchaus immunologisch reaktiv sein kann gegenüber anderen Materialien, die nicht zu dem Assay der Erfindung gehören. Repräsentative Beispiele, ohne andere auszuschließen, für geeignete inerte Proteine sind Albumin und Kasein.
  • Mit Hinblick auf einen Sandwich-Assay für den Nachweis von Antigen, ist das Fängerreagenz ein erster Antikörper, der spezifisch für das vorbestimmte Antigen ist, und das Indikatorreagenz ist als zweiter Antikörper zu verstehen, ebenfalls spezifisch für das vorbestimmte Antigen. Der erste Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper oder ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antiköper, wird als Fängerreagenz an die Reaktionsmembran gebunden. Der erste Antikörper wird nach seiner Fähigkeit gewählt, einen bestimmten Epitopen auf dem interessierenden Analyten zu erkennen und sich dort anzubinden. Der zweite Antikörper, der ein Teil Indikatorreagenz bildet, wird danach gewählt, dass er einen alternativen Epitopen auf dem interessierenden Analyten erkennt und daher bei der Bindungswechselwirkung zwischen dem ersten Antikörper und dem Antigen nicht stört. Fachleute werden abschätzen können, dass der Sandwich-Assay auch durchgeführt werden kann, wenn sie Rollen von Antigen und Antikörper getauscht werden. Zum Beispiel kann der immobilisierte Partner des immunologischen Paares das Antigen sein, um einen interessierenden Antikörper in der Testprobe nachzuweisen, wobei ein markierter anti-humaner Antikörper oder Protein A als Indikatorreagenz eingesetzt wird.
  • Mit Verweis auf die 4, 5 und 7 und unter Verwendung einer anderen flüssigen Testprobe, als Vollblut, wird die Methode der Erfindung durchgeführt, indem eine Menge der flüssigen Testprobe direkt auf die Oberseite der Reaktionsmembran 21 durch Einführung durch Öffnung in dem Reservoir 22 aufgetragen wird. Die Menge an flüssiger Testprobe und multifunktionellem Pufferreagenz die der Assayvorrichtung 13 über das Reservoir 22 zugeführt wird, kann in verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung variieren. Im Allgemeinen wird für eine bestimmte spezifische Ausführungsform, eine vorher festgelegte und unverdünnte Menge an Testprobe zugeführt, während der multifunktionelle Puffer normalerweise im Überschuss zugegeben wird. Eine vorher festgelegte Menge an Probe wird vorzugsweise tropfenweise in die Mitte des Reservoirs 22 gegeben, wozu eine übliche sterilisierte Pipette benutzt wird, so dass ein gleichförmiger Kontakt zwischen der Probe und dem immobilisierten Fängerreagenz erhalten bleibt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird lediglich ein einzelner Tropfen dem Reservoir zugegeben. Indem die flüssige Testprobe durch Kapillarkraft angeregt wird, durch das absorbierende Kissen 20 zu fließen, kommen alle freien Antigene, die in der Testprobe vorhanden sein können, in Kontakt mit dem Antikörper, der auf der Oberfläche der Reaktionsmembran 21 fixiert ist. Das freie Antigen wird dadurch durch den Antikörper immobilisiert, während die Testprobe in das absorbierende Kissen 20 darunter diffundiert. Anschließend wird der Nachfilteraufsatz 15 befestigt und in eine betriebsfähige Verbindung mit dem Reservoir 22 der Testkartusche 14 gebracht. Eine vorher festgelegte Menge an multifunktionellem Puffer kann durch einen Marker in Reservoir 22 gemessen werden, oder vorzugsweise tropfenweise zugeführt werden, wozu eine zweite sterilisierte Standard-Pipette benutzt wird. Die tropfenweise Zugabe des Pufferreagenzes in die Mitte des Nachfilteraufsatzes 15 sollte einen gleichförmigen Kontakt und Sättigung der Nachfiltereinheit 3 anregen, so dass das getrocknete Indikatorreagenz vollständig resolubilisiert wird. Weiterhin sollte die Menge an Pufferreagenz genügend sein, um jegliches ungebundene Indikatorreagenz von der Reaktionsmembran 21 zu entfernen, nachdem die spezifischen Bindungswechselwirkungen stattgefunden haben. Indem der Strom des Pufferreagenzes die Reaktionsmembran 21 erreicht und anschließend hindurch diffundiert, werden ungebundene Reaktionspartner von den gebundenen Reaktionspartnern getrennt. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können dem Nachfilteraufsatz 15 10 bis 15 Tropfen Puffer zugeführt werden. Nach Zugabe des multifunktionellen Puffers und der folgenden Resolubilisierung des getrockneten Indikatorreagenzes, das ein markierter Antikörper ist, wird der markierte Antikörper durch den Puffer zu der Reaktionsmembran 21 transportiert, wo er sich an jedes Antigen bindet, das durch den fixierten Antikörper gebunden wurde. Wegen der Menge und der chemischen Eigenschaften des multifunktionellen Puffers, ist ein getrennter Waschschritt zur Entfernung von ungebundenen markierten Antikörpern nicht erforderlich. Das Vorhandensein von markierten Antikörpern auf der Reaktionsmembran 21 wird dann bestimmt als Indikator für das Vorhandensein des Zielanalyten in der Probe. Die Bindungsreaktion des markierten Antikörpers mit dem Antigen erzeugt ein visuell erkennbares Signal als Indikator für ein positives Ergebnis, das leicht zu beobachten ist, nachdem der Nachfilteraufsatz 15 abgenommen wurde.
  • Die vorliegende Erfindung lässt sich auch bei der kompetitiven Bindungsmethode anwenden, beschrieben, zum Beispiel in U.S Patent Nr. 4,366,241 (Tom et al.). In einem solchen System für den Nachweis von Antigen in einer flüssigen Testprobe, wird der komplementäre Partner des immunologischen Paars, nämlich der Antikörper, auf der Oberfläche der Reaktionsmembran 21 fixiert. Der Bindungspartner für das Indikatorreagenz ist jedoch eine authentische Probe des Zielantigens, die eine vergleichbare Bindungsaffinität für den Antikörper hat, der auf der Reaktionsmembran 21 fixiert ist. Nachdem die flüssige Testprobe auf die Reaktionsmembran 21 aufgetragen wurde, konkurrieren das Antigen, sofern vorhanden, und das zusätzliche Antigen des Indikatorreagenzes um die Bindungsstellen des Antikörpers. Da die Menge an immobilisiertem Antikörper begrenzt ist, entsteht ein Wettbewerb zwischen dem Antigen in der Probe und dem markierten Antigen. Wenn kein Antigen in der Testprobe vorhanden ist, sammelt sich markiertes Antigen auf der Reaktionsmembran 21 an. Daher signalisiert eine Farbreaktion ein negatives Resultat wegen des Fehlens einer nachweisbaren Menge an Antigen in der Probe. Wenn Antigen vorhanden ist, entwickelt sich keine Farbe, wegen der Reduzierung der Menge an markiertem Antigen, die von dem fixierten Antikörper gebunden wird, da die Bindungsstellen bereits von dem Zielantigen besetzt wurden, wodurch ein positives Ergebnis angezeigt wird. Entsprechend ist das Signal, das von dem Marker ausgeht, umgekehrt proportional zu der Menge an Antigen in der Probe. Außerdem kann, wie bei dem Sandwich-Assay, der kompetitive Assay mit umgekehrten Rollen von Antigen und Antikörper durchgeführt werden. Zum Beispiel kann der immobilisierte Partner des immunologischen Paares das Antigen sein, für den Nachweis eines interessierenden Antikörpers in der Testprobe, der mit markierten Antikörpern konkurriert.
