DE3783845T2

DE3783845T2 - Chromatographische teststreifen zur bestimmung von liganden und rezeptoren.

Info

Publication number: DE3783845T2
Application number: DE8787110903T
Authority: DE
Inventors: Shanfun Ching; Julian Gordon; Michael Edward Mcmahon
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1986-09-29
Filing date: 1987-07-28
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2007-07-29
Also published as: CA1303493C; EP0262328A2; JPS6396559A; US4960691A; JPH0736017B2; DE3783845D1; ATE85130T1; ES2038973T3; EP0262328A3; EP0262328B1; AU598871B2; AU7903187A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Festphasenverfahren zur Durchführung spezifischer Bindungsbestimmungen an Flüssigkeitsproben und, spezieller, auf die Anwendung von chromatographischen Verfahren zur Durchführung derartiger Bestimmungen bzw. Assays.
Die Anwendung spezifischer Bindungsbestimmungen hat sich als von großem Wert bei einer Vielzahl klinischer Anwendungen erwiesen. Verschiedene biologische Flüssigkeiten und Gewebeproben können auf eine große Vielzahl von Komponenten analysiert werden, wie auf Arzneimittel bzw. Drogen, Hormone, Enzyme, Proteine, Antikörper, DNA- und RNA-Fragmente und andere biologische Substanzen. Spezifische Bindungsuntersuchungen umfassen solche Untersuchungen, bei denen eine zu analysierende Probe gemessen wird, die ein Teil eines spezifisch bindenden Paares ist, bestehend aus einem Liganden und einem Rezeptor. Der Ligand und der Rezeptor stehen so zueinander in Beziehung, daß der Rezeptor spezifisch den Liganden bindet und in der Lage ist, zwischen dem Liganden und anderen Bestandteilen der Probe mit ähnlichen Eigenschaften zu unterscheiden. Immunologische Bestimmungen hängen ab von Reaktionen zwischen Immunoglobulinen (Antikörpern), die in der Lage sind, spezifische Antigendeterminanten von verschiedenen Verbindungen und Materialien (Antigene) zu binden. Spezifische Bindungsbestimmungen können auch DNA- und RNA-Hybridisierungsreaktionen umfassen, bei denen einzelne Stränge von Polynukleotiden durch die Bildung von Wasserstoffbindungen mit Strängen von anderen Polynukleotiden, umfassend komplementäre Sequenzen, hybridisieren. Noch weitere spezifische Bindungsuntersuchungen sind bekannt, wie solche, die Hormonrezeptoren umfassen, die weder immunologische Reaktionen noch DNA-Hybridisierung umfassen.
Da die Ergebnisse von spezifischen Bindungsreaktionen häufig nicht direkt beobachtbar sind, wurden verschiedene Verfahren zu ihrer indirekten Beobachtung entwickelt. Spezifische Bindungsreaktionen können beobachtet werden durch Markieren eines der Bestandteile des spezifisch bindenden Paares nach bekannten Verfahren,einschließlich radioaktiver Markierung und der Verwendung von Chromophoren, Fluorophoren und Enzymmarkierungen. Radioaktive Markierungen, Chromophore und Fluorophore können nachgewiesen werden durch Anwendung von Strahlungsdetektoren, Spektrophotometern und dem bloßen Auge. Wenn Teile eines spezifisch bindenden Paares mit einer Enzymmarkierung versehen sind, kann ihr Vorhandensein nachgewiesen werden durch enzymatische Aktivierung eines Reaktionssystems, bei dem eine Verbindung, wie ein Farbstoff, aktiviert wird, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
Immunologische Bestimmungen gehören zu drei allgemeinen Typen. Bei den Konkurrenzbindungsbestimmungen konkurrieren markierte Reagentien und nicht markierte zu bestimmte Verbindungen um die Bindungsstellen an einem bindenden Material. Nach einer Inkubationszeit werden nicht gebundene Materialien ausgewaschen und die Menge an markiertem Reagens, das an die Stelle gebunden ist, wird verglichen mit Bezugsmengen zur Bestimmung der Konzentration an zu bestimmender Verbindung in der Lösung der Probe. Eine zweite Art von immunologischen Bestimmungen ist bekannt als Sandwich-Bestimmung und umfaßt allgemein das Zusammenbringen einer Lösung der zu bestimmenden Substanz mit einer Oberfläche, umfassend ein erstes bindendes Material, das für die zu bestimmende Substanz immunologisch spezifisch ist. Eine zweite Lösung, umfassend ein markiertes Bindungsmaterial der gleichen Art (Antigen oder Antikörper) wie das erste bindende Material, wird dann zu dem Bestimmungsgemisch zugesetzt. Das markierte bindende Material bindet an etwaige, zu bestimmende Substanz die an das erste bindende Material gebunden ist. Das Bestimmungssystem wird dann einer Waschstufe unterworfen, um markiertes bindendes Material zu entfernen, das nicht an die zu bestimmende Substanz gebunden ist,und die Menge an markiertem Material, das zurückbleibt, ist üblicherweise proportional der Menge an gebundener zu bestimmender Substanz.
Eine dritte Art von immunologischem Bestimmungsverfahren umfaßt Agglutinationsreaktionsverfahren und ist beispielhaft angegeben durch bekannte Bestimmungen für Blutantigene und Serumtypen. Immunologische Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern in dem Serum und Antigenen, die an der Oberfläche von roten Blutkörperchen vorhanden ist, wird angezeigt durch die Bildung eines dreidimensionalen Netzwerks von roten Blutkörperchen und Antikörpern. Die Agglutinierung von Gemischen aus Serum und roten Blutkörperchen führt zur Bildung einer Perle, die für das bloße Auge sichtbar sein kann.
Diese verschiedenen Bestimmungsverfahren wurden ursprünglich durchgeführt entsprechend Flüssigphasen-Immunchemietechniken, bei denen Reaktionen mit Enzym und radioaktiv markierten Reaktionspartnern in flüssiger Lösung in Vorrichtungen, wie Mikrotiterplatten, durchgeführt wurden. In jüngster Zeit wurden Techniken und Verfahren entwickelt zur Durchführung von "Fest"-Phasenbestimmungen, bei denen enzymatische und immunologische Reaktionen in Lösung auf einem feuchten, porösen, festen Substrat durchgeführt werden.
Die US-PS 4 328 183 von Rosenfield et al. beschreibt ein Festphasenverfahren zur Blutgruppenbestimmung, bei dem eine Monoschicht aus lysierten roten Blutkörperchen kovalent an die Wände eines Plastikröhrchens gebunden ist. Die Monoschicht wird dann mit einer Serumprobe zusammengebracht und es tritt Immunoadsorption der in der Probe vorhandenen Antikörper durch die gebundenen roten Blutkörperchen ein, wenn die Antikörper mit den in den Zellmembranen vorhandenen Antigenen reagieren können. Die mit Antikörper sensibilisierte Monoschicht von roten Blutkörperchen kann dann eine zweite Schicht von Blutkörperchen, die komplementäres Antigen enthalten, in einer Agglutinierungsreaktion binden. Wenn die immunologische Art sowohl der Monoschicht als auch des Antikörpers bekannt sind, kann die Bildung oder Nichtbildung einer zweiten Zellschicht angewandt werden, um den immunologischen Typ der die zweite Schicht bildenden Zellen anzuzeigen. Andererseits kann, wenn die immunologische Spezifität der ersten Zellschicht bekannt ist, die Fähigkeit, eine zweite Zellmonoschicht mit den gleichen Zellen zu bilden, als Mittel angewandt werden, um zu bestimmen, ob oder ob nicht eine immunologisch absorbierte Schicht von Antikörpern gebildet worden ist, die spezifisch mit den Antigenen der ersten Zellschicht reagieren.
Die US-PS 4 168 146 von Grubb et al. beschreibt die Verwendung von Teststreifen zur Durchführung von angeblich "Festphasen"-Immunoassays vom Sandwich-Typ. Die Streifen bestehen aus saugfähigen Trägermaterialien, an die Antikörper durch Adsorption, Absorption oder kovalente Bindung gebunden sind. Bevorzugte Materialien für Teststreifen umfassen cellulosefaserhaltige Materialien, wie Filterpapier, Ionenaustauscherpapier und chromatographisches Papier. Ebenfalls beschrieben ist die Verwendung von Materialien, wie Cellulosedünnschichtchromatographiescheiben, Celluloseacetatscheiben, Stärke und dreidimensional vernetzten Materialien, wie Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden). Immunoassays werden durchgeführt durch Benetzen der Teststreifen mit abgemessenen Mengen einer wässrigen Lösung, enthaltend das vermutete Antigen. Antigenmoleküle in der Testlösung wandern durch Kapillarwirkung durch den Teststreifen, aber aufgrund der gebundenen Antikörper wird die Wanderung der Antigene, für die sie spezifisch sind, verzögert, wobei das Ausmaß der Wanderung der Antigenmoleküle über einen festgelegten Zeitpunkt eine Funktion ist der Antigenkonzentration in der Testlösung. Die antigenhaltigen Bereiche der diagnostischen Vorrichtung werden dann durch Zusatz von markierten Antikörpern angezeigt.
Die US-PS 4 517 288 von Giegel et al. beschreibt Verfahren zur Durchführung von Festphasenimmunoassays auf inerten, porösen Materialien. Die Patentschrift beschreibt die immunologische Immobilisierung eines bindenden Materials in einer spezifischen Zone des porösen Materials und Aufbringen des Analyten auf die Zone, die das immobilisierte bindende Material enthält. Ein markiertes Indikatormaterial, das mit dem Analyten Bindungen eingeht, wird dann auf die Zone aufgebracht, wo es in einer Menge immobilisiert wird, die der Analytmenge in der Zone entspricht. Dann wird ein Lösungsmittel auf die Mitte der Zone aufgebracht, um den nicht gebundenen markierten Indikator chromatographisch aus der Zone zu entfernen, so daß die in der Zone verbleibende Menge an markiertem Indikator dann gemessen werden kann.
Deutsch et al. beschreiben in der US-PS 4 361 537 Testvorrichtungen zur Durchführung von spezifischen Bindungsassays, wie radioaktiv markierten Konkurrenzbindungsassays, umfassend einen Streifen, der in der Lage ist, eine Entwicklerflüssigkeit durch Kapillarwirkung zu transportieren, der eine erste Zone zur Aufnahme der Probe, eine zweite Zone, die mit einem ersten Reagens imprägniert ist, das in der Lage ist, von der Entwicklerflüssigkeit transportiert zu werden, und eine dritte Zone, die mit einem dritten Reagens imprägniert ist, aufweist. Außerdem umfassen die Vorrichtungen eine Meßzone und ein Verzögerungselement, das entweder das zweite Reagens oder das Material des Streifens sein kann. Das erste Reagens ist in der Lage, mit einer Substanz zu reagieren aus der Gruppe, bestehend aus (1) der Probe, (2) der Probe und dem zweiten Reagens oder (3) dem zweiten Reagens in Konkurrenz mit der Proben unter Bildung eines Produkts in einer Menge, die abhängt von der zu bestimmenden Eigenschaft. Eine Probe wird mit der ersten Zone zusammengebracht und der Streifen wird dann in die Entwicklerflüssigkeit getaucht, um den Transport der Probe und des ersten Reagens zur Bildung des Reaktionsprodukts einzuleiten. Das Verzögerungsele ment verzögert den Transport von entweder dem Produkt oder dem ersten Reagens (dem beweglichen Reagens), um räumlich die beiden zu trennen, und die Menge an dem beweglichen Element wird dann an der Meßstelle gemessen.
Die US-PS 4 435 504 von Zuk et al. beschreibt ein chromatographisches Immunoassay, bei dem der Abstand von einem Ende der chromatographischen Vorrichtung, an dem eine Grenze entsteht, ein Zeichen ist für die Menge des in einer Probe vorhandenen Analyten. Der Analyt, der ein Teil eines spezifisch bindenden Paares ist, wird immunochromatographiert auf einem saugfähigen Träger, an den der Bindungspartner nicht-diffus gebunden ist und eine Mehrzahl von Protokollen wird angewandt, um eine Abgrenzung zwischen dem Bereich zu erhalten, an dem der Analyt gebunden ist, und dem Bereich, der frei von Analyt ist. Gemäß einem Protokoll wird der Analyt in Gegenwart oder Abwesenheit eines markierten bindenden Konjugats chromatographiert, wobei die Markierung ein Teil eines ein enzymatisches Signal erzeugenden Systems ist, das ein oder mehrere Enzyme umfaßt. Wenn das markierte Konjugat nicht mit dem Analytenchromatographiert wird, wird das Konjugat auf das Chromatogramm aufgebracht, wo es proportional zu der Menge des vorhandenen Analyten gebunden wird. Ähnlich wird, wenn das markierte Konjugat mit dem Analyten chromatographiert wird, das Konjugat sich an den Analyten binden, proportional der Menge an Analyten, der an dieser Stelle vorhanden ist. Das markierte Konjugat kann ein Enzym sein als Teil eines ein Signal erzeugenden Systems, das umfassen kann chromophore, phosphoreszierende, fluoreszierende und chemilumineszierende Substanzen, sowie gekuppelte, ein enzymatisches Signal aussendende Systeme. Wenn ein gekuppeltes Enzymsystem angewandt wird, kann ein zweites Enzym, das mit dem Produkt der ersten enzymkatalysierten Reaktion unter Bildung eines nachweisbaren Produktes reagieren kann, mit der Analytlösung chromatographiert werden, oder es kann zu dem Teststreifen nach der Chromatographie des Analyten zugegeben werden.
Die europäische Patentanmeldung 164 194 (veröffentlicht am 11. Dezember 1985) beschreibt Verbesserungen des Verfahrens von Zuk et al., wobei die transportierten chromatographischen Materialien im wesentlichen die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit entlang der Längskante des chromatographischen Streifens sowie entlang des Hauptteils des Streifen aufweisen. Das ermöglicht, daß die Front des chromatographischen Transports im wesentlichen flach bleibt und nicht konkav wird.
Von Interesse für die vorliegende Patentanmeldung sind zwei veröffentlichte Patentdokumente des Erfinders. Die US-PS 4 452 901 von Gordon beschreibt die Verwendung von porösen Nitrocelluloseträgern zur Immobilisierung von Proteinen. Es wird angegeben, daß solche Nitrocellulosestreifen angewandt werden können für Immunoassayverfahren, wenn die Restbindungskapazitäten der Nitrocellulosestreifen abgesättigt sind durch Blockierungsbehandlung mit einer oder mehreren Arten von Proteinen, die unterschiedlich sind von solchen, die immobilisiert sind, und nicht mit irgendeinem der später bei dem Assay verwendeten Antikörper kreuz-reagieren.
Von weiterem Interesse für den Hintergrund der Erfindung sind die Offenbarungen von Gordon in der EPO-Anmeldung 63 810, voröffentlicht am 3. November 1982, die sich auf Vorrichtungen zur Durchführung von immunologischen Assays beziehen. Die Vorrichtungen bestehen aus einem porösen festen Träger, der eine vorgewählte Anordnung von begrenzten Adsorptionsbereichen von Antigenen, Antikörpern oder beiden umfaßt, wobei restliche Adsorptionsstellen auf dem Substrat durch Proteinblockierungsmittel, wie Rinderserumalbumin, abgesättigt sind, die nicht mit den Antigenen oder Antikörpern, die bei dem Assay angewandt werden, kreuz-reagieren. Es ist angegeben, daß die porösen Träger eine ausreichende Oberflächenporosität besitzen, um einen Eintritt der Antikörper zu ermöglichen, und eine Oberflächenaffinität, die geeignet ist für bindende Antigene. Es ist angegeben, daß derartige Träger auswählbar sind aus einer Vielzahl von natürlichen und synthetischen Polymeren und Derivaten, aber vorzugsweise Nitrocellulosestreifen von 0,1 mm Dicke mit einer Porengröße zwischen etwa 0,15 um und etwa 15 um sind. Antigene oder Antikörper werden durch direkten Kontakt auf den porösen festen Träger aufgebracht und anschließend mit blockierenden Mitteln inkubiert. Assays zum Nachweis (bzw. zur Bestimmung) von unbekannten Antigenen oder Antikörpern werden dann durchgeführt unter Verwendung von markierten Antikörpern, die auch Antiimmunoglobulinantikörper sein können. Ergebnisse von einzelnen oder mehrfachen Assays werden bestimmt durch Nachweis der markierten Antikörper.
Es sind auch verschiedene spezifische Bindungsassay-Techniken zum Nachweis von spezifischen DNA- und RNA-Sequenzen bekannt. Derartige Assays wenden Nucleinsäurehybridisierungsverfahren an, bei denen komplementäre Polynucleotidsequenzen von einzelsträngigen Nucleinsäurepolymeren einander erkennen und in Wechselwirkung treten unter Bildung einer stabilen Duplexstruktur. Southern J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975) beschreibt Verfahren, bei denen DNA-Moleküle, die durch Gelelektrophorese getrennt worden sind, von Agaroseelektrophoresegelen auf Nitrocellulosefilterpapier überführt werden können. Die DNA-Fragmente können dann hybridisiert werden zu radioaktiv markierten RNA-Fragmenten zum Nachweis spezieller Sequenzen.
Falkow et al. beschreiben in der US-PS 4 358 535 Verfahren, die geeignet sind zum Nachweis von DNA-Sequenzen, die mit infektiösen Krankheitszuständen assoziiert sind, wobei DNA, die mit infektiösen Mikroorganismen assoziiert ist, isoliert und fixiert wird in einer einzelsträngigen denaturierten Form an einen inerten Träger, wie Nitrocellulose. Eine markierte Polynucleotidsonde, die spezifisch ist für eine DNA-Sequenz, die charakteristisch ist für ein pathogenes Produkt, von dem angenommen wird, daß es in der klinischen Probe vorhanden ist, wird mit der DNA der Probe unter hybridisierenden Bedingungen zusammengebracht. Der Träger wird dann gewaschen, um etwaiges nicht hybridisiertes Sondenmaterial zu entfernen und das Vorhandensein von etwaigem verbleibendem hybridisiertem Sondenmaterial ist ein Anzeichen für das Vorhandensein von Pathogen.
