JPH0238971A

JPH0238971A - 酸素免疫測定法用試薬及びこれを用いる酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPH0238971A
Application number: JP19080488A
Authority: JP
Inventors: Kenjiro Mori; 健二郎森; Tetsuo Watanabe; 哲男渡辺; Yasuo Kihara; 木原　康夫; Hiroshi Yoshikawa; 吉川　浩志; Takashi Tsuji; 孝辻
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1988-07-29
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1990-02-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産呈上鬼肌尻分互本発明は、酵素免疫測定法用試薬及びこれを用いる酵素
免疫測定法に関し、詳しくは、酵素免疫測定法を簡単迅
速且つ高精度で行ない得るようにした酵素免疫測定法用
試薬及びこれを用いる酵素免疫測定法に関する。

堡米ｑ伎五血清、尿等の体液に含まれる種々の成分や薬物の検出及
び測定は、臨床上、極めて重要であって、従来、種々の
方法によって行なわれている。かかる方法として、代表
的には、体液中の被検！ｆである抗原又は抗体と、これ
らに対して特異的結合性を有する抗体又は抗原を利用す
る色環学的測定法が知られており、なかでも、抗原抗体
間の反応の有無やその程度を知るために、酵素標識した
抗体や抗原等、酵素標識免疫体を用いる酵素免疫測定法
がその高感度性及び測定の安定性から広く用いられてい
る。

この酵素免疫測定法には、例えば、石川栄治ら著「酵素
免疫測定法」　（医学書院■１９８７年発行）に記載さ
れているように、種々の方法が知られている。−数的に
は、ポリスチレンビーズ、試験管内壁面、プレート、膜
等、水不溶性固相担体の表面に、例えば被検物質と抗体
抗原反応を行なわせるための抗体を固定し、先ず、これ
に測定すべき被検物質としての抗原を含む被検液を加え
て、抗原抗体反応によって上記抗原を上記抗体を介して
、上記固相担体上に結合させる。次いで、未反応の抗原
を緩衝液等にて洗浄除去し、上記抗原に対応して、酵素
標識した抗体を反応させて、これを前記抗原に結合させ
た後、未反応の酵素標識抗体を洗浄除去し、この後、固
相担体上に結合された標識酵素の量から測定すべき前記
被検物質としての抗原の量を求める。上、記標識酵素量
は、例えば、酵素に対応する基質や、或いは基質と発色
剤とを反応させ、反応生成物の生成に基づく液相の色変
化を肉眼にて測定して抗原を検出し、或いは光学的に測
定する。

日が　ンしようとする量しかし、近年の医療体制の進展によって、多数の血清、
尿等の体液中の微量成分を迅速且つ高感度に測定するこ
とが強く要望されるに至っており、上述したような従来
の酵素免疫測定法は、操作が煩雑であって、操作性や迅
速性に欠ける。

本発明は、従来の酵素免疫測定法における上記した問題
を解決するためになされたものであって、節単迅速且つ
高感度にて酵素免疫測定法を実施することを可能にする
酵素免疫測定法用試薬及びかかる試薬を用いる酵素免疫
測定法を提供することを目的とする。

量　を　゛　るための本発明による酵素免疫測定法用試薬は、連続した吸水性
基材上に、被検物質である免疫体と結合し得る免疫体を
固定化した固定相と、上記被検物質と結合し得る酵素標
識免疫体を水溶化によって前記基材から脱離し得るよう
に含有させた標識相とを、間隔をおいて設けてなること
を特徴とする。

また、本発明による酵素免疫測定法は、連続した吸水性
基材上に、被検物質である免疫体と結合し得る免疫体を
固定化した固定相と、上記被検物質と結合し得る酵素標
識免疫体を水溶化によって前記基材から脱離し得るよう
に含有させた標識相とを、間隔をおいて設けてなる試薬
の前記標識相の一端から被検物質を含有する被検液を吸
収させ、標識相の酵素標識免疫体を溶解させ、被検物質
と結合させて、酵素標識免疫複合体を形成させ、次いで
、この標識酵素免疫複合体を前記固定相にて免疫体に結
合させることを特徴とする特に、本発明においては、上記酵素標識相は、酵素標識
免疫体を含有する水溶性重合体からなることが好ましい
。