  • Weiterhin in Betracht zu ziehen ist, dass dieses System erweitert werden könnte für den gleichzeitigen Nachweis von zwei oder mehr interessierenden Analyten in einer flüssigen Testprobe, indem eine entsprechende Anzahl von auf der Reaktionszone immobilisierten immunologischen Reagenzien verwendet wird. Zum Beispiel kann ein erster Antikörper gewählt werden, der reaktiv ist mit bestimmter Untereinheit einer Anzahl verschiedener Antikörper. Wenn ein zweiter Antiköper spezifisch ist für eine Untereinheit nur eines Antigens, kann ein solcher zweiter Antikörper als der immobilisierte Antikörper verwendet werden, und ein einzelner markierter erster Antikörper kann als universeller markierter Antikörper für das interessierende Antigen verwendet werden. Andererseits können zwei verschiedene Typen von immobilisierten Antikörpern eingesetzt werden, wenn erwartet wird, dass Antigen, das von seinem passenden Bindungspartner erkannt werden kann, wahrscheinlich in einer flüssigen Testprobe vorhanden ist, z. B. anti-HCV-Antikörper und anti-HIV-Antikörper, die in einer koinfizierten Patientenprobe gefunden werden.
  • Im Fall der Analyse einer Vollblutprobe ist die Methode der Erfindung im Wesentlichen identisch zu der oben beschriebenen, mit der Ausnahme, dass eine Probenmenge direkt in das Reservoir 104 gegeben wird, was durch die darin befindliche Öffnung (siehe 7A) Zugang zum vorderen Ende der Bluttrennungszone und direkten Kontakt damit ermöglicht. Die Menge der Vollblutprobe die in das Reservoir 104 eingebracht wird und die Menge an multifunktionellem Pufferreagenz, die dem Reservoir 22 zugeführt wird, kann in verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung variieren. Im Allgemeinen für eine bestimmte spezifische Ausführungsform, wird eine vorher festgelegte und unverdünnte Menge der Testprobe zugegeben, während das multifunktionelle Pufferreagenz normalerweise im Überschuss zugegeben wird. Eine vorher festgelegte Menge der Probe wird vorzugsweise unter Verwendung einer sterilisierten Standardpipette tropfenweise in die Mitte des Reservoirs 104 gegeben, so dass ein gleichmäßiger Kontakt zwischen der Probe und der Bluttrennungszone gewährleistet ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Zugabe von nur zwei Tropfen der Vollblutprobe zum Reservoir 104 erforderlich. Nach einer kurzen Inkubationszeit migriert der RBK-freie Anteil der Vollblutprobe, einschließlich jeglichen Analyten, in lateraler Richtung die Bluttrennungszone entlang, bis er zu der Reaktionsmembran 21 gelangt. Indem die RBK-freie Testprobe durch Kapillarkraft angeregt wird, durch das absorbierende Kissen 20 zu fließen, kommt jedes freie Antigen, das in der Testprobe sein kann, in Kontakt mit dem Antikörper, der auf der Oberfläche der Testmembran 21 fixiert ist. Das freie Antigen wird dadurch durch den Antikörper gebunden, während die flüssige Testprobe zusammen mit nicht essentiellen Komponenten, in das absorbierende Kissen 20 darunter diffundiert. Danach wird der Nachfilteraufsatz 15 angebunden und in eine betriebsfähige Verbindung mit dem Reservoir 22 der Testkartusche 14 gebracht, Eine vorher festgelegte Menge an multifunktionellem Puffer kann mit einem Marker in das Reservoir 22 abgemessen oder vorzugsweise tropfenweise zugegeben werden, wozu eine zweite sterilisierte Standardpipette verwendet wird. Die tropfenweise Zugabe des Pufferreagenzes in die Mitte des Nachfilteraufsatzes 15 sollte einen gleichförmigen Kontakt und Sättigung der Nachfiltereinheit 3 anregen, so dass das getrocknete Indikatorreagenz vollständig resolubilisiert wird. Weiterhin sollte die Menge an Pufferreagenz genügend sein, um jegliches ungebundene Indikatorreagenz von der Reaktionsmembran 21 zu entfernen, nachdem die spezifischen Bindungswechselwirkungen stattgefunden haben. Indem der Strom des Pufferreagenzes die Reaktionsmembran 21 erreicht und anschließend hindurch diffundiert, werden ungebundene Reaktanten von den gebundenen Reaktanten getrennt. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können dem Nachfilteraufsatz 15 10 bis 15 Tropfen Puffer zugeführt werden. Nach Zugabe des multifunktionellen Puffers und der folgenden Resolubilisierung des getrockneten Indikatorreagenzes, das ein markierter Antikörper ist, wird der markierte Antikörper durch den Puffer zu der Reaktionsmembran 21 transportiert, wo er mit jedem Antigen einen Komplex bildet, das durch den fixierten Antikörper gebunden wurde. Wegen der Menge und der chemischen Eigenschaften des multifunktionellen Puffers, ist ein getrennter Waschschritt zur Entfernung von ungebundenen markierten Antikörpern nicht erforderlich. Das Vorhandensein von markierten Antikörpern auf der Reaktionsmembran 21 wird dann bestimmt als Indikator für das Vorhandensein des Zielanalyten in der Probe. Die Bindungsreaktion des markierten Antikörpers mit dem Antigen erzeugt ein visuell erkennbares Signal zur Anzeige eines positiven Ergebnisses, das leicht zu beobachten ist, nachdem der Nachfilteraufsatz 15 abgenommen wurde.
  • 9.0 TEST KIT
  • Gemäß der Erfindung können Kits erzeugt werden, die aus der schnellen Assay-Vorrichtung, dem multifunktionellen Puffer sowie Anleitungen, die das Assayprotokoll zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Zielanalyten in einer flüssigen Testprobe beschreiben, bestehen. Die Diagnosevorrichtung der vorliegenden Erfindung, zu der die Testeinheit und eine Nachfiltereinheit gehören, wird typischerweise in Form eines Diagnose-Kits zur Verwendung für den Nachweis des interessierenden Zielanalyten abgepackt werden. Das Kit wird in normaler Gestalt aus der Flow-Through-Assayvorrichtung, vorzugsweise in einem geeigneten Behälter untergebracht, dem multifunktionellen Puffer, Einweg- Plastikpipetten und Anleitungen, die die Methode zur Ausführung des Assayprotokolls beschreiben, bestehen. Je nach Art des durchgeführten Assays, z. B. Sandwich oder kompetitiv, und des Zielanalyten, der in der flüssigen Testprobe bestimmt werden soll, werden die Anweisungen auch die relativen Mengen an Testprobe und multifunktionellem Puffer, die der Testeinheit bzw. der Nachfiltereinheit zugegeben werden, umfassen. Zusätzlich werden die erforderlichen Zeiten bei der sequentiellen Zugabe von Probe und Puffer, sowie die benötigte Zeit zur Erzeugung eines Ergebnisses zu den Angaben gehören.
