JPS63501595A - 結合アッセイ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 症亘選 □ 本発明は、吸収材及び展開液を含んでなる酵素標識結合アッセイ用装置であって 、その吸収材は指示薬帯域を含む複数の試薬帯域を有するとともに展開液を毛管 作用により順次各試薬帯域を通過させて輸送することができ、かつその指示薬帯 域にはアッセイの結果に応じた量で酵素標識試薬を直接あるいは間接的に固定す ることのできる試薬が含有されている、酵素標識結合アッセイ用装置に関する。

且景肢歪 免疫検定などの結合アッセイは、生体液中に含有される物質の検出用として臨床 検査に広く用いられている。しかしながら、複雑な分析技術や装置を用いなくと も、例えば、医師が自分の診療室で、あるいは患者が自分の家で行うことのでき るアッセイの開発に増々関心が集まっている。このようなアッセイは、単に便利 であると言うだけでなく、時間や費用の節約にもなる。現在、ことさら便利でか つ筒便なアッセイ及び試薬の製剤がめられている用途として、妊娠の検知と月経 周期の受精期間（ｆｅｒｔｉｌｅ　ｐｅｒｉｏｄ）の検知が挙げられる。

複数の試薬帯域を有する材料のストリップを用い、展開液によりソルベントフロ ントを形成し、そのソルベントフロントが毛管作用によりストリップに沿って進 むことによって、試薬帯域に位置するアッセイ試薬と試料との間に反応を起こし 、かつその反応を促進させることにより、結合アッセイを行うことが知られてい る（例えば、英国特許明細書ＧＢ　−Ｂ　−１５８９２３４号参照）。このよう なストリップの特徴は、アッセイプロトコール及び試料組成により決まるある条 件下で標識試薬が固定され、アッセイ結果の表示を与える試験位置が存在するこ とである。初期の頃のアッセイにおいては、放射性同位元素で標識した結合相手 又は測定すべきアナライト（分析対象物）の類似体を標識試薬として用いていた 。しかしながら、このようなアッセイでは、放射性標識の量を検出するための手 段が必要であることと、健康上の危険が伴うという問題がある。この問題を解決 するために、適当な基質により特徴的なシグナル〔例えば、比色定量的（ｃｏｌ ｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）シグナル〕を生ずる酵素標識が用いられてきた。

このようないわゆる［ディツプスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）　ｊ酵素標識結 合アッセイを行う際にそうぐうする重大な問題は、検出可能なシグナルを発生さ せるための酵素に対する適当な基質を使用しなければならない点にある。このシ グナルは、アッセイを終了まで進めた後に試薬ストリップ上の適当な位置に基質 を添加することによって発生させることができる。

又、ストリップの適当な部分を取り出して化学的に分析してもよい。これらすべ ては、家庭においてこのアッセイを行うことが不可能でないにしても少なくとも 不便な工程である。

発浬坏１叉 本発明者らは本発明に従って、吸収材及び展開液を含んでなる酵素標識結合アッ セイを実施するための装置であって、その吸収材は指示薬帯域を含む複数の試薬 帯域を有するとともに、展開液を毛管作用により順次各試薬帯域を通過させて輸 送することができ、及びその指示薬帯域にはアッセイ測定の結果に応じた量で酵 素標識試薬を直接あるいは間接的に固定することのできる試薬が含有されており 、その際、展開液が酵素に対するシグナル形生基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を含 んでいることを特徴とする酵素標識結合アッセイ用装置を提供するものである。

本発明は、その最も広い概念において、操作工程を最小限にし、家庭内での結合 アッセイ法の利用が容易にする。展開液のソルベントフロントは試薬を吸収しそ れらの反応を許容しながら吸収材を通って進むので、基質が酵素標識試薬と接触 した際に色が形成されるなどのシグナルが生ずる。これにより、アッセイの間に 、試験ストリップを上昇する展開液のソルベントフロントにシグナルのバンドが 生ずる。ソルベントフロントが、酵素標識試薬が固定される試薬帯域を通過する ときに、結合酵素標識が固定され、未結合酵素標識がソルベントフロントととも に前進するため、シグナルの分離が起こる。

この場合の結合酵素標識物と未結合酵素標識物から生ずるシグナルの分離は、あ る結合条件のものでは明確にはできないことから、多くの用途についてはこれで 充分であるものの、この程度の分離ではまだ不十分である場合がある。比色定量 的アッセイにおいては、このために色彩、シグナルの汚れが生じたり、測定結果 が不明になったりする。

このようなことから、好ましくは、本発明の装置の特に好都合な態様においては 、展開溶液が酵素に対するシグナル形生基質を含有し、この基質が、使用中に、 酵素標識試薬あるいはアッセイ中に生成した酵素標識試薬の化合物のいずれより も遅く展開液によって運ばれることが好ましい。

上記の本発明の好ましい態様では、酵素基質の輸送速度は、酵素標識試薬の輸送 速度よりも遅いので、上記の問題を克服できる。使用中には、アッセイに伴う反 応は、展開液が吸収材を通過する際に、移動するソルベントフロントにおいて起 る。基質は酵素標識試薬やアッセイ反応中に生成した化合物よりも遅く輸送され るので、これらの物質は、吸収材中において基質よりも前方のまま輸送される。

酵素標識試薬を他種類の試薬により直接あるいは間接的に固定することによりア ッセイ結果が得られる。このようにして固定された酵素標識試薬は、基質よりも 前方のままの状態を維持せず、従って、それに続いて基質がこの固定された酵素 標識試薬のすべてと接触してシグナルを発生する。一方、固定されていない酵素 標識試薬は、基質よりも前方のままの状態を維持するので色の汚れは生じない。

固定される酵素標識試薬が存在しない場合には、測定のいかなる段階でも、たと えソルベントフロントが固定化帯域を通過する時に一時的でさえ、吸収材の固定 化帯域にシグナルは発生しない、このことは、特に装置を家底周に用いることを 意図している場合、明瞭な結果を得る上で非常に重要である。本発明によれば、 デイフブステイ・２クアツセイの感度及び明瞭性の上で著しい向上が得られる。

シグナル発生基質は、単色生成化合物でもよいし、あるいは別の一種または複数 種の化合物とのコファクターとして作用して酵素の存在下で着色シグナルを発生 する化合物でもよい。この別の一種又は複数種の化合物は、展開液に含有させて もよく、この場合、酵素標識試薬あるいはアッセイ中に生成した酵素標識試薬の 化合物と共に、あるいはこれらよりも遅い速度で展開液により輸送される。例え ば、この基質の一例として、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素により酸化 され着色シグナルを生ずるテトラメチルベンジジンが挙げられる。

このアッセイは、指示薬帯域において固定された酵素標識の量でアッセイの結果 が示される酵素標識結合アッセイのどのようなタイプにも適用できる。指示薬帯 域で生じたシグナルは、比色定量的であることが好ましい。本発明の装置は、試 料中のアナライトが酵素標識試薬に結合するかあるいはアナライト類似物との競 合において酵素標試試薬に結合する、拮抗及び非拮抗結合アッセイを実施するの に適している。そのアッセイが免疫検定であることが好ましい。