本発明において、吸水性基材は、被検物質を含有する被
検液、例えば、血清、血液、尿等や、或いはこれらの緩
衝液による希釈液を吸収することが必要である。吸水性
基材が吸水性に劣るときは、後述するような本発明によ
る試薬を用いる測定において、被検液が酵素標識相及び
固定相に到達するのに長時間を要し、従って、迅速な測
定を行なうことができない。しかし、吸水性基材の吸水
性が余りに高すぎるときは、被検液中の被検物質が酵素
標識免疫体や固定相の抗体又は抗原と十分な反応を行な
うための時間に不足するので、正確な測定を行なうこと
が困難となる。従って、本発明においては、被検液中の
被検物質が酵素標識免疫体や固定相の抗体又は抗原と十
分な反応を行なうための時間を確保し得るような吸水性
基材を用いることが必要であるが、かかる基材の選択は
、酵素免疫測定法に通暁しておれば、容易になし得る範
囲であ、る。しかし、特に、好ましい具体例としては、
例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維布、多孔質材料等を
挙げることができる。

また、これら基材の吸水性を調整するために、基材に親
水性重合体を被覆し、或いは含浸させることもできる。

更に、本発明においては、吸水性基材は、何ら同一材料
からなるものを用いる必要はなく、異種の材料からなる
ものを接合して、連続した基材とすることもできる。

本発明において、吸水性基材は、その形状において何ら
限定されるものではないが、例えば、矩形のシート状や
ロッド状等が好ましい。

本発明において、酵素標識免疫体が被検液に接触したと
き、容易に水溶化し、基材から脱離し得るように、酵素
標識免疫体を吸水性基材に含有させるには、例えば、酵
素１識免疫体の溶液を吸水性基材に塗布した後、適当な
条件にて乾燥させる。

乾燥の一態様として、凍結乾燥させることもできる。

更に、別の方法として、水溶性重合体の溶液中に酵素ｗ
４識免疫体を溶解させ、この溶液を吸水性基材に塗布し
た後、乾燥させる方法を挙げることができる。この方法
は、本発明による試薬を調製するのに有利な方法である
。即ぢ、重合体濃度を調整することによって、適当な粘
度の溶液を得ることができるので、吸水性基材の所定の
領域に酵素標識免疫体を含有させるのが容易であるのみ
ならず、乾燥に際して、酵素標識免疫体の凝集や変成が
生じ難く、更に、乾燥後に酵素標識免疫体が吸水性基材
から脱離し難いからである。

上記水溶性重合体としては、例えば、ポリビニルピロリ
ドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール
、セルロースエーテル、例えば、メチルセルロース、エ
チルセルロース、ベンジルセルロース、トリチルセルロ
ース、シアンエチルセルロース、カルボキシルメチルセ
ルロース、カルボキシルエチルセルロース、オキシエチ
ルセルロース、ゼラチン等が好ましく用いられる。これ
らの水溶性重合体は単独で又は２種以上の混合物として
用いられるが、混合物として用いる場合は、混合物が速
やかに被検液に溶解し得るように、平均分子量２５００
０以下の重合体を含むことが好ましい。

更に、本発明においては、重合体の水溶化を容易にする
ために、重合体の分子量を選択する以外に、グリセリン
、ペンタノール等の（多価）アルコール類、ノニオン性
界面活性剤等の水溶性低分子量化合物を重合体と共に併
用することもできる。

次に、本発明において、抗体又は抗原を吸水性基材上に
固定化する方法も、特に限定されるものではないが、従
来より知られている通常の吸着法や共有結合法によるの
が好適であり、特に、抗体や抗原の基材からの脱離がな
い共有結合法によるのが好ましい。吸水性基材が上記共
有結合法のための官能基を有しないときは、例えば、適
宜の官能基を有する重合体を基材にその吸水性を阻害し
ない程度に付着させる。

本発明による診断薬においては、上記したような連続し
た吸水性基材上に酵素標識相と固定相とが間隔をおいて
設けられる。酵素標識相と固定相との間に間隔がないと
きは、被検液中の被検物質が酵素標識相にて酵素標識免
疫体と十分に結合することなく、即ち、被検物質が遊離
のまま、固定相に移動し、その結果として、特に被検液
が多量の被検物質を含有する場合に、測定を開始して初
期の段階において、酵素標識免疫体と結合しないままの
被検物質が固定相上に到達して、固定相に固定されるの
で、測定が不正確となる。