  • Das bevorzugte Kit der vorliegenden Erfindung setzt die Flow-Through-Diagnosevorrichtung ein, wie sie in den 1 bis 3 beschrieben und dargestellt wird. Vorzugsweise wird die Flow-Through-Diagnosevorrichtung in einem geeigneten Behälter untergebracht, der zu dem Test-Kit gehören kann, und der aus zwei trennbaren Komponenten besteht, wobei jede Komponente getrennt die Testeinheit bzw. die Nachfiltereinheit aufnimmt, die übereinander und räumlich voneinander getrennt angeordnet sind. Insbesondere sollte es die Gestaltung des Behälters ermöglichen, dass Testeinheit und Nachfiltereinheit funktionell miteinander verbunden werden, so dass die Reaktionszone und die Markierungszone während des Assayprotokolls mit einer einzigen Bewegung in einen vorübergehenden Flüssigkeitsaustausch miteinander gebracht werden können. Der Behälter, der die Testeinheit aufnimmt, sollte in der Lage sein, die Schichten der Testeinheit unter Druck zu halten, um für einen durchgehenden und gleichförmigen Kontakt zu sorgen, so dass Flüssigkeit gleichmäßig durch den Apparat fließt. Die 4, 5 und 7 bieten ein repräsentatives Beispiel von einem Behälter der Art, wie er Teil eines TestKits sein kann, das die Flow-Through-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Die Erfindung wird genauer anhand der folgenden Beispiele verstanden werden, die andere nicht ausschließen. Die folgenden Beispiele werden angeboten, um im Detail einige der repräsentativen, gegenwärtig bevorzugten Methoden und Materialien der Erfindung zu beschreiben. Diese Beispiele dienen dem Zweck der Veranschaulichung der originellen Konzepte und sollen nicht den Geltungsbereich der Erfindung einschränken, wie er durch die angehängten Ansprüche definiert wird.
  • 10.0 BEISPIELE
  • Das Vorangehende ist eine allgemeine Beschreibung von Apparat, Methoden und Reagenzien der Erfindung. Eine Reaktion des Sandwich-Typs kann für den Nachweis von Helicobacter pylori durchgeführt werden. Daher ist, als unten gebotenes Beispiel, das Fängerreagenz eine Lösung von Helicobacter pylori, die auf die Reaktionsmembran der Testeinheit aufgetragen wird. Obwohl Farbstofflösungen, Goldlösungen, oder gefärbte Latexpartikel an Protein A gebunden werden können, um das Indikatorreagenz zu bilden, ist der bevorzugte sichtbare Marker, der in dem Beispiel-Assay verwendet wird, kolloidale Goldpartikel. Durch Einsatz einer Apparatur, die aus der Testeinheit und der Nachfiltereinheit besteht, so, wie sie in den 4 und 5 veranschaulicht werden, und durch Ausführung des zweischrittigen schnellen Assays der vorliegenden Erfindung, kann eine Bestimmung von Antikörpern gegen Helicobacter pylori in einer Serum-Testprobe in weniger als drei Minuten durchgeführt werden.
  • 10.1 HERSTELLUNG DER DIAGNOSTISCHEN ASSAY-APPARATUR
  • Die Vorrichtung 13, die in den 4 und 5 dargestellt wird und aus einer Testkartusche 14 und einen Nachfilteraufsatz 15 besteht, repräsentiert einen geeigneten Behälter, um die Testeinheit 2 und die Nachfiltereinheit 3 der vorliegenden Erfindung aufzunehmen.
  • A. Testkartusche
  • Die Testkartusche, die die Testeinheit der Schnelltestvorrichtung aufnimmt, ist aus sauberem, weißen Polypropylen-Kunststoff von technischer Qualität gemacht und besitzt ein Ober- 16 und ein Unterteil 17. Beide wurden in den synchronisierten Spritzguss hergestellt und präzise bearbeitet, um einen festsitzenden, dichten Verschluss zu ermöglichen, wenn beide Komponenten zusammengepresst werden. Die Komponenten werden als einzelne Gehäuse von Top View International Limited, Hong Kong, geliefert und werden in der Fertigungsanlage von MedMira Laborstories, Halifax, Kanada, zusammengesetzt. Diese Komponenten erfüllen die folgenden Kriterien:
    • • Erscheinung – eine saubere, weiße, glatte Kunststoffstruktur
    • • Eine genaue Passung, um ein auslaufsicheres Gehäuse zu erzeugen und die sichere Aufbewahrung aller eingesetzten Flüssigkeiten zu gewährleisten.
    • • Vereinbarkeit mit den Abmessungen laut Spezifikation von 2,5 cm Breite, 3,5 cm Länge und 1,3 cm Höhe.
    • • Vereinbarkeit mit den Abmessungen der Öffnung des Reservoirs 22 mit einem Durchmesser von 1,6 cm und einer ausgeformten Zylindertiefe von 0,5 cm.
    • • Vereinbarkeit mit der Position des Reservoirs 22 im Oberteil der Testkartusche 14.
  • B. Reaktionszone
  • Das Material, das für die Reaktionszone verwendet wird, ist eine Membran 21, wie etwa Nitrozellulose, mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,45 Mikrometer (Whatman, England) und auf 12 mm × 12 mm zurechtgeschnitten. Die Membran 21 ist 0,2 mm dicke, papierverstärkte Nitrozellulose und speziell behandelt für eine verstärkte Proteinbindung. Zertifizierte Spezifikationen durch den Hersteller (Whatman, England) geben eine Bindungskapazität von 80–90 mg Protein/cm2, eine Fließrate für Wasser von 6 ml/min/cm2 und einen Bubble-Point von 3,5 bar an. Die Reaktionsmembran 21 ist so zubereitet, dass sie zwei immunoreaktive Teststellen, nämlich eine Testzone und eine Kontrollzone aufweist, wobei jede Zone in Form einer deutlichen vertikalen Linie hergestellt wurde. Die Kontrolllinie und die Testlinie sind senkrecht zu einander orientiert, ohne sich zu berühren, um für eine deutliche Unterscheidung zwischen beiden zu sorgen. Die Testzone der Membran wird hergestellt durch Auftragen einer Lösung von Helicobacter pylori in Phosphatpuffer (pH 7 bis 9,5) unter Verwendung eines Dispensers (BioJet Quanti 3000). Die Kontrollzone wird auf ähnliche Weise durch Auftragen einer Mischung eines speziell kalibrierten Antigen-Präparats hergestellt, das alle Klassen von IgG-Antikörpern bindet, die gewöhnlich in einer biologischen flüssigen Testprobe vorhanden sind, ungeachtet des Status des Helicobacterpy/ori IgG Antikörpers, und dient daher als Kontrollzone. Nachdem die Membran bei Raumtemperatur 10 Minuten lang getrocknet wurde, wird sie mit einer Lösung aus 1% Rinderserumalbumin in 0,1 M Natriumphosphatpuffer behandelt und kann dann bei Raumtemperatur für etwa 24 Std. vollständig trocknen.