Dunn et al., Cell. 12, 23-26 (1977) beschreiben ein alternatives Hybridisierungsverfahren, das als Sandwich-Hybridisierung bekannt ist. Nach diesem Verfahren wird RNA der Probe hybridisiert mit definierten DNA-Fragmenten, die an Nitrocellulosepapierträger gebunden sind, so daß das 3'- oder 5'-Ende der RNA als einzelsträngiger Schwanz herausragt. DNA-Sequenzen, die komplementär sind zu den "Schwanz"-Sequenzen, können dann bestimmt werden durch Behandlung mit spezifischen Fragmenten von markierter DNA unter Hybridisierungsbedingungen.
Neben den verschiedenen bekannten spezifischen Bindungsassayverfahren sind auch zahlreiche Assayverfahren bekannt, die den Diffusions- oder chromatographischen Transport von Assayreagentien umfassen. Forgione beschreibt in der US-PS 3 875 014 Festphasentestindikatoren zur Bestimmung von Konzentrationen des Enzyms Aspartataminotransferase (AST) in Seren unter Anwendung eines Reaktionspaares. Bei der ersten Reaktion katalysiert AST die Reaktion von L-Aspartinsäure und Alpha-Ketoglutarsäure unter Bildung von Oxaloacetat. Bei der zweiten Reaktion reagiert Oxaloacetat mit einem Diazoniumsalz unter Bildung eines gefärbten Reaktionsprodukts. Der Testindikator nach Forgione umfaßt ein Paar von saugfähigen Materialien, die miteinander verbunden sind mit einem Klebemittel, das selektiv permeabel ist für Oxalessigsäure. Das erste Material ist mit den Substraten L-Aspartinsäure und Alpha-Ketoglutarsäure imprägniert. Das zeite Material ist imprägniert mit einem trockenen Diazoniumsalzfarbstoff. Die Vorrichtung wird mit Serum zusammengebracht, das, wenn es AST enthält, die Reaktion der Substrate unter Bildung von Oxalessigsäure katalysiert. Oxalessigsäure diffundiert dann durch die Klebemitteltrennschicht zu dem zweiten Streifen und aktiviert eine Farbreaktion mit dem Diazoniumsalz, die mit Standards verglichen werden kann.
Campbell beschreibt in der US-PS 3 893 808 einen Teststreifen zum Nachweis von Bleiverunreinigungen in nicht verbleiten Motortreibstoffen. Der Teststreifen umfaßt einen Papierstreifen mit drei Zonen. Die erste Zone ist imprägniert mit Jod, während die zweite Zone mit einem Gemisch aus Jod und Kaliumjodid behandelt ist. Eine Probe des zu untersuchenden Motortreibstoffs wird auf den Streifen aufgebracht und durch Kapillarwirkung durch die erste und die zweite Zone zu der dritten Zone transportiert, auf die dann eine Dithizonindikatorlösung aufgebracht wird. Etwaiges in dem Motortreibstoff vorhandenes organisches Blei wird auf der Oberfläche des Streifens zu anorganischem Bleijodid umgewandelt und dieses wird nachgewiesen durch Reaktion mit dem Dithizonindikator unter Bildung eines Bleidithizonatkomplexes mit einer charakteristischen Farbe.
Alberty et al. beschreiben in der US-PS 3 895 914 einen Teststreifen zum Nachweis von Barbitursäure und Barbitursäurederivaten in einer biologischen Flüssigkeit. Der Streifen umfaßt einen saugfähigen Papierstreifen mit drei Zonen. Die erste Zone ist imprägniert mit Säure, um die Probenflüssigkeiten, die darauf aufgebracht werden, anzusäuern. Die zweite Zone ist mit alkalisch gepuffertem Quecksilberacetat imprägniert, das in der Lage ist, unter Bildung eines Barbituratquecksilberkomplexes zu reagieren. Die dritte Zone ist imprägniert mit einer Quecksilber anzeigenden Verbindung, wie Diphenylcarbazon. Eine Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit wird auf die erste Zone aufgebracht und der Streifen in Lösungsmittel getaucht. In der Probe vorhandene Barbiturate reagieren unter Bildung eines Barbiturat-Quecksilber- Komplexes, der zu der dritten Zone transportiert wird und mit der Quecksilber anzeigenden Verbindung reagiert.
Kallies beschreibt in der US-PS 4 298 688 eine Assayvorrichtung zur Bestimmung von Glucosespiegeln in biologischen Flüssigkeiten. Die Vorrichtung umfaßt einen Papierteststreifen, der aufgeteilt ist in eine Meßzone, die unbehandelt sein kann, eine Reaktionszone, die Glucoseoxidase enthält, und eine Nachweiszone, die Peroxidase und eine Indikatorsubstanz, wie o-Tolidin und Orasolgelb, enthält. Das zu bestimmende Material kann durch die Meßzone in die Reaktionszone diffundieren, in der etwaige Glucose mit der Glucoseoxidase reagiert und dann in die Nachweiszone, wo eine Farbreaktion stattfindet, wobei der Grad abhängt von dem Ausmaß der in der Reaktionszone abgelaufenen Reaktion. Wasser kann verwendet werden, um die Diffusion der Testmaterialien durch die Vorrichtung zu unterstützen und der Teststreifen kann auch in einem Glaskapillarröhrchen enthalten sein.
Fogt et al. beschreiben in der US-PS 4 444 193 eine quantitative Testvorrichtung zur Messung von Chloridgehalten in Schweiß. Die Vorrichtung, die zur Verwendung bei Reihenuntersuchungen auf cystische Fibrose (Mucoviscidose) vorgesehen ist, umfaßt einen flachen Lappen, der, wenn er auf die Haut einer Person aufgelegt wird, eine bestimmte Menge Schweiß aufnimmt. Der Lappen besteht aus zwei konzentrischen kreisförmigen Reaktionsbereichen aus einem chemisch behandelten Absorptionsmaterial. Die Schweißprobe wird in der Mitte des inneren kreisförmigen Reaktionsbereiches aufgenommen, der ein chemisches Mittel, wie ein Silberphosphat, enthält, das in der Lage ist, mit dem gesamten Chlorid in der Schweißprobe unterhalb einer vorbestimmten Konzentration zu reagieren, um eine Grenzmenge "auszusieben". Der äußere ringförmige Reaktionsbereich enthält ein chemisches Mittel, wie Silberchromat, das braun ist und das mit etwaigem Chlorid, das diesen Bereich erreicht, unter Bildung von weißem Silberchlorid reagiert und ein Farbsignal erzeugt, das das Vorhandensein von Chlorid über einer vorbestimmten Grenzmenge anzeigt.
Von Interesse für die vorliegende Erfindung ist die Offenbarung von Wieland und Determann in J. Chromatog., 28, 2-11 (1967), die sich auf die Verwendung von Sephadexgelen bezieht, die bei einer Dünnschichtchromatographie zur Trennung von Proteinen angewandt werden. Während Sephadex nicht als Substrat bei einer üblichen Dünnschichtchromatographie bekannt ist und übliche Dünnschichtchromatographie nicht angewandt wird zur Trennung von Proteinen, werden hoch vernetzte Teilchen von Sephadex G-25 angewandt bei der aufsteigenden Dünnschichtchromatographie, aber eine Veränderung bei der Herstellung von Sephadex in Perlenform macht eine aufsteigende Chromatographie unmöglich, da die Teilchen nicht ausreichend aneinander haften und zusammenhalten. Die Verwendung von Sephadex der Arten G-100 und G-200 mit großen Poren in der absteigenden Dünnschichtchromatographie zur Trennung von Proteinen ist ebenfalls angegeben.
Morris, J. Chromatog., 16, 167-175 (1964) beschreibt ebenfalls die Verwendung von Sephadex G-100- und G-200-Platten bei der absteigenden Chromatographie für Proteine. In der Literaturstelle ist jedoch angegeben, daß der Transport langsam ist und es wird gesagt, daß unter "optimalen Arbeitsbedingungen" Human-CO-Hämoglobin nur etwa 70 mm in etwa 4 bis 5 Stunden wandert.
Trotz der großen Fortschritte, die im Bezug auf spezifische Bindungsassaytechniken in den letzten Jahren gemacht worden sind, bestehen noch deutliche Möglichkeiten zur Verbesserung dieser Verfahren. Eine besondere Begrenzung der derzeitigen Assayverfahren liegt darin, daß zahlreiche Zugabe- und Waschstufen erforderlich sind. Diese Stufen, die erforderlich waren, um unerwünschte Kreuzreaktionen zu vermeiden und überschüssige Reagentien und störende Substanzen zu entfernen, komplizieren das Verfahren und begrenzen die Genauigkeit (sophistication) bezüglich Art und Menge von analytischen Verfahren, die durchgeführt werden können. Die Eliminierung oder Verringerung der Anzahl von Wasch- und Zugabestufen, die von technischem Personal durchgeführt werden müssen, verringert nicht nur die Zeit und die Kosten bei der Durchführung der Assays und der Analyse von Assayergebnissen, sondern verringert auch die Schwierigkeit der Automatisierung von Ergebnisanalysen. Aus diesen Gründen sind neue Systeme, umfassend Festphasenassayvorrichtungen, die ein Minimum an Zugabe- und Waschstufen erfordern, höchst erwünscht. Derartige Vorrichtungen wären vorzugsweise geeignet bei der Verwendung zur Durchführung von Assays für eine große Vielfalt von Materialien und wären in der Lage, die Durchführung einer komplexen Reaktionsfolge auf im wesentlichen automatische Weise zu ermöglichen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert neue Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von spezifischen Bindungsassayverfahren an flüssigen Proben. Diese Methoden und Vorrichtungen erfordern ein Minimum an Wasch- und Zugabestufen und sind geeignet zur Durchführung von qualitativen und quantitativen spezifischen Bindungsassays für eine Vielzahl von Analyten einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Antikörper, Antigene, DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen und andere reaktive chemische Substanzen. Bei der Anwendung von Testvorrichtungen nach der vorliegenden Erfindung wird ein Reaktionspartner (Reaktant) selektiv an einer Stelle auf einem chromatographischen Material immobilisiert und eine Mehrzahl von Reaktionspartnern nach und nach mit dem immobilisierten Reagens in Kontakt gebracht und nicht umgesetzte Materialien werden physikalisch davon entfernt, wobei die zeitliche Abfolge und die Reihenfolge durch die Ausgestaltung der Vorrichtung bestimmt werden.
Speziell umfassen die Vorrichtungen nach der Erfindung einen Teststreifen zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, umfassend ein längliches Teil aus einem chromatographischen Material, das die Fähigkeit zum schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht immobilisierten Reagentien und reaktiven Probenbestandteilen mit Hilfe eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels besitzt. Der Streifen umfaßt ein erstes Ende, an dem der chromatographische Transport beginnt, ein zweites Ende, an dem der chromatographische Transport endet, und eine Mehrzahl von Zonen, die sich zwischen den beiden Enden befinden. Die Zonen umfassen eine erste Zone (imprägniert mit einem ersten Reagens, das in dem Lösungsmittel beweglich ist und in der Lage ist, mit dem Analyten zu reagieren und gegenüber dem Lösungsmitteltransport immobilisiert zu werden, wenn der Analyt in einer dritten Zone immobilisiert wird), eine zweite Zone (zur Aufnahme der Probe, in der ein Analyt vermutet wird) und eine dritte Zone (die sich stromabwärts von der ersten Zone befindet und mit einem zweiten Reagens imprägniert ist, das gegenüber einem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist und in der Lage ist, selektiv mit dem Analyten zu reagieren und den Analyten in immobilisierter Form in der dritten Zone festzuhalten) . Die erste und zweite Zone haben einen ausreichenden Abstand von dem ersten Ende, um einen Kontakt des ersten Endes, aber nicht der ersten und zweiten Zone mit dem chromatographischen Lösungsmittel zu ermöglichen. Die Vorrichtung ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß, nachdem die Probe in der zweiten Zone aufgenommen worden ist und nachdem das erste Ende in das chromatographische Lösungsmittel getaucht worden ist, die relative Beweglichkeit des Analyten und des ersten Reagens oder die räumliche Beziehung zwischen der zweiten und dritten Zone so gewählt sind, daß der Analyt abgeschieden und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert wird, in der dritten Zone, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht, wodurch störende Bestandteile der Probe und Nicht-Analytkomponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, von der dritten Zone durch den chromatographischen Lösungsmitteltransport entfernt werden, bevor der chromatographische Lösungsmitteltransport des ersten Reagens die dritte Zone erreicht. Die Vorrichtung umfaßt gegebenenfalls Mittel zum Nachweis des ersten Reagens in der dritten Zone einschließlich einer vierten und fünften Zone, die mit dritten und vierten (Indikator)-Reagentien imprägniert sind.
Assayverfahren unter Verwendung der Vorrichtungen werden durchgeführt durch (a) Abscheiden der Probe in der zweiten Zone, (b) Eintauchen des ersten Endes in das chromatographische Lösungsmittel während eines Zeitraums, der ausreicht, um den Analyten und das erste Reagens zu der dritten Zone zu transportieren, wobei die relative Beweglichkeit des Analyten und des ersten Reagens oder die räumliche Beziehung zwischen der zweiten und der dritten Zone so sind, daß der Analyt in der dritten Zone abgeschieden wird, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht, wodurch störende Substanzen oder Nicht-Analytkomponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, durch chromatographischen Lösungsmitteltransport aus der dritten Zone entfernt werden, bevor das erste Reagens ankommt, und (c) Nachweis des Vorhandenseins des ersten Reagens in der dritten Zone.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Bedingung, daß die relative Mobilität des Analyten und des ersten Reagens oder die örtliche Beziehung zwischen der zweiten und dritten Zone so sind, daß der Analyt in der dritten Zone abgeschieden und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert wird, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht, so daß störende Substanzen und Nicht-Analytkomponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, aus der dritten Zone durch chromatographischen Lösungsmitteltransport entfernt sind, bevor das erste Reagens durch chromatographischen Lösungsmitteltransport die dritte Zone erreicht. Dieses Merkmal, wodurch eine "Wasch"-Stufe an der dritten Zone automatisch durchgeführt wird, bevor das erste Reagens mit dieser Zone in Berührung kommt, vermeidet sowohl eine Waschstufe (der dritten Zone) als auch eine Zugabestufe (des ersten Reagens). Als Folge der Möglichkeit manuelle Waschstufen zu vermeiden, wird es so möglich, zusätzliche Reagentien in dem Teststreifen einzubauen und somit manuelle Zugabestufen zu vermeiden. Durch den Einbau zusätzlicher Reagentien und die Ausschaltung manueller Waschstufen sind die Vorrichtungen nach der vorliegenden Erfindung in der Lage, zwei oder mehrere Reaktionen nacheinander durchzuführen. Es wird ferner möglich, mehrere Wege für den chromatographischen Lösungsmitteltransport auszunutzen, so daß die Probe, das erste Reagens und etwaige andere Materialien, wie Indikatorreagentien, nach einer vorbestimmten Reihenfolge transportiert werden können, wobei sie entlang von teilweise nicht zusammenfallenden Wegen für den chromatographischen Lösungsmitteltransport (die teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen) getrennt gehalten werden. Es können mehrere Wege so gebildet werden, daß sie einen Flüssigkeitsmikrokreislauf bilden, der so "programmiert" werden kann, daß eine Mehrzahl von mehrstufigen Bestimmungsverfahren durch aufeinanderfolgenden chromatographischen Lösungsmitteltransport von verschiedenen Reagentien zu bestimmten Stellen durchgeführt werden kann.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist es, daß es sich gezeigt hat, daß Dünnschichtchromatographiematerialien besonders geeignet sind für einen schnellen chromatographischen Transport nach der Erfindung. Während DNA- und RNA-Sequenzen, Proteine und große Polypeptide, einschließlich Antikörpern und verschiedenen Antigenen üblicherweise nicht chromatographisch auf Dünnschichtchromatographiesubstraten transportiert worden sind, hat es sich gezeigt, daß ein schneller chromatographischer Lösungsmitteltrnasport derartiger Materialien möglich ist, wenn nicht spezifische Bindungsstellen auf dem Substrat in geeigneter Weise blokkiert worden sind, wie durch Behandlung mit nicht spezifischen Protein-blockierenden Mitteln, wie Rinderserumalbumin. Während Proteine, große Polypeptide und andere Materialien gemäß der Erfindung durch andere chromatographische Materialien transportiert werden können, wie solchen, die für die Papierchromatographie verwendet werden, ist die Anwendung von Dünnschichtchromatographiesubstraten besonders bevorzugt aufgrund der verbesserten Geschwindigkeit und Auflösung, die durch die Verwendung derartiger Materialien erzielt wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figuren 1a, 3a, 4a und 6a sind Vorderansichten von drei unterschiedlichen Formen der Testvorrichtung nach der Erfindung;
Figuren 1b, 3b, 4b und 6b sind Querschnitte der Testvorrichtungen, wie sie in den Figuren 1a, 3a bzw. 4a gezeigt sind, entlang den Linien 1b-1b, 3b-3b, 4b-4b und 6b-6b;
Figur 1c ist ein Querschnitt der Testvorrichtung, wie sie in Figur 1a gezeigt ist in Kontakt mit einem Volumen chromatographisches Lösungsmittel;
Figuren 2a bis 2f sind Vorderansichten der in Figur 1a gezeigten Vorrichtung zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und
Figur 5 ist ein Querschnitt der Testvorrichtung der Figur 3a entlang den Linien 5-5.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Allgemeine Beschreibung der Vorrichtungen

