DE68912342T2

DE68912342T2 - Verfahren zum nachweis des menschlichen papillomavirus (hpv) für diagnosezwecke.

Info

Publication number: DE68912342T2
Application number: DE89911909T
Authority: DE
Inventors: Joakim Dillner; Lena Dillner
Original assignee: Ferring AB
Current assignee: Ferring AB
Priority date: 1988-10-28
Filing date: 1989-10-30
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2009-10-31
Also published as: WO1990004790A1; FI97426B; FI912050A0; JPH04506562A; JP3117695B2; FI97426C; EP0440700A1; EP0440700B1; AU639666B2; SE8803870D0; AU4481589A; US5629146A; DE68912342D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem menschlichen Papillomavirus (HPV) für Diagnosezwecke.
Die Infektion des Gebärmutterhalses mit dem menschlichen Papillamavirus (HPV) ist mit Karzinomen des Gebärmutterhalses verbunden. Es wurden mehr als 50 verschiedene Arten des HPV identifiziert. Es wurde gefunden, daß die MPV-Arten 6, 11, 16, 18, 31, 33 und 51 den Genitaltrakt infizieren. Die Arten 6 und 11 verursachen benigne bzw. gutartige wuchernde Schädigungen im Genitaltrakt, Kondylom acuminatus. Die Arten 16, 18, 31 und 33 werden in vorkarzinomatösen Schädigungen und im größten Teil der Karzinome des Gebärmutterhalses gefunden. Die menschlichen Papillomaviren sind immunologisch mit den Papillamaviren vom Rind verwandt: Antiseren bzw. Immunseren, die mit beiden Virengruppen reagieren können, können leicht hergestellt werden. Papillomaviruscapsid-Antigene wurden in vorkarzinomatösen Schädigungen und im kondylomatösen Gewebe nachgewiesen, indem derartige gruppenspezifische Antiseren verwendet wurden, die gegen Viruscapside hergestellt worden waren. Es wurde berichtet, daß Patienten mit Genitalwarzen, intraepitheliaie Geschwulstbildung am Gebärmutterhals (CIN), und Karzinom des Gebärmutterhalses im Vergleich mit Kontrollgruppen höhere Werte an Serum-IgG-Anti körpern für das gruppenspezifische Capsid-Antigen aufweisen.
Die Aufgabe dieser Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens des oben genannten Typs, um den Nachweis eines Karzinoms, insbesondere eines Gebärmutterhalskarzinoms, oder von Vorstufen davon oder des Risikos der Entwicklung des Karzinoms zu erleichtern.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens des oben genannten Typs, durch das das Vorhandensein eines Karzinoms, oder Vorstufen davon, oder das Risiko der Entwicklung des Karzinoms auf einfache und schnelle Weise bestimmt werden können. indem das Vorhandensein von Antikörpern für den menschlichen Papillomavirus (HPV) in Körperfluiden nachgewiesen wird.
Um diese und weitere Zwecke zu erreichen, die aus der folgenden Beschreibung deutlich werden, erhielt das erfindungsgemäße Verfahren die kennzeichnenden Merkmale der Ansprüche 1, 11, 21 und 31.
EP-A-0 257 754 beschreibt synthetisierte Papillomavirus-Peptide, die für die Herstellung von Htperimmunseren in Tieren vorteilhaft sind, wobei diese Seren gegenüber den Proteinen des Papillomavirus reaktiv sind.
Diese Erfindung wird nachfolgend detaillierter beschrieben, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, welche zeigen:
Fig. 1 eine graphische Darstellung des Nachweises der IgA-Antikörper gegen den Papillomavirus in Sekreten des Gebärmutterhalses;
Fig. 2 eine graphische Darstellung der Wechselwirkung von IgA- Antikörpern für den Papillomavirus in Seren und Sekreten des Gebärmutterhalses;
Fig. 3 eine graphische Darstellung des Vergleiches der IgG-Antikörper für den Papillomavirus im Serum und in Sekreten der Vagina;
Fig. 4 eine graphische Darstellung, die den Vergleich von IgA- und IgG-Antikörpern gegen den Papillomavirus in Sekreten der Vagina darstellt;
Fig. 5 und 6 graphische Darstellungen, die den Nachweis von IgA- und IgG-Antikörpern durch Immun-Blottlng zeigen;
Fig. 7 eine graphische Darstellung der alters- und geschlechtsabhängigen Verteilung der Serum-IgA-Antikörper für PV in der normalen Population;
Fig. 8 eine graphische Darstellung der alters- und geschlechtsabhängigen Verteilung der Serum-IgG-Antikörper für PV in der normalen Population;
Fig. 9 eine graphische Darstellung des Nachweises der IgA-Antikörper gegen PV in einem Serum von Patienten mit CIN oder einem Karzinom des Gebärmutterhalses;
Fig. 10 eine graphische Darstellung des Nachweises der IgG-Antikörper für PV in einem Serum von Patienten mit CIN oder einem Karzinom des Gebärmutterhalses;
Fig. 11 eine graphische Darstellung des Nachweises der IgM-Antikörper für PV in einem Serum von Patienten mit CIN oder einem Karzinom des Gebärmutterhalses;
Fig. 12 eine graphische Darstellung des Unterschiedes zwischen der IgA- und der IgG-Reaktion auf PV im Zusammenhang mit der Erkrankung;
Fig. 13 eine graphische Darstellung der IgA-Reaktivität für das L1-Protein;
Fig. 14 eine graphische Darstellung der IgA-Reaktivität für das L2-Protein;
Fig. 15 eine graphische Darstellung der IgA-Reaktivität für das L1-Protein;
Fig. 16 eine graphische Darstellung der IgG-Reaktivität für das L2-Protein;
Fig. 17 eine graphische Darstellung der IgM-Reaktivität für das L1-Protein;
Fig. 18 eine graphische Darstellung der IgM-Reaktivität für das L2-Protein; und
Fig. 19 eine graphische Darstellung der mit der Erkrankung verbundenen Reaktivität synthetischer Peptide.