このアッセイは、例えば、英国特許明細書ＧＢ　−Ｂ　−２０２９０１１号及び ＧＢ　−Ｂ　−２１１６３１３号に記載されている種類の二重（ｄｕａｌ）アナ ライト検定のような二重競合アッセイまたは二点（輛０ｓｉｔｅ）イムノメトリ ックアッセイに適用できる。この場合のアナライトは特定の結合相手を有するも のであればどのようなものでもよい。

細長いストリップの形をしていてもよい吸収材は、毛管作用により、展開液を輸 送できるいずれの材料でもよい。必要とする毛管特性を示し及び非特異的結合の 程度が小さいいずれの材料も使用することができるが、好ましい材料としては、 ガラス繊維紙などの吸水性紙が挙げられる。

酵素標識物と基質との示差泳動（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｍｉｇｒａｔｉｏ ｎ）は、酵素標識、基質及び緩衝液の特定の組み合わせを条件として、吸収剤に ついて適当な材料を選択することにより達成することができる。紙の示差輸送特 性を変えるために化合物を紙に添加することができる。特に、紙と酵素標識物と の間の相互作用に比例して紙と基質との間の吸引（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）相互 作用を増加させるために１種または複数種の化合物を添加することができる。例 えば、基質がテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で紙が硼珪酸塩ガラス繊維紙で ある場合には、製造中にアクリル結合剤をガラス繊維に配合すると、ＴＭＢの泳 動速度が著しく減少する。逆に、β−シクロデキストリンなどのある種の化合物 は、この相互作用を干渉し、そのような結合剤の吸引効果を減少させる。本発明 者等の実験により、水性展開緩衝液、例えば、０．２％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ ）　２０を含有する０、　１　Ｍ酢酸塩（ｐＨ６，０）を用いた時、ペルオキシ ダーゼ、Ｈ，Ｏ，及びＴＭＢは、純粋な硼珪酸ガラスからなるガラス繊維のスト リップ上をソルベントフロントとともに泳動する（Ｒｆ　＝１．０）ことがわか った。しかしながら、アクリル結合剤を硼珪酸塩ガラス繊維の製造中に配合する と、Ｈ２Ｏ，とペルオキシダーゼの泳動速度は変わらないが、ＴＭＢの泳動速度 が減少する（Ｒｆ値：１．０未満）。このように、ＴＭＢＯＲｆ値を、ガラス繊 維中に存在するアクリル結合剤の濃度によって所望の値にコントロールすること ができる。アクリル結合剤を含有するガラス繊維上でのＴＭＢの示差泳動は、Ｔ ＭＢとアクリル結合剤との間の相互作用を干渉する化合物、例えば、β−シクロ デキストリンを用いることによってもコントロールできる。例えば、ゲルマン（ Ｇｅｌｍａｎ）　ＡＰ２５特性ガラス繊維厚紙〔米国ミシガン州アンアーバー（ Ａｎｎ　Ａｒｂｏｕｒ）在のゲルマンサイエンス社（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎ ｃｅｓ　Ｉｎｃ、、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｕｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ＋ＵＳＡ）製〕の ストリップを、０．１Ｍ酢酸塩（ｐＨ６，０）　、０．１　ｗｍｊ−’ＴＭＢ　 。

０．００１％ＨｚＯｚ、１％ＤＭＳＯ及び０．２％ツイーン２０を含有する溶液 中に入れると、ＴＭＢがＲｆ値０．４で泳動する。展開液にβ−シクロデキスト リンを０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で添加すると、ＴＭＢのＲｆ値が０．５５に増 加するがＨ２０□については何ら影響がない。又、β−シクロデキストリンの濃 度を０．２５％（ｗ／ｖ）に増加させると、ＴＭＢＯＲｆ値は０．７に増加する が、Ｈ，Ｏ□については何ら影響がない。更に、β−シクロデキストリンはバッ ファーフロント（ｂｕｆｆｅｒ　ｆｒｏｎｔ）　（Ｒｆ　＝　１．０　）ととも に泳動するペルオキシダーゼの泳動には何ら影響を及ぼさない。

これに代えて、酵素標識物と基質との示差泳動は、酵素標識試薬帯域より前に、 使用時に展開溶液によって遭遇されるアッセイ装置上の位置で基質と結合するこ とができる基質結合試薬帯域を設け、使用時に結合試薬帯域が実質的に飽和され るまで基質を前記結合試薬帯域に通さないことによって達成することができる。

吸収材上又は吸収材中の試薬帯域は展開液が該試薬帯域と順次接触するように配 置する。この試薬帯域は特定のアッセイプロトコール用の試薬を含有し、隣接す る試薬帯域との接触の間のあらかじめ定められたインキュベーション時間を可能 とするように吸収材中又は吸収材上に配置する。

試薬帯域の間隔はあらかじめ定められたインキュベーション時間を設定するのに 変化させることのできるパラメーターを提供する。また、展開液の泳動速度はポ リマーなどの化合物を展開液に含有せしめることにより制御または変させること ができる。このようなポリマーの好ましい例としては、泳動速度を減少させるデ キストラン又はポリビニルピロリドンなどが挙げられる。展開液の泳動速度を変 えることのできる化合物（例えばポリマー）を所定の試薬帯域の直後の別の試薬 帯域に提供して、装置の使用中にソルベントフロントにおける試薬の泳動が前記 所定の試薬帯域で一時的に停止したり遅くなったりする間前記側の試薬帯域で化 合物が可溶化されるようにすることができる。従って、所定の試薬帯域で展開液 の泳動を停止することにより、その帯域でのインキュベーションの時間を長くす ることができる。

本発明による装置の好ましい態様においては、吸収材は横断試薬帯域を有する細 長いストリップ状である。

指示薬帯域の少なくとも一部分における吸収材のの横断面積は、装置の残りの部 分における吸収材の横断面積よりも少ないことが好ましい。吸収材がストリップ 状である場合には、前記のことは好都合には指示薬帯域のストリップにネックを 形成することによって達成することができる。このことにより、試薬帯域のスト リップを上昇するすべての試薬を濃縮し、このようにして潜在的なシグナル強度 を増加させ得るという別の利点が生ずる。

展開液は、基質を添加した試料そのものであってもよいが、試料とは別であるこ とが好ましい。好都合には、展開液は、吸収材の一部分に隣接して、適当には吸 収材のストリップの一端に設けられた、破裂可能な１１（ｓａｃ）に入れておく のがよい。または、本発明の装置は、吸収材と上記の展開液の容器を別々にした ものからなるキットの形態であってもよい。この展開液は、アッセイシステムと 適合性のある緩衝液からなることが好ましい。酵素標識免疫検定用として特に好 ましい展開液は適当には、０．２％（ｖ／ｖ）のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０ 及び酵素の基質を含有する０、　１　Ｍ酢酸塩（ｐｌ（６）を含んでなる。

展開液は、更に、展開液の泳動速度を変えることのできる化合物、例えば、ポリ マー、例えばデキストランあるいはポリビニルピロリドンを含有していてもよい 。

酵素は適当な基質の存在下において、測定可能なシグナルを生ずることのできる 酵素であればどのようなものでもよい。

例えば、酵素としてセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ベルオキシター セラ用い、展開液にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）　及び過酸化水素を含有 せしめてもよい。

本発明の装置は、所望により濾過パッド等の濾過部材を設けて細胞材料や細胞片 などの固形物質を除去するようにすることのできる試料受容帯域を含んでいるこ とができる。

吸収材の物理的寸法を過度に大きくしないようにするために、酵素標識試薬（遊 離及び結合状態）は０．７以上のＲｆ値を示すものが好ましい。酵素基質のＲｆ 値は、酵素標識物（遊離及び結合状態）のＲｆ値の５０〜９０％の範囲にあるこ とが好ましい。