Bei den Vorrichtungen nach der vorliegenden Erfindung wird ein chromatographisches Lösungsmittel verwendet, um nacheinander den Analyten enthaltende Probenmaterialien, die in einer zweiten Zone aufgebracht worden sind, und ein erstes Reagens, das in einer ersten Zone aufgebracht ist, zu einer dritten Zone zu transportieren, in der ein zweites Reagens (vorhanden ist) das in der Lage ist, selektiv mit dem Analytmaterial zu reagieren und den Analyten zu immobilisieren. Durch Anwendung des chromatographischen Lösungsmitteltransports des Analyten und des ersten Reagensmaterials, die vorher auf der Vorrichtung, in Form eines porösen Streifens, abgeschieden worden sind, ist es möglich, zahlreiche Zugabe- und Waschstufen zu vermeiden, die bei bekannten Assaysystemen erforderlich waren.
Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist es, daß die relative Beweglichkeit des Analyten und des ersten Reagens oder die räumliche Beziehung zwischen der zweiten und der dritten Zone so sind, daß der Analyt in der dritten Zone abgeschieden und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert wird, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht und mit dem Analyten in Kontakt kommt. Dieses Merkmal der Erfindung kann erreicht werden, in dem die zweite Zone mit der dritten Zone zusammenfällt, das heißt, in dem die Probe direkt auf die dritte Zone aufgebracht wird. Wahlweise kann die Beweglichkeit der Probe und des ersten Reagens oder die Ausbildung der Vorrichtung so sein, daß das erste Reagens und die nachgewiesenen störenden Komponenten der Probe und Nicht-Analytkomponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, daran gehindert werden, miteinander in Kontakt zu kommen vor der Immobilisierung des Analyten in der dritten Zone.
Ein zweites wesentliches Merkmal der Erfindung ist, daß störende Substanzen und Nicht-Analytkomponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, durch chromatographischen Lösungsmitteltransport aus der dritten Zone entfernt werden, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht. Dieses Merkmal, durch das eine Waschstufe automatisch an der dritten Zone durchgeführt wird, bevor das erste Reagens mit dieser Zone in Berührung kommt, vermeidet die Stufe eines manuellen Waschens dieser Zone nach Aufbringen der Probe, um Nicht-Analytkomponenten der Probe und Komponenten der Probe und Materialien, die stören oder mit Reagentien, die anschließend auf die dritte Zone aufgebracht werden, reagieren können, zu entfernen. Die Ausschaltung dieser Waschstufe macht es auch möglich, vorher chromatographisch bewegliche Reagensmaterialien (wie das erste Reagensmaterial) auf das Streifenmaterial während des Herstellungsverfahrens der Vorrichtung aufzubringen, statt daß es erforderlich ist, daß derartige Reagentien während des Verlaufs des Assayverfahrens aufgebracht werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung können die zweite Zone, auf die das Probenmaterial aufgebracht wird, und die dritte Zone, in der das zweite Reagens immobilisiert ist, zusammenfallen (können die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen), damit der Analyt gegen einen Lösungsmitteltransport in der dritten Zone immobilisiert werden kann, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht. Es ist jedoch bevorzugt, daß die zweite und dritte Zone nicht zusammenfallen (nicht die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen), damit Nicht-Analytkomponenten der Probe mit geringer oder keiner Löslichkeit in dem chromatographischen Lösungsmittel nicht in der dritten Zone verbleiben, wo sie stören oder mit dem Analyten,dem zweiten Reagens oder anderen Reagentien, die anschließend auf die dritte Zone aufgebracht werden, reagieren könnten. Die Duldung, daß kleine Mengen von störenden Probenbestandteilen und Nicht-Analytkomponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, nicht einem chromatographischen Lösungsmitteltransport unterliegen und daher mit dem ersten Reagens reagieren, anstatt daß sie über die dritte Zone hinaus transportiert werden, liegt innerhalb des Rahmens der Erfindung, wenn derartige Reaktionen den Nachweis des zu bestimmenden Materials in der dritten Zone nicht stören.
Die Art der bei Durchführung der Erfindung angewandten Reagentien variiert nach der Art des zu bestimmenden Analyten. Wenn der Analyt ein Antigen oder Antikörper ist, kann eine immunologische spezifische Bindungsreaktion zwischen dem Analyten und dem zweiten Reagens angewandt werden, um den Analyten in der dritten Zone zu immobilisieren. Wenn der Analyt ein Antikörper ist, kann das zweite immobilisierte Reagens ein Antigen sein, für das der Antikörper spezifisch reaktiv ist, und das erste Reagens kann ein markiertes Antigen sein, das ebenfalls mit dem zu bestimmenden Antikörper reaktiv ist, oder ein markierter Antiimmunoglobulinantikörper, der spezifisch reaktiv ist, mit dem zu bestimmenden Antikörper. Wenn der Analyt ein Antigen ist, kann das zweite immobilisierte Reagens ein Antikörper sein, der spezifisch reaktiv ist mit dem Antigen und das erste Reagens kann ein markierter Antikörper oder ein anderes spezifisch bindendes Material sein, das auch spezifisch mit dem Antigen reaktiv ist.
In Fällen, in denen der Analyt ein DNA- oder RNA-Strang mit einer spezifischen Nukleotidsequenz ist, kann das zweite Reagens eine Einzelstrang-DNA- oder -RNA-Sonde sein, die auf dem Streifenmaterial immobilisiert ist und die eine Nukleotidsequenz darstellt, die in der Lage ist, mit einem ersten Teil der zu bestimmenden Nukleotidsequenz zu hybridisieren und so den Analyten zu immobilisieren. Das erste Reagens kann dann ein markiertes, spezifisch bindendes Material, wie eine markierte DNA- oder RNA-Sonde mit einer Nukleotidsequenz sein, die in der Lage ist, mit einem zweiten Teil der zu bestimmenden Nukleotid-Sequenz zu hybridisieren, um so durch den Analyten immobilisiert zu werden.
Die Assaymethoden und Vorrichtungen nach der vorliegenden Erfindung brauchen nicht beschränkt zu werden auf solche, bei denen nur zwei oder sogar vier Reagentien angewandt werden. Tatsächlich besteht ein deutlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen darin, daß es möglich ist, mehrstufige Assayverfahren mit einem Minimum an manuell durchgeführten Zugabe- und Waschstufen durchzuführen, indem solche Waschstufen "automatisch" durch den chromatographischen Transport der unterschiedlichen Analyten und Reaktionspartner und durch vorheriges Aufbringen der Reaktionspartner auf die Vorrichtung während der Herstellung durchgeführt werden. Derartige mehrstufige Assayverfahren können durchgeführt werden durch Einbau zusätzlicher Reagentien und Reagenszonen auf den erfindungsgemäßen Vorrichtungen. Derartige Reagentien können chromatographisch zu der dritten Zone transportiert werden zur Reaktion als Teil der Mittel zum Nachweis der ersten Reagens. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung können dritte und vierte Reagentien in die Testvorrichtung eingebaut werden, um ein chemisches Substratmaterial zu liefern und Farbstoffverbindungen zur Reaktion mit einem enzymmarkierten ersten Reagens. Es wird ferner in Betracht gezogen, daß zusätzliche Reagentien chromatographisch zu anderen Zonen zur Reaktion transportiert werden und daß die Produkte derartiger Reaktionen immobilisiert oder an eine andere Stelle transportiert werden können zur weiteren Reaktion oder zum Nachweis. Es wird auch in Betracht gezogen, daß die Vorrichtung angewandt werden kann zum Nachweis von mehreren Analyten innerhalb einer Probe. Während es vorgesehen ist, daß durch die Erfindung manuelle Wasch- und Zugabestufen bei der Durchführung von Assays ausgeschaltet werden, wird auch in Betracht gezogen, daß bestimmte manuelle Wasch- und Zugabestufen günstig sein können bei der Durchführung von bestimmten Assayverfahren nach der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Fluß des chromatographischen Lösungsmittels, der die den Analyten enthaltende Probe zu der dritten Zone transportiert, dazu dient, (unerwünschte) nicht fixierte Materialien aus dieser Zone zu entfernen. Derartige nicht fixierte Materialien umfassen Probenkomponenten, die bei der Reaktion zwischen dem ersten Reagens und dem Analyten stören können, sowie Nicht-Analytbestandteile der Probe, die mit dem ersten Reagens reaktiv sein könnten. Im Falle von immunologischen Assays zum Nachweis von spezifischen Antikörpern in antikörperhaltigen Flüssigkeiten reagieren solche Antikörper, die spezifisch mit dem Antigenmaterial (zweites Reagens) reaktiv sind, das in der dritten Zone immobilisiert ist, mit dem Antigenmaterial und werden selbst in dieser Zone immobilisiert. Nicht-Analyt-, d.h. nicht zu bestimmende Antikörper, die in der Probe vorhanden sind und die nicht spezifisch mit dem zweiten Reagens reagieren, werden in der dritten Zone durch das zweite Reagens nicht immobilisiert und werden chromatographisch von der dritten Zone wegtransportiert, zusammen mit anderen Komponenten der Probe. Das ist ein besonderer Vorteil, wenn das Assay ein traditionelles "Sandwich"-Assay ist und das erste Reagens ein markierter spezies-spezifischer Antiimmunoglobulin- Antikörper ist, und nicht zu bestimmende Antikörper, die nicht aus der dritten Zone entfernt worden sind, zu falsch-positiven Ergebnissen führen können. Die Nichtentfernung von Probenbestandteilen, die die Reaktion zwischen dem Analyten und dem ersten Reagens stören können, könnte zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Als ein Beispiel, bei dem das Assay ein Hybridisierungsassay zum Nachweis von spezifischen DNA- oder RNA-Polynukleotidsequenzen ist, ist es erwünscht, Nukleinsäurematerial der Probe von Nichtnukelinsäurematerialien, wie Polysacchariden, Polypeptiden und Proteinen, abzutrennen, die mit den Sonden reagieren und das Assay stören können.
Bei Vorrichtungen nach der Erfindung können ein einzelner oder mehrere Wege für den chromatographischen Lösungsmitteltransport angewandt werden, um eine Mehrzahl von Assayverfahren durchzuführen. Die einfachsten (Einzelweg)-Vorrichtungen umfassen einen Streifen mit einem einzigen Transportweg, umfassend ein erstes Ende, ein zweites Ende stromabwärts von dem ersten Ende, eine erste Zone, auf der ein erstes markiertes Reagens abgeschieden ist, eine zweite Zone, in der die Probe aufgenommen wird, und eine dritte Zone, die mit einem zweiten Reagens imprägniert ist.
Die drei Zonen sind entlang eines einzigen Weges für den chromatographischen Lösungsmitteltransport angeordnet, so daß die dritte Zone stromabwärts von der ersten und zweiten Zone und die zweite Zone stromabwärts von der ersten Zone liegt.
Die einfachsten Mehrwegevorrichtungen umfassen zwei nicht zusammenfallende (nicht die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmende) Wege, die getrennt zu der dritten Zone führen. Ein erstes Reagens ist in einer ersten Zone auf einem Weg aufgebracht und später wird eine Probe auf die zweite Zone auf dem anderen Weg aufgebracht. Das chromatographische Lösungsmittel, die Streifenmaterialien der beiden Wege für den chromatographischen Transport, die Anordnung der ersten und zweiten Zone und die Zusammensetzungen der Materialien selbst werden so gewählt, daß die Probenmaterialien mit der dritten Zone in Kontakt kommen und etwaige nicht zu bestimmte Komponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, und etwaige störende Substanzen von der dritten Zone entfernt werden, bevor der chromatographische Lösungsmitteltransport des ersten Reagens die dritte Zone erreicht. Noch kompliziertere Mehrwegevorrichtungen können konstruiert werden, wobei eine erste, zweite und dritte Zone entlang eines Weges angeordnet sind, und eine vierte und fünfte Zone mit einem Enzymreaktionssubstrat und einer Farbstoffverbindung auf einem zweiten, teilweise nicht koinzidenten (teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmenden) Weg angeordnet sind, der zu der dritten Zone führt. Noch kompliziertere Mehrkomponentensysteme können konstruiert werden unter Verwendung von zusätzlichen chromatographischen Wegen, um eine Trennung zwischen Reagentien und Probenmaterialien aufrecht zu erhalten, um Materialien nach bestimmten Reihenfolgen zusammenzubringen und miteinander umzusetzen.
Nicht-koinzidente (nicht die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmende) und teilweise nicht-koinzidente (teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmende) Wege für den chromatographischen Lösungsmitteltransport können durch verschiedene Mittel gebildet werden. Undurchlässige Trennschichten können zwischen Wegen gebildet werden, um die durch Lösungsmittel transportierten Materialien zu trennen bis zu ihrem Transport zu ausgewählten Zonen und Bereichen. Derartige Trennschichten können gebildet werden durch physikalische Zwischenschaltung eines undurchlässigen Materials zwischen das längliche Material, umfassend die Wege für den chromatographischen Lösungsmitteltransport. Wahlweise kann das Material für den chromatographischen Lösungsmitteltransport, wie Nitrocellulose, geätzt werden, so daß Spalte zwischen den Wegen auftreten. Diese Spalte verhindern einen seitlichen chromatographischen Lösungsmitteltransport von Materialien von einer Seite des Spaltes zu der anderen und somit eine Wechselwirkung von Substanzen auf einer Seite des Spaltes mit Materialien auf der anderen.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung, umfassend Einzel-, Zwei-, Drei- und Vier-Wegevorrichtungen, und ihre Funktion werden im folgenden beschrieben.