Tabelle 1A ist eine graphische Zusammenstellung der Vergleiche zwischen den IgA- und IgG-Antikörpern für PV im Serum und in Sekreten vom Gebärmutterhals.
Tabelle 1 ist eine graphische Darstellung des Nachweises der mit dem Gebärmutterhalskarzinom verbundenen Antikörper.
Tabelle 2 ist eine graphische Erläuterung der für die synthetischen Peptide verwendeten Formel.
Tabelle 3 ist eine graphische Darstellung der Aminosäuresequenzen der synthetischen Peptide.
Um zu erforschen, ob IgA-Antikörper gegen den Papillomavirus vorhanden sind, und ob diese mit dem Verlauf bis zur Malignität in Zusammenhang stehen, wurden zervikovaginale Sekrete von Patientinnen mit Kondylom und CIN geprüft, wobei ein modifiziertes ELISA-Verfahren (enzymverbundene Immunoadsorptionsbestimmung) angewendet wurde.
Vierundzwanzig Frauen im Alter von 20-50 Jahren nahmen an dieser Untersuchung teil. Sie hatten vorher einen abnormen Vaginalabstrich und/oder Kondylome oder nahmen an einem Untersuchungsprogramm teil. Alle Patientinnen wurden einer kolposkopischen Untersuchung unterzogen. Am Tage der Kolposkopie wurde ein regulärer Papaniculaou-Abstrich entnommen, und in einigen Fällen wurden von kolposkopisch nachgewiesenen Schädigungen Gewebsuntersuchungen vorgenommen. Es wurden zytologische und histologische Prüfungen vorgenommen, und diese stimmten mit den ELISA-Ergebnissen am Ende der Untersuchung überein. Die morphologischen Kriterien der HPV-Infektion erfolgten nach Meisels et al (1979). Das Auffinden von koilozytischen Zellen wies auf eine aktive Papillomavirusinfektion hin. Die typische koilozytische Zelle ist eine Zwischenzelle mit einem vergrößerten hyperchromen Kern, der von einer klaren Zytoplasmazone umgeben wird. Mit einem kleinen Abstrichtupfer wurden zervikovaginale Sekrete von innen nach außen vom Gebärmutterhals und der Vagina entnommen. Dieser Tupfer wurde in ein Glasrohr gegeben, das mit 0,5 ml PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gefüllt war, und wurde auf einem Vortex-Mischer gemischt. Die Proben wurden bis zur Verwendung bei -20ºC gelagert. Die genaue Menge des Sekrets wurde bestimmt, indem das Rohr vor und nach der Aufnahme gewogen wurde. Vor der Verwendung wurden sie zentrifugiert, um Abfälle zu entfernen. Die Proben wurden unabhängig vom Tag des Menstruationszyklus entnommen, wobei nur die tatsächlichen Tage der Menstruation ausgenommen waren. Mit Blut gefärbte Proben wurden weggeworfen.
BPV war wie folgt gereinigt worden: Hautwarzen vom Rind, die in einer mit Glycerylphosphat gepufferten Kochsalzlösung (1:1) bei +4ºC aufbewahrt worden waren, wurden in einem Turrax-Ultramischer in 0,1 m Tris-HCl, pH = 7,5, homogenisiert. Es wurde eine 10%-ige Suspension hergestellt, und nach dem Zusatz von Tareosyl und Freon wurde die Suspension 30 min lang in einem Rotor vom Typ Sorvall SS-34 bei 11,950 g zentrifugiert. Die resultierende überstehende Flüssigkeit wurde bei 35.000 U/min 60 min lang in einem Titanrotor MSE 8x40 ml zentrifugiert. Der Preßling wurde in 0,1 m Tris-HCl suspendiert und mit CsCl vermischt. Die Lösung wurde bei 35.000 U/min über Nacht in einem Rotor MSE SW50 bis zum Gleichgewicht zentrifugiert. Die Virusbanden wurden aufgefangen, mit einem TE-Puffer dialysiert (0,01 m Tris-HCl, 0,001 m EDTA) und gefroren bei -70ºC gelagert. Extrakte der Hautwarzen wurden durch 2 Zyklen des Gleichgewichtszentrifugierens in CsCl gereinigt. In den Gradienten waren zwei unterschiedliche Banden ersichtlich. Die leichtere Bande hatte eine Schwebedichte von 1,29 g/ml; sie bestand aus den leeren Viruspartikeln, dies wurde durch Elektronenmikroskopie (EM) bestimmt. Die schwere Bande hatte eine Schwebedichte von 1,34 g/ml und enthielt vollständige Viruspartikel mit der typischen Morphologie des Papovavirus, dies wurde ebenfalls durch EM bestimmt.