本発明の装置には、アッセイの完了を示すために、固定化酵素を含んでなるアッ セイ完了指示薬帯域を設けることができる。吸収材がストリップ状である場合に は、展開溶液が適用される一端から隔ったストリップの他端の付近にアッセイ完 了指示薬帯域を位置させるのが好ましい。

吸収材は、不透明のカバーでおおってもよいが、但し、この場合には、指示薬帯 域には透明の窓を設けることができるものとする。試料帯域へのアクセスは、試 料の適用後に交換することのできる再密封可能なプラグを取りはずして行うこと ができる。試料の装置への適用は、予め決められた容量の試料を放出することの できる、例えばサンプリングループなどのアプリケーターを用いて行うことがで きる。

装置は、個々に包装してもよいが、例えば、家庭用などで、容易に月経の周期が モニターできるように、本発明の複数の装置をいっしょに包装することもできる 。従って、本発明者等は、更に、本発明の複数の装置からなるテストンート（ｔ ｅｓｔｓｈｅｅｔ）を提供するものである。

装置使用に際して、展開液を吸収材に適用する。例えば、吸収材がストリップ状 である場合には、展開液は好都合には、例えば、指の圧力で密封された嚢を破裂 させて内容物を放出させることによってストリップの一端に通用する。展開液は 、試料受容帯域に適用された試料、及び酵素標識試薬をはじめとする他の試薬を 吸収しながら吸収材を通って進む。展開液に含有される酵素の基質あるいはコフ ァクターは、酵素標識試薬よりもゆっくりと吸収材を移動するので、シグナルは 発生しない。アッセイに伴う反応が、前進している展開液のソルベントフロント において起こり、試薬帯域の分離の程度によって決まるインキュベーション期間 の後、アフセイ結果に応じた量の酵素標識試薬が指示薬帯域に固定される。その 後、基質が、固定された酵素標識試薬と接触し、それによって指示薬帯域におい てシグナルを発生させる。

本発明の装置によって示されるアッセイの結果は、定性的であることができ、指 示薬帯域におけるシグナル発生、特に着色シグナル発生の有無によって簡単に読 みとることができる。このタイプの結果は、例えば、試料中の特定のアナライト の闇値をモニターしようとする（特定のホルモンのレベルなど）場合にかなりの 利用価値がある。しかしながら、本発明の装置は、定量的測定結果を得るために も用いることができる。すなわち、指示薬帯域で生ずるシグナルの強度は、試料 中に存在するアナライトの濃度に比例ないしは反比例する。

従って、アッセイ後、装置の指示薬帯域を反射分光光度針あるいは螢光針（発生 するシグナルが螢光性の場合）にそう人し、発生したシグナルの強度を測定する ことにより定量することができる。また、指示薬帯域を展開液の泳動の方向に引 き延ばすことができ、または複数個の独立した指示薬帯域を設けるようにしても よい。従って、指示薬帯域に生じたシグナルの長さ、あるいはシグナルを示す個 々の帯域の数が定量性を有し、試料中に存在するアナライトの濃度に比例あるい は反比例する。

型皿■皿単久脱皿 本発明を、実施例により添付の図面を参照しながら以下に説明する。

第１図は、競合的ハブテンアッセイを行うための装置を示す図であり、 第２図は、非競合的ハブテンアッセイを行うだめの装置を示す図であり、 第３図は、二点サンドインチ、すなわち免疫検定（イムノアッセイ）を行うため の装置を示す図であり、第４図は、二重アナライトアッセイを行うための装置を 示す図であり、 第５図は、二重アナライトアッセイを行うための別の態様の装置を示す図であり 、 第６図は、月経周期をモニターするように配置した複数の本発明の装置からなる テストンートを示す図であり、第７図は、競合的ハブテンアッセイを行うための 装置を示す図であり、 第８図は、非競合的ハブテンアッセイを行うための装置を示す図であり、そして 第９図は、二重アナライトアッセイを行うための装置を示す図である。

本発明の実施態様を、まず第１図〜第６図を参照して概略説明し、次に実施例１ 〜４により、より具体的に説明する。

以下記載する材料及び方法は以下に述べる一般的な実施態様及びとりわけ実施例 １〜４に用いられるものである。

特に断わらない限り、全ての試薬は英国のアール（Ｐｏｏｌｅ）にあるシグマケ ミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）製のものである。

訂　スト嘗・ブ　２ ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）ＡＰ２５特製ガラス繊維厚紙〔米国ミシガン州アンア ーバ在のゲルマンサイエンシズ社（Ｇｅｌｉａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ、） 製〕 貝澗運ＬＣ９０旧１東り 展開液を下記のようにして調製した。

１０００−の無菌ＤＢ！Ｏに下記のものを添加した。

β−シクロデキストリン　２．５ｇ 酢酸ナトリウム　３．２ｇ くえん酸　０．３５７ｇ ３０％Ｈ２Ｏ２５０ｊｒ！ １０■／ａｆ　ＴＭＢのＤＭＳＯ溶液　１〇−ＢＳＡ”　５　ｇ ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　１　ｔｎｌ塩化ナトリウム　５ｇ ＊シグマケミカル社（Ｓｈｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）製患 Ａ３６４７．フラクションＶ 伺」ＵＫ生 ストリップ上への試薬の固定は、当業者によく知られている方法を用いて、スト リップへの物理吸着又は化学的カップリングにより行うことができる〔アール・ アクセン等（１９６７年）、ネイチ＋　−、２１４，１３０２（Ｒ，Ａｘｅｎ　 ｅｔ　ａｌ、　（１９６７）、Ｎａｔｕｒｅ。

２１４工、１３０２）　；ニス・エイブラミース及びティ・チルニック。

（１９６９年）、イムノケミストリー、　６＋５３（Ｓ、Ａｖｒａｏ＋ｅａｓ　 ａｎｄＴｅｒｎｙｎｃｋ＋　（１９６９）＋　Ｉｍ＋＊ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ＋　６　＋５３）　；シイーΦニス瞭ベーテル等、（１９７９年）、ザ・ジャ ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５４．２６７２（Ｇ、Ｓ、Ｂ ｅｔｈｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）。

Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２５４．２６７２）：　ジェイ・エム・ジェイ・フレシエ、（１９８１年）、テ トラヘドロン、■。

６６３（Ｊ、Ｍ、Ｊ、Ｐｒｅｃｈｅｔ、（１９８１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 、　３７，６６３）参照〕。

しかしながら、好ましい方法は、吸収材ストリップ材料の骨格内に捕捉されるの に正確な大きさを有し、従って展開液とともに移動することのできない不溶性粒 子にリガンドを結合させる方法である。適当な種類の粒子としては、西ドイツ、 ヴアイテルシュタフト（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｃｌｔ）にあるロームファルマジイ ー・エム・ビー・エイチ（Ｒｏｈｍ　Ｐｈａｒａ＋ａ　ＧｍｂＨ）製のオイペル ギフト（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）ＣＩＺがあげられる。この材料への抗体のカンプリ ングは下記のようにして行われる。