本発明による上述したような試薬を用いて、酵素免疫測
定法を行なうには、先ず、試薬の酵素１識免疫の一端か
ら被検液を吸収させる。被検液は、吸水性基材を移動し
て、先ず、吸水性基材における酵素標識相に到達し、酵
素標識免疫体を溶解させ、ここで、被検物質はこの酵素
標識免疫体と結合する。このようにして、被検物質と酵
素標識免疫体との結合反応を十分に行なわせて、被検物
質と酵素標識免疫体との酵素標識免疫複合体を形成させ
る。次いで、被検液の吸水性基材中の移動と共に、上記
酵素標識免疫複合体は固定相に到達し、ここで、固定相
に固定化された免疫体と更に結合し、新たに酵素標識免
疫複合体を形成して、固定相上に結合され、かくして、
被検液中の被検物質は、試薬の固定上に酵素標識免疫複
合体として固定される。酵素８Ｉ！！相の未反応の酵素
標識免疫体は、試薬の他端側から解放される被検液と共
に試薬から脱離する。

この後、固定相に酵素標識免疫体に対する基質、又は基
質と発色剤との溶液を加え、固定相上に結合された被検
物質量に対応して、発色を生じさせ、これを肉眼にて観
察し、又は光学的に測定する。

尚、固定相に酵素標識免疫体に対する基質、又は基質と
発色剤との溶液を加える代わりに、これらを前記したよ
うな水溶性重合体に含有させてフィルムとし、これを固
定相上に密着させてｉｉ！置してもよい。

尚、酵素標識免疫体に比べて、被検物質が大過剰である
ときは、発色が弱く、測定が困難である。

かかるプロゾーン現象の発生を防止するために、酵素標
識免疫体量や固定相の免疫体量を予め適宜に調整するこ
とが望ましいことは明らかであろう。

プロゾーンの可能性があるときは、被検液を緩衝液で希
釈した後、測定に供することが望ましい。

逆に、酵素標識免疫体に比べて、被検物質が非常に少な
いときは、被検物質の抗原沢定基のすべてに標識抗体（
ポリクロナール抗体）が結合し、被検物質が固定相の抗
体に供給し得ないことも予想される。従って、このよう
な場合には、標識抗体にもモノクロナール抗体を用いる
ことによって、被検物質の量が非常に少ないときでも、
正確に検出することができる。

また、本発明によれば、固定相に異種の抗体又は抗原を
固定すると共に、これに対応して、酵素標識相に複数の
酵素標識免疫体を含有させることによって、複数種類の
被検物質を同時に測定することもできる。

主肌皇四果以上のように、本発明の酵素免疫測定法によれば、連続
した吸水性基材上に、被検物質である免疫体と結合し得
る免疫体を固定化した固定相と、上記被検物質と結合し
得る酵素標識免疫体を水溶化によって前記基材から脱離
し得るように含有させた標識相とを、間隔をおいて設け
てなる試薬を用い、その標識相の一端から被検物質を含
有する被検液を吸収させ、標識相の酵素ｔｌ識免疫体を
溶解させ、被検物質と結合させて、酵素標識免疫複合体
を形成させ、次いで、この標識酵素免疫複合体を前記固
定相にて免疫体に結合させるので、従来の酵素免疫測定
法におけるように、緩衝液等による洗浄や、或いは酵素
標識免疫体の添加を必要とせず、従って、簡単迅速で且
つ高感度の酵素免疫測定法を可能とする。

大施舅以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１クロマトグラフィー用濾紙（東洋濾紙■製５Ｉ４ＡＳ　
ＩＯＸｌｏｏｍ＞を過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（０，
３ａ＋ｏｌ／ｊり　３０ｍｌに浸漬し、室温で２時間反
応させた後、濾紙を取出し、蒸留水で洗浄し、室温で一
夜乾燥させた。

この濾紙の一端から２０〜３０ｍの箇所に抗ｈＣＧ抗体
（ダコ（Ｄａｋｏ）社製、ウサギ夏ｇＧ）を感作したポ
リスチレンラテックス（粒子径０．３μｍ、感作量３０
■／ｇ、１％）５０μｌを直径１００の円形状に塗布し
た後、室温で１日間放置した。

次いで、この濾紙を水素化ホウ素ナトリウム溶液（１％
）３０ｍｌに浸漬し、未反応のアルデヒド基を還元した
後、濾紙を取出し、蒸留水で洗浄した。これをウシ血清
アルブミン溶液（１％）３０躍１中に１時間浸漬した後
蒸留水で洗浄し、室温で２日間乾燥させて、固定相を調
製した。