  • C. Optionale Trennschicht
  • Eine Trennschicht 25, welche die Reaktionsmembran 21 unterstützt, kann hergestellt werden, indem die Oberseite der Reaktionsmembran 21 an der Unterseite der Trennschicht 25 so befestigt wird, dass die Oberseite der Reaktionsmembran 21 durch eine Öffnung in der Trennschicht 25 exponiert ist. Die Oberseite der Reaktionsmembran 21 wird mit der Unterseite der Trennschicht 25 mit einem feuchtefesten Kleberstoff fest verbunden, so dass ein undurchdringliches Siegel zwischen dem Rand 27 der Trennschicht 25, der die Öffnung 26 definiert und der nicht exponierten Oberseite der Reaktionsmembran 21 gebildet wird. Diese Anordnung hilft dabei, den Flüssigkeitsstrom, anstatt in eine laterale Richtung, abwärts zu lenken, durch die Reaktionsmembran 21 hindurch und in das darunter liegende absorbierende Kissen 20 hinein. Die Trennschicht 25 kann mit einem wasserlöslichen Klebstoff gekauft werden, der bereits auf die Unterseite aufgetragen wurde, oder der Klebstoff kann während des Herstellungsvorgangs aufgetragen werden. Die Trennschicht 25 ist ein Einsatz aus Polystyrol-Material mit einem braunen, papierverstärkten, beidseitigen Klebeband (Halifax Folding Company, Nova Scotia, Kanada). Die Reaktionsmembran 21 wird mit dem beidseitigen Klebeband an der Trennschicht 25 befestigt. Die zusammengesetzte Trennschicht 25 hat eine Fläche von ungefähr 29,0 mm × 20,5 mm und eine Dicke von 1,0 mm und befindet sich auf der Oberseite des absorbierenden Kissens 20, die auf dem Boden der Testkartusche 14 liegt, wie in den 4 und 5 gezeigt.
  • D. Absorptionszone
  • Die Absorptionszone besteht aus einem Kissen 20, die sich direkt unterhalb der Reaktionsmembran 21 befindet und sicher innerhalb des Unterteils 17 der Testkartusche 14 befestigt ist. Das Kissen 20 besteht aus komprimierter Acetylcellulose mit einer Porosität von 40 ml/min (Filtrona, Richmond Inc., Richmond, VA). Sie wird aus synthetischen Fasern ohne Verwendung von Harzen oder Klebstoffen hergestellt und bietet eine ausgezeichnete Kompatibilität zu wässrigen Lösungen. Der Hohlraum wird mit 80 bis 85% spezifiziert und die Flüssigkeitsabsorption mit dem 6-fachen des Trockengewichts und bis zu 90% des gesamten Hohlraumvolumens. Sie verträgt pH-Werte im Bereich von 2,5 bis 9,5. Das Kissen 20 wird auf die spezifizierten Maße 2,2 cm Breite, 3,2 cm Länge und 0,5 cm Höhe ausgestanzt. Das Kissen 20 passt fest in das Unterteil 17 der Testkartusche 14, so dass ein komprimierter Verbund aus der Reaktionsmembran 21 mit dem Absorptionskissen 20 erzeugt wird, um einen kontinuierlichen Flüssigkeitsaustausch zwischen den porenhaltigen Materialien zur verbesserten Hydrodynamik und vollständigen Absorption zu gewährleisten, wenn Testproben auf die Reaktionsmembran 21 aufgetragen werden.
  • E. Nachfilteraufsatz
  • Der Nachfilteraufsatz 15, der die Nachfiltereinheit 3 der Schnelltestvorrichtung 13 aufnimmt, besteht aus einer äußeren trichterartigen Hülse 29, die einen inneren Kragen 34 an ihrer Basis hat, einer inneren trichterartigen Hülse 28 mit einem hervorstehendem Griff 35 und der Nachfiltereinheit 3. Die trichterartigen Hülsen 28, 29 und der Griff 35 werden aus einem Kunststoffmaterial geformt. Ein bevorzugtes Kunststoffmaterial ist Polystyrolharz (Fouzhou Chimoplus Chemical Company Ltd., China). Die äußere 29 und innere 28 trichterartige Hülse haben eine zylindrische Form mit einem äußeren Durchmesser von 15,0 mm bzw. 12,5 mm und der zusammengesetzte Aufsatz 15 passt fest in das Reservoir 22 der Testkartusche 14. Der Nachfilteraufsatz 15 ist so gestaltet, dass er nach der Einbringung der Testprobe in das Reservoir 22 der Testkartusche 14 mit dem Reservoir 22 verbunden wird, und wieder entfernt wird, kurz nachdem der multifunktionelle Puffer zugegeben wurde und durch die Nachfiltereinheit 3 des Nachfilteraufsatzes 15 diffundiert ist. In der zusammengesetzten Form liegt die Volumenkapazität des Nachfilteraufsatzes 15 bei etwa 0,5 ml.
  • Die Markierungszone der Nachfiltereinheit 3 besteht aus einer Filterschicht, die von dem Indikatorreagenz durchdrungen ist, und die in direktem Flüssigkeitsaustausch mit der Reaktionszone der Testeinheit 2 stehen wird, um die nachfolgende Reaktivität zwischen den Antikörpern der kolloidalen Goldkonjugate und der Antigen beschichteten Reaktionsmembran 21 zu verbessern. Der Filter besteht aus Glasmikrofasern mit OVA-Binder (Whatman, GF/AVA) ist weiß und hat ein Flächengewicht 48 g/m2, eine Dicke von 0,303 mm, eine Fließrate von 150 s/1,5 cm, eine Zugfestigkeit trocken von 640 g/1,5 cm, eine Zugfestigkeit nass von 324 g/1,5 cm, und eine Porosität von 3 sec/100 ml/in2. Nach der Zusammensetzung, wird das gefriergetrocknete kolloidale Goldkonjugat mit einer Lösung aus 0,1–0,15 ml PBS-Puffer (0,6–0,7mM Kaliumchlorid, 0,03 M Natriumchlorid, 2–2,1 mM Natriumhydrogenorthophosphat, 0,3-0,4 Kaliummonophosphat) mit 10% Zuckergehalt rekonstituiert. Das kolloidale Goldkonjugat wird auf jeden Filter dispensiert (0,1 bis 0,15 ml) und dann bei einer Temperatur von 37 bis 40°C getrocknet. Die Filterschicht wird entsprechend folgender Spezifikationen ausgestanzt: Dicke, 790 bis 830 Mikrometer, Porosität, 1,6 bis 2,0 s/100 ml/in2; Zugfestigkeit 14,5 N/55 mm; Fließrate, 67 s/7,5 cm; Absorptionsrate, 76,4%; Porengröße, 4,3 Mikrometer; Wicking, 1,00 min:sek und Durchmesser, 0,42 mm.
  • 10.2 ÜBERPRÜFUNG AUF PROTEIN A (PA)
  • Formulierung
  • Natriumchlorid
    • 10% in doppelt destilliertem Wasser
  • RSA
    • 1% RSA in doppelt destilliertem Wasser pH 5,00 to 9,00 (Optimum 6,00).
  • Kolloidales Gold
    • Zubereitet bis zum pH-Schritt
  • Vorratslösung des markierenden Materials
  • Original Konzentration verdünnt in doppelt destilliertem Wasser bis zur endgültigen Konzentration von 0,1–2 mg/ml (Optimum 0,1 mg/ml)
  • Prozedur
    • • Präparation einer 9-fachen Reihenverdünnung von Protein A (PA).
    • • Zugabe des bereits pH-angepassten kolloidalen Golds in einem 1:10 Verhältnis zu der PA-Lösung (d. h. zu 0.1 ml verdünnter PA-Lösung Zugabe von 1 ml kolloidales Gold).
    • • 10 Minuten Inkubation.
    • • Zu jedem Verdünnungsröhrchen Zugabe von 8–10% Natriumchlorid bis zur endgültigen Konzentration von 1% (Optimum 0,9%).
    • • 5 Minuten Inkubation.
    • • Zu jedem Röhrchen Zugabe von 0,07–0,1% Rinderserumalbumin bis zur endgültigen Konzentration von 0,1% (Optimum 0,08%).