Einzelwegvorrichtung

In der Zeichnung zeigen Figuren 1a, 1b und 1c eine Testvorrichtung (10) zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend ein längliches Stück aus chromatographischem Material (11) mit einem ersten Ende (14), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport beginnt, und einem zweiten Ende (18) , an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Das längliche Material (11) umfaßt eine erste Zone (15), eine zweite Zone (16) und eine dritte Zone (17). Die erste Zone (15) ist imprägniert mit einem ersten Reagens, das in dem chromatographischen Lösungsmittel (21) beweglich ist und das in der Lage ist, mit dem Analyten zu reagieren und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert zu werden, wenn der Analyt in der dritten Zone immobilisiert ist. Die zweite Zone (16) befindet sich stromabwärts von der ersten Zone (15) und stellt eine geeignete Stelle zur Aufnahme der zu analysierenden Probe dar. Die dritte Zone (17) befindet sich stromabwärts von der zweiten Zone (16) und ist mit einem zweiten Reagens imprägniert, das gegenüber einem Lösungsmitteltransport immobilisiert ist und in der Lage ist, selektiv mit dem Analyten zu reagieren und den Analyten in immobilisierter Form festzuhalten. Die Vorrichtung umfaßt ferner einen inerten Trägerstreifen (12), auf dem das chromatographische Material (11) befestigt ist. Die Vorrichtung umfaßt zusätzlich eine Deckplatte (13) über der Länge des chromatographischen Materials (11), die das erste Ende (14) des Materials freiläßt. Die Deckplatte (13) besitzt zwei Öffnungen, die der zweiten Zone (16) und der dritten (17) entsprechen und diese freilassen. Erste und zweite, entfernbare Laschen (19, 20) bedecken die zweite bzw. dritte Zone (16, 17). Es ist zu bemerken, daß bei dieser und den anderen Figuren die unterbrochenen Linien zwischen der dritten Zone (17) und dem zweiten Ende (18) einen längeren Abstand zwischen diesen beiden Teilen kennzeichnen, der einen chromatographischen Lösungsmitteltransport von allen Materialien zu oder hinter die dritte Zone (17) ermöglicht vor der Zeit, zu der die Front des chromatographischen Lösungsmittels das zweite Ende erreicht und der chromatographische Lösungsmitteltransport beendet ist.
Gemäß einem Verfahren zur Anwendung der Vorrichtung (10) der Figuren 1a, 1b und 1c wird die erste Lasche (19) von der Vorrichtung (10) entfernt, eine Probe des zu untersuchenden Materials auf die zweite Zone (16) aufgebracht und die erste Lasche (19) wieder aufgebracht. Die Vorrichtung (10) wird dann mit ihrem ersten Ende (14) in einen Behälter (21) mit chromatographischem Lösungsmittel (22) getaucht. Das chromatographische Lösungsmittel (22) schreitet dann über die Länge des chromatographischen Materials (11) fort und transportiert ein erstes Reagens, das in der ersten Zone (15) imprägniert ist, und die auf die zweite Zone (16) aufgebrachte Probe zu der dritten Zone (17). Dort reagiert das immobilisierte zweite Reagens selektiv mit dem in der Probe vorhandenen Analyten und immobilisiert ihn. Nicht-Analytkomponenten der Probe werden von der dritten Zone (17) wegtransportiert. Das erste Reagens wird dann zu der dritten Zone (17) transportiert, wo es gegen einen Lösungsmitteltransport durch den Analyten immobilisiert wird, wenn Analyt in immobilisierter Form vorliegt. Der chromatographische Lösungsmitteltransport der von dem Analyten befreiten Probe und des ersten Reagens geht weiter, bis das chromatographische Lösungsmittel (22) das zweite Ende (18) des Materials erreicht.Die zweite Lasche (20) wird dann entfernt und etwaiger Farbstoff oder andere reaktive Materialien können auf die dritte Zone (17) aufgebracht werden, um das Vorhandensein des ersten Reagens in der dritten Zone (17) nachzuweisen.
Die Figuren 2a bis 2f sind eine Vorderansicht der in Figur 1a gezeigten Vorrichtung. Die Figuren zeigen schematisch die Arbeitsweise der Testvorrichtung (30) zur Analyse eines Analyten (B) in einer Probe, enthaltend Analyten (B) und Nicht-Analytmaterialien (C), wobei die Vorrichtung eine Länge aus chromatographischem Material (31) umfaßt mit einem ersten Ende (34) an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport beginnt, einem zweiten Ende (38), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet, einer ersten Zone (35), einer zweiten Zone (36) und einer dritten Zone (37). Die erste Zone (35) ist mit einem ersten Reagens (A) imprägniert, das in dem chromatographischen Lösungsmittel (42) beweglich ist und in der Lage ist, mit dem Analyten (B) zu reagieren und gegenüber einem Lösungsmitteltransport immobilisiert zu werden, wenn dieser Analyt (B) in der dritten Zone immobilisiert ist. Die dritte Zone (37) ist mit einem zweiten Reagens (D) imprägniert, das gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert ist und in der Lage ist, selektiv mit dem Analyten (B) zu reagieren und den Analyten (B) in immobilisierter Form in der dritten Zone (37) festzuhalten. Die Vorrichtung umfaßt ferner einen inerten Trägerstreifen (32) an dem das chromatographische Material (31) befestigt ist. Die Vorrichtung umfaßt ferner eine Deckplatte (33), die sich über dem Material (31) befindet und das erste Ende (14) des Materials freiläßt. Die Deckplatte (33) besitzt zwei Öffnungen, die der zweiten Zone (36) und der dritten Zone (37) entsprechen und diese freilassen. Erste und zweite, entfernbare Laschen (39, 40) befinden sich auf der Deckplatte (33) und bedecken die zweite bzw. dritte Zone (36, 37).
Bei der Anwendung wird die erste Lasche (39) von der Deckplatte (33) entfernt und eine Probe des zu analysierenden Materials, umfassend den Analyten (B) und Nicht-Analyt-(C)-Materialien, wird auf die zweite Zone (36) aufgebracht. Die erste Lasche (39) wird dann wieder auf die Deckplatte (33) aufgesetzt und bedeckt die Stelle der zweiten Zone (36), um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.
Wie in Figur 2b gezeigt, wird das erste Ende (34) der Testvorrichtung in einen Behälter (41) mit chromatographischem Lösungsmittel (42) eingetaucht, das dann über das chromatographische Material (31) fortschreitet, und mit der ersten Zone (35) in Berührung kommt, und das erste Reagens (A) hinter einer Front des chromatographischen Lösungsmittels (43) stromabwärts auf das zweite Ende (38) hin transportiert.
Wie in Figur 2c gezeigt, kommt die Front (43) des chromatographischen Lösungsmittels mit der zweiten Zone (36) in Berührung und geht hindurch, wo die flüssige Probe, enthaltend den Analyten (B) und Nicht-Analytmaterial (C) vorher abgeschieden worden ist. Es ist bevorzugt, daß die Probe flüssig ist und daß die zweite Zone nicht austrocknen kann. Getrocknete Probenmaterialien in der zweiten Zone können nicht so schnell in dem Lösungsmittel gelöst werden mit dem Ergebnis, daß das erste Reagens in Kontakt kommen und reagieren kann mit Komponenten der Probe vor deren Transport zu der dritten Zone. (Die "Tetrode"-Vierwegevorrichtung, die unten beschrieben wird, bezieht sich auf diese Begrenzung und ist geeignet zur Verwendung in einigen Fällen, wo getrocknete Proben analysiert werden sollen) . Die flüssige Probe, enthaltend den gelösten oder suspendierten Analyten (B) und Nicht-Analytmaterialien (C), wird entlang einer Probentransportfront (44) vor der Transportfront (43) des chromatographischen Lösungsmittels, hinter der das erste Reagens (A) transportiert wird, hergeschoben.
Figur 2d zeigt, daß, wenn die Probentransportfront (44) mit der dritten Zone (37) in Kontakt kommt und durch diese hindurchgeht, das zweite Reagens (D), das selektiv mit dem Analyten (B) reagieren kann, mit dem Analyten (B) reagiert und ihn in immobilisierter Form in der dritten Zone (37) festhält. Das zweite Reagens (D) ist nicht spezifisch reaktiv mit den Nicht-Analytkomponenten (C) der flüssigen Probe und diese Materialien werden nicht in der dritten Zone (37) immobilisiert.
Figur 2e zeigt eine Probentransportfront (44) und die Nicht- Analytkomponenten (C) der Probe, die chromatographisch von der dritten Zone (37) stromabwärts auf das zweite Ende (38) transportiert worden sind. Gleichzeitig kommt die Front (43) des chromatographischen Lösungsmittels, hinter der das erste Reagens (A) transportiert wird, mit der dritten Zone (40) in Kontakt, wo der Analyt (B) immobilisiert ist. Das erste Reagens (A) kann mit dem Analyten(B) reagieren und gegenüber einem Lösungsmitteltransport immobilisiert werden, wenn der Analyt (B) in immobilisierter Form vorliegt. Ein Teil des Reagens (A), das vorzugsweise in einem Überschuß vorhanden ist, wird von dem Analyten (B) in der dritten Zone (37) immobilisiert. Etwaiges überschüssiges Reagens (A) wird weiter durch den chromatographischen Lösungsmitteltransport über die dritte Zone (37) hinaus transportiert.
Wie in Figur 2f gezeigt, erreichen die Probentransportfront (44) und die chromatographische Lösungsmittelfront (43) gegebenenfalls das zweite Ende (38) der Vorrichtung, wo der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Uberschüssiges erstes Reagensmaterial (A), das zu dem zweiten Ende (38) transportiert wird, kann sich dort durch Diffusion bewegen und mit Nicht-Analytmaterial (C) der Probe in Kontakt kommen und reagieren, ohne daß es die analytische Genauigkeit stört.
Das erste Reagensmaterial (A) kann ein markiertes Material sein, das direkt nachweisbar ist (wie ein radioaktiv markiertes Material) oder ein solches, das durch Reaktion mit anderen Materialien nachweisbar ist. Wenn das erste Reagens (A) direkt nachweisbar ist, kann das Vorhandensein eines spezifischen Analyten (B) in einem Probenmaterial nachgewiesen werden durch Nachweis des Vorhandenseins des ersten Reagens (A) in der dritten Zone (37), wie mit einem Strahlungszähler. Alternativ können, wenn das erste Reagens (A) nicht direkt nachweisbar ist, wie im Falle eines enzymmarkierten Reagens, zusätzliche Reagentien zu der dritten Zone (37) zugesetzt werden, um zum Beispiel eine Farbreaktion zu ergeben. Folglich kann die zweite Lasche (40) von der Deckplatte (33) entfernt und Enzymsubstrate und Farbstoffmaterialien zugesetzt werden, um eine Farbreaktion in Gegenwart des immobilisierten ersten Reagens (A) zu ergeben.

Zweiwegevorrichtung (Diode)

Figuren 3a und 3b zeigen eine Zweiwegevorrichtung, die als "Diode" (50) bezeichnet wird, zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe. In dieser Vorrichtung sind zwei zusätzliche Reagentien eingebaut, die angewandt werden können zur Erzeugung eines nachweisbaren Farbsignals durch Reaktion mit der Enzymmarkierung des ersten Reagens. Die Vorrichtung umfaßt ein längliches Stück chromatographisches Material (51) mit einem ersten Ende (54) , an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport beginnt, und einem zweiten Ende (60), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Die Länge des Materials ist durch eine in der Mitte verlaufende Lösungsmittelbarriere (Trennschicht) (62), die mit der linken Kante (67) einen linken Weg für den chromatographischen Lösungsmitteltransport und mit der rechten Kante (68) einen rechten Weg für den chromatographischen Lösungsmitteltransport definiert, getrennt. Die Länge des Materials umfaßt eine erste Zone (55), zweite Zone (56), dritte Zone (57), vierte Zone (58) und fünfte Zone (59). Die erste Zone (55) befindet sich in dem linken Weg für den chromatographischen Lösungsmitteltransport und ist imprägniert mit einem ersten Reagens, das in einem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist und mit dem Analyten reagieren und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert werden kann, wenn der Analyt in der dritten Zone immobilisiert ist. Die zweite Zone (56) befindet sich stromabwärts von der ersten Zone (55) auf dem linken chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und stellt eine geeignete Stelle zur Aufnahme der zu analysierenden Probe dar.
Die vierte Zone (58) befindet sich auf dem rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem dritten Reagens, das in dem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist. Die fünfte Zone (59) befindet sich stromabwärts von der vierte Zone (58) auf dem rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem vierten Reagens, das in dem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist. Die dritte Zone (57), die mit einem zweiten Reagens imprägniert ist, das gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert ist, befindet sich stromabwärts auf das zweite Ende (60) hin von der ersten Zone (55), zweiten Zone (56), vierten Zone (58) und fünften Zone (59).
Neben der mittleren Lösungsmittelbarriere (62), die einen linken und rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg definiert, umfaßt die Vorrichtung eine erste Lösungsmittelsperre (63) und eine zweite Lösungsmittelsperre (64), die den chromatographischen Lösungsmitteltransport entlang des rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweges verzögern, indem sie dazu führen, daß das aufsteigende Lösungsmittel einen verschlungeneren Weg zwischen dem ersten Ende (54) und dem zweiten Ende (60) zurücklegen muß. Es existiert auch eine rechte Lösungsmittelbarriere (65) und eine linke Lösungsmittelbarriere (66), die den chromatographischen Lösungsmitteltransport der Probenmaterialien und der ersten, dritten und vierten Reagentien auf die dritte Zone (57) hinlenken.
Die Vorrichtung (50) umfaßt ferner einen inerten Trägerstreifen (52), an dem das längliche chromatographische Material befestigt ist, und eine Deckplatte (53), die sich über der Länge des Materials (51) befindet und die das erste Ende (24) des Materials freiläßt. Die Deckplatte (53) besitzt ein Loch, das der zweiten Zone (56) entspricht und diese freiläßt. Eine Lasche (61) bedeckt die zweite Zone (56) und kann entfernt werden, um Probenmaterialien oder Reagentien auf die zweite Zone (56) aufzubringen.
Gemäß einem Verfahren zur Anwendung der Vorrichtung (50) nach den Figuren 3a und 3b wird die Lasche (61) aus ihrer Stellung über der zweiten Zone (56) in der Deckplatte (53) entfernt und eine flüssige Probe des zu analysierenden Materials auf die zweite Zone (56) aufgebracht. Die Lasche (61) wird dann über die zweite Zone (56) gelegt, um die Probe vom Austrocknen während des Assayverfahrens zu schützen. Die Vorrichtung (50) wird mit dem ersten Ende (54) in ein chromatographisches Lösungsmittel getaucht, das dann stromabwärts auf das zweite Ende (60) läuft, sowohl entlang des linken als auch des rechten Lösungsmitteltransportweges. Der chromatographische Lösungsmitteltransport entlang des rechten Lösungsmitteltransportweges ist verzögert als Folge des verschlungenen Weges, der durch die erste (63) und zweite (64) Sperre hervorgerufen wird. Entlang dem linken Weg transportiert das chromatographische Lösungsmittel das in der ersten Zone (55) imprägnierte erste Reagens und das flüssige Probenmaterial, das auf der zweiten Zone (56) abgeschieden ist, zu der dritten Zone (57), ohne daß das erste Reagens mit dem Probenmaterial in Kontakt kommt.
In der dritten Zone (57) reagiert das immobilisierte zweite Reagens selektiv mit dem in der Probe vorhandenen Analyten und immobilisiert ihn. Nicht-Analytkomponenten der Probe werden chromatographisch von der dritten Zone (57) wegtransportiert. Das erste Reagens kommt dann mit der dritten Zone (57) in Kontakt, wo es durch den Analyten, wenn der Analyt in immobilisierter Form vorliegt, gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert wird.
Gleichzeitig nimmt das chromatographische Lösungsmittel, das über den rechten Lösungsmitteltransportweg fortschreitet, die dritten und vierten Reagentien, die sich in der vierten (58) und fünften (59) Zone befinden, mit und vermischt sie. Das dritte und vierte Reagens, die beispielhaft die enzymkatalysierten Farbsignalmittel umfassen, werden dann durch die rechte Lösungsmittelbarriere (65) durch den Spalt zwischen der rechten Lösungsmittelbarriere (65) und der mittleren Lösungsmittelbarriere (62) in den linken Transportweg geleitet. Der Hauptteil des Probenmaterials und des ersten Reagens ist zu diesem Zeitpunkt über den engen Spalt zwischen der rechten Lösungsmittelbarriere (65) und der linken Lösungsmittelbarriere (66) hinaus transportiert worden, um etwaigen Kontakt des ersten Reagens mit dem dritten und vierten Reagens, die spezifisch mit dem ersten Reagens unter Bildung eines nachweisbaren Signals reagieren, möglichst gering zu halten. Trotzdem wird eine gewisse Menge des Lösungsmittels, enthaltend die Probe und das erste Reagens, in den rechten Lösungsmitteltransportweg transportiert, wo sie mit dem dritten und vierten Reagens reagieren unter Bildung eines nachweisbaren Signals an ihrem Treffpunkt. Indem der chromatographische Lösungsmitteltransport fortschreitet, werden das dritte und vierte Reagens durch den Spalt zwischen der rechten Lösungsmittelbarriere (65) und der linken Lösungsmittelbarriere (66) zu der dritten Zone (57) transportiert. Nachdem sie mit der dritten Zone (57) in Kontakt gekommen sind, reagieren das dritte und vierte Reagens mit etwaigem immobilisiertem ersten Reagens unter Bildung eines nachweisbaren Signals, das das Vorhandensein des Analyten anzeigt.

Dreiwegevorrichtung (Triode)

Die Figuren 4a und 4b zeigen eine verbesserte Dreiwege ("Triode")-Vorrichtung (70) zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe. Die Vorrichtung stellt eine Verbesserung gegenüber der Diodenvorrichtung der Figur 3 dar, indem sie einen dritten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg umfaßt, der dazu dient, dazu beizutragen, zu verhindern, daß die Probe und das erste Reagens mit dem dritten und vierten Reagens zusammenkommen, bevor diese mit der dritten Zone (77) in Kontakt kommen.
Die Vorrichtung umfaßt ein längliches Stück aus chromatographischem Material (71) mit einem ersten Ende (74), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport beginnt, und einem zweiten Ende (80), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Die Länge des Materials ist aufgespalten durch lösungsmittelundurchlässige Barrieren (82 bis 85) in einen linken Lösungsmitteltransportweg, der definiert ist durch die linke Kante des Materials (88), die erste Lösungsmittelbarriere (82) und die zweite Lösungsmittelbarriere (83), einen mittleren Lösungsmitteltransportweg, der definiert ist durch die zweite Lösungsmittelbarriere (83) und die dritte Lösungsmittelbarriere (84) und einen rechten Lösungsmitteltransportweg, der definiert ist durch die dritte Lösungsmittelbarriere (84), die vierte Lösungsmittelbarriere (85) und die rechte Kante des Materials (89). Die drei Lösungsmitteltransportwege laufen zusammen unter Bildung einer Verlängerung des mittleren Transportweges, die definiert ist durch die erste (82) und die vierte (85) Lösungsmittelbarriere und die linke (88) und rechte (89) Kante des Materials.
Die Länge des chromatographischen Materials umfaßt eine erste Zone (75), eine zweite Zone (76), eine dritte Zone (77), eine vierte Zone (78) und eine fünfte Zone (79). Die erste Zone (75) befindet sich in dem linken chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem ersten Reagens, das in einem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist und in der Lage ist, mit dem Analyten zu reagieren und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert zu werden, wenn der Analyt in der dritten Zone immobilisiert ist. Die zweite Zone (76) befindet sich stromabwärts von der ersten Zone (75) und befindet sich in der Verlängerung des mittleren Lösungsmitteltransportweges, definiert durch die erste (82) und vierte (85) Lösungsmittelbarriere. Die vierte Zone (78) befindet sich in dem rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem dritten Reagens, das in dem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist. Die fünfte Zone (79) befindet sich stromabwärts auf das zweite Ende (80) der Vorrichtung hin entlang dem rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem vierten Reagens, das in dem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist. Die dritte Zone (77) befindet sich stromabwärts der ersten (75) zweiten (76), vierten (78) und fünften (79) Zone in der Verlängerung des mittleren Lösungsmitteltransportweges, der definiert ist durch die erste (82) und vierte (85) Lösungsmittelbarriere.
Der rechte Lösungsmitteltransportweg, der definiert ist durch die dritte (84) und vierte (85) Lösungsmittelbarriere und die rechte Kante des Materials (89) ist die Stelle, wo die erste Lösungsmittelsperre (86) und die zweite Lösungsmittelsperre (87) angeordnet sind, die den chromatographischen Lösungsmitteltransport entlang des rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweges verzögern, indem sie dazu führen, daß das aufsteigende Lösungsmittel einen verschlungeneren Weg zwischen dem ersten Ende (74) und dem zweiten Ende (80) gehen muß.
Die Vorrichtung (70) umfaßt ferner einen inerten Trägerstreifen (72), an dem das chromatographische Material (71) befestigt ist und eine Deckplatte (73), die sich über der Länge des Materials (71) erstreckt und die das erste Ende (74) des Materials freiläßt. Die Deckplatte (73) besitzt eine Öffnung entsprechend der zweiten Zone (76) und läßt diese frei. Eine Lasche (81) bedeckt die zweite Zone (76) und kann entfernt werden, um Probenmaterialien oder Reagentien auf die zweite Zone (76) aufzubringen.
Die verbesserte Vorrichtung (70) der Figuren 4a und 4b wird nach den gleichen Verfahren angewandt wie die Vorrichtung (50) der Figuren 3a und 3b. Speziell wird die Decklasche (81) aus ihrer Stellung über der zweiten Zone (76) auf der Deckplatte (73) entfernt und eine flüssige Probe des zu analysierenden Materials wird auf die zweite Zone (76) aufgebracht. Die Lasche (81) wird dann wieder auf die zweite Zone (76) aufgesetzt, um ein Austrocknen des Probenmaterials während des Assayverfahrens zu vermeiden. Die Vorrichtung (70) wird mit ihrem ersten Ende (74) in ein chromatographisches Lösungsmittel getaucht, das dann stromabwärts (nach oben) auf das zweite Ende entlang dem linken, mittleren und rechten Lösungsmittelweg fortschreitet. Der chromatographische Lösungsmitteltransport entlang dem rechten Lösungsmitteltransportweg ist verzögert als Folge des verschlungenen Weges, der ihm durch die erste (86) und zweite (87) Sperre aufgezwungen wird. Entlang dem linken Weg transportiert das chromatographische Lösungsmittel das in der ersten Zone (75) imprägnierte erste Reagens und das in der zweiten Zone (76) abgeschiedene Probenmaterial zu der dritten Zone (77). Das chromatographische Lösungsmittel wird auch entlang dem mittleren chromatographischen Lösungsmitteltransportweg transportiert mit der Wirkung, daß es die Verbindung des linken chromatographischen Transportweges und des rechten Lösungsmitteltransportweges erreicht und einen Rückfluß des ersten Reagens in den rechten Lösungsmitteltransportweg, wo die vierte und fünfte Zone mit dem dritten und vierten Reagens imprägniert sind, das spezifisch mit dem ersten Reagens unter Bildung eines Farbsignals reagiert, vermeidet. Es liegt an der Minimierung dieses Rückflusses und daraus folgenden Verhinderung einer vorzeitigen Reaktion, daß die Vorrichtung (80) der Figuren 4a und 4b eine Verbesserung gegenüber der Vorrichtung (60) der Figuren 3a und 3b darstellt. Bei dieser Vorrichtung (60) kann ein Teil des ersten Reagensmaterials, das spezifisch mit dem vierten (58) und/oder fünften (59) Reagens reaktiv ist, in den rechten Transportweg der Vorrichtung zurückfließen mit der Wirkung, daß Teile des ersten, dritten und vierten Reagens vorzeitig verbraucht werden und falsche Signale erzeugt werden, die nicht notwendig mit dem Nachweis eines Analyten verbunden sind.
Der chromatographische Lösungsmitteltransport schreitet fort, wobei die Probe und das erste Reagens auf die dritte Zone (77) hin transportiert werden. Die erste (82) und vierte (85) Lösungsmittelbarriere sind so ausgebildet, daß sie die Ströme der Reagentien in die dritte Zone konzentrieren. In der dritten Zone (77) reagiert das immobilisierte zweite Reagens selektiv mit in der Probe vorhandenem Analyten, um ihn zu immobilisieren, während Nicht-Analytbestandteile der Probe nicht immobilisiert und von der dritten Zone (77) wegtransportiert werden. Das erste Reagens kommt dann mit der dritten Zone (77) in Kontakt, wo es gegen einen Lösungsmitteltransport durch den Analyten immobilisiert wird, wenn der Analyt in immobilisierter Form vorliegt.
Gleichzeitig nimmt das chromatographische Lösungsmittel, das über den rechten Lösungsmitteltransportweg fortschreitet, das in der vierten Zone (78) abgeschiedene dritte Reagens und das in der fünften Zone (79) abgeschiedene vierte Reagens mit. Das dritte und vierte Reagens werden durch die vierte Lösungsmittelbarriere (85) in die Verlängerung des mittleren Lösungsmitteltransportweges kanalisiert, nachdem das erste Reagens in diese Verlängerung transportiert worden ist. Mit fortschreitendem chromatographischem Lösungsmitteltransport werden das dritte und vierte Reagens zu der dritten Zone (77) transportiert, wo sie mit etwaigem immobilisiertem erstem Reagens unter Erzeugung eines nachweisbaren Farbsignals reagieren.
Die Figur 5 der Zeichnungen zeigt einen Querschnitt der Testvorrichtung (50) der Figur 3a entlang der Linie 5-5. Die Figur zeigt das Material mit Kapillarität (51), durch das der chromatographische Lösungsmitteltransport stattfindet. Das Material ist sandwichartig eingeschlossen zwischen einem inerten Trägerstreifen (52) und einer inerten Deckfolie (53), durch die kein Lösungsmitteltransport stattfinden kann. Zwei Teile des Materials (51), die getrennte Lösungsmitteltransportwege darstellen, sind durch die mittlere Lösungsmittelbarriere (62) getrennt, die für den Lösungsmitteltransport undurchlässig ist. Die Lösungsmittelbarriere (62) kann ein undurchlässiges Material sein oder sie kann einen luft- oder gasgefüllten Spalt in dem Material (51) mit einer ausreichenden Breite darstellen, daß ein chromatographischer Lösungsmitteltransport über dem Spalt nicht stattfindet.