Hyperimmunseren gegen gereinigte Papillomaviren vom Rind wurde in Hasen hergestellt, indem etwa 100 ug des gereinigten Virus, der im kompletten Freundschen Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) emuIgiert war, intramuskulär geimpft wurden. In einem Abstand von zwei Wochen wurden zwei anschließende Impfungen vorgenommen, wobei die gleiche Virusmenge, jedoch ohne Adjuvans verwendet wurde. Eine Woche nach der letzten Impfung wurden die Hasen zur Ader gelassen.
Es wurde eine Modifikation der bereits beschriebenen ELISA-Verfahren verwendet. Kurz gesagt bedeutet dies, daß BPV-Virionen in PBS verdünnt, einer Mikrotitrationsplatte mit 96 Vertiefungen zugesetzt und bei einer festgelegten Konzentration von 0,06 ug/Vertiefung über Nacht bei +4ºC gehalten wurden. Nach drei Waschungen mit PBS, die 0,05% Tween (PBS-Tween) enthielt, wurden die Platten 6 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 4% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Gelatine in PBS blockiert bzw. inaktiviert, danach über Nacht bei +4ºC gelassen. Vor der Verwendung wurden die Platten 5 mal mit PBS-Tween gewaschen. Die zervikovaginalen Sekrete wurden 1/40 verdünnt und die Seren wurden 1/100 in 4% BSA, 0,1% Gelatine und 0,05% Tween verdünnt. Um die gebundenen Antikörper festzustellen, wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur der Affinitätsreinigung unterzogene biotinylierte Human-IgA-Antikörper (anti-human IgA) (α-kettenspezifisch) oder biotinylierte Human-IgG-Antikörper (beide von Sigma) mit einer Verdünnung von 1/1000 verwendet. Danach wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Peroxidase konjugiertes bzw. gepaartes Avidin bei einer Verdünnung von 1/400 zugesetzt. Als Substrat wurden 0,4% o-Phenylendiamin (Sigma), 0,012% H&sub2;O&sub2; in 50 mM Phosphat-Citrat-Puffer, pH = 5,0, verwendet. Positive Kontrollen waren Antiseren vom Hasen gegen BPV-Virionen und/oder Antiseren vom Hasen gegen den Papillomavirus vom Elch. Neugeborenen Seren von Menschen und Präimmunseren vom Hasen stellten negative Kontrollen dar.
BPV-Virionen wurden der Gradientengelelektrophorese auf 5-20% Polyacrylamid unterzogen. Etwa 5 ug der Virionen wurden für jede Probenbahn angewendet. Die Übertragung auf Nitrocellulose- Schichten bzw. -Lagen erfolgte so, wie es von Towbin et al beschrieben wird. Diese Lagen wurden in Streifen geschnitten und 15 Minuten lang mit 2% Tween 80 in 50 mM Tris, pH = 10,2, 150 mM NaCl, 5 mM NaN&sub3; inaktiviert. Die Nitrocellulose-Streifen wurden über Nacht mit Patientenseren inkubiert, die 1/100 in Spülpuffer verdünnt waren (50 mM Tris, pH = 10,2, 150 mM NaCl, 5 mM NaN&sub3;, 0,1% Tween 20). Nach dem Inkubieren über Nacht wurden die Blots im gleichen Puffer gewaschen. Antiserum vom Hasen gegen PV wurde als positive Kontrolle verwendet und Präimmunserum vom Hasen als negative Kontrolle. Zum Nachweis der gebundenen Antikörper wurden biotinylierte Human-IgA-Antikörper von der Ziege oder biotinylierte Human-IgG-Antikörper von der Ziege verwendet, die in Spülpuffer 1/1000 verdünnt waren. Diese Blots wurden anschließend mit mit Peroxidase konjugiertem Avidin inkubiert, das in Spülpuffer 1/400 verdünnt war. Für die Antiseren vom Hasen wurden Hasen-IgG-Antikörper der Ziege verwendet, die mit Peroxidase konjugiert waren, und 1/1000 in Spülpuffer verdünnt waren. Alle Blots wurden mit 0,02% Carbazole (Sigma) in 50 mM Natriumacetat, pH = 5,5, entwickelt.