    • • Absorbierung bei 520 nm lesen.
    • • Die korrekte Konzentration an Protein ist die Minimalmenge, bei der eine Flockung verhindert wird.
  • Konz. (Pg) Absorbierung 1 Absorbierung 2 Durchschnitt
    0 0,313 0,314 0,314
    2 0,524 0,524 0,524
    3 0,533 0,532 0,533
    4 0,533 0,533 0,533
    5 0,540 0,540 0,540
    6 0,575 0,571 0,573
    7 0,580 0,580 0,580
    8 0,576 0,583 0,580
    9 0,576 0,576 0,576
  • Hughes D. A & J. E. Beesley (1998) Preparation of Colloidal Gold Probes in (ed) J.D. Pound. Methods in Molecular Biology vol 80: Immunochemical Protocols, 2nd edition. Humana Press Inc, Totowa, NJ.
  • 10.3 HERSTELLUNG VON KOLLOIDALEM GOLDKONJUGAT
  • Materialien
    Natriumcitrat 0.3 mM in doppelt destilliertem Wasser
    RSA 1% RSA in doppelt destilliertem Wasser, pH 5,00 bis 9,00
    PEG 1% Polyethylenglycol (MW 15.000 bis 20.000) in doppelt destilliertem Wasser, pH auf 6,00
    Phosphatpuffer Mischung von 0,04 M (in doppelt destilliertem Wasser) NaH2PO4 in 0,07 M (in Wasser) KH2PO4 in einem 1:4,4 Verhältnis; pH auf 6,00
    Protein A in Hepes-Puffer Protein A in Hepes-Puffer (0,025M Hepes and 0,25 mM Thimerosal pH 7,00 in doppelt destilliertem Wasser) für eine endgültige Konzentration von 1 mg/mL.
    Boratpuffer 0,05 M of Natriumborat in doppelt destilliertem Wasser pH 8,50
  • Resuspensionspuffer
    • 8 mM Natriumhydrogenorthophosphat
    • 1% Rinderserumalbumin
    • 3 mM Natriumazid
    • 0,02% Polyethylenglycol
    • 0,14–0,16 M Natriumchlorid
    • 1,5 mM Kaliumdihydrogenorthophosphat
    • 2,7 mM Kaliumchlorid
    • 4,3 mM Trinatriumorthophosphat
  • Die obigen Ingrediens in 1000 ml doppelt destilliertem Wasser mischen, pH 7,30 bis 7,50.
  • Prozedur
    • • Zugabe von 1% Tetrachlorgoldsäure zu Wasser für eine endgültige Konzentration von 0,01%.
    • • Lösung zum Kochen bringen.
    • • 15 m 0,3 mM Natriumcitrat zufügen, unter Rückfluss kochen für 30 Minuten.
    • • Kolben abnehmen und Inhalt auf etwa 40°C oder niedriger abkühlen lassen.
    • • 60 mL Phosphatpuffer zufügen (0.04 M (in doppelt destilliertem Wasser) NaH2PO4 in 0,07 M (in Wasser) KH2PO4 in einem 1:4,4 Verhältnis mischen; pH bis 6.00) oder 50 mM Boratpuffer (pH 8,50); pH des kolloidalen Gold auf 6,00–9,00 einstellen (optimal ist 6,00), falls der pH zu niedrig ist, Tropfen von 2 mM K2CO3 zufügen.
    • • Ein Teil der Lösung wird entfernt um einen Gerinnungstest durchzuführen und die Konzentration des Liganden zu erkennen, die der Goldlösung zuzuführen ist.
    • • Protein A zufügen mit einer endgültigen Konzentration von 5–9 μg/mL + 5% (Optimum 6 + 0,3 = 6,3 μg/mL).
  • Figure 00540001
    • D. h. Gesamtmenge = 500 ml CG und dH2O + 15 ml Natriumcitrat + 60 ml Phosphat
    • Puffer – 3 ml Test auf pH = 572 ml = 0,572 L
  • Figure 00540002
    • • Die Lösung kann sich für 15–30 Minuten entwickeln (Optimum 20 Minuten).
    • • Die Absorption des Liganden wird durch Zugabe von 10% Rinderserumalbumin gestoppt, pH 5,00 bis 9,00, endgültige Konzentration von 0.1%, Umrühren für 5-15 Minuten (Optimum 10 Minuten).
    • • Das markierte kolloidale Gold wurde zentrifugiert bei einer Geschwindigkeit 46.500 g (20.000 rpm) und einer Temperatur 4–5°C für 50 bis 80 Minuten.
  • Aspiration and Resuspension
  • Überstand mit Hilfe eines Vakuumkolbens absaugen, dabei darauf achten, dass die Pellets nicht durcheinander gebracht werden. Resuspensieren in Resuspensionspuffer (oder PBS-RSA) bis zu einer endgültigen optischen Dichte von 1,180 bis 4,500 (Optimum 2,000) bei 520 nm.
  • Lyophilisationsvorgang
  • Nach dem Erreichen der passenden optischen Dichte wurde die Lösung in 0,6 ml Aliquoten in 3 ml Glasampullen gefüllt. Lyophilisierungsstopfen (1 mm Durchmesser) wurden halb in die Ampullen eingesteckt und diese in das Lyophilisator-Gestell überführt. Eine Temperatur von –40°C wurde für etwa 5 Stunden beibehalten. Die primäre Trocknung wurde bei einem Vakuum von weniger als 100 mTorr bei einer Stellflächentemperatur von –30°C für etwa 3 Stunden und einer Kondensatortemperatur von weniger als –80°C ausgeführt. Es folgte eine Stellflächentemperatur von –10°C für etwa 5 Stunden, dann eine Stellflächentemperatur von 0°C und ein Vakuum von 0 m Torr für etwa 2 Stunden. Eine sekundäre Trocknung wurde bei + 20°C für etwa 4 Stunden ausgeführt. Am Ende des Prozesses wurden die Ampullen unter Vakuum mit den Lyophilisierungsstopfen versiegelt. Das Produkt wurde danach dem Gestell entnommen und ein zweckdienlicher Test wurde ausgeführt, um die Qualität des Produktes sicherzustellen. Proben wurden für ein späteres Vergleichsmuster aufbewahrt.
  • 10.4 STABILISATION VON KOLLOIDALEM GOLDKONJUGAT
  • Prozedur
    • • Herstellung von 1%, 2%, 5% und 10% Saccharose in PBS-Lösung, pH 7.0–7.5.
    • • Rekonstituierung des gefriergetrockneten kolloidalen Goldkonjugats mit a) 5 Tropfen (150 μl) b) 10 Tropfen (350 μl) and c) 15 Tropfen (650 μl) mit jedem Saccharose-Prozentanteil.
    • • Auftragen von 5 Tropfen (150 μl) jeder Rekonstitution auf das Filtermedium.
    • • Gründliche Lufttrocknung.
  • Probe Ergebnis
    1% 1% 2% 5% 10%
    Kontrolllinie 2+ 2+ 2+ 3+
    Positive Kontrolle 1+ 1+ 1+ 2+/3+
    Negative Kontrolle neg neg neg neg
  • 10.5 PRÄPARIERUNG DER NACHFILTEREINHEIT
  • Eines der Ziele bei der diagnostischen Prüfung ist die Entwicklung einer Testvorrichtung, die nur wenige Arbeitsschritte erfordert. Daher wird durch die Assoziierung des Indikatorreagenzes mit dem Filtermedium der Nachfiltereinheit 3 die Eliminierung zusätzlicher Schritte, in denen Reagenzien während des Assayprotokolls der Diagnosevorrichtung getrennt zugegeben werden, ermöglicht.