Vierwegevorrichtung (Tetrode)

Die Figuren 6a und 6b zeigen eine verbesserte Vierwege ("Tetrode)-Vorrichtung (90) zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe. Die Vorrichtung stellt eine Verbesserung gegenüber der Triodenvorrichtung der Figur 4 dar, indem die Anordnung der vier Lösungsmitteltransportwege nicht nur einen vorzeitigen Kontakt des ersten Reagens mit dem dritten oder vierten Reagens verhindert, sondern auch so wirkt, daß sie verhindert, daß das erste Reagens die Probe erreicht, bevor die Probe mit der dritten Zone (97) in Kontakt kommt.
Die Vorrichtung umfaßt ein längliches Stück aus einem chromatographischen Material (91) mit einem ersten Ende (94), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport beginnt, und einem zweiten Ende (101), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport endet. Das erste Ende der Vorrichtung (24) ist in ihrer Mitte vorgesehen und definiert einen Spalt zwischen der linken und der rechten Seite der Vorrichtung. Das längliche Material ist ferner durch lösungsmittelundurchlässige Barrieren (103 bis 107) in vier chromatographische Lösungsmitteltransportwege aufgespalten, die in der Mitte der Länge der Vorrichtung zusammenfließen unter Bildung eines mittleren chromatographischen Lösungsmitteltransportweges, in dem sich die dritte Zone (97) befindet. Ein linker chromatographischer Lösungsmitteltransport weg ist definiert durch die linke Kante der Vorrichtung (108) und die erste Lösungsmittelbarriere (103) auf der einen Seite und die linke Kante des Spaltes (110) der Vorrichtung und die zweite und dritte (104 bis 105) Lösungsmittelbarriere auf der anderen. Ein rechter chromatographischer Lösungsmitteltransport weg ist definiert durch die rechte Kante der Vorrichtung (109) und die fünfte Lösungsmittelbarriere (107) auf der einen Seite und die rechte Kante (111) des Spaltes der Vorrichtung und die vierte (106) Lösungsmittelbarriere auf der anderen. Stromabwärts von dem Spalt und zwischen dem linken und rechten Lösungsmitteltransportweg sind ein linker mittlerer und ein rechter mittlerer Lösungsmitteltransportweg definiert. Der linke mittlere Weg ist definiert durch die zweite Lösungsmittelbarriere (104) auf einer Seite und die dritte Lösungsmittelbarriere (105) und führt von dem ersten Ende (94) oberhalb des Spaltes nach oben zu dem linken Lösungsmittelweg. Der rechte mittlere Weg ist definiert durch die dritte Lösungsmittelbarriere (105) auf der einen Seite und die vierte Lösungsmittelbarriere (106) auf der anderen Seite und führt von dem ersten Ende (94) oberhalb des Spaltes zu dem rechten Lösungsmitteltransportweg.
Die Länge des Materials umfaßt eine erste Zone (95), zweite Zone (96) , dritte Zone (97), vierte Zone (98), fünfte Zone (99) und sechste Zone (100). Die erste Zone (95) befindet sich in dem linken chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem ersten Reagens, das in einem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist und in der Lage ist, mit dem Analyten, wenn der Analyt in der dritten Zone immobilisiert ist, zu reagieren und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert zu werden. Die zweite Zone (96) befindet sich in dem linken Lösungsmitteltransportweg stromabwärts der ersten Zone (95) und dem Punkt, wo der linke mittlere Lösungsmitteltransportweg mit dem linken Transportweg zusammenfließt. Die vierte Zone (98) befindet sich in dem rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem dritten Reagens, das in dem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist. Die fünfte Zone (99) befindet sich stromabwärts auf das zweite Ende (101) der Vorrichtung zum entlang dem rechten chromatographischen Lösungsmitteltransportweg und ist imprägniert mit einem vierten Reagens, das in dem chromatographischen Lösungsmittel beweglich ist. Die dritte Zone (97) befindet sich stromabwärts der ersten (95), zweiten (96), vierten (98) und fünften (99) Zone in der Verlängerung des mittleren Lösungsmitteltransportweges, der definiert ist durch die erste (103) und fünfte (107) Lösungsmittelbarriere. Die sechste Zone (100) befindet sich stromabwärts der dritten Zone (97) nahe dem zweiten Ende (101) und ist imprägniert mit einem fünften Reagens, das das Vorhandensein von Lösungsmittel an dem zweiten Ende anzeigt.
Die Vorrichtung (90) umfaßt ferner einen inerten Trägerstreifen (92), an dem die Länge des chromatographischen Materials (91) befestigt ist und eine Deckplatte (93), die sich über der Länge des Materials (91) befindet, und das erste Ende (94) des Materials freiläßt. Der inerte Trägerstreifen (92) und die Deckplatte (93) sind für Lösungsmittel undurchlässig und umgeben das chromatographische Material, so daß es entlang seiner Kanten undurchlässig ist und nur dort, wo die Deckplatte das chromatographische Material an dem ersten Ende (94) freiläßt, mit Lösungsmittel benetzt werden kann. Die Deckplatte (93) besitzt ferner eine Öffnung, die der zweite Zone (96) entspricht und diese freiläßt. Eine Lasche (102) bedeckt die zweite Zone (96) und kann entfernt werden, um das Probenmaterial oder die Reagentien auf die zweite Zone (96) aufzubringen.
Die verbesserte Vorrichtung (90) der Figuren 6a und 6b wird nach dem gleichen Verfahren angewandt wie die Vorrichtungen (50) und (70) der Figuren 3a, 3b, 4a und 4b. Speziell wird die Lasche (102) von ihrer Stelle über der zweiten Zone (96) in der Deckplatte (93) entfernt und eine flüssige Probe des zu analysierenden Materials wird auf die zweite Zone (96) aufgebracht. Die Lasche (102) wird dann wieder über die zweite Zone (96) gedeckt, um das Probenmaterial vom Austrocknen während des Assayverfahrens zu bewahren. Die Vorrichtung (90) wird in das chromatographische Lösungsmittel in einer solchen Tiefe eingetaucht, daß das Lösungsmittel das erste Ende (94) für alle vier Lösungsmitteltransportwege berührt, aber wobei die Deckplatte so ausgebildet ist, daß der Lösungsmitteltransport weiter stromabwärts auf das zweite Ende hin an dem zweiten und dritten Lösungsmitteltransportweg beginnt als für den ersten und vierten Weg. Das Lösungsmittel schreitet dann stromabwärts auf das zweite Ende hin fort entlang dem linken, linken mittleren, rechten mittleren und rechten Lösungsmittelweg.
Der Transport des chromatographischen Lösungsmittels entlang dem linken mittleren Lösungsmitteltransportweg schreitet so fort, daß das Lösungsmittel zwischen der ersten Zone (95) und der zweiten Zone (96) in den linken chromatographischen Lösungsmitteltransportweg transportiert wird. Da der linke mittlere Transportweg kürzer ist als der linke Lösungsmitteltransportweg, erreicht dieses Lösungsmittel den Bereich zwischen der ersten und zweiten Zone, bevor Lösungsmittel, das von dem ersten Ende (94) des linken Weges aus fortschreitet, diesen Bereich erreicht. Das von dem linken mittleren Weg zugeführte Lösungsmittel dient so dazu, das erste, in der ersten Zone (95) abgeschiedene Reagens von den in der zweiten Zone (96) abgeschiedenen Substanzen zu trennen. Das Lösungsmittel kommt mit den Probensubstanzen in der zweiten Zone zusammen, löst diese und transportiert sie stromabwärts auf das zweite Ende (101) hin. Gleichzeitig kommt das Lösungsmittel mit dem ersten Reagens, das in der ersten Zone (95) imprägniert ist, in Kontakt und transportiert dieses "stromaufwärts" (nach unten) auf das erste Ende (94) hin, bis es die "stromabwärts" (nach oben) von dem ersten Ende (94) fortschreitende Lösungsmittelfront trifft. Das erste Reagens wird dann stromabwärts auf die dritte Zone (101) hin transportiert, aber getrennt von den Probensubstanzen durch die Masse des Lösungsmittels, das von dem linken mittleren Transportweg zugeführt worden ist. Die Masse der von dem linken mittleren Lösungsmitteltransportweg zugeführten Flüssigkeit ist auch in einigen Fällen nützlich, wo das Probenmaterial getrocknet ist. Die Masse von Lösungsmittel ergibt häufig ausreichend Zeit, um das Material zu lösen und es zu transportieren, während eine Trennung zwischen der Probe und dem ersten Reagens aufrechterhalten bleibt.
Der chromatographische Lösungsmitteltransport entlang dem rechten mittleren Lösungsmitteltransportweg schreitet so fort, daß Lösungsmittel auf die Verbindung des rechten mittleren Transportweges und des rechten Transportweges hin transportiert wird. Da der rechte mittlere Weg kürzer ist als der rechte Weg und der rechte Weg zwischen der vierten Lösungsmittelbarriere (106) und der rechten Kante (109) der Vorrichtung eingeschränkt, erreicht Lösungsmittel, das durch den rechten mittleren Weg zu der Verbindung mit dem rechten Weg transportiert wird, diesen Punkt vor dem Lösungsmittel, das "stromabwärts" entlang dem rechten Weg fließt. Das Lösungsmittel fließt dann "stromaufwärts" auf das erste Ende (94) des rechten Weges zu und vermischt das dritte und vierte Reagens, die an der vierten (98) und fünften (99) Zone imprägniert sind, bevor es den stromabwärts laufenden Fluß durch den rechten Transportweg trifft. Der reine Lösungsmittelstrom "stromabwärts" transportiert dann das dritte und vierte Reagens auf die dritte Zone (97) zu. Inzwischen hat der Lösungsmittelfluß durch den rechten mittleren Weg dazu gedient, zu verhindern, daß die Probe und das erste Reagnes zurückfließen und sich mit dem dritten und vierten Reagens vermischen.
Der chromatographische Lösungsmitteltransport schreitet fort, wobei die Probe und das erste Reagens auf die dritte Zone hin transportiert werden. In der dritten Zone (97) reagiert das zweite immobilisierte Reagens selektiv mit dem Analyten, der in der Probe vorhanden ist, und immobilisiert ihn. Nicht-Analytkomponenten der Probe werden von der dritten Zone (97) wegtransportiert. Das erste Reagens kommt dann mit der dritten Zone (97) in Kontakt, wo es durch den Analyten gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert wird, wenn der Analyt in immobilisierter Form vorliegt. Gleichzeitig transportiert das chromatographische Lösungsmittel, das entlang dem rechten Lösungsmitteltransportweg fortschreitet, das dritte und vierte Reagens auf die dritte Zone zu, nachdem etwaiges nicht gebundenes erstes Reagensmaterial über die dritte Zone (97) hinaus transportiert worden ist. In der dritten Zone (97) können das dritte und vierte Reagens mit etwaigem immobilisiertem erstem Reagens reagieren, um ein nachweisbares Signal zu ergeben. Wenn eine Farbstoffverbindung, wie ein Diazoniumsalz, als drittes oder viertes Reagens verwendet wird, kann das Farbsignal ein gefärbter Komplex sein, der häufig in dem angewandten chromatographischen Lösungsmittel unlöslich ist, so daß der umgesetzte Farbstoff in der dritten Zone (97) immobilisiert wird.
Die Vorrichtung ist so ausgebildet, daß sie ausreichend lang ist, daß das chromatographische Lösungsmittel nicht das zweite Ende (101) erreicht und der chromatographische Lösungsmitteltransport fortschreitet, bis die Probe und das erste, dritte und vierte Reagens mit der dritten Zone in Kontakt gekommen sind. Um zu bestimmen, ob das chromatographische Lösungsmittel über die volle Länge der Vorrichtung fortgeschritten ist, kann eine sechste Zone (100) nahe dem zweiten Ende (101) der Vorrichtung angeordnet sein. Die Zone kann imprägniert sein mit einem fünften Reagens, das ein Material, wie Kupfersulfat, sein kann, das das Vorhandensein von Lösungsmittel anzeigt. So ist, wenn die sechste Zone ein Signal anzeigt, daß das Lösungsmittel über die gesamte Länge der Vorrichtung fortgeschritten ist, die dritte Zone bereit zur Beobachtung, um entweder eine positive oder negative Reaktion zu beobachten.