Fig. 1 zeigt den Nachweis der IgA-Antikörper gegen den Papillomavirus. Die Gebärmutterhalssekrete, 1/40 verdünnt, wurden auf ELISA-Platten aufgebracht, die mit gereinigten und zerbrochenen BPV-Virionen beschichtet waren. Die IgA-Antikörper wurden mit einem IgA-spezifischen biotinylierten zweiten Antikörper und einem Avidin-Peroxidase-Konjugat nachgewiesen. Nach der Zugabe des Substrats wurden nach 15 Minuten die Absorptionsmaße bei 490 nm aufgezeichnet. Die Werte des Absorptionsmaßes mit > 0,1 über dem Hintergrund (Human-Neugeborenenserum) wurden als positiv markiert.
IgA-Antikörper für PV wurden bei 17 von 42 Frauen in den Sekreten des Gebärmutterhalses gefunden. In der graphischen Darstellung der Fig. 1 stellt jeder Punkt das mittlere Absorptionsmaß der Probenduplikate von jeder Patientin dar. Von 9 Frauen mit CIN hatten 8 IgA-Antikörper gegen PV in ihren Gebärmutterhalssekreten - Gruppe I (Patientinnen mit einer histologisch bestätigter intraepithelialer Geschwulstbildung (CIN)). Koilocytose im Pap.-Abstrich und kolposkopisch nachgewiesene Kondylome ohne CIN wurden bei 9 Patientinnen gefunden, und 3 davon hatten IgA- Antikörper gegen PV - Gruppe II (Patientinnen mit Koilocytose und/oder Kondylom, jedoch kein histologischer Beweis von CIN). Sechs von 24 Frauen mit normalen Untersuchungsergebnissen hatten IgA-Antikörper gegen PV - Gruppe III (Patientinnen ohne irgendwelche pathologischen Befunde). Die Absorptionsmaße von IgA aus der ELISA wurden auf signifikante Unterschiede zwischen diesen drei Gruppen untersucht. Bei der kontinuierlichen nichtparametrischen bzw. nicht metrischen Brei-Wege-Untersuchung (Kruskal-Wallis-Test) wies die CIN-Gruppe deutlich höhere Werte des Absorptionsmaßes als die normale Kontrollgruppe auf (p < 0,015). Es wurde auch gefunden, daß der Anteil an IgA-positiven Gebärmutterhalssekreten in der CIN-Gruppe deutlich höher war (8 von 9) als bei der normalen Gruppe (6 von 24), (p < 0,005, Chi²-Test). Im Gegensatz dazu gab es keinen Unterschied zwischen der Gruppe mit Kondylom/Koilocytose und der normalen Gruppe (p < 0,05; mittleres Absorptionsmaß = 0,109 gegenüber 0,104).
Bei 15 Patientinnen wurden die Werte für IgG und IgA im Serum (1/1000 verdünnt) und in den Sekreten (1/40 verdünnt) verglichen. Die Werte der IgA-Antikörper im Serum und in den Sekreten standen in einer relativ guten Wechselbeziehung: p < 0,001, wie es in Fig. 2 gezeigt ist. Die Werte der IgG-Antikörper im Serum und in den Sekreten standen in keiner deutlichen Wechselbeziehung: 0,05 < p < 0,1, wie es in Fig. 3 gezeigt ist. Zwischen den Werten für IgA und IgG wurde keine signifikante Wechselbeziehung in den Sekreten (p < 0,1), wie es in Fig. 4 gezeigt ist, oder im Serum gefunden (nicht gezeigt).
Um zu untersuchen, gegen welche Virion-Polypeptide die PV-Antikörper gerichtet waren, wurde das Immun-Blotting der gereinigten BPV-Virionen durchgeführt.
Es wird auf die Fig. 5 und 6 Bezug genommen. Die gereinigten BPV-Virionen wurden der Gelektrophorese auf 5-20% Polyacrylamid unterzogen und auf Nitrocellulose übertragen. Die Streifen wurden mit Hyperimmunserum vom Hasen gegen gereinigte Rinder- Virionen (+), Human-Neugeborenenserum (-) und 10 Patientenseren (1 bis 10) inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mit biotinylierten Human-IgG-Antikörpern von der Ziege (Fig. 5) oder biotinylierten Human-IgA-Antikörpern von der Ziege (Fig. 6) und mit Peroxidase konjugiertem Avidin nachgewiesen. In diesem IgA- Test waren die Streifen mit den Patientenseren Nr. 2-9 gleich negativ wie das Serum Nr. 1 und sind nicht gezeigt. In Fig. 5 und 6 kennzeichnen die Pfeile die nachgewiesenen PV-Hauptproteine, K = Molekulargewicht in Kilodalton und MW = Molekulargewicht der Marker. Die Molekulargewichte der Marker betrugen 200, 116, 92, 66, 44 und 29 Kilodalton (kDa).