  • Materialien
    • – Kolloidales Goldkonjugat, hergestellt und zuvor gefriergetrocknet, wie oben beschrieben.
    • – Zucker, z. B. Trehalose, Lactose, Saccharose, Glucose, Maltose, Mannose, Fructose, etc.
  • Prozedur
    • • Das gefriergetrocknete kolloidale Gold mit 0,1–0,15 ml PBS-Puffer (0,6–0,7 mM Kaliumchlorid, 0,03 M Natriumchlorid, 2–2,1 mM Natriumhydrogenorthophosphat, 0,3–0,4 mM Kaliumphosphat) und 10% Saccharose rekonstituieren.
    • • 0,1 bis 0,15 ml kolloidale Goldlösung auf jeden Filter dispensieren.
    • • Filter bei 37–40°C vollständig trocknen lassen.
  • 10.6 HERSTELLUNG DES MULTIFUNCTIONELLEN PUFFERS
  • Formulierung
    • 0,01–0,1 M EDTA
    • 0,02 M Natriumazid
    • 0,05–0,1 M Natriumchlorid
    • 6 mM Natriumhydrogenorthophosphat
    • 0,1–0,25 mM Thimerosal
    • 0,05–0,1% Triton®X-100
    • 0,02–0,03 M Trizma-hydrochlorid
    • 0,2–0,3% Tween-20
    • 0,5–2,5% PVP-40
  • Prozedur
    • • Alle Ingredienzien zusammengeben (0,01–0,1 M EDTA, 0,02 M Natriumazid, 0,05–0,1 M Natriumchlorid, 6 mM Natriumhydrogenorthophosphat, 0,1–0,25 mM Thimerosal, 0,05–0,1% Triton®X-100, 0,02–0,03 M Trizma-hydrochloride, 0,2–0,3% Tween-20, 0,5–2,5% PVP-40).
    • • Mit doppelt destilliertem Wasser auffüllen.
    • • pH auf 7,00 to 10,00 einstellen.
  • 10.6 ASSAY-PROTOKOLL
  • Serum- oder Plasmaprobe
  • Unter Verwendung einer sauberen Pipette, wurde 1 Tropfen einer Serum- oder Plasmaprobe auf die Mitte der Reaktionsmembran gegeben. Daraufhin ließ man die Probe vollständig durch die Membran und in das Kissen aus absorbierendem Material diffundieren. Der Nachfilteraufsatz wurde mit dem Reservoir der Testkartusche verbunden, so dass die Nachfiltereinheit in Flüssigkeitsaustausch mit der Testeinheit stand. Zehn bis fünfzehn Tropfen des multifunktionellen Puffers wurden anschließend in den Trichter des Nachfilteraufsatzes gegeben. Nach einer kurzen Inkubationszeit von etwa einer Minute, während der das resolubilisierte kolloidale Goldkonjugat durch die Nachfiltereinheit gezogen wurde, wurde der Nachfilteraufsatz von der Testeinheit abgenommen. (Eine) deutliche, gefärbte Linie(n), eine vertikale Kontrolllinie und eine Testlinie, entwickelte(n) sich in der Mitte der Reaktionsmembran, wodurch das Vorhandensein von Helicobacter pylori in der Testprobe angezeigt wurde. Die Ergebnisse des Assays lagen innerhalb von etwa drei (3) Minuten vor.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Die Schnelltestvorrichtung, der Assay und der multifunktionelle Puffer, ebenso wie die Methode, das Test-Kit und die Formel zur Erzeugung des multifunktionalen Puffers, die hier erklärt wird, stellen generell verbesserte diagnostische Mittel zum Nachweis eines Zielanalyten in einer flüssigen Probe bereit.

Claims (58)

  1. Abwärts- oder Vertikaldurchflußtestvorrichtung (1) zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyts (10) in einer Fluidtestprobe (9), welche umfaßt: – eine Testeinheit (2) umfassend eine Reaktionszone (5) in vertikaler Verbindung mit einer Absorbenszone (4), wobei die Reaktionszone (5) immobilisiertes Einfangreagens (6) enthält, das in der Lage ist zur Bindung mit einem interessierenden Zielanalyten (10), um einen zweigliedrigen Komplex einer spezifischen Bindungswechselwirkung zu bilden, und wobei die Absorbenszone ein Absorbensmaterial umfaßt, das unterhalb der Reaktionszone positioniert ist, um Abwärts- oder Vertikalfluidfluß durch die Reaktionszone zu ermöglichen; und – eine entfernbare Nachfiltereinheit (3) umfassend eine Markierungszone (7), die ein getrocknetes Indikatorreagens (8) enthält, wobei das Indikatorreagens (8) in der Lage ist, an ein Element der spezifischen Bindungswechselwirkung zu binden, um ein visuell detektierbares Signal folgend einer Wiederauflösung desselben durch ein Pufferreagens (12) zu erzeugen; und dadurch gekennzeichnet, daß die Nachfiltereinheit (3) proximal an der Testeinheit (2) nachfolgend der Bildung des zweigliedrigen Komplexes angeordnet wird, so daß die Reaktionszone (5) der Testeinheit (2) und die Markierungszone (7) der Nachfiltereinheit (3) direkten Abwärts- oder Vertikalfluß des wieder aufgelösten Indikatorreagens (8) von der Markierungszone (7) zur Reaktionszone (5) folgend einer Aufbringung des Pufferreagens (12) auf die Markierungszone (7) ermöglichen.
  2. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Bindungswechselwirkung eine Antikörper-Antigen-Wechselwirkung ist.
  3. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Indikatorreagens (8) in der Lage ist, an einen Zielanalyten (10) an einer Stelle zu binden, welche nicht die spezifische Bindungswechselwirkung zwischen dem Zielanalyten (10) und dem Einfangreagens (6) beeinträchtigt.
  4. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Indikatorreagens (8) in der Lage ist, an das Einfangreagens (6) an einer Stelle zu binden, welche die spezifische Bindungswechselwirkung zwischen dem Zielanalyten (10) und dem Einfangreagens (6) beeinträchtigt.
  5. Vorrichtung (1) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zielanalyt (10) ein Antigen ist und das Einfangreagens (6) ein monoklonaler Antikörper oder ein affinitätsgereinigter (affinity purified) polyklonaler Antikörper für das Antigen ist.
  6. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone (5) ein Material umfaßt, das eine Porengröße aufweist, die eine Trennung und Filtration von nicht-gebundenen Komponenten aus der Fluidtestprobe (9) erlaubt, und eine Dicke, welche erlaubt, daß eine adäquate Menge des Einfangreagens (6) daran immobilisiert wird.
  7. Vorrichtung (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Material einen Porengrößenbereich von 0,1 bis 12,0 Mikrometer aufweist.
  8. Vorrichtung (1) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Material einen Porengrößenbereich von 0,2 bis 0,8 Mikrometer aufweist.
  9. Vorrichtung (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke des Materials in einem Bereich von 0,05 mm bis 3,0 mm liegt.
  10. Vorrichtung (1) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke des Materials in einem Bereich von 0,1 bis 1,0 mm liegt.