Beschreibung des chromatographischen Streifenmaterials

Chromatographische Streifenmaterialien, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen solche Materialien, die Kapillarität besitzen und die Fähigkeit zum chromatographischen Lösungsmitteltransport nicht immobilisierter Reagentien und reaktiver Probenbestandteile mit Hilfe eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels haben. Während eine große Vielzahl von chromatographischen Substratmaterialien, die für die Papierchromatographie verwendet werden, geeignet ist zur Verwendung nach der Erfindung, ist die Verwendung von Dünnschichtchromatographiesubstraten bevorzugt zur Anwendung nach der Erfindung, da die Verwendung derartiger Substrate die Geschwindigkeit und Auflösung der Assays nach der Erfindung verbessert. Die Materialien sollten vorzugsweise inert sein und im allgemeinen nicht physikalisch oder chemisch mit irgendeinem der Analyten, Reagentien oder Reaktionsprodukte reagieren. Die Materialien können Fasermaterialien umfassen, wie sie geeignet sind zur Verwendung bei Papierchromatographieverfahren, einschließlich Geweben und Vliesstoffen. Bevorzugter sind solche Materialien mit mikroporösen oder Mikrogranulatstrukturen mit Mikroporen oder Mikrogranulatmaterialien, die geeignet sind zur Verwendung bei Dünnschichtchromatographien, sind besonders bevorzugt.
Dünnschichtchromatographiematerialien, die besonders geeignet sind für die vorliegende Erfindung, umfassen granulatförmige Dünnschichtchromatographiematerialien, wie Kieselsäure oder mikrogranulare Cellulose. Bevorzugte nicht granulatförmige, mikroporöse Materialien umfassen mikroporöse Celluloseester, zum Beispiel Ester von Cellulose mit einer aliphatischen Carbonsäure, wie einer Alkancarbonsäure mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure oder eine der Buttersäuren oder Valeriansäuren. Besonders bevorzugt sind mikroporöse Materialien, die hergestellt worden sind aus Nitrocellulose, wobei unter diesem Ausdruck irgendein Salpetersäureester von Cellulose zu verstehen ist. Geeignete Materialien umfassen Nitrocellulose in Kombination mit irgendeinem der erwähnten Carbonsäurecelluloseester. So kann reiner Nitrocelluloseester verwendet werden, der besteht aus einem Ester von Cellulose mit etwa drei Nitrogruppen auf sechs Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt ist ein gemischtes Acetat/Nitrat-Celluloseestermaterial unter dem Handelsnamen "Millipore Typ HAWP" (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts) mit einer Porengröße von 0,45 um.
Die verschiedenen chromatographischen Materialien können als solche in geeigneten Formen, wie als Filme, Streifen, Bahnen oder Folien, verwendet werden. Sie können auch als Überzug aufgebracht oder gebunden an oder laminiert mit entsprechenden inerten Trägermaterialien, wie Papier, Glas, Kunststoff, Metall oder Stoff, verwendet werden. (Ein bevorzugtes inertes Trägermaterial ist Mylar ). Ein derartiges Trägermaterial hat nicht nur die Wirkung, daß es einen strukturellen Träger für das chromatographische Material darstellt, sondern verhindert auch ein Verdampfen von Reagentien und Lösungsmittelmaterialien während des Assayverfahrens. Das poröse feste Substrat liegt vorzugswiese in Form von Streifen mit einer Dicke im Bereich von 0,01 mm bis 0,5 mm und insbesondere von etwa 0,1 mm vor. Die Streifen können in ihren anderen Dimensionen weitgehend variieren, werden aber vorzugsweise entsprechend schmal gehalten, um die Assayentwicklungszeit zu verkürzen und den Materialverbrauch möglichst gering zu halten. Wenn die Streifen extrem schmal sind, können sie an einem geeigneten Handgriff oder Halter befestigt sein, um die Handhabung und Beobachtung der Ergebnisse zu erleichtern. Streifen von ungefähr 3 mm Breite und bis zu 75 mm Länge haben sich als besonders geeignet erwiesen bei der Herstellung von Einzelwegvorrichtungen nach der Erfindung. Bei Mehrwegevorrichtungen können größere Streifen verwendet werden, auf denen mehrere Wege angeordnet sind. Die Porengröße kann innerhalb weiter Grenzen variieren, liegt jedoch vorzugsweise zwischen etwa 0,05 um und 10 um, insbesondere zwischen 0,1 um und 1,0 um und insbesondere bei etwa 0,45 um. Die Kombination von Porengröße und Substratdicke kann verändert werden entsprechend den Eigenschaften der speziellen angewandten Reagentien, um die gewünschten Eigenschaften bezüglich der Geschwindigkeit und Auflösung zu erhalten.
Es ist erwünscht, daß bei der Herstellung der Formen der Materialien nach der vorliegenden Erfindung irgendwelche Ungleichmäßigkeiten in den Materialien oder in den Kanten des Materials, die zu einem ungleichmäßigen Fluß durch das Material führen, vermieden werden. Bevorzugte Mittel zur Gestaltung der Streifenmaterialien umfassen die Verwendung eines Papierschneiders mit einer sich drehenden Schneide aus Wolframcarbid. Andere geeignete Mittel umfassen Methoden, wie Laserschneiden, das besonders geeignet ist zur Verwendung bei der Massenproduktion.
Da das Streifenmaterial der Vorrichtung vorzugsweise chemisch inert ist, kann es erforderlich sein, es in der dritten Zone zu aktivieren, damit das zweite Reagens gegen einen Lösungsmitteltransport in dieser Zone immobilisiert werden kann. Verschiedene Methoden sind erforderlich, um das zweite Reagens zu immobilisieren je nach der speziellen chemischen Art des Streifenmaterials und des zweiten Reagens. Im allgemeinen ist, wenn das Streifenmaterial Nitrocellulose oder ein gemischter Celluloseester ist, keine spezielle chemische Bindung erforderlich, um das zweite Reagens zu immobilisieren. Für andere Materialien und Reagentien können verschiedene Techniken angewandt werden einschließlich der Funktionalisierung mit Substanzen, wie Carbonyldiimidazol, Glutaraldehyd oder Bernsteinsäure, oder Behandlung mit Substanzen, wie Cyanogenbromid. Andere geeignete Reaktionen umfassen die Behandlung mit Schiff'schen Basen und Borhydrid zur Reduktion von Aldehyd-, Carbonyl- und Aminogruppen. DNA, RNA und bestimmte Antigene können gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert werden durch "Backen" auf dem Streifenmaterial. Das "Backen" kann durchgeführt werden bei Temperaturen im Bereich von 60ºC bis 120ºC während Zeiträumen von 5 Minuten bis 12 Stunden, aber vorzugsweise bei etwa 80ºC während etwa 2 Stunden.

Beschreibung der Antikörper

Antikörper, die geeignet sind zur Durchführung der Immunoassays nach der vorliegenden Erfindung umfassen solche, die spezifisch reaktiv sind mit verschiedenen Analyten, deren Nachweis in biologischen Flüssigkeiten erwünscht ist. Derartige Antikörper sind vorzugsweise IgG- oder IgM-Antikörper oder Gemische davon, die im wesentlichen nicht verbunden sind mit Antikörpern, die in der Lage sind, mit Nicht-Analytmolekülen zu reagieren. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und sind im Handel erhältlich oder können erhalten werden aus Mausascites, Gewebekultur oder nach anderen bekannten Verfahren. Eine typische Beschreibung für ein Hybridomverfahren zur Bildung von monoklonalen Antikörpern findet sich bei J. R. Wands und V. R. Zurawski in Gastroenterology 80:225 (1981); A. Marshak-Rothstein et al., J. Immunol. 122:2491 (1979); V. Y. Oi und L. A. Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hyvrid", B. B. Mishell und S. M. Shiige (Hrsg.) Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco: W. H. Freeman Publishing, 1979; und in der US-PS 4 515 893 von Kung et al. Die Verwendung von Gemischen von monoklonalen Antikörpern unterschiedlicher antigener Spezifitäten oder von monoklonalen Antikörpern und polyklonalen Antikörpern kann erwünscht sein. Ungeachtet ihrer speziellen Quelle oder des Typs von Antikörpern ist es jedoch bevorzugt, daß sie im allgemeinen frei sind von Verunreinigungen. Die Antikörper können gereinigt werden durch Säulenchromatographie oder andere übliche Verfahren, werden jedoch vorzugsweise nach den bekannten Affinitätsreinigungsverfahren gereinigt.

Beschreibung der Antigene

Antigene, die geeignet sind zur Durchführung der Immunoassays nach der vorliegenden Erfindung, umfassen solche Materialien natürlichen oder synthetischen Ursprungs, die antigene Determinanten darstellen, für die die Analytantikörper spezifisch reaktiv sind, wenn sie auf dem chromatographischen Streifenmaterial nach der Erfindung vorliegen. Synthetische Antigene umfassen solche, die nach üblichen chemischen Syntheseverfahren hergestellt worden sind, sowie solche, die hergestellt worden sind nach den Rekombinations-DNA-Verfahren. Antigene Materialien können als Reaktionsmaterial verwendet werden, das an die Reaktionszone gebunden ist in Sandwichassays zum Nachweis von spezifischen Antikörpern. Sie können auch markiert sein und verwendet werden bei den gleichen Assays als Signalmoleküle zum Nachweis von immobilisierten Antikörpern.

Beschreibung von Blockierungsmitteln für Immunoassays

Blockierungsmittel, die geeignet sind zur Herstellung von Vorrichtungen für Immunoassays nach der Erfindung umfassen solche, die imstande sind, überschüssige Bindungsstellen auf dem chromatographischen Streifenmaterial zu blockieren, die den chromatographischen Lösungsmitteltransport von Proben, Substanzen oder Reagentien nach der Erfindung behindern könnten. Bei der Herstellung von Vorrichtungen nach der Erfindung wird das zweite Reagens zunächst in der dritten Zone immobilisiert. Wenn das zweite Reagens in der dritten Zone immobilisiert ist, wird der Streifen so bearbeitet, daß überschüssige Bindungsstellen des chromatographischen Materials blockiert werden, die den chromatographischen Lösungsmitteltransport von Reagentien oder Probensubstanzen behindern könnten. Besonders geeignet ist die Verwendung von Blockierungslösungen, umfassend nicht spezifische Proteine, wie sie in Gelatine oder Vollserum vorhanden sind. Derartige Proteine werden so ausgewählt, daß sie Reagensmaterialien der Assays nicht stören oder nicht mit ihnen reagieren. Die Blokkierung der Stellen kann durchgeführt werden durch Behandlung mit einer Serumlösung, wie 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in physiologischer Salzlösung. Die Streifen werden dann bis zu 2 Stunden bei einer Temperatur von 30ºC bis 50ºC, vorzugsweise bei 40ºC, inkubiert und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Ein bevorzugtes Blockierungsmaterial für immunologische Assays ist jedoch Gelatinelösung, wie eine 1 %ige LB-Gelatinelösung, die keine Inkubation erfordert.

Beschreibung des Lösungsmittelsystems für Immunoassays

Geeignete chromatographische Lösungsmittelsysteme für Immunoassays nach der vorliegenden Erfindung umfassen Lösungsmittel, die in der Lage sind, den Analyten, das erste Reagens und etwaige weitere Reagentien und Materialien bzw. Substanzen zu lösen und sie zu der dritten Zone zu transportieren. Derartige Lösungsmittel sollten eine ausreichende Ionenstärke besitzen, um eine elektrostatische Wechselwirkung der transportierten Substanzen mit dem Streifenmaterial zu vermeiden. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Verwendung bei Immunoassayverfahren nach der Erfindung ist physiologische Salzlösung mit einem pH-Wert im neutralen Bereich. Proteine sowie Detergentien, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100 und Natriumdeoxycholat (DOC) können in das chromatographische Lösungsmittel in Mengen eingebracht werden, die eine nicht spezifische Bindung mit dem Streifenmaterial möglichst gering halten, aber nicht darüberhinaus, was die gewünschten Bindungs- und Immobilisierungsreaktionen verhindern würde. Andere chromatographische Lösungsmittel, wie Lösungsmittel zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC), die die Lösung von Proteinen und anderen Reaktionspartnern begünstigen und die Bindung an Streifenmaterialien, wie Nitrocellulose, minimieren, können ebenfalls verwendet werden. Parekh et al., Anal. Biochem., 148, 87-92 (1985) beschreiben verschiedene chromatographische Lösungsmittel, wie Lösungen von 50 % Pyridin oder 40 % Acetonitril in Ammoniumacetatpuffer (pH 8,9), die besonders geeignet sind für Immunoassays nach der vorliegenden Erfindung.

Beschreibung von DNA- und RNA-Hybridisierungssubstanzen

DNA- und RNA-Hybridisierungssubstanzen, die geeignet sind nach der vorliegenden Erfindung, umfassen markierte und nicht markierte DNA- und RNA-Polynukleotidsonden mit Basensequenzen, die allgemein komplementär sind zu denjenigen des zu bestimmenden Genmaterials. Die Sonden nach der Erfindung besitzen im allgemeinen zwischen 25 und 10 000 Basen und vorzugsweise zwischen 30 und 5 000 Basen.
Die Sonden brauchen nicht vollständig komplementär zu sein zu den Basensequenzen des Analytgenmaterials und hybridisieren allgemein, wenn etwa 70 % oder mehr Homologität zwischen den Basensequenzen vorliegt. Bedingungen bezüglich der DNA- und RNA-Hybridisierung sind allgemein angegeben von Crosa et al., in J. Bact. 115(3), 904-911 (1973). Polynukleotidsondenmaterialien können nach bekannten Verfahren erhalten werden. Siehe zum Beispiel Kornberg, DNA Replication, W. H. Freeman und Co., San Francisco, 670-679 (1978); Dallas et al., J. Bacteriol. 139, 850-858 (1979) und So et al., Nature, 277, 453-456 (1979).
Nach einem Hybridisierungssandwich-Assayverfahren nach der vorliegenden Erfindung ist die erste Zone der Assayvorrichtung imprägniert mit einem ersten Reagens, das markiert sein kann, umfassend eine Polynukleotidsonde mit einer Basensequenz, die im allgemeinen komplementär ist zu dem ersten Teil der Basensequenz der zu bestimmenden Nukleinsäure. In der dritten Zone ist ein zweites Reagens immobilisiert, umfassend ein Polynukleotid mit einer exponierten Basensequenz, die im allgemeinen komplementär ist zu einem zweiten Teil der Basensequenz der zu bestimmenden Nukleinsäure.
Entsprechend dem Assayverfahren wird die analythaltige Probe auf die zweite Zone aufgebracht und wird chromatographisch unter Hybridisierungsbedingungen zu der dritten Zone transportiert, so daß das Analytmaterial durch Hybridisierung des zweiten Teils seiner Basensequenz mit der Basensequenz des zweiten Reagens immobilisiert wird. Das erste Reagens wird dann chromatographisch unter Hybridisierungsbedingungen zu der dritten Zone transportiert, wo es immobilisiert wird durch Hybridisierung seiner Basensequenz mit der Basensequenz des ersten Teils der Analytmolekülbasensequenz. Die relative Beweglichkeit der Probenkomponenten und des ersten Reagens oder die räumliche Beziehung zwischen der zweiten und dritten Zone ist so, daß der Analyt in der dritten Zone abgeschieden und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert wird, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht. Ferner werden störende Probenbestandteile und Nicht-Analytkomponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, aus der dritten Zone entfernt, bevor der chromatographische Transport des ersten Reagens die dritte Zone erreicht.

Beschreibung von Blockierungsmitteln für Hybridisierungsassays

Blockierungsmittel, die geeignet sind zur Verwendung bei Polynukleotidhybridisierungsassays nach der vorliegenden Erfindung umfassen solche Blockierungsmittel, die in der Lage sind, überschüssige Bindungsstellen auf dem chromatographischen Streifenmaterial, die den chromatographischen Lösungsmitteltransport der Probensubstanzen oder Reagentien nach der Erfindung behindern könnten, zu begrenzen oder zu blockieren. Ferner sollten derartige Materialien die Hybridisierung der Proben und Reagenspolynukleotidmaterial nach der Erfindung nicht stören. Ein bevorzugtes Blockierungsmittel für Hybridisierungsassays ist eine Lösung, umfassend SSPE-Puffer (der 0,9 M NaCl, 560 mM NaH&sub2;PO&sub4; und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 7,4) enthält) und Denhardt's Lösung (enthaltend 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon und 1 mg/ml BSA) . Nitrocellulosestreifen, auf denen das zweite Reagens immobilisiert ist, werden blockiert durch Behandlung mit dieser Lösung in dicht verschlossenen Beuteln während 2 Stunden bei 65ºC.

Beschreibung von Lösungsmittelsystemen für Hybridisierungsassays

Geeignete chromatographische Lösungsmittelsysteme für Polynukleotidhybridisierungsassays nach der vorliegenden Erfindung umfassen Lösungsmittel, die in der Lage sind, den Analyten, das erste Reagens und etwaige weitere Reagentien und Substanzen zu lösen und sie zu der dritten Zone zu transportieren. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Verwendung der Polynukleotidhybridisierungsassays nach der vorliegenden Erfindung umfaßt SSPE-Puffer (der 0,9 M NaCl, 560 mM NaH&sub2;PO&sub4; und 5 mM EDTA (pH 7,4) enthält), Denhardt's Lösung (enthaltend 0,06 % Ficoll, 0,06 % Polyvinylpyrrolidon und 0,6 mg/ml BSA) und 50 % deionisiertes Formamid. Das bevorzugte Lösungsmittel kann gegebenenfalls Träger-DNA enthalten, wie 100 ug/ml Humanplacenta-DNA oder Lachssperma-DNA.