次に、ポリビニルピロリドン（分子１２５０００）水溶
液（５％）ｌｏｃａｌにアルカリホスファターゼ標識抗
ｈＣＧ抗体（タンパク賞濃度１．８■／ｍｌ）　２．５
ｍｌを加えて調製した酵素標識抗体含有重合体溶液２０
０μｌを前記濾紙の固定相から４０〜５０鶴の領域に１
０１０Ｘ１０の正方形状に塗布して、室温で２日間乾燥
させて、酵素標識相を調製した。

このように処理した濾紙をポリエチレンテレフタレート
フィルム（１０Ｘ８０ｔｍ）上にＪｉ！置し、抗ｈＣＧ
抗体固定相及びアルカリホスファターゼ標識抗ｈＣＧ抗
体相を有する濾紙からなるｈＣＧ診断薬を得た。

（ｈｃｃの測定）前記濾紙からなるｈＣＧ診断剤を、アルカリホスファタ
ーゼ標識抗ｈＣＧ抗体相側が上方に位置するように、４
５°の角度にて傾けて配置し、この上方の一端を被検液
としてのｈＣＧ溶液（５０ｍ　Ｔ　Ｕ／ｍｌ、　ｈ　Ｃ
Ｇを男性健常人尿に溶解させたもの）ｌＯａ＋１に浸漬
した。別に、同様の診断薬の一端を男性健常人尿１０ｍ
１中に浸漬した。

浸漬を開始して１０分後、濾紙の下方の一端から排出さ
れた液が約３１１１になった時点で、それぞれの抗ｈＣ
Ｇ抗体固定相にアルカリホスファターゼの基質である５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート溶
液（５ｍｓ＋ｏｌ／１）　２００μｌを加え、２０秒後
の発色を観察した。

その結果、被検液がｈＣＧを含む尿の場合、鮮明な青色
発色が固定相に認められたが、ｈＣＧを含まない尿の場
合、肉眼では発色は認められず、かくして、本発明によ
る試薬によれば、陽陰性を明瞭に知ることができた。

実施例２（リウマチ診断薬の調製）ガラスフィルター（東洋濾紙■製ＧＡ−１００，１０１
０Ｘ１４をポリエチレンイミン水溶液（０゜０１％）２
０１中に室温にて３０分間浸漬し、室温で乾燥させた後
、これをグルタルアルデヒド溶液（０，１％）２０＋１
中に室温にて２時間浸漬し、蒸留水で洗浄、室温で一夜
乾燥させた。

このフィルターにウサギＩｇＧ　（Ｓｉｇａｏａ社製）
を感作したポリスチレンラテックス（粒子径０．３μｍ
、感作量３０弯／ｇ、１％）１００．ｃｌを直径１０ｍ
の円形状に塗布して、室温で１日間放置した。

次いで、このフィルターを水素化ホウ素ナトリウム溶液
（１％）２０ｍｌに浸漬して、未反応のアルデヒド基を
還元した後、フィルターを取出し、蒸留水で洗浄した後
、ウシ血清アルブミン溶液（１％）２０μβ中に１時間
浸漬し、蒸留水で洗浄し、室温で２日間乾燥させた。

次に、ポリビニルピロリドン（分子量２５０００）４．
８ｇ及びメトローズ６０ＳＨ−５０（信越化学工業■製
）０．８ｇを蒸留水１００ｍ１に溶解させて、重合体溶
液を調製し、これにパーオキシダーゼ標識ウサギＴｇＧ
　（２，５＊／ｍｌ）　５．０　ｍｌを加えて、酵素標
識ウサギＩｇＧ含有重合体溶液を調製した。この溶液２
００μｐをレーヨン不織布（ハイボンＦＴ−６０，１０
Ｘ７０鶴）の一端から２０〜３０ｍの箇所に１０×１０
ｆｌの正方形状に塗布して、室温で２日間乾燥させた。

次に、前記ウサギＩｇＧ固定化フィルターの一端に固定
相と標識１ｇＧ相の間隔が約４０ｍｍとなるように酵素
標識ウサギＩｇＧ含有不織布を連結し、また、フィルタ
ーの他端にレーヨン不織布（１０×２５ｆｌ）を連結し
た。