  11. Vorrichtung (1) nach Anspruch 6, wobei das Material eine Nitrocellulosemembran ist.
  12. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone (5) zwei oder mehr unterschiedliche Einfangreagentien (6) enthält, die daran in erkennbaren und getrennten Bereichen immobilisiert sind, so daß mehrere Zielanalyten (10) in einer einzigen Fluidtestprobe (9) gleichzeitig analysiert werden können.
  13. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone (5) ferner ein immobilisiertes Kontrollreagens in einem erkennbaren und getrennten Bereich von dem Einfangreagens (6) umfaßt.
  14. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorbenszone (4) von der Reaktionszone (5) durch eine dazwischenkommende Abstandsschicht (25) mit einer oder mehreren darin definierten Öffnungen getrennt ist, um eine Fluidkommunikation zwischen der Reaktionszone (5) und der Absorbenszone (4) zu erlauben.
  15. Vorrichtung (1) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstandsschicht (25) ein starres oder halbstarres, Fluid-resistentes Material ist.
  16. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorbenszone (4) eine oder mehrere Schichten eines Materials umfaßt, das in der Lage ist, Fluid durch Kapillarwirkung aufzunehmen und ein beträchtliches Volumen an Fluid zu absorbieren.
  17. Vorrichtung (1) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr Schichten identische oder unterschiedliche Materialien umfassen.
  18. Vorrichtung (1) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Material Celluloseacetat ist.
  19. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungszone (7) ein Filtermaterial mit einer Porengröße umfaßt, das in der Lage ist, es getrocknetem Indikatorreagens (8) zu erlauben, effektiv durch Pufferreagens wieder aufgelöst und zur Reaktionszone (5) durch laminaren Fluidfluß überführt zu werden.
  20. Vorrichtung (1) nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial Glasfasermaterial ist.
  21. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Indikatorreagens (8) eine Direktmarkierung umfaßt.
  22. Vorrichtung (1) nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Direktmarkierung kolloidales Gold ist.
  23. Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Testeinheit (2) und die Nachfiltereinheit (3) in einem geeigneten Gehäuse aufgenommen sind.
  24. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Testeinheit (2) angepaßt ist, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyts (10) in einer Vollbluttestprobe (9N) zu bestimmen, und die weiter eine seitliche Blutflußtrennzone (100) in seitlicher Kommunikation mit der Reaktionszone (5) umfaßt, wobei die Bluttrennzone (100) ein erstes Ende (101), das einen Bereich zur Aufnahme einer Vollbluttestprobe (9N) definiert, und ein zweites Ende (102) in direkter Kommunikation mit der Reaktionszone (5) aufweist.
  25. Vorrichtung (1) nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Bluttrennzone (100) ein Material umfaßt, das in der Lage ist zum selektiven Halten einer effektiven Menge von roten Blutzellen (RBC) aus der Vollbluttestprobe (9N), um einen im wesentlichen RBC-freien Fluidteil zu erzeugen, der mit unbeeinträchtigter Bewegung vom ersten Ende (101) der Bluttrennzone (100) zur Reaktionszone (105) fließen kann.
  26. Vorrichtung (1) nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Material eine Glasfasermatrix ist.
  27. Vorrichtung (1) nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Material einen hydrophoben Träger umfaßt, der in der Lage ist, ein Versickern der Vollbluttestprobe (9N) und des RBC-freien Fluidteils zu reduzieren, wenn sie bzw. er entlang der Bluttrennzone (100) migriert.
  28. Vorrichtung (1) nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Testeinheit (2) und die Nachfiltereinheit (3) in einem geeigneten Behälter aufgenommen sind.
  29. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Pufferreagens (12) ein multifunktioneller Puffer ist, welcher umfaßt: einen biologischen Puffer, um den pH-Wert zwischen 7,0 und 10,0 zu halten; wenigstens ein oberflächenaktives Mittel, um eine nicht-spezifische Bindung von Untersuchungsreagentien zu reduzieren, während gleichzeitig eine Inhibierung einer spezifischen Bindungswechselwirkung vermieden wird; ein Polymer mit hohem Molekulargewicht als Dispersions- und Suspensionsreagens mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 2 × 102 bis 2 × 106 D; einen pH-Stabilisator, um den pH-Wert des mehrfunktionellen Puffers innerhalb eines Bereichs von pH 7,0 bis 10,0 zu halten; ein ionisches Salz, um nicht-spezifische Bindung von Antikörpern zu reduzieren; wenigstens ein Konservierungsmittel, um bakterielles und mikrobielles Wachstum zu reduzieren; und einen Calciumchelator, um eine Vollbluttestprobe von einem Verklumpen abzuhalten; wobei der biologische Puffer, das oberflächenaktive Mittel, das Polymer mit hohem Molekulargewicht, der pH-Stabilisator, das ionische Salz, das Konservierungsmittel und der Calciumchelator alle in effektiven Konzentrationen vorliegen.
  30. Vorrichtung (1) nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des biologischen Puffers im Bereich von 5 bis 100 mM liegt.
  31. Vorrichtung (1) nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des biologischen Puffers im Bereich von 5 bis 30 mM liegt.
  32. Vorrichtung (1) nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des biologischen Puffers 5 mM ist.
  33. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 29 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß der biologische Puffer ein Phosphatpuffer ist.
  34. Vorrichtung (1) nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels im Bereich von 0,01 bis 0,50% (w/v) liegt.
  35. Vorrichtung (1) nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels im Bereich von 0,05 bis 0,10% (w/v) liegt.
  36. Vorrichtung (1) nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels 0,07% (w/v) ist.
  37. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 29 und 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel Triton7X-100 ist.
  38. Vorrichtung (1) nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des ionischen Salzes 0 bis 300 mM ist.
  39. Vorrichtung (1) nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des ionischen Salzes 50 bis 200 mM ist.
  40. Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 29, 38 und 39, dadurch gekennzeichnet, daß das ionische Salz Natriumchlorid ist.
  41. Vorrichtung (1) nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewichtsbereich von 10 kD bis 1500 kD ist.
  42. Vorrichtung (1) nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Polyvinylpyrrolidonpolymers 0,1 bis 3,0% (w/v) ist.
  43. Vorrichtung (1) nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Polyvinylpyrrolidonpolymers 0,5 bis 2,5% (w/v) ist.
  44. Vorrichtung (1) nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Polyvinylpyrrolidonpolymers 1,4% (w/v) ist.
  45. Vorrichtung (1) nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Calciumchelator EDTA ist.
  46. Vorrichtung (1) nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des EDTA 5,0 bis 100,0 mM ist.
  47. Vorrichtung (1) nach Anspruch 46, durch gekennzeichnet, daß die Konzentration des EDTA 10,0 bis 50,0 mM ist.
  48. Vorrichtung (1) nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des EDTA 20,0 mM ist.
  49. Vorrichtung (1) nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Stabilisator tris-Puffer ist.
  50. Vorrichtung (1) nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des pH-Stabilisators 20 bis 30 mM ist.
  51. Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyts (10) in einer Fluidtestprobe (9), welches die Schritte umfaßt: – Abscheiden der Fluidtestprobe (9) auf der Reaktionszone (5) der Testeinheit (2) der Abwärts- oder Vertikaldurchflußtestvorrichtung (1), die in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 23 definiert ist; – Ermöglichen, daß die Fluidtestprobe (9) durch die Reaktionszone (5) in die Absorbenszone (4) fließt; – Anbringen der Nachfiltereinheit (3) an der Testeinheit (2), so daß die Markierungszone (7) der Nachfiltereinheit (3) und die Reaktionszone (5) der Testeinheit (2) proximal angeordnet sind, um einen direkten Abwärts- oder Vertikalfluidfluß von der Markierungszone (7) zur Reaktionszone (5) zu ermöglichen; – Beaufschlagen eines Pufferreagens (12) auf die Nachfiltereinheit (3), um das getrocknete Indikatorreagens (8) zu rekonstituieren; – Ermöglichen, daß das rekonstitutierte Indikatorreagens durch die Reaktionszone (5) und in die Absorbenszone (4) fließt, ohne daß irgendwelche ungebundenen Reaktanten von der Reaktionszone (5) in die Absorbenszone (4) gewaschen werden; und – Entfernen der Nachfiltereinheit (3), um ein Testergebnis zu beobachten, das durch eine Gegenwart oder Abwesenheit eines visuell detektierbaren Signals an der Reaktionszone (5) beschrieben wird.