緩衝液Ａ　：　１０００−のＤＨｔ、０に下記の物質を添加した。

ＮａｔＨＰＯａ　５．９６　ｇ Ｎａ）ＩｚＰＯ４１，２４ｇ ＮａＣ１２９，２２ｇ 上記の緩衝液（Ａ）の５００Ｊ１１に３〜４■の凍結乾燥抗体及び１２５■のオ イペルギフト（Ｅｕｐｅｒｇｉ　ｔ）ＣＩＺを添加した。これらの試薬をかるく 混合した後、室温にて４８時間放置した。

次に、オイベルギソトを次に示す緩衝液（緩衝液Ｂ）２０ｍｆ中に懸濁した。

緩衝液Ｂ　：　１０１００ＯのＤ）１．０に下記の物質を添加した。

ＮａｚＨＰＯａ　５．９６　ｇ ＮａＨｚＰＯｎ　１．２４　ｇ グリシン　３．７５　ｇ このオイペルギントＣＩＺを４℃で１２時間沈降させた。上清を吸引して除去し た後、オイペルギフトを２０ｍＺの緩衝液Ｂ中に再懸濁し、ふたたび沈降させた 。再度、上清を吸引して除去し、得られたオイペルギフト／抗体を１２．５−の 緩衝液Ｂに再懸濁した。

塾−ペルオキシダーゼ　ム ベルオキシダーゼ複合体は、例えば、スルフヒドリルマレイミドカップリング〔 石川、イー、、　（１９８０年）、イムノアッセイ・サブ用。上＋１　１６（Ｉ ｓｈｉｋａｗａ、Ｅ、、（１９８０）、ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＳｕｐｐｌ、上 、　１−１６）　；ダンカン、アール・ジエイ・ニス、等、アナル・バイオケム 、＋１３２　＋　６８　７２（Ｄｕｎｃａｎ、Ｒ，Ｊ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、Ａｎａ ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３２　、６８−７２）　）　、ジスルフィド−チオール 交換〔カールソン、ジェイ、９等（１９７８年）、バイオケム、ジェイ、。

１７３．７２３　７３７（Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、（１９７８） 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１７３　。

？２３−７３７））　、過ヨウ素酸塩酸化〔中相、ビイ−・ケイ１９等１０８４ −１９１）　）又はグルタルアルデヒドカップリング〔エイブラミース、ニス・ 　（１９６９年）、イムノケム、、■、　４３−７４３−７２（Ａｖｒ、　Ｓ、 　（１９６７）　＋　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　＋　６　、４３−７２）　；エ イプラミース、ニス・等、（１９７１年）、イムノケム、１．１１７５ｌｌ７５ −１１７９（Ａｖｒａ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、（１９７１）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍ　、　８　、１１７５−１１７９））を用いて調製することができる。

好ましい方法においては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をエイブ ラミース（Ａｖｒａｍｅａｓ）のグルタルアルデヒド法（上記引用）の変法を用 いて、モノクローナル抗体に結合させた。す、なわち、ｉｏｏ■のＨＲＰを５０ ０Ｉの０．０５　Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解した。この溶液に、 同じ緩衝液中に調製した１１％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒド液５００Ｉを添加 した。ゆるやかにしんとうしながら、室温（２０〜２５℃）において２時間反応 させた。その後、反応混合物を、あらかじめ０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ ９，５）で平衡化させておいたＰＤＩＯカラム（ファーマシア社製）に適用した 。溶離を同じ緩衝液で行い。活性化）ＩＲＰを含有する両分を集めた。０．０５ Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９，５）中抗体（２−３ｎｇ／ｍＺ）を、活性化１（ ＲＰ対抗体の質量比が６＝１となるようにして活性化ＨＲＰに添加した。反応を ４℃で１６〜２１時間行なった後、抗体−ＨＲＰ複合体をゲル濾過、典型的には ＰＳＫＧ３０００ＳＷカラム（日本国東洋曹達工業社製）上でのゲル濾過によっ て精製した。

徂治２ｊ］をＪ促銃り 混合ステロイド抗原（ＭＳＡ）は、エストロン−３−グルクロニド（ＥＩ３Ｇ） 及びプレグナンジオール−３−グルクロニド（ＰＤ３Ｇ）からなる二官能性リガ ンドである。この化合物の合成は英国特許明細書ＧＢ　−Ｂ　−２１１６３１８ 号に記載されている。

凰±液旦 無菌ＤＨｚ０１０００ｒｒｌｌに下記の物質を加えた。

酢酸ナトリウム　８．２ｇ くえん酸　０．３５７ｇ ツイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ　２０）　２−第１図は、競合的ハブテンアッセイ プロトコールを用いて、尿試料中のプレグナンジオール−３−グルクロニド（Ｐ Ｄ３Ｇ）の濃度を測定するための装置である。第１図における装置は、吸水性紙 よりなるストリップ１、および基質緩衝液からなる展開液３０入っている溜め２ から構成されている。ストリップは、試料受容帯域４、第１試薬帯域５、及び第 ２指示薬帯域６を有している。第１試薬帯域５には、セイヨウワサビペルオキシ ダーゼ酵素標識に共有結合している酵素標識ＰＤ３Ｇハブテンが含まれており、 この酵素標識ＰＤ３Ｇは、装置使用時に、展開液がストリップを通過することに よってストリップ中を泳動することができるようにストリップ中に含浸されてい る。

指示薬帯域６はストリップに共有結合したＰＤ３Ｇに対する抗体を含んでいる。

溜め２は、コファクターであるテトラメチルベンジジン及び過酸化水素を含む基 質緩衝液を含んでいる破裂可能な嚢（ｓａｃ）より構成されている。装置使用の 際、尿の試料を試料受容帯域４に適用し、嚢２を指の圧力で破裂させることによ って基質緩衝液３をストリップの一端上に放出する。展開液３は、毛管作用によ り、試料受容帯域４からは試料を、そして第１試薬帯域５からは酵素標識ＰＤ３ Ｇをそれぞれソルベントフロントにおいて吸収しながらストリップを通って進む 。酵素コファクターであるテトラメチルベンジジンは酵素標識ＰＤ３Ｇよりも遅 い速度でストリップを通って運ばれる。

従って、基質緩衝液３のソルベントフロントが第１試薬帯域５に到達したときに は、ソルベントフロントにはコファクターはほとんどまたは全く存在せず、従っ て、色の生成は実質的に起こらない。試料中に存在しているＰ０３Ｇはいずれも 、第２指示薬帯域６において限られた数の結合部位に対して酵素標識ＰＤ３Ｇと 競合する。従って、指示薬帯域６においてストリップに結合した酵素標識ＰＤ３ Ｇの量は、試料中に含まれるＰＤ３Ｇの濃度に逆比例する。ストリップの展開を 続けることにより、指示薬帯域６を通って未反応試薬のいずれをも洗浄し、次に 、コファクターはこの指示薬帯域と接触状態となり、そこで基質は結合酵素標識 ＰＤ３Ｇにより変換されて着色生成物を与える（セイヨウワサビペルオキシダー ゼは過酸化水素によるテトラメチルベンジジンの酸化を触媒する）。着色生成物 は、その先には泳動せず、従って、指示薬帯域６にシャープな色のバンドが生ず る。第１図に示した距離ＢとＡとの差は、試料と酵素標識ＰＤ３Ｇとは指薬帯域 ６に達するまでは相互に作用しないので比較的小さくすることができ、その結果 ストリップの長さを短かくすることができる。しかしながら、距離Ｂについては 、指示薬帯域６にコファクターが到達する前に、展開液３の泳動を継続すること により結合酵素標識ＰＤ３Ｇが十分に洗浄されるように十分な長さでなければな らない。指示薬帯域６で生ずる競合反応の持続時間は、試料と酵素標識ＰＤ３Ｇ が指示薬帯域６を通過するのに要する時間に等しい。これは、ストリップを作製 する材料の物性によって決まる。