Hyperimmunseren vom Hasen, die gegen die gereinigten Rinder-Virionen hergestellt worden waren, wiesen vier Polypeptide nach: Das Hauptprotein 14-kDa, die Proteine 28-kDa und 54-kDa und das Protein 64 K, Fig. 4. Zehn der zehn geprüften Patientinnen hatten Serum-IgG-Antikörper für das Protein 54-kDa. Zwei Patientinnen hatten Serum-IgG-Antikörper für das Protein 64-kDa und 2 Patientinnen hatten Serum-IgG-Antikörper für das Protein 28- kDa. Bei der Prüfung mit dem IgA-spezifischen Konjugat hatte nur eins der zehn Patientenseren nachweisbare IgA-Antikörperwerte beim Immun-Blotting, Fig. 6. Dieses Serum hatte eine außergewöhnlich hohe IgA-BPV-Antikörper-Reaktivität (IgA anti- BPV). Dies wurde durch ELISA bestimmt (vergleiche Fig. 2). Beim Immun-Blotting reagierte es mit den Polypeptiden 14-kDa, 28-kDa und 54-kDa und nur gering mit dem Polypeptid 64-kDa (Fig. 6).
Es hat sich gezeigt, daß im Genitaltrakt örtlich Antikörper für den Papillomavirus vorhanden sind und daß diese leicht nachgewiesen und gemessen werden können. Es wurde eine deutliche Wechselbeziehung zwischen dem Vorhandensein der IgA-Antikörper für PV in den Gebärmutterhalssekreten und der histologischen Diagnose von CIN gefunden. 6 von 24 Frauen mit normalem Pap.- Abstrich und normaler Kolposkopie hatten jedoch auch IgA-Antikörper gegen PV. Es ist nicht bekannt, ob diese Patientinnen mit IgA-Antikörpern, jedoch ohne CIN, histologisch nicht nachweisbare CIN-Schädigungen haben können. Eine frühere Untersuchung legt nahe, daß IgG-Antikörper für das gruppenspezifische Antigen des Papillomavirus in CIN vermehrt sind. Die Werte der Serum-IgG-Antikörper für PV sind jedoch auch bei Patienten mit Hautwarzen erhöht. Dieses Problem wurde gelöst, indem nur die Antikörper gemessen wurden, die mit der PV-Infektion des Genitaltraktes in Zusammenhang stehen, indem die hier beschriebenen IgA-Antikörper gemessen werden. Es sollte betont werden, daß gefunden wurde, daß der hier beschriebene Test keine Wechselbeziehung zu dem bereits beschriebenen Test hat, der IgG-Antikörper verwendet. Diese Schlußfolgerung ergibt sich aus unserem Nachweis, daß es eine Wechselbeziehung zwischen den IgA-Antikörpern für HPV im Serum und in Sekreten (Fig. 2), jedoch keine Wechselbeziehung zwischen IgA- und IgG-Antikörpern für HPV in Sekreten (Fig. 4) oder im Serum (Tabelle 1A) gibt. Es gab keine Wechselbeziehung zwischen den Werten der IgA-Antikörpern im Serum und in den Sekreten. Es ist folglich möglich, daß die IgA- Antikörper im Serum einen für den Genitaltrakt spezifischen Test liefern können, der leicht als Teil der üblichen klinischen Arbeit angewendet werden kann.
Die Erkenntnis, daß normale bzw. gesunde Patientinnen und Patientinnen mit nachgewiesener Virusreplikation (Koilocytose und/oder Kondylom) IgA-Antikörperwerte hatten, die denen gesunder Patientinnen ähnlich sind, scheint überraschend. Diese Situation findet sich jedoch auch beim Epstein-Barr-Virus, bei dem Viruscapsid-IgA-Antikörper nicht mit dem Wert der Viruserzeugung, sondern nur mit dem Vorhandensein des zum Virus gehörigen Karzinom im Zusammenhang stehen. Das Immun-Blotting wies vier Virion-assoziierte Polypeptide nach. Das Vorhandensein von IgG-Antikörpern für das Protein 54-kDa entspricht früheren Untersuchungen: ein reguläres IgG-immunogenes Protein mit 56-kDa durch das L1-offene Leseraster codiert, wurde als Hauptkomponente des Capsid indentifiziert. Ein geringfügiges Capsidprotein mit 70- kDa wird durch das L2-offene Leseraster codiert. Dieses Protein sollte dem Protein mit 64-kDa entsprechen, das von uns nachgewiesen wurde. Die Identitäten des Proteins 28-kDa und der Proteine 40-kDa sind unbekannt. Das einzelne IgA-positive Serum hatte eine IgA-Reaktion für die Polypeptide 54-, 28- und 14- kDa, wohingegen die IgG-Reaktion des gleichen Serums nur gegen das Polypeptid 54-kDa gerichtet war. Dies zeigt, daß die PV- Epitope, die IgA- und IgG verursachen, nicht immer identisch sind. Um die Reaktion des Serum-Antikörpers auf die gruppenspezifischen PV-Capsid-Antigene zu analysieren, wurde das Überhandnehmen der Serum-Antikörper gegen PV in einer normalen gesunden Population im Vergleich mit dem Titer der Serum-Antikörper in Seren von Frauen mit CIN oder Gebärmutterhalskarzinom untersucht.