これをポリエチレンテレフタレートフィルム（１０Ｘ８
０ｍｎ）上に載置し、ウサギＴｇＧ固定相及びパーオキ
シダーゼ標識ウサギＩｇＧ含有相を有するガラスフィル
ター及びレーヨン不織布からなるリウマチ診断薬を得た
。

（リウマチの測定）前記ガラスフィルター及びレーヨン不織布からなるリウ
マチ診断薬をパーオキシダーゼ標識ウサギＩｇＧ相側が
上方に位置するように、４５°の角度にて傾けて配置し
、この上方の一端を関節リウマチ因子陽性血清リン酸緩
衝液希釈液中に浸漬した。別に、同様の診断薬の一端を
関節リウマチ因子陰性血清リン酸緩衝液希釈液中に浸漬
した。

浸漬を開始して１０分後、不織布の下方の一端から排出
された液が約２１になった時点にてそれぞれのウサギＩ
ｇＧ固定相にパーオキシダーゼの基質溶液、０−フェニ
レンジアミン５ｍＭと過酸化水素ｏ、ｏｏｓ％からなる
リン酸緩衝液）２００μｌを加え、２０秒後の発色を観
察した。

その結果、陽性血清の場合は、鮮明な赤色発色が固定相
に認められたが、陰性血清の場合は、発色は認められず
、陽陰性を明瞭に区別することができた。

比較例１実施例２と同様にして、ガラスフィルター（１ＯＸｌＯ
ｔｍ）にウサギＩｇＧを固定化した。濾紙（１５Ｘ１５
ｍ）を８枚重ね合わせた上に、ナイロンメツシュ（１５
Ｘ１５ｍ）を重ね、更にその上に上記ウサギＩｇＧ固定
化フィルターを重ね合わせ、リウマチ診断薬を得た。

上記リウマチ診断薬に関節リウマチ因子陽性血清１００
μｌを加え、２分間放置した後、リン酸緩衝液を加えて
、洗浄した０次いで、パーオキシダーゼｇ１識つサギＩ
ｇＧ溶液（０，１２ｍｇ／１ｍＩ）　２００μｌを加え
、５分間放置した後、再度、リン酸緩衝液を加え、未反
応の標識ＩｇＧを洗浄除去した。

次に、パーオキシダーゼの基質溶液（Ｏ−フェニレンジ
アミン５ｍＭと過酸化水素０．００５％からなるリン酸
緩衝液）２００μｌを加え、２０秒後の発色を観察した
。

上記のように、数段階の試薬添加工程を経て測定を行な
ったが、発色の程度は実施例２の場合と殆ど同じであっ
た。

比較例２比較例１と同様にして調製したリウマチ診断薬に関節リ
ウマチ因子陽性血清又は陰性血清それぞれ１００μｌを
加え、２分間放置した後、洗浄せずに、パーオキシダー
ゼ標識ウサギｒｇｃ　ｃｏ、　１２■／ｍ１）２００ｐ
ｌを加え、５分間放置した後、洗浄せずに、比較例１と
同様にして、２０秒後の発色を観察した。

陽性血清の場合は、比較例１以上の強い発色を示し、ま
た、陰性血清でも、肉眼で明瞭な発色が認められ、正確
な診断を行なうことができなかった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）連続した吸水性基材上に、被検物質である免疫体
と結合し得る免疫体を固定化した固定相と、上記被検物
質と結合し得る酵素標識免疫体を水溶化によつて前記基
材から脱離し得るように含有させた標識相とを、間隔を
おいて設けてなることを特徴とする酵素免疫測定法用試
薬。
（２）標識相が酵素標識免疫体を含有する水溶性重合体
からなることを特徴とする請求項第１項記載の酵素免疫
測定法用試薬。
（３）連続した吸水性基材上に、被検物質である免疫体
と結合し得る免疫体を固定化した固定相と、上記被検物
質と結合し得る酵素標識免疫体を水溶化によつて前記基
材から脱離し得るように含有させた標識相とを、間隔を
おいて設けてなる試薬の前記標識相の一端から被検物質
を含有する被検液を吸収させ、標識相の酵素標識免疫体
を溶解させ、被検物質と結合させて、酵素標識免疫複合
体を形成させ、次いで、この標識酵素免疫複合体を前記
固定相にて免疫体に結合させることを特徴とする酵素免
疫測定法。
（４）標識相が酵素標識免疫体を含有する水溶性重合体
からなることを特徴とする請求項第３項記載の酵素免疫
測定法。