Ausbildung von Wegen und Lösungsmittelbarrieren

Es sind verschiedene Mittel bekannt, um den aufeinanderfolgenden Transport von Reagentien und Probenmaterialien nach der Erfindung zu erzielen. Derartige Mittel können umfassen das Aufbringen von Probensubstanzen und Reagentien an bestimmten Stellen, Variation der Länge der Wege, entlang denen Reagentien und Probensubstanzen transportiert werden, und Manipulation der Geschwindigkeit, mit der der Transport stattfindet. Mittel zur Variation der Weglängen umfassen die Bildung von verschlungenen Wegen durch Verwendung von LöSungsmittelbarrieren.
Lösungsmittelbarrieren, die den chromatographischen Fluß nach der Erfindung blockieren, können hergestellt werden durch verschiedene physikalische oder chemische Ätzverfahren. Spalte von weniger als 0,1 mm in der Breite haben sich als wirksam zur Verhinderung des Flüssigkeitsflusses erwiesen. Ein bevorzugtes Mittel zur Erzeugung derartiger Spalte umfaßt jedoch die Anwendung von Laserätzverfahren. Ein CO&sub2;-Laser kann nach einem Verfahren angewandt werden, bei dem Cellulose mit Mylar-Rücken auf eine Stützbefestigung aufgebracht wird, die auf einem computergesteuerten X-Y-Tisch montiert ist, der sehr enge Stellungstoleranzen ermöglicht. Wahlweise kann ein den Strahl bewegender Mechanismus angewandt werden. Unter Anwendung einer Kombination von geeigneten optischen Linsen und sorgfältiger Fokussierung des Strahls kann ein Laserstrahlpunkt mit einem Durchmesser von etwa 0,005 inch auf die Nitrocellulose fokussiert werden. Durch sorgfältige Steuerung der Laserkraft kann eine schmale Bahn von Nitrocellulose von etwa 0,005 inch Breite entweder von der Mylar- Unterlage entfernt oder mit ihr verschmolzen werden.
Die Anwendung eines CO&sub2;-Lasers ist besonders bevorzugt aufgrund der vorteilhaften Kupplungswirkung des Lichts aus dem Laser mit der Nitrocellulose. Trotzdem sind auch andere Arten von Lasern geeignet, vorausgesetzt, daß die Wellenlänge des Laserstrahls die gewünschte Wirkung auf das Lösungsmitteltransportmaterial ausübt. Durch Verwendung eines beweglichen Strahls oder eines X-Y-Tisches können präzise Wege mit durch Sperren erzeugten Kanälen oder andere verschlungene Formen auf der Mikrocellulose erzeugt werden.
Mechanische und chemische Mittel können angewandt werden, um die Wege wirksam zu verlängern oder zu verkürzen durch Modifizierung der chromatographischen Transportgeschwindigkeiten der Lösungsmittel, Reagentien und Probenmaterialien. Ein geeignetes Mittel umfaßt die Modifizierung der Hydrophilie des chromatographischen Substrats in unterschiedlichen Graden. Die Hydrophilie des Substrats kann chemisch variiert werden durch Zugabe verschiedener Substanzen, wie Proteine oder Detergentien zu dem Medium oder chromatographischen Lösungsmittel, die die Oberflächenspannung oder Viskosität der Materialien auf dem Streifen beeinflussen. Derartige Materialien sollten mit den Reaktionssubstanzen, die über den Weg transportiert werden sollen, kompatibel bzw. verträglich sein und können selektiv auf die entsprechenden Bahnen aufgebracht werden durch lithographische und andere Verfahren, wie sie für den Fachmann bekannt sind.
Wenn das Streifenmaterial kein dünnschichtchromatographisches Substrat umfaßt, können mechanische Mittel ebenfalls angewandt werden, um die Porosität des Substrats und damit die Geschwindigkeit des chromatographischen Transports zu modifizieren. Verpressen von porösen, chromatographischen Materialien, wie Papier, verringert die Porengröße des Materials, was im allgemeinen zu einer Zunahme der Diffusionsgeschwindigkeit von Substanzen durch dieses Substrat führt. Durch selektives Verpressen bestimmter Bahnen in höherem oder geringerem Ausmaß und Nichtverpressen von anderen ist es möglich, eine Folge der chromatographischen Zufuhr von Reaktionssubstanzen zu der dritten Zone zu programmieren. Materialien können durch übliche Gravurverfahren komprimiert werden, wie es dem Fachmann bekannt ist.

Nachweismittel

Es stehen verschiedene Mittel zum Nachweis des ersten Reagens in der dritten Zone zur Verfügung. Derartige Mittel umfassen im allgemeinen die Markierung des ersten Reagens mit einem Signalmolekül, das in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das eine Radiomarkierung, ein Chromophor, Fluorophor oder eine Enzymmarkierung sein kann. Während Signalmoleküle, die mit Radioisotopen markiert sind, besonders wirksam sind zur Aussendung von nachweisbaren Signalen, erfordert ihr Nachweis die Anwendung von speziellen Vorrichtungen und stellt Schwierigkeiten bezüglich der Gesundheit und Sicherheit dar. Besonders bevorzugt ist die Anwendung von markierten Indikatormolekülen, die nachweisbare Signale ergeben einschließlich Licht im sichtbaren Spektrum. Besonders geeignet ist die Anwendung von Enzymmarkierungen, bei denen die Moleküle des ersten Reagens mit Enzymen oder Coenzymen markiert sind, die dann Reaktionen katalysieren, die Farbstoffsubstanzen aktivieren, die Strahlung absorbieren oder aussenden, um ein nachweisbares Signal zu ergeben.
Enzymsysteme, die geeignet sind als signalerzeugende Systeme nach der vorliegenden Erfindung umfassen Alkaliphosphatase, Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, β-Galactoxidase und β- Lactamase. Andere Enzyme und Coenzyme, die für signalerzeugende Systeme geeignet sind, umfassen solche, wie sie beschrieben sind in der US-PS 4 275 149 (Spalten 19 bis 23) und der US-PS 4 318 980 (Spalten 10 bis 14), auf die hier ausdrücklich verwiesen wird. Die Anwendung von Enzymen, die Wasserstoffperoxid erzeugen, das dann einen Farbstoffvorläufer zu einem Farbstoff oxidiert, ist bekannt. Geeignete Kombinationen umfassen Saccharidoxidasen, wie Glucoseoxidase und Galactoseoxidase, und heterocyclische Oxidasen, wie Uricase und Xanthinoxidase in Kombination mit einem Enzym, wie Peroxidase und Cytochrom-C-oxidase zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid und zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers. Die Verwendung von anderen Oxidoreduktasen ist ebenfalls geeignet, ebenso wie die Verwendung von Enzymen, wie Hydrolasen und Transferasen. Verschiedene Coenzyme, wie NADH, NADPH, Pyridoxalphosphat, FADH und FMNH können angewandt werden, besonders zusammen mit Oxidoreduktasen.

Beispiel 1

Nach diesem Beispiel wurde eine Einzelweg-Immunoassayvorrichtung zum Nachweis von Syphilisantikörpern hergestellt und angewandt. Mikroporöses Cellulosematerial mit einer Dicke von etwa 0,1 mm und einem mittleren Porendurchmesser von 0,45 um wurde auf eine inerte Mylar-Trägerfolie von etwa 0,1 mm Dicke (Micron Separation Industries, Waltham, Mass.) aufgegossen. Ein Stück von 27 mm x 31 mm wurde mit einem Papierschneider mit rotierender Scheibe (Alvin, Windsor, Ct.) abgeschnitten. Um die Herstellung der Vorrichtung zu erleichtern, wurde dann ein Gitter auf die Nitrocellulose aufgedruckt mit einem Inkjet-Printer (Hewlett Packard, Thinkjet, Palo Alto, Ca) unter Verwendung eines Grafiksoftwarepakets und eines Hewlett Packard 9816 Computers (Palo Alto, Ca.). Das Gitter umfaßte eine Anzahl von numerierten Bahnen von etwa 3 mm Breite und 31 mm Länge, die von fünf Linien gekreuzt wurden, mit einem Abstand von 3 mm, wobei die erste Linie 9mm vom ersten Ende des Gitters entfernt war. Die erste und zweite Linie definieren eine erste Zone, die dritte Linie definiert die Mitte einer zweiten Zone und die vierte und fünfte Linie definieren eine dritte Zone. Eine 27 mm x 29 mm Mylar-Deckplatte wurde dann angewandt, um die Nitrocellulose zu bedecken, wobei ein nicht bedeckter Teil von 2 mm Nitrocellulose am ersten Ende frei lag. Ferner wurden Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm in die Nitrocelluloseabdeckschicht entsprechend der zweiten und dritten Zone gestanzt. Außerdem wurde ein 9 mm x 27 mm Mylar- Streifen geschnitten, um die Löcher während der Chromatographie zu bedecken. Beide Mylar-Stücke wurden auf einer Seite mit Kautschukzement (Sanford, Bellwood, Il.) überzogen und konnten mindestens eine Stunde trocknen.
Syphilisantigen, umfassend Treponema palladium, wurde isoliert durch intratestikuläre Injektion von Kaninchen und gereinigt durch Differentialzentrifugieren. Das Antigen wurde auf die dritte Zone in abwechselnden Bahnen in 0,5 ul Anteilen einer TBS-Lösung, enthaltend das Antigen in einer Konzentration von 10&sup9; Zellen/ml mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von mg/ml aufgebracht. Abwechselnde Bahnen wurden angewandt, um zu verhindern, daß Material von der einen Bahn dasjenige von einer anderen verunreinigte. Die Nitrocellulose wurde dann blokkiert durch Inkubieren während einer Stunde bei Raumtemperatur und leichtes Bewegen in einer 1 %igen Lösung von LB-Gelatine (Inotech, Wohlen, Schweiz) in TBS-Lösung, enthaltend (0,15 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH 7,6). Die Folien konnten dann ablaufen und an der Luft trocknen.
Mit Peroxidase markierte Ziegenantihuman-IgG-Antikörper (Kirkegaard-Perry, Gaithersburg, Maryland) wurden dann im Verhältnis 1:5 verdünnt in einem Gemisch, enthaltend 1 % LB-Gelatine und 1,0 % Triton X-100. Das Antikörpergemisch wurde dann in 0,5 ul- Anteilen auf die ersten Zonen der Probenbahnen aufgebracht, auf die vorher Antigen aufgebracht worden war. Das gleiche Verdünnungsgemisch, enthaltend 1 % LB-Gelatine und 1,0 % Triton X-100, wurde dann in 0,5 ul-Anteilen auf die zweiten (Proben aufnehmenden) Zonen der Vorrichtung aufgebracht.
Der Mylar-Trägerstreifen und die Deckschicht wurden auf der behandelten Nitrocellulose befestigt, so daß die zweiten und dritten Zonen und 2 mm des ersten Endes freilagen. Positive und negative Serumproben wurden dann auf die zweiten Zonen in 0,5 ul-Anteilen aufgebracht und die Öffnungen für die Probe mit dem vorher hergestellten Mylar-Streifen bedeckt. Das erste Ende der Bahn wurde dann in ein Lösungsmittel getaucht, umfassend TBS und 1 % Gelatine, und die Flüssigkeitsfront konnte zum oberen Ende der Bahn während eines Zeitraums von etwa 10 Minuten aufsteigen. Die Deckfolie wurde entfernt, wobei das chromatographische Material freigelegt wurde. Die dritten Zonen der Streifen wurden dann 15 Minuten in eine Peroxidaseindikatorlösung getaucht, umfassend 10 ml TBS, 4 ul 30 %ige Wasserstoffperoxidlösung und 0,8 ml einer Lösung, enthaltend 4-Chlornaphthol in Methanol in einer Konzentration von 3 mg/ml. Positive Sera und das Vorhandensein des enzymmarkierten Antikörpers führten zum Auftreten eines blau-schwarzen Punktes in der dritten Zone.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde eine geätzte Einzelwegvorrichtung hergestellt zum Nachweis von AlDS-Patientenantikörpern zu HIV (human immunodeficiency virus). Das allgemeine Verfahren des Beispiels 1 wurde angewandt mit der Ausnahme, daß Nitrocellulose manuell mit Hilfe von Kautschukzement nach dem Verfahren des Beispiels 1 auf 8 inch x 11 inch Mylar-Bahnen aufgeklebt wurde. Es wurden parallele Linien in die Nitrocellulose in Intervallen von 3 mm eingeätzt durch gesteuerte Behandlung mit einem CO&sub2;- Laser, ohne daß die Unterlage verbrannte (durchgeführt durch Laser Age, Inc. Waukegan, Il.). In diesem Beispiel wurden alle Bahnen verwendet, da kein Flüssigkeitsstrom zwischen den Kanälen stattfand.
Geeignetes HIV-Antigen (siehe Gallo, US-PS 4 520 113) wurde mit 30 % Gew/Vol Bioperlen (Biorad, Richmond, Ca.) 30 Minuten behandelt, um Detergens von dem Präparat zu entfernen. Das Antigen wurde dann auf die Nitrocellulose entsprechend dem Verfahren des Beispiels 1 aufgebracht. Mit Peroxidase markiertes Ziegenantihuman-IgG entsprechend Beispiel 1 wurde dann auf die erste Zone aufgebracht und das restliche Verfahren des Beispiels 1 angewandt. Tests mit positiven und negativen HIV-Serumproben ergaben positive Farbreaktionen für die positiven Proben und keine Reaktion für die negativen Proben.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird eine Einzelweg-Immunoassayvorrichtung zum Nachweis von spezifischen Antigenen beschrieben. Diese Vorrichtung ist im Prinzip ähnlich der Antikörpernachweisvorrichtung nach Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß Antikörper, die spezifisch mit dem nachzuweisenden Antigen reagieren, gegen einen Lösungsmitteltransport in der dritten Zone der Vorrichtung immobilisiert werden, wo sie selektiv antigenhaltige Substanzen von Interesse in der Analytprobe binden. Die so immobilisierten Antigensubstanzen können dann nachgewiesen werden durch Behandlung mit markierten Antikörpern, die spezifisch mit dem gleichen oder anderen antigenen Epitopen des interessierenden Antigens reagieren.
Mikroporöses, festes Substratmaterial, vorzugsweise Nitrocellulose mit einer Dicke von etwa 0,1 min, wird auf eine Mylar-Folie, vorzugsweise mit der gleichen Dicke aufgegossen. Ein Gitter wird dann auf die Nitrocellulose aufgedruckt mit einem Injekt-Drucker, umfassend eine Anzahl von Bahnen mit etwa 3 min Breite und 20 bis 100 mm lang, und vorzugsweise etwa 75 mm lang. Antikörpermaterial, das spezifisch mit einer oder mehreren der antigenen Determinanten des zu bestimmenden Antigens reagiert, wird dann auf die dritte Zone des Streifens in einer Stellung, die nahe an einem Ende des Streifens und vorzugsweise etwa 10 mm von einem Ende entfernt ist, aufgebracht. Das Antikörpermaterial können polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Kombinationen davon sein und kann IgG, IgM oder eine andere Klasse von Immunoglobulin oder Kombinationen davon sein.
Die Antikörper können auf das poröse Substrat manuell, wie mit Hilfe von Kapillarröhrchen, Pipetten oder flüssigen Treibmitteln, aufgebracht werden. Wenn das Immunoglobulin mit Hilfe eines Sprays aufgebracht wird, kann eine Aufbringvorrichtung oder ein Applikator, der mit Hilfe von Verfahren, wie sie in der Mikroelektronik bekannt sind, miniaturisiert ist, zusammen mit bekannten lithographischen Verfahren angewandt werden.
Die Antikörper können auf die dritte Zone aufgebracht werden, um eine geeignete Geometrie zu erhalten, wie Punkte, Linien oder Flecken. Es ist bevorzugt, daß Antikörperlösungen in Volumina von weniger als 1 ul, wobei Volumen von etwa 0,5 ul besonders bevorzugt sind, zur Erzeugung von Flecken mit 1 bis 2 mm Durchmesser aufgebracht werden. Zonen dieser Größe sind bevorzugt für Vorrichtungen, die auf einer visuellen Untersuchung eines positiven Farbsignals beruhen. Kleinere Volumina von Antikörperlösung können auch angewandt werden, aber derartige Volumina können zu kleineren Zonen führen, die die Bewertung durch spektrophotometrische Mittel erforderlich machen. Wenn vorgesehen ist, daß Vorrichtungen nach der vorliegenden Erfindung durch nicht-visuelle Mittel bewertet werden, wie mit einem Reflektionsspektrophotometer, ist es bevorzugt, daß Volumina von weniger als 0,5 ul aufgebracht werden, um so die Mengen an Antikörpermaterial, das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen erforderlich ist, weiter zu verringern.
Konzentrationen an Antikörpern, die in Lösungen aufgebracht werden, liegen vorzugsweise im Bereich von 100 bis 150 ug IgM/ml Lösung, wenn sie auf Nitrocellulosebahnen nach der Erfindung aufgebracht werden. Insbesondere liegen Antikörperkonzentrationen im Bereich von 120 bis 140 ug IgM/ml Lösung. Höhere Konzentrationen können aufgebracht werden, dienen jedoch möglicherweise nicht zur Zunahme der Bindungswirkung in der dritten Zone. Geringere Konzentrationen können aufgebracht werden mit der Wirkung, daß die Dichte der positiven Bindungssignale verringert wird. Während es in Betracht gezogen wird, daß geringere Antikörperkonzentrationen die Intensität eines positiven Signals so weit verringern, daß sie eine visuelle Bewertung der Testergebnisse verhindern, ist es trotzdem möglich, daß geringere Intensitäten von Bindungssignalen die spektrophotometrische oder andere Techniken für automatisierte Bewertungen der erfindungsgemäßen Vorrichtungen nicht unangemessen behindern.
Nach Zugabe des Antikörpermaterials zu der dritten Zone werden die dritte Zone und der Rest des Streifenmaterials vorzugsweise mit einem Blockierungsmittel, wie 1 %ige LB Gelatinelösung, behandelt. Zu diesem Zeitpunkt wird das erste Reagens, umfassend markiertes Antikörpermaterial, das spezifisch mit einer oder mehreren antigenen Determinanten des Analyten reagiert, auf die erste Zone, die sich zwischen der dritten Zone und dem ersten Ende befindet, aufgebracht. Dieses markierte Antikörpermaterial ist nicht gegen einen chromatographischen Lösungsmitteltransport immobilisiert und es soll chromatographisch beweglich sein, so daß es zu der dritten Zone transportiert werden kann. Das erste Reagens kann mit Hilfe von Kapillarröhrchen, Pipetten oder flüssigen Treibmitteln aufgebracht werden. Das Antikörpermaterial kann mono lonal oder poly lonal sein und kann von unterschiedlichen Untertypen und Epitopen-Spezifitäten sein, solange es spezifisch mit dem von dem Analyten gelieferten Antigen reagiert. Das Antikörpermaterial ist markiert, so daß es visuell, spektrophotometrisch oder mit anderen Mitteln nachgewiesen werden kann. Enzymgebundene Antikörper, die eine nachweisbare Farbreaktion katalysieren, sind besonders bevorzugt.
Nach dem Aufbringen der fixierten Antikörper auf die dritte Zone und der markierten chromatographisch beweglichen Antikörper auf die erste Zone kann die Vorrichtung mit Ausnahme der dritten Zone und gegebenenfalls der zweiten Zone mit einer Deckschicht bedeckt werden, die nach einer Ausführungsform Mylar ist, und zwar 3 bis 5 mm vom Ende des Streifens entfernt. Die Deckschicht verhindert ein Verdampfen des chromatographischen Lösungsmittels und etwaiger flüssiger Reagentien aus der Vorrichtung.
Um die Antigenassayvorrichtung anzuwenden, wird die Probe, die Serum oder eine andere biologische oder nicht biologische Flüssigkeit sein kann, auf die zweite Zone der Vorrichtung aufgebracht. Es ist bevorzugt, daß die Probenlösungen in Volumina von 0,1 ul bis 5 ul aufgebracht werden, wobei Volumina von 1 ul besonders bevorzugt sind. Aufgrund des Unterschiedes in den Antigenkonzentrationen und Aktivitäten können diese Volumina variieren, obwohl es im Rahmen des fachmännischen Könnens liegt, geeignete Volumina zu bestimmen.
Nach Aufbringen des Probenmaterials wird das Ende der Testvorrichtung in eine chromatographische Lösungsmittellösung getaucht. Eine bevorzugte Lösung umfaßt eine 1 %ige LB-Gelatinelösung, obwohl andere chromatographische Lösungsmittel, wie sie bekannt sind, ebenfalls geeignet sind. Das Lösungsmittel schreitet durch den Streifen fort und transportiert Antikörper aus dem ersten Reagens kurz hinter der Lösungsmittelfront auf die dritte Zone zu. Da die Lösungsmittelfront in der Testvorrichtung nach oben fortschreitet, erreicht sie als nächstes das Probematerial, das mitgerissen und auf die dritte Zone zu transportiert wird. Das Probenmaterial wird leicht vor der Lösungsmittelfront transportiert, während das erste Reagensmaterial leicht hinter der Lösungsmittelfront transportiert wird. Als Folge davon vermischen sich die beiden Materialien nicht. Nur wenn das Analytmaterial von dem zweiten Reagens in der dritten Zone immobilisiert wird, übernimmt das erste Reagens den Analyten und reagiert mit ihm. Andere Substanzen, die in der Probe enthalten sind, werden weiter chromatographisch durch das Lösungsmittel transportiert und werden aus der dritten Zone entfernt. Wenn kein Analytmaterial in der dritten Zone gebunden wird, wird das erste Reagens chromatographisch weiter transportiert und aus der dritten Zone entfernt und führt somit zu keinem Signal in dieser Zone.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde eine Zweiwege-"Diode"-Vorrichtung hergestellt zum Nachweis von HIV. Nach diesem Beispiel wurden Testvorrichtungen in die allgemeine Form der Vorrichtung der Figur 3 mit einem Hochenergielaser geschnitten, der sowohl durch die Nitrocellulose als auch die Mylar-Schicht hindurchschnitt. Ein zweiter Durchgang mit einem Niederenergiestrahl schnitt nur durch die Nitrocelluloseschicht und bildete zwei chromatographische Lösungsmitteltransportwege. Die dritte Zone wurde mit der gleichen HIV-Zubereitung,wie in Beispiel 2 beschrieben, imprägniert und die erste Zone wurde imprägniert mit den gleichen, mit Phosphatase markierten Ziegen-Antihuman-IgG-Antikörpern nach dem Verfahren des Beispiels 2. Die Vorrichtungen dieses Beispiels umfassen auch eine vierte und eine fünfte Zone, die imprägniert sind mit einem dritten und vierten Reagens, umfassend in diesem Falle eine Enzymsubstratverbindung und eine Farbstoffverbindung. Die vierte Zone war imprägniert mit einem dritten Reagens, umfassend 0,5 ul 0,1 M 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in 0,1 M Tris-Base, während die fünfte Zone imprägniert war mit einem vierten Reagens, umfassend 0,5 ul 0,1 M Nitroblautetrazolium (Sigma) in Wasser. Die gesamte Vorrichtung wurde dann mit einer Mylar-Deckschicht mit einer Öffnung für die Probe bei der zweiten (Proben)-Zone bedeckt. Positive und negative HIV-Serumproben wurden dann auf die zweite Zone aufgebracht und die Vorrichtungen wurden in Lösungsmittel, umfassend 1 %ige LB- Gelatine und TBS, eingetaucht. Positive Serumproben ergaben positive Farbreaktionen, während negative Serumproben negative Farbreaktionen ergaben.
Variationen der Vorrichtung nach diesem Beispiel umfassen die "Triode"- und "Tetrode"-Vorrichtungen, wie in den Figuren 4 und 6 gezeigt. Die gleichen Reagentien und Materialien wurden in diese Vorrichtungen eingebaut mit der Ausnahme, daß zusätzliche Kanäle in die Vorrichtungen geätzt wurden. Diese Kanäle können angewandt werden, um den Zeitpunkt des Mischens und den Transport der Reagentien festzulegen und ein vorzeitiges Vermischen der Reagentien und Probenmaterialien zu verhindern.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wurde eine Einzelweg-Polynukleotidhybridisierungsbestimmugnsvorrichtung hergestellt und angewandt. Ein Stück mikroporöses Nitrocellulosematerial von etwa 5 mm Breite und 55 mm Länge mit einer Dicke von etwa 0,1 mm wurde auf einen inerten Mylar-Träger von etwa 0,1 mm Dicke aufgebracht. Der Streifen wurde mit SSPE-Pufferlösung, umfassend 0,9 M NaCl, 560 mM NaH&sub2;PO&sub4; und 5 mM EDTA (pH 7,4) vorher benetzt. Zu einer dritten Zone, etwa 27 mm vom ersten Ende des Streifens, wurden 1,5 ul einer zweiten Reagenslösung, umfassend etwa 15 pM (Picomol) linearisierte, denaturierte DNA, die im allgemeinen komplementär war, zu einem ersten Teil der Basensequenz des zu analysierenden Polynukleotids in SSPE-Puffer, umfassend 0,9 M NaCl, 560 nM NaH&sub2;PO&sub4; und 5 mM EDTA (pH 7,4), aufgebracht. Der Streifen wurde dann an der Luft getrocknet und 2 Stunden auf 80ºC erhitzt.
Das Streifenmaterial, auf das das zweite Reagens aufgebracht worden war, wurde dann in der SSPE-Pufferlösung vorbenetzt und imprägniert mit einer Blockierungslösung, umfassend den SSPE-Puffer und Denhardt's Lösung, enthaltend 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon und 1 mg/ml BSA. Der Streifen wurde 2 Stunden in einen dicht verschlossenen Beutel bei 65ºC gegeben und dann an der Luft getrocknet.
Der Streifen wurde an der ersten Zone 7 mm vom ersten Ende mit 100 pM eines ersten Reagensmaterials, umfassend ein linearisiertes und denaturiertes radioaktiv markiertes Polynukleotid mit einer Basensequenz, die im allgemeinen komplementär ist, zu einem zweiten Teil der Basensequenz des Analytpolynukleotids imprägniert.
Das erste Reagens ist an dem 5'-Ende markiert durch Behandlung mit ³²P Radiomarkierung und T4-Polynukleotidkinase. Das erste Reagensmaterial wird dann an der Luft getrocknet und eine Mylar- Deckplatte mit einem Spalt über der zweiten Zone zwischen der ersten und dritten Zone wird über das chromatographische Nitrocellulosematerial aufgebracht.
Assays werden durchgeführt mit der Polynukleotid-Hybridisierungsassayvorrichtung nach der Erfindung durch Aufbringen des den Analyt enthaltenden Probenmaterials auf die zweite Zone. Eine Decklasche wird dann über die zweite Zone gelegt und die Assayvorrichtung in etwa 175 ul chromatographisches Lösungsmittel, umfassend SSPE-Lösung (enthaltend 0,9 NaCl, 560 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 5 mM EDTA (pH 7,4)), Denhardt's Lösung (enthaltend 0,06 % Ficoll, 0,06 % Polyvinylpyrrolidon und 0,6 mg/ml BSA) und 50 % entionisiertes Formamid, getaucht. Während der Streifen bei 37ºC inkubiert wird, schreitet das Lösungsmittel die Vorrichtung entlang nach oben fort und löst und transportiert chromatographisch das erste Reagens auf die dritte Zone zu. Nach Erreichen der zweiten Zone löst das chromatographische Lösungsmittel die den Analyten enthaltende Probe und transportiert sie auf die dritte Zone zu. Die relative Beweglichkeit des ersten Reagens und der Probenkomponenten ist so, daß der Analyt in der dritten Zone abgeschieden und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert wird, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht. Ferner werden etwaige störende Probenbestandteile und Nicht-Analytkomponenten der Probe, die in der Lage sind, mit dem ersten Reagens zu reagieren, aus der dritten Zone entfernt vor dem chromatographischen Transport des ersten Reagens zu der dritten Zone.
Nach Erreichen der dritten Zone wird etwaiges in der Probe enthaltenes Analytmaterial durch Hybridisierung an einer zweiten Basensequenz mit dem in dieser Zone immobilisierten zweiten Reagens immobilisiert. Etwaiges, nicht hybridisiertes Material wird aus der dritten Zone durch chromatographischen Lösungsmitteltransport entfernt, bevor das erste Reagens diese Zone erreicht. Nach Erreichen der dritten Zone wird das radioaktiv markierte erste Reagens selbst immobilisiert durch Hybridisierung an der ersten Basensequenz des Analyten. Der Streifen und das chromatographische Lösungsmittel werden bei 37ºC inkubiert, bis die Lösungsmittelfront das obere Ende des Streifens erreicht und zu diesem Zeitpunkt wird der Streifen aus dem Lösungsmittel entfernt und an der Luft getrocknet. Der Streifen wird dann der Autoradiographie mit einem Kodak XAR-5-Film unterworfen. Das Vorhandensein von Analyt in dem Probenmaterial wird angezeigt durch Entwickeln des Films, der mit der dritten Zone in Kontakt gestanden hat. Variationen der Vorrichtung dieses Beispiels umfassen "Diode"-, "Triode"- und "Tetrode"-Vorrichtungen unter Anwendung von Enzymmarkierungen und Nachweissystemen.