Es wurden insgesamt 139 Kontrollseren von gesunden erwachsenen Frauen erhalten. 62 Seren waren von gynäkologisch ambulant behandelten Klinikpatientinnen. Die Frauen hatten entweder keine pathologischen Befunde (48 Frauen) oder hatten Kondylome, jedoch keinen histopathologischen Nachweis von CIN (14 Frauen). 59 Seren wurden von gesunden weiblichen Laborangestellten und 18 Seren von Frauen gewonnen, die der jährlichen Überprüfungsuntersuchung unterzogen wurden.
Die Patientengruppe bestand aus 114 Frauen mit unbehandelter histopathologisch bestätigter Gebärmutterhalsgeschwulst, wovon 13 Schädigungen als CIN 1, 16 Schädigungen CIN 2, 16 Schädigungen CIN 3 und die restlichen 69 Schädigungen ausbreitungsfähige Gebärmutterhalskarzinome waren. Es wurden auch 83 Seren von Kindern verschiedenen Alters als auch von Erwachsenen beiderlei Geschlechts erhalten.
Die Isolation und Reinigung des Virus erfolgte wie oben beschrieben.
Die Herstellung des Papillomavirus vom Rind ist in den Fig. 5 und 6 gezeigt, sie umfaßt vier Proteine, die alle Epitope enthalten, die mit Humanseren immunoreaktiv sind, dies wurde durch Immun-Blotting gezeigt.
Gereinigtes BPV wurde durch fünf Zyklen aus Gefrieren/Auftauen zerbrochen und in 10 mM Carbonatpuffer, pH = 9,6, verdünnt und mit einer festgelegten Konzentration von 0,15 ug/Vertiefung der halben Fläche von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Die Platten, die das BPV enthielten, wurden über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Nach einer Waschung mit PBS-0,05% Tween 20 (PBS-T) wurden die Platten mit 10% Serum vom Lamm (durch Wärme inaktiviert; Flow) in PBS inaktiviert und bei 37ºC 60 Minuten lang inkubiert. Die Inaktivierungslösung wurde weggeschüttet und die Platten wurden gründlich gegen Papier geklopft. Humanseren wurden 1:20 in 10% Serum vom Lamm/PBS verdünnt, den Platten in den Duplikatvertiefungen zugegeben und konnten 120 Minuten lang bei 37ºC reagieren. Die Platten wurden dann fünfmal mit PBS-T gewaschen. Zum Nachweis der gebundenen Antikörper wurde ein mit Peroxidase von Meerrettich markierter monoklonaler Antikörper gegen Human-IgA (Janssen) verwendet (Fig. 3), mit 10% Serum vom Lamm/PBS auf 1:500 verdünnt, 120 Minuten lang bei 37ºC auf den Platten inkubiert. Die Platten wurden danach fünfmal mit PBS-T gewaschen und mit 20 mg/ml 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolinsulfonat(6)))deammoniumsalz (ABTS) entwickelt, das mit 0,9% Wasserstoffperoxid in 0,1 m Citratpuffer, pH = 4, auf 1:50 verdünnt war. Das Absorptionsmaß bei 415 nm wurde nach 30 Minuten (Fig. 7, 8) oder nach 60 Minuten (Fig. 9 bis 12) aufgezeichnet. Zum Nachweis des IgG wurden die Platten gewaschen und mit 10% Serum vom Lamm/PBS 60 Minuten lang bei 37ºC inaktiviert.
Danach wurde ein Konjugat aus Human-IgG-Antikörper vom Hasen und alkalischer Phosphatase (Dako), das in 10% Serum vom Lamm/PBS auf 1:1000 verdünnt war, 120 Minuten lang bei 37ºC (Fig. 9-12) oder ein mit Peroxidase vom Meerrettich konjugierter monoklonaler Antikörper gegen Human-IgG (Janssen) in einer Verdünnung von 1:2000 (Fig. 7 8) verwendet. Nach fünfmaligem Waschen mit PBS-T wurden 1 mg/ml Phosphatasesubstrat (Sigma) in 0,1 m Diethanolamin-Puffer, pH = 9,6/1 mM MgCl&sub2;, zugesetzt, und die Platten wurden nach 90 Minuten bei 405 nm abgelesen. Wenn der mit Peroxidase konjugierte Antikörper verwendet wurde, wurden die Platten 30 Minuten lang entwickelt, wie es oben für das IgA-Konjugat beschrieben ist. Zum Nachweis der IgM-Antikörper wurden die Platten wie oben beschrieben gewaschen und inaktiviert und danach mit einem Konjugat aus Human-IgM-Antikörper/Glucoseoxidase (Sera-lab) in einer Verdünnung von 1:800 in 10% Serum vom Lamm/PBS 120 Minuten lang inkubiert. 0,36 mg/ml ABTS, 2,4% Glucose, 8 ug/ml Meerrettich-Peroxidase (Sigma) in 0,1 m Phosphatpuffer, pH = 6,0, wurden als Substrat verwendet. Die Platten wurden nach 60 Minuten bei 415 nm abgelesen. Bei allen ELISA wurde ein Absorptionsmaß von 0,15 oder mehr über dem Hintergrund (das gleiche Serum auf unbeschichteten Vertiefungen) als positive Reaktion angesehen. Bei allen Versuchen wurden zwei CIN-Patientenseren mit bekannter Reaktivität als interne Standards verwendet. Als negative Kontrolle dienten die unbeschichteten Vertiefungen in den Duplikaten.