第２図は、非競合的ハブテンアッセイプロトコールを利用して尿試料に含まれて いるＰＤ３Ｇの濃度を測定するための別の装置である。第２図に示される装置は 、吸水性紙のストリップ１１、および基質緩衝液からなる展開液１３を含有する 溜め１２から構成されている。ストリップは、試料受容帯域１４、第１試薬帯域 １５、及び第２指示薬帯域１６を有している。第１試薬帯域１５には、セイヨウ ワサビペルオキシダーゼ酵素標識に共有結合しているＰＤ３Ｇに対する抗体から なる酵素標識抗−ＰＤ３Ｇが含まれており、この酵素標識抗−Ｐ０３Ｇは、装置 使用時において、基質緩衝液１３がストリップを通過することによってストリッ プ中を泳動するようにストリップ中に含浸されている。指示薬帯域１６は、スト リップに共有結合したＰＤ３Ｇを含んでいる。溜め１２は、図１について前述し たものと同じである。

装置使用に際して、尿の試料を試料受容帯域１４に適用し、基質緩衝液１３を、 指の圧力で嚢１２を破ることによってストリップの末端に放出す。基質緩衝液１ ３は、毛管作用により、試料を吸収しながらストリップを通過する。試料中に存 在するいかなるＰＤ３Ｇも、過剰に存在する酵素標識抗−ＰＤ３Ｇにより第１試 薬帯域１５において結合する。この相互作用を起こすためのインキュベーション 時間は、第２図に示す距離ＢとＡとの差によってコントロールされる。ソルベン トフロントが指示薬帯域１６に接触すると、ストリップに共有結合したＰＤ３Ｇ がすべての未反応酵素標識ＰＤ３Ｇ抗体と結合する。上述したように、コファク ターは、酵素標識抗体よりもゆっくりとストリップを進むので、色の発生は、酵 素標識抗体が固定された指示薬帯域１６でのみ起こる。

第３図は、二点サンドイッチアッセイ、すなわちイムノメトリックアッセイプロ トコールを用いて試料中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ）］）の濃度を測定するた めの装置を示している。

第３図に示す装置は、吸水性紙のストリップ２１及び基質緩衝液からなる展開液 ２３を含有する溜め２２から構成されている。ストリップは、試料受容帯域２４ 、第１試薬帯域２５及び第２指示薬帯域２６を有している。第１試薬帯域２５に は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素標識に共有結合したＴＳＨに対する抗 体を含んでいる酵素標識抗−ＴＳＨが含まれており、この酵素標識抗−ＴＳＨは 、装置使用時に、基質緩衝液２３がストリップを通過することによってストリッ プ中を泳動するようにストリップ２１中に含浸されている。指示薬帯域２６は、 ストリップ２１に共有結合したＴＳＨに対する第２抗体を含んでいる。この第２ 抗体は、酵素標識抗体の特異性とは異なり、別のかつ非競合的であるＴＳＨのエ ピトープに対する特異性を有している。装置使用時に、試料中に存在するＴＳ） Ｉはいずれも、過剰に存在する酵素標識抗体により、それらがストリップ中を共 に泳動するときに、結合される。この第１の反応の反応時間は、第３図示す距離 ＢとＡとの差によって決まる。指示薬帯域を通過する際、ＴＳＨ（抗体複合体の 形態）は第２抗体により結合される。この第２インキユベーシヨンの時間は、ソ ルベントフロントがストリップの材料中を毛管泳動する速度によって決まる。上 述したように、色の性成は、酵素標識抗体が指示薬帯域において固定され、それ によってソルベントフロントの毛管作用によりコファクターを該抗体と接触させ 得るところでのみ起こる。

第４図は、尿試料中のＰ０３Ｇとエストロン−３−グルクロニド（ＥＩ３Ｇ）と の濃度比を測定するための装置である。これらの２つの生成物の濃度比は、女性 の月経周期の内、受精期の目安となることが判明している（例えば、英国特許明 細書ＧＢ−Ｂ−２０２９０１１及びＧＢ−Ｂ−２１１６３１，８参照）。

第４図を参照するに、装置は、吸収性紙のストリップ３１と、基質緩衝液からな る展開液３３の入った溜め３２がら構成されている。このストリップは、試料受 容帯域３４、第１試薬帯域３５、第２試薬帯域３６、第３試薬帯域３７及び第４ 試薬帯域３８を有する。第１試薬帯域３５は、ブリッジ構造に共有結合したＥＩ ３Ｇハブテン及びＰＤ３Ｇハプテンからなる混合ステロイド抗原（ＭＳＡ）を含 んでいる。ＭＳＡは、使用に際し、前進している基質緩衝液３３のソルベントフ ロントにおいてストリップ中を泳動し得るように、ストリップ３１中に含浸され ている。第２試薬帯域３６は、スト・リップに共有結合されていることが好まし いが前進しているソルベントフロントにおいてストリップ中を泳動するように遊 離状態であってもよいＥＩ３Ｇに対する抗体から構成されている。第３試薬帯域 ３７は、基質緩衝液３３とともにストリップ中を泳動できるように、ストリップ ３１中に含浸された酵素標識抗−ＥＩ３Ｇ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵 素標識に共有結合したＥＩ３Ｇに対する抗体）から構成されている。第４試薬帯 域３８は、ストリップに共有結合したＰＤ３Ｇに対する抗体から構成されている 。溜め３２は、基質緩衝液を含んでいる破裂可能な嚢から構成されている。

使用に際しては、尿試料を試料帯域３４に適用し、展開液３３を含んだ溜３２を 破り、ストリップの一端に基質緩衝液を出す。基質緩衝液３３は、毛管作用によ り、試料受容帯域３４から試料を、第１試薬帯域３５から混合ステロイド抗原を 吸収しながらストリップ３１を上昇する。試料とＭＳＡは、共にストリップに沿 って泳動し、第２試薬帯域３６に到達する。第２試薬帯域３６には、ＥＩ３Ｇに 対する抗体が共有結合により固定されている。試料中に存在するＭＳＡとＥＩ３ Ｇとは、第２試薬帯域３６を通過する際、限定された結合部位に関して競合する 。試料中に存在するＥＩ３Ｇの濃度が低い場合には、ＭＳＡの実質的部分が第２ 試薬帯域３６に結合し、更にその先に泳動することが不可能となる。しかしなが ら、試料中のＦＪ３Ｇの濃度が高い場合には、ＭＳＡは、試料とともに次の試薬 帯域、すなわち、ＥＩ３Ｇに対する酵素標識抗体からなる第３試薬帯域３７まで 自由に泳動することができる。この後者の試薬は過剰に存在しており、ストリッ プ３１に非共有的に吸収されている。酵素標識抗体と？ＩＳＡの両者が共に、ス トリップに沿って、ＰＤ３Ｇに対する抗体がストリップに共有結合している第４ 指示薬帯域３８まで泳動する際には、前記酵素標識抗体はＭＳＡに結合している 。第４指示薬帯域３８においては、試料中に存在するＰＤ３Ｇは、共有的に固定 された抗−ＰＤ３Ｇ抗体の限られた数の結合部位への結合に対して、ＭＳＡ／抗 −ＥＩ３Ｇ複合体と競合する。酵素標識免疫複合体は、試料中のＰ０３Ｇの濃度 が低い場合にのみ、指示薬帯域３８で結合される。過剰の試薬は、ストリップの 展開を継続させることによって測定位置から洗浄する。指示薬帯域３８に到達す ると、コファクターが酵素標識抗体結合？ｌＳＡにより明瞭で陽性のシグナルを 与える着色生成物に転換される。この測定は、予め決められたＥＩ３Ｇの上昇レ ベルが予め決められたＰＤ３Ｇの低レベルと一致した場合のみ、陽性の応答を呈 するように調整することができる。共有結合により結合したセイヨウワサビペル オキシダーゼからなる追加の試薬帯域（図示せず）を、溜め３２から遠く離れた 位置に設けることができる。この試薬帯域により、基質がストリップの全長を泳 動したこと、即ち、測定が完了したことが示される。