Claims

1. Teststreifen zum Nachweis bzw. zur Bestimmung einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit Hilfe einer Reihe aufeinanderfolgender Reaktionen, wobei der Teststreifen umfaßt:

ein längliches Stück chromatographisches Material mit Kapillarität und der Fähigkeit für einen schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht-immobilisierten Reagentien und reaktionsfähigen Komponenten der Probe mit Hilfe eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels, wobei der Streifen umfaßt

ein erstes Ende, an dem der Transport des chromatographischen Lösungsmittels beginnt,

ein zweites Ende, an dem der Transport des chromatographischen Lösungsmittels endet,

eine Mehrzahl von Zonen, die sich zwischen dem ersten und dem zweiten Ende befinden, wobei diese Zonen umfassen:

eine erste Zone, die mit einem ersten Reagens imprägniert ist, das in dem Lösungsmittel beweglich ist und im Stande ist, mit der zu bestimmenden Substanz zu reagieren und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert zu werden, wenn die zu bestimmende Substanz in einer dritten Zone immobilisiert wird,

eine zweite Zone zur Aufnahme der Probe,

eine dritte Zone stromabwärts der ersten Zone, die mit einem zweiten Reagens imprägniert ist, das gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert ist, und in der Lage ist, selektiv mit der zu bestimmenden Substanz zu reagieren, um die zu bestimmende Substanz in immobilisierter Form in der dritten Zone festzuhalten,

Mittel zum Nachweis des ersten Reagens in der dritten Zone, wobei die erste und zweite Zone ausreichend weit von dem ersten Ende entfernt sind, um einen Kontakt des ersten Endes, aber nicht der ersten und zweiten Zone, mit dem chromatographischen Lösungsmittel zu ermöglichen,

wodurch, nachdem die Probe von der zweiten Zone aufgenommen worden ist und das erste Ende in das chromatographische Lösungsmittel getaucht worden ist, die relative Mobilität der Komponenten der Probe und des ersten Reagens oder die örtliche Lage zueinander zwischen der zweiten und der dritten Zone so ist, daß die zu bestimmende Substanz in der dritten Zone abgeschieden und gegen Lösungsmittel immobilisiert wird, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht, wodurch störende Komponenten der Probe und nicht zu bestimmende Komponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, durch chromatographischen Lösungsmitteltransport aus der dritten Zone entfernt worden sind, vor dem chromatographischen Lösungsmitteltransport des ersten Reagens in die dritte Zone.

2. Teststreifen nach Anspruch 1, wobei das Mittel zum Nachweis des ersten Reagens in der dritten Zone eine Markierungssubstanz auf dem ersten Reagens ist.,

3. Teststreifen nach Anspruch 2, wobei die Markierungssubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus radioaktiven Markierungen, Chromophoren, Fluorophoren und Enzymmarkierungen.

4. Teststreifen nach Anspruch 1, umfassend mehrere Bahnen für den chromatographischen Lösungsmitteltransport.

5. Teststreifen nach Anspruch 4, wobei die Bahnen für den chromatographischen Lösungsmitteltransport der Probe und des ersten Reagens teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen.

6. Teststreifen nach Anspruch 3, wobei die Markierung eine Enzymmarkierung ist und ein drittes Reagens, das mit der Markierungssubstanz reagieren kann, in einer vierten Zone angeordnet ist, und eine solche relative Mobilität in dem chromatographischen Lösungsmittel besitzt, daß das dritte Reagens durch das Lösungsmittel in die dritte Zone transportiert wird, nachdem das erste Reagens in die dritte Zone transportiert worden ist.

7. Teststreifen nach Anspruch 6, wobei das dritte Reagens eine Indikatorsubstanz ist.

8. Teststreifen nach Anspruch 6, wobei die Bahn für den chromatographischen Lösungsmitteltransport des ersten Reagens und des dritten Reagens teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen.

9. Teststreifen nach Anspruch 4, wobei die Transportbahnen durch lösungsmittelundurchlässige Barrieren getrennt sind.

10. Teststreifen nach Anspruch 9, wobei die lösungsmittelundurchlässigen Barrieren durch Laserätzen erzeugt worden sind.

11. Teststreifen nach Anspruch 1, wobei das chromatographische Material ein Material für Dünnschichtchromatographie ist.

12. Teststreifen nach Anspruch 11, wobei das Material für Dünnschichtchromatographie Nitrocellulose ist.

13. Teststreifen nach Anspruch 1, wobei die zu bestimmende Substanz ein Antikörper ist.

14. Teststreifen nach Anspruch 1, wobei die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist.

15. Teststreifen nach Anspruch 1, wobei die zu bestimmende Substanz ein Polynukleotid ist.

16. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit Hilfe einer Reihe aufeinanderfolgender Reaktionen, wobei bei dem Verfahren angewandt wird:

ein Streifen, umfassend ein längliches Stück aus einem chromatographischen Material mit Kapillarität und der Fähigkeit für einen schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht-immobilisierten Reagentien und reaktionsfähigen Komponenten der Probe mit Hilfe eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels, wobei der Streifen umfaßt:

ein zweites Ende, an der der Transport des chromatographischen Lösungsmittels endet,

eine Mehrzahl von Zonen, die sich zwischen dem ersten und dem zweiten Ende befinden, wobei diese Zonen umfassen: eine erste Zone, die mit einem ersten Reagens imprägniert ist, das in dem Lösungsmittel beweglich ist und im Stande ist, mit der zu bestimmenden Substanz zu reagieren und gegen einen Lösungsmitteltransport immobilisiert zu werden, wenn die zu bestimmende Substanz in einer dritten Zone immobilisiert wird-

eine zweite Zone zur Aufnahme der Probe,

Mittel zum Nachweis des ersten Reagens in der dritten Zone, wobei die erste und die zweite Zone ausreichend weit von dem ersten Ende entfernt sind, um einen Kontakt des ersten Endes, aber nicht der ersten und zweiten Zone, mit dem chromatographischen Lösungsmittel zu ermöglichen,

wobei das Verfahren umfaßt:

(1) Aufbringen der Probe auf die zweite Zone,

(2) Eintauchen des ersten Endes in das chromatographische Lösungsmittel während eines Zeitraums, der ausreicht, um die zu bestimmende Substanz und das erste Reagens chromatographisch zu der dritten Zone zu transportieren, wobei die relative Mobilität der zu bestimmenden Substanz und des ersten Reagens oder die örtliche Beziehung zwischen der zweiten und dritten Zone so sind, daß die zu bestimmende Substanz in der dritten Zone abgeschieden wird, bevor das erste Reagens die dritte Zone erreicht, wodurch störende Substanzen der Probe und nicht zu bestimmende Komponenten der Probe, die mit dem ersten Reagens reagieren können, aus der dritten Zone durch das chromatographische Lösungsmittel entfernt worden sind, bevor das erste Reagens ankommt, und

(3) Nachweis des Vorhandenseins des ersten Reagens oder des Reaktionsprodukts in der dritten Zone.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Mittel zum Nachweis des ersten Reagens in der dritten Zone eine Markierungssubstanz auf dem ersten Reagens ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Mittel zum Nachweis des ersten Reagens in der dritten Zone ein drittes Reagens ist, das mit dem ersten Reagens reagieren kann.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das dritte Reagens eine Indikatorsubstanz ist.

20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das dritte Reagens in einer vierten Zone angeordnet ist und chromatographisch zu der dritten Zone transportiert wird, nachdem das erste Reagens zu der dritten Zone transportiert worden ist.

21. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Teststreifen mehrere Bahnen für das chromatographische Lösungsmittel umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das erste Reagens und das dritte Reagens entlang Bahnen transportiert werden, die teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen.

23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Probe und das dritte Reagens entlang von Bahnen transportiert werden, die teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen.

24. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Bahnen für das chromatographische Lösungsmittel teilweise die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen aufgrund von für das Lösungsmittel undurchlässigen Barrieren.

25. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zweite Zone und die dritte Zone die gleiche Stelle auf dem Streifen einnehmen.

26. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das chromatographische Material ein Material zur Dünnschichtchromatographie ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Material zur Dünnschichtchromatographie Nitrocellulose ist.

28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Nitrocellulose gekennzeichnet ist durch eine mittlere Porengröße im Bereich von 0,1 um bis 1 um.

29. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zu bestimmende Substanz ein Antikörper ist.

30. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist.

31. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zu bestimmende Substanz ein Polynukleotid ist.