Der Durchschnittswert der Absorptionsmaße der Duplikate mit dem abgezogenen Durchschnitt der Absorptionsmaße der Duplikate auf den unbeschichteten Vertiefungen wurde durch einen zweiseitigen nicht metrischen Reihentest (Mann-Whitney-Test) nach statistisch signifikanten Unterschieden zwischen der Patientengruppe und der gesunden Kontrollgruppe untersucht.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Von 83 Seren aus der normalen Population, die sowohl aus Kindern und Erwachsenen beiderlei Geschlechts bestand, hatten 24 IgA-Antikörper und 46 IgG-Antikörper gegen PV. Es wurde gefunden, daß die Titer von IgA-Antikörper-BPV in gesunden männlichen im Vergleich zu gesunden weiblichen erhöht waren (p < 0,002, Mann-Whitney-Test), dies ist in Fig. 7 gezeigt, die die alters- und geschlechtsabhängige Verteilung der Serum-IgA-Antikörper für PV in einer normalen Population zeigt. Die Seren wurden 1:20 verdünnt und die IgA-Antikörper gegen BPV wurden mit einem α-kettenspezifischen, mit Peroxidase vom Meerrettich konjugierten monoklonaien Antikörper nachgewiesen. 30 Minuten nach der Zugabe des Substrats wurden die Absorptionsmaße bei 415 nm aufgezeichnet. Jeder Punkt stellt das mittlere Absorptionsmaß der Proben-Duplikate dar, wobei die durchschnittlichen Duplikatreihen für jeden Patienten abgezogen waren. Die IgA-Antikörperwerte waren bei Kindern (< 20 Jahre) im Vergleich zu Erwachsenen sowohl bei männlichen als auch weiblichen sehr ähnlich (Durchschnittswert für Erwachsene 0,79; Durchschnittswert für Kinder 0,103). Die gleichen Seren, die auf IgA-Antikörper gegen BPV geprüft worden waren, wurden auch nach dem Vorhandensein von IgG-Antikörpern laut Fig. 8 untersucht, die die alters- und geschlechtsabhängige Verteilung der Serum-IgG-Antikörper für PV in einer normalen Population zeigt. Die gleichen Seren, die nach IgA-Antikörpern gegen BPV untersucht wurden, wurden auch in ähnlicher Weise wie in Fig. 7 auf das Vorhandensein von IgG- Antikörpern überprüft, außer daß ein monoklonaler Antikörper gegen IgG, der mit Peroxidase von Meerrettich konjugiert war, verwendet wurde. Die IgG-Antikörper waren bei Kindern im Vergleich zu Erwachsenen stark erhöht (p < 0,0015). Es gab jedoch auch eine, jedoch nicht so deutliche Tendenz, daß Titer von IgG-Antikörper-BPV bei normalen männlichen im Vergleich zu weiblichen erhöht waren (0,1 > p > 0,05).
139 Seren von gesunden erwachsenen Frauen, 13 Seren von Frauen mit CIN Grad 1, 16 Seren von Frauen mit CIN Grad 2, 16 Seren von Frauen mit CIN Grad 3 und 69 Seren von Frauen mit ausbreitungsfähigen schuppenförmigen Zellkarzinomen des Gebärmutterhalses (SCC) wurden auf IgA-, IgG- und IgM-Antikörper für PV analysiert. Für die statistische Analyse wurden die unterschiedlichen CIN-Gruppen und die SCC-Gruppe zu einer einzelnen Gruppe mit Geschwulstbildung des Gebärmutterhalses kombiniert. Die IgA-Antikörperwerte waren in der Patientinnengruppe mit CIN oder Karzinom deutlich erhöht, wenn man dies mit vom Alter und Geschlecht dazu passenden Kontrollen ohne bekannte CIN vergleicht (p < 0,025), dies ist in Fig. 9 gezeigt, in der der Nachweis der IgA-Antikörper gegen PV im Serum von Patientinnen mit CIN oder Karzinomen des Gebärmutterhalses dargestellt ist. Die Seren wurden 1:20 verdünnt und Platten zugesetzt, die mit BPV beschichtet waren. Die IgA-Antikörper wurden mit einem monoklonalen Antikörper gegen Human-IgA nachgewiesen, der mit Peroxidase vom Meerrettich markiert war. 60 Minuten nach der Zugabe des Substrats wurden die Absorptionsmaße bei 415 nm abgelesen. Jeder Punkt stellte das mittlere Absorptionsmaß der Duplikate dar, wobei der Durchschnitt des Duplikats für die Serumreihen abgezogen war. Im Vergleich zur Gruppe "Kein CIN" waren die Titer in der CIN- und Karzinomgruppe erhöht (p < 0,025).