第５図は、尿試料中のＰ０３ＧとＥＩ３Ｇとの濃度標識を測定するための別の装 置である。

第５図に示されている装置は、吸収性紙からなるストリップ４１及び展開液の入 っている溜め４２から構成されている。

このストリップは、試料受容帯域４３、第１試薬帯域４４、第２試薬帯域４５、 第３試薬帯域４６、第４試薬帯域４７、第５試薬帯域４８、第６試験指示薬帯域 ４９及び、必要に応じて、第７対照指示薬帯域５０を有している。第１試薬帯域 ４４は、抗−ＥＩ３Ｇ　（ＥＩ３Ｇに対する抗体）から構成されている。

第２試薬帯域４５は、実施例４に記載の混合ステロイド抗原（ＭＳＡ）から構成 されている。第３試薬帯域４６はビオチン標識抗−Ｐ０３Ｇデキストラン被覆木 炭から構成されている。第５試薬帯域、（ビオチンに共有結合したＰＤ３Ｇに対 する抗体）。

第４試薬帯域４７は含んでいる、４８は、酵素標識抗−Ｅ１３Ｇ（＋！、イヨウ ワサビペルオキシダーゼに共有結合したＥＴ３Ｇに対する抗体）から構成されて いる。第６試薬帯域４９は、固定化されたストレブタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖ ｉｄｉｎ）から構成されている。必要に応じて設けられる第７試薬帯域５０は、 セイヨウワサビペルオキシダーゼから構成されている。

これらの試薬帯域の活性成分は、横方向のバンドとして、ストリップ上で乾燥さ れる。第６試験指示薬帯域４９のストレプタビジンは、ストリップに共有結合さ れており、第４試薬帯域４７のデキストラン被覆木炭は、微粒子木炭の水性懸濁 液を加え、続いて水分を除去することによりストリップ上に付着されている。他 の試薬は全て、可溶性であり、それぞれ溶液の形態で適用し、続いて乾燥するこ とによってストリップ中に含浸されている。この可溶性試薬は、使用時に、展開 液のソルベントフロントとともに泳動する。溜め４２は、展開液を含んでいる破 裂可能な嚢から構成されている。

使用に際しては、尿の試料は、試料受容帯域４３に適用され、展開溶液の溜め４ ２を破り、展開液をストリップの一端に放出する。この展開液は、毛管作用によ り、試薬受容帯域４３から試薬、そして順次、抗−Ｅ１３Ｇ　、　ｒＩＳＡ及び ビオチン標識抗−ＰＤ３Ｇを吸収しながらストリップを上昇する。このアッセイ における可溶成分は、前進するソルベントフロント中でストリップを通過し、同 時に、混合され反応する。試薬帯域の分離の程度は、最適の反応インキュベーシ ョン時間を可能とするように調整することができる。ＭＳＡやステロイドなどの 結合していない低分子量物質は、第４試薬帯域４７の木炭によりソルベントフロ ントから除去される。ソルベントフロントは、酵素標識抗−Ｅ１３Ｇを吸収しな がら第５試薬帯域４８を通過する。このようにして、アッセイプロトコールを完 了する。酵素標識抗−Ｅ１３Ｇ／ＭＳＡ／ビチオン標識ＰＤ３Ｇの複合体の存在 は、高レベルの２１３Ｇ及び低レベルのＰ０３Ｇを示している。

この複合体は、ビオチンと固定されているストレブタビジンとの相互作用により 第６試験指示薬帯域４９に固定される。

展開液は、前述の通り、ペルオキシダーゼに対する発色基質を含んでいる。この 基質が装置の酵素標識物と実質的に同じＲｆ値を有する場合には、第５試薬帯域 ４８に到達するやいなやソルベントフロントにおいて発色し、そのソルベントフ ロントは、ストリップの残部を通過する間着色状態を保っている。展開液から離 れている方のストリップ末端部に色が現われたことより、測定の完了が示される 。ソルベントフロントが、第６試験指示薬帯域４９に到達しそこを通過する際、 着色生成物及び結合していない酵素標識抗−ＥＴ３Ｇはすべて、入いってくる新 鮮な展開液によりこの帯域より洗浄除去される。しかしながら、酵素標識抗−Ｅ Ｔ３Ｇを含む複合体が固定されたときは、発色は、第６試験指示薬帯域において 起こる。

第６試薬帯域における色は、テスト結果が陽性であることを示している。一方、 基質が、泳動速度の最も遅い酵素標識物のＲｆ値より小さいＲｆ値を存する場合 には、発色は、酵素標識物の固定されている箇所、すなわち、第６試験指示薬帯 域においてのみ、陽性の結果が得られた場合に生ずる。この後者の態様において 、好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼからなる第７対照指示薬帯域５ ０を、アッセイの完了に相当する、ストリップの予め決められた部分に基質が到 達したことを示すために設けることもできる。

第６図は、第４〜５図に関し上述した複数のテストストリップを具体化させる月 経周期モニター用テストンートである。

第６図に示したテストンートは、本発明による複数のテストストリップ、例えば 、５２を支持する剛性のプラスチック裏板又はスタンド５１から構成されている （本図において、吸収材ストリップの詳細は示さない）。図示した態様において は、１５ケのテストストリップが、横方向に平行に配列されて設けられている。

裏板又はスタンド５１の上には、試料受容帯域５３の部分を除き、テストストリ ップを覆うため、プラスチックフィルムがかぶせられている。プラスチックフィ ルム（第６図においては簡明のため透明体として画かれている）は、試験指示薬 帯域５４及び対照指示薬帯域５５の部分を除き、不透明である。プラスチック裏 板ムには、適当にマスクまたはプリントを付し、試料受容帯域、試験指示薬帯５ ６に含まれている。

使用に際しては、使い捨てのサンプルループを用いて中間流の尿を採取し、その アリコートをテストストリップ５２の試料受容帯域５３上に点着（ｂｌｏｔ）さ せる。展開溶液の入った破裂可能な嚢５６の封を指の圧力で破りテストを開始す る。