  52. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß das Pufferreagens (12) ein mehrfunktioneller Puffer ist, welcher umfaßt: einen biologischen Puffer, um den pH-Wert zwischen 7,0 und 10,0 zu halten; wenigstens ein oberflächenaktives Mittel, um nicht-spezifische Bindung von Untersuchungsreagentien zu reduzieren, während gleichzeitig eine Inhibierung einer spezifischen Bindungswechselwirkung vermieden wird; ein Polymer mit hohem Molekulargewicht als ein Dispersions- oder Suspensionsreagens mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 2 × 102 bis 2 × 106 D; einen pH-Stabilisator, um den pH-Wert des mehrfunktionellen Puffers innerhalb eines Bereiches von pH 7,0 bis 10,0 zu halten; ein ionisches Salz, um nichtspezifische Bindung der Antikörper zu reduzieren; wenigstens ein Konservierungsmittel, um bakterielles und mikrobielles Wachstum zu reduzieren; und einen Calciumchelator, um eine Vollbluttestprobe von einem Verklumpen abzuhalten; wobei der biologische Puffer, das oberflächenaktive Mittel, das Polymer mit hohem Molekulargewicht, der pH-Stabilisator, das ionische Salz, das Konservierungsmittel und der Calciumchelator alle in effektiven Konzentrationen vorliegen.
  53. Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyts (10) in einer Vollbluttestprobe (9N), welches die Schritte umfaßt: – Abscheiden der Vollbluttestprobe (9N) auf dem ersten Ende (101) der Bluttrennzone (100) der Vorrichtung (1), wie sie in einem der Ansprüche 24 bis 28 definiert ist; – Ermöglichen, daß die Vollbluttestprobe (9') seitlich entlang der Bluttrennzone (100) fließt, wobei eine an roten Blutzellen freie Probe die Reaktionszone (5) erreicht; – Ermöglichen, daß die an roten Blutzellen freie Probe vertikal oder abwärts gerichtet durch die Reaktionszone (5) in die Absorbenszone (4) fließt; – Anbringen der Nachfiltereinheit (3) an der Testeinheit (2), so daß die Markierungszone (7) der Nachfiltereinheit (3) und die Reaktionszone (5) der Testeinheit (2) proximal zueinander angeordnet sind, um einen direkten Abwärts- oder Vertikalfluidfluß von der Markierungszone (7) zur Reaktionszone (5) zu erlauben; – Beaufschlagen von Pufferreagens (12) auf die Nachfiltereinheit (3), um das getrocknete Indikatorreagens (8) zu rekonstituieren; – Ermöglichen, daß das rekonstituierte Indikatorreagens durch die Reaktionszone (5) in die Absorbenszone (4) fließt, ohne daß irgendwelche ungebundenen Reaktanten aus der Reaktionszone (5) in die Absorbenszone (4) gewaschen werden; und – Entfernen der Nachfiltereinheit (3), um ein Testergebnis zu beobachten, das durch eine Gegenwart oder Abwesenheit eines visuell detektierbaren Signals an der Reaktionszone beschrieben wird.
  54. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß das Pufferreagenz (12) ein mehrfunktioneller Puffer ist, welcher umfaßt: einen biologischen Puffer, um den pH-Wert zwischen 7,0 und 10,0 zu halten; wenigstens ein oberflächenaktives Mittel, um nicht-spezifische Bindung von Untersuchungsreagentien zu reduzieren, während gleichzeitig eine Inhibierung einer spezifischen Bindungswechselwirkung vermieden wird; ein Polymer mit hohem Molekulargewicht als ein Dispersions- und Suspensionsreagens mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 2 × 102 bis 2 × 106 D; einen pH-Stabilisator, um den pH-Wert des mehrfunktionellen Puffers innerhalb eines Bereichs von pH 7,0 bis 10,0 zu halten; ein ionisches Salz, um nichtspezifische Bindung von Antikörpern zu reduzieren; wenigstens ein Konservierungsmittel, um bakterielles und mikrobielles Wachstum zu reduzieren; und einen Calciumchelator, um eine Vollbluttestprobe von einem Verklumpen abzuhalten; wobei der biologische Puffer, das oberflächenaktive Mittel, das Polymer mit hohem Molekulargewicht, der pH-Stabilisator, das ionische Salz, das Konservierungsmittel und der Calciumchelator alle in effektiven Konzentrationen vorliegen.
  55. Testkit zur Verwendung in der Detektion eines Zielanalyts (10) in einer Fluidtestprobe (9) oder einer Vollbluttestprobe (9N), die unter dem Verdacht steht, das Analyt (10) zu enthalten, gekennzeichnet durch: – eine Vorrichtung (1), wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 28 definiert ist; und – ein Pufferreagens (12), um das getrocknete Indikatorreagens (8) zu rekonstituieren und jegliche nicht-gebundenen Reaktanten aus der Reaktionszone (5) zu waschen.
  56. Testkit nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß das Pufferreagens (12) ein mehrfunktioneller Puffer ist, welcher umfaßt: einen biologischen Puffer, um den pH-Wert zwischen 7,0 und 10,0 zu halten; wenigstens ein oberflächenaktives Mittel, um nicht-spezifische Bindung von Untersuchungsreagentien zu reduzieren, während gleichzeitig eine Inhibierung einer spezifischen Bindungswechselwirkung vermieden wird; ein Polymer mit hohem Molekulargewicht als ein Dispersions- und Suspensionsreagens mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 2 × 102 bis 2 × 106 D; einen pH-Stabilisator, um den pH-Wert des mehrfunktionellen Puffers innerhalb eines Bereichs von pH 7,0 bis 10,0 zu halten; ein ionisches Salz, um nichtspezifische Bindung von Antikörpern zu reduzieren; wenigstens ein Konservierungsmittel, um bakterielles und mikrobielles Wachstum zu reduzieren; und einen Calciumchelator, um eine Vollbluttestprobe (9N) von einem Verklumpen abzuhalten; wobei der biologische Puffer, das oberflächenaktive Mittel, das Polymer mit hohem Molekulargewicht, der pH-Stabilisator, das ionische Salz, das Konservierungsmittel und der Calciumchelator alle in effektiven Konzentrationen vorliegen.
  57. Testkit nach Anspruch 55, weiter umfassend: – Instruktionen zum Durchführen der diagnostischen Untersuchung; und – ein Paar von Pipetten zum getrennten Beaufschlagen der Testprobe (9) und des Pufferreagens (12) zur Testeinheit (2) bzw. Nachfiltereinheit (3).
  58. Testkit nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß die Testeinheit (2) und die Nachfiltereinheit (3) in einem geeigneten Behälter aufgenommen sind.
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