１５〜２０分後に、対照指示薬帯域５５を観察し、もし着色していれば、測定結 果を試験指示薬帯域５４から読みとる。

試験帯域における色の存在は、陽性の結果、すなわち、その女性が受精期（ｆｅ ｒｔｉｌｅ　ｐｅｒｉｏｄ）にあるかまたはその近くにあることを示している。

逆のことが、着色のない場合に言える。つまり、妊娠を回避したい女性の場合は 、月経周期の約６日目または７日目から始め、日に１度は尿検査を行うべきこと を意図している。その女性は、陽性の結果の持続期間が（２日以上）観察された 後陰性の結果が（２日以上）続くのが観察されるまでは、毎日の検査を続行しな ければならない。

このことは、通常、月経周期において合計１０〜１５回の検査が必要であること を意味している。陽性の結果が観察されたときは常にその女性は性交をひかえる べきであり、連続して２日間陰性の結果が観察されるまでは性交の回避を続ける べきである。

ストリップ中に現われた色は、安定であり、その女性の月経周期活動の半永久的 な記録となるよう意図されている。

ス１１建上 第１図に関して一般的に説明したものと同様の競合的ハブテンアッセイを行うた めの装置を作製した。

第７図に示す装置は、ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）ガラス繊維（１５×１Ｇ）のス トリップ６１及び基質緩衝液６３を含有する溜め６２から構成されている。この ストリップは、試料受容帯域６４　（ストリップの下端から１．５ａａ）　、１ ０ｔｄのＭＳＡ　（Ｊａ衝液Ｃ中１０１０００ｎを適用した第１試薬帯域６５　 （ストリップの下端から２．０ＣＩ１１）、ペルオキシダーゼに結合させたＰＤ ３Ｇに対するモノクローナル抗体（緩衝液Ｃ中１　ｇｍ／−’）の１０ｍを適用 した第２試薬帯域６６　（ストリップの下端から２．５　ａｎ　）及びＥＩ３Ｇ に対する固相モノクローナル抗体５ｏｐ１を適用した指示薬帯域６７　（ストリ ップの下端か５．０■）を有している。

装置を使用するに際して、ＰＤ３Ｇについてアッセイすべき試料２０ｍを試料受 容帯域６４に通用し、ストリップを浸漬する。１５分後、ストリップの指示薬下 端を、指示薬帯域６７の最初の０．５■だけが観察されるように２−の基質緩衝 液中に入れる。指示薬帯域６７における青色の存在は、試料中のＰＤ３Ｇの濃度 が１１００００ｎ以下（５０００ｎＭ及び１１００００ｎで色が生成；１５００ ０ｎＭ、　２００００ｎＭ及び２５０００ｎＭでは色の生成なし）であることを 示している。

この装置は次のように作動する。

基質緩衝液がストリップに沿って泳動する際、試料中のＰＤ３Ｇ　、　ＭＳＡ及 び抗−Ｐ０３Ｇペルオキシダーゼ複合体が、泳動速度の遅い（Ｒｆ＝　０．７　 ”）刊り麦徐ん緩衝液基質のすべての成分とともにバッファーフロントにおいて 輸送される。ストリップに沿って泳動する間、Ｐ０３ＧとＭＳＡは、抗−Ｐ０３ Ｇペルオキシダーゼ複合体の結合部位に関して競合する。指示薬帯域６７に到達 すると、固定化された抗−ＥＩ３Ｇ抗体がＭＳＡに結合する。

試料中のＰＤ３Ｇの濃度が低い場合には、ＭＳＡも抗−Ｐ０３Ｇペルオキシダー ゼ複合体によって結合され、ＴＭＢが指示薬帯域６７に到達すると青色が生ずる 。一方、試料中のＰ０３Ｇの濃度が高い場合には、抗−Ｐ０３Ｇペルオキシダー ゼ複合体力旬ＳＡに結合せず、指示薬帯域６７には何ら色彩シグナルが観察され ない。

ス羞側ユ 第２図に関して一般的に説明したものと同様の非競合的ハブテンアッセイを行う ための装置を作製した。

第８図に示す装置は、ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）ガラス繊維（１５×１ＣＩ１１ ）のストリップ７１及び基質緩衝液７３を含有する溜め７２から構成されている 。このストリップは、試薬受容帯域７４（ストリップの下端から１．５ａａ）、 ペルオキシダーゼに下端から２．０　ｃｎ＋）　、ＭＳＡ（緩衝液Ｃ中５．００ ０ｎＭ）　１０　ｐｉを適用した第２試薬帯域７６（ストリップの下端から５． ５　ａｎ　）及びＥＩ３Ｇに対する固相モノクローナル抗体５０μｌを適用した 指示薬帯域７７　（ストリップの下端から６．０ｃｍ）を有している。

装置を使用するに際して、２０ｐ！の試料を試料受容帯域７４に適用し、スｉ・ リップの最初のＱ、　５　Ｃ１１１１のみが浸漬されるようにストリップの下端 を２−の基質緩衝液に入れる。１５分後、指示薬帯域７７を観察する。この帯域 ７７における青色の存在は、試料中のＰ０３Ｇ？ｉ度が１１００００ｎ以下（５ ０００ｎＭ及び１１００００ｎで色が生成；　１５０００ｎＭ、２００００ｎＭ 及び２５０００ｎＭでは色が生成しない）であることを示している。

この装置は次のようにして作動する。

基質緩衝液がストリップに沿って泳動する際、試料中のＰ０３Ｇ及び抗−ＰＤ３ Ｇペルオキシダーゼ複合体が泳動速度の遅い（Ｒｆ＝０．７）Ｔ皿血徐ん緩衝液 基質の全成分とともにバッファーフロントで輸送される。ストリップに沿って泳 動する間、抗−Ｐ０３ＧペルオキシダーゼがＰＤ３Ｇに結合する。第２試薬帯域 ７６に到達すると、過剰のＭＳＡがすべての未反応抗−Ｐ０３Ｇペルオキシダー ゼ複合体に結合し、指示薬帯域７７に輸送され、そこで、固相抗−ＥＩ３Ｇ抗体 が、遊離及び抗−Ｐ０３Ｇペルオキシダーゼ複合体結合ＭＳＡの両方と結合する 。従って、試料中に存在するＰＤ３Ｇの濃度が低い場合には、抗−Ｐ０３Ｇペル オキシダーゼ複合体の大部分が指示薬帯域６７でＭＳＡによって結合される。Ｔ ＭＢが指示薬帯域６７に到達すると、青色が形成される。しかしながら、試料中 のＰＤ３Ｇの濃度が高い場合には、抗−ＰＤ３Ｇペルオキシダーゼ複合体の大部 分がＭＳＡと結合することができず、従って、指示薬帯域６７には何ら色が観察 されない。

次ｌｌ生走 第３図に関して一般的に説明したものと同様の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）用 の二点サンドインチイムノアッセイを行うための装置を作製した。

再度第３図を参照するに、ストリップ２１はゲルマン（Ｇｅｌ−ｍａｎ）ガラス 繊維（１７Ｘ　１．８　ｃｍ）である。第１試薬帯域２５（ストリップの下端か ら５．５ｃｍ）に、ペルオキシダーゼに結合したＴ　Ｓ　ｌ（に対するモノクロ ーナル抗体（緩衝液Ｃ中５ｉｍ／−’）の２０ｍを適用する。指示薬帯域２６　 （ストリップの下端から７．５０）には、ＴＳＨに対する固相モノクローナル抗 体３００Ｉを適用する。装置の使用に際して、５０Ｉの試料を試料受容帯域２４ に適用し、ストリップを、その最下端Ｉｃｍのみが浸漬されるようにして５ｍＺ の基質緩衝液に入れる。１５分後に、指示薬帯域２６を観察する。この帯域に存 在する青色から、試料中に存在するＴＳ）Ｉの濃度は２００ｍＵ／Ｌを越えてい ることがわかる（５０ｍＵ／Ｌ、　１００ｍＵ／Ｌ及び２００ｍＵ／Ｌでは色生 成なし；　２５０ｍＬＩ／Ｌで色生成あり）。

去詣班↓ 第２図を参照して一般的に説明した種類の二点サンドイッチアッセイのもう一つ の実施例において、実施例３で述べたＴＳＨに対するモノクローナル抗体（試薬 帯域２５及び指示薬帯域２６）の代わりに、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンに対す るモノクローナル抗体を用いた。このテストは、尿試料が２００ｍ１Ｕ／ａｆ以 上のｈＣＧを含有している場合に色が形成される妊娠の指標として利用すること ができる（５０ｍｌＵ／　ｒｔｌ　、　１００ｍ１Ｕ／−及び２００ｍ１Ｕ／− では色の生成なし；　２５０ｍ１Ｕ／　−、３０抛１０／ｒｎ１及び５００ｍＩ Ｕ／ｍ／で色の生成あり）。

天北貫工 第４図を参照して一般的に説明したものと同様の二重アナライトアッセイを行う ための装置を作製した。

第９図に示す装置は、ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）ガラス繊維（１５Ｉ１ｃｍ）の ストリフブ８１及び基質緩衝液８３を含有する溜め８２から構成されている。こ のストリップは、試料受容帯域８４　（ストリップの下端から１．５ｃｍ）、ペ ルオキシダーゼに結合したＰ０３Ｇに対するモノクローナル抗体（緩衝液Ｃ中１ ■ｍ１−１　）の１０Ｉを適用した第１試薬帯域８５（ストリップの下端から２ 　ｃｍ）　、’ＭＳＡ（緩衝液Ｃ中２５０ｎＭ）の１０ｍを適用しな第３試薬帯 域８７　（ストリップの下端から３．０ａｎ）及びＥＩ３Ｇに対する同相モノク ローナル抗体５０ｍを適用した指示薬帯域８８　（ストリップの下端から５．０ ｃｍ）を有している。

装置の使用において、尿の試料２０ｍを試料受容帯域８４に適用し、ストリップ の下端０．５　ａｍが浸漬されるようにストリップを基質緩衝液２−中に入れる 。１５分後、指示薬帯域８８を観察する。この帯域８８における青色の存在は、 試料中のＥ）３Ｇｓ度が５０ｎＭを越えておりそして試料中のＰ　Ｄ　ａ　Ｇ　 ｔｉｔ度が１１００００ｎ未満であることがわかる（第一表参照）。

第二表 ＰＤ３Ｇ　（ｎＭ） ＥＩ３Ｇ（ｎＭ）　０　１０００　５００　１００００　２００００＋＝指示薬 帯域に青色の発色有り −＝指示薬帯域に青色の発色無し この装置は、次のように作動する。

基質緩衝液がストリップに沿って泳動するとともに、試料のＥＩ３Ｇ及びＰＤ３ Ｇ、抗−Ｐ０３Ｇペルオキシダーゼ複合体、抗−ＥＩ３Ｇ抗体及び耶＾は、泳動 速度の遅い（Ｒｆ＝　０．７　）　］ハエ緩衝液基質のすべての成分と共にバフ ファーフロントで泳動する。試料中のＥＩ３Ｇ？Ｍ度が低い場合は、ＭＳＡは泳 動の間抗−ＥＩ３Ｇ抗体と結合し、指示薬帯域８８で固相抗−ＥＩ３Ｇ抗体とは 結合しない。一方、ＥＩ３（４度が高い場合には、ＭＳＡは、自由に指示薬帯域 ８８で結合する。試料中のＰ　Ｄ　３　Ｇ　ｔＭ度が低い場合には、ＭＳＡは坑 −ＰＤ３Ｇペルオキシダーゼ複合体と結合し、ＴＭＢが指示薬帯域８８に到達し た時に青色発色が起こる。しかしながら、試料中のＰＤａＧｔｉ度が高い場合に は、抗−Ｐ０３Ｇペルオキシダーゼ複合体と結合して、後者が？ｌＳＡと結合す るのを阻止するので、シグナルの発生は起こらない。

実施例は、本発明を説明する目的でのみ述べられたものであり、細部の変更は本 発明の範囲内であることは明らかであろう。

ＦＩＧ、　Ｉ　ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３　ＦＩＧ、　４ 手続補正書く方式） 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 ＰＣＴ／ＧＢ８６１００６７０ ２、発明の名称 結合アッセイ装置 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ブーツーセレテク ダイアグノースティックス　リミティド４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 国際調査報告 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の［特許出願人の代表者」 の欄 （２）委任状 （３）明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 （１１（２１別紙の通り （３）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の浄 書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の ５第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）　明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　’ｈＨＥ　ＩＮＴＥＲ，ＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲ ＥＰＯＲＴ　０ＮＦｏｒ　ｍｏｒｅ　ｄｅｔａｉｌｓ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｉｓ　 ａｎｎｅｘ　＋

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．吸収材及び展開液を含んでなる酵素標識結合アッセイを実施するための装置 であって、該吸収材は指示薬帯域を含む複数の試薬帯域を有すると共に、展開液 を毛管作用により順次各試薬帯域を通過させて輸送することができ、且つ該指示 薬帯域はアッセイの結果に応じた量で酵素標識試薬を直接あるいは間接的に固定 することのできる試薬を含んでおり、その際、展開液が酵素に対するシグナル形 生基質を含んでいることを特徴とする酵素標識結合アッセイ用装置。
2. ２．前記展開液が酵素に対するシグナル形生基質を含んでおり、該基質が、装置 使用時に、酵素標識試薬あるいはアッセイ中に形成される酵素標識試薬の化合物 のいずれよりも遅い速度で展開液により輸送される、請求の範囲第１項に記載の 装置。
3. ３．前記吸収材が、横方向の試薬帯域を有する細長いストリップの形態である、 請求の範囲第１項または第２項記載の装置。
4. ４．前記展開液及び酵素に対するシグナル形生基質が、吸収材の一部分に隣接す る破裂可能な嚢に入れられている、請求の範囲第２項またはは第３項記載の装置 。
5. ５．前記酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼであり、及び展開液がテトラメ チルベンジジン及び過酸化水素を含んでいる、前記請求範囲のいずれかに記載の 装置。
6. ６．前記請求の範囲のいずれかに記載の装置の複数からなるテストシート。
7. ７．前記請求の範囲のいずれかに記載の装置を使用して行なう酵素標識結合アッ セイ。
8. ８．前記アッセイがイムノアッセイである、請求の範囲第７項に記載の酵素標識 結合アッセイ。
9. ９．前記アッセイが、尿中のプレグナンジオール−３−グルクロニドとエストロ ン−３−グルクロニドとの相対濃度を測定するための二重アナラライトアッセイ である、請求の範囲第８項に記載の酵素標識結合アッセイ。