Die Titer der IgG-Antikörper gegen PV waren bei Patientinnen mit Geschwulstbildungen am Gebärmutterhals im Vergleich mit Kontrollen deutlich geringer (p < 0,001), dies ist in Fig. 10 gezeigt, die den Nachweis der IgG-Antikörper für PV im Serum von Patientinnen mit CIN oder Karzinom des Gebärmutterhalses darstellt. Wie in Fig. 9 wurden einige Seren auf das Vorhandensein von IgG-Antikörpern gegen BPV untersucht, wobei ein Konjugat aus Human-IgG-Antikörpern vom Hasen-alkalischer Phosphatase verwendet wurde. 90 Minuten nach der Zugabe des Substrats wurden die Absorptionsmaße bei 405 nm aufgezeichnet.
Es bestand auch eine signifikante Abnahme der IgM-Titer für PV in der Patientinnengruppe mit Geschwulstbildung des Gebärmutterhalses im Vergleich mit den Kontrollen (p < 0,005), dies ist in Fig. 11 gezeigt, die den Nachweis von IgM-Antikörpern für PV im Serum von Patientinnen mit CIN oder Karzinom des Gebärmutterhalses darstellt. Die gleichen Seren wie in Fig. 9 wurden auch auf das Vorhandensein von IgM-Antikörpern gegen PV untersucht. Als Konjugat wurde ein Konjugat aus Human-IgM-Antikörper-Glucoseoxidase verwendet, und 60 Minuten nach Entwicklung der Platten wurde bei 415 nm abgelesen. Wenn der Unterschied zwischen der IgA- und der IgG-Reaktion (IgA-IgG) für die Gruppe ohne bekannte CIN und die Gruppe mit CIN oder Karzinom verglichen wurde, wurde ein deutlicher Anstieg für die Patientinnengruppe mit CIN oder Karzinom festgestellt (p < 0,0001). Fig. 12 zeigt den Unterschied zwischen der IgA- und IgG-Reaktion (IgA- IgG) für PV im Verhältnis zur Erkrankung. Einige Werte des Absorptionsmaßes, die in den Fig. 9 und 10 aufgezeichnet sind, wurden als IgA dargestellt, von dem IgG abgezogen ist.
Alle HPV-Genome haben mindestens acht potentiell Protein codierende Bereiche, offene Leseraster (ORF). Es wurde nachgewiesen, daß zwei ORF, L1 und L2, Viruscapsid-Proteine codieren. Das L1- Protein ist ein reichlich vorhandenes Capsidprotein mit etwa 54 kDa, das sowohl für IgG- als auch IgA-Antikörper regulär immunogen ist. Antikörper für das L1-Protein weisen eine den Virus neutralisierende Aktivität auf, zumindest für BPV-1. Einige Untersuchungen, die monoklonale Antikörper oder bakteriell exprimierte Fusionsproteine verwenden, zeigten, daß das L1-Protein sowohl Epitope, die für alle Typen von PV gemeinsam sind, sog. gruppenspezifische Epitope, als auch Epitope aufweist, die für jeden HPV-Typ spezifisch sind. Ein gruppenspezifisches und ein Typ-spezifisches Epitop von L1 in HPV 6 wurde kartiert, wobei ein Satz kleiner Fusionsproteine verwendet wurde. Dieses L2 ORF codiert ein Capsidprotein mit etwa 70 kDa, das von uns als Protein mit etwa 64-kDa bezeichnet wurde, das in einer vergleichsweise geringen Menge vorkommt. Es wurde berichtet, daß das L2-Protein Typ-spezifische Epitope enthält. Um eine vollständigere Karte der linearen Epitope der wichtigsten Capsidproteine von HPV 16 zu erhalten, wurden die gesamten Aminosäuresequenzen dieser beiden Proteine als Satz von synthetischen Peptiden mit 20 Aminosäuren bei einer Überlappung von 5 Aminosäuren synthetisiert. Die Positionen der sequenzspezifischen Epitope, die mit IgA-, IgG- oder IgM-Antikörpern in den Seren von Patientinnen mit HPV 16 tragenden Gebärmutterhalsgeschwulsten reagierten, sind in den Fig. 13-19 gezeigt.
Sechsundsechzig Peptide aus 20 Aminosäuren, wobei 5 Aminosäuren einander überlappten, wurden nach der abgeleiteten Aminosäuresequenz der L1 und L2 ORF von HPV 16 synthetisiert. Zur Kennzeichnung der Position im Protein wurde das mutmaßliche Startcodon als Aminosäure 1 bezeichnet. Die Zahl 1 des synthetischen Peptids entspricht den Aminosäuren 2-21 im L1 ORF, die Peptidzahl 2 den Aminosäuren 17-36, die Nummer 3 den Aminosäuren 32 bis 51 usw. bis zum Peptid am L1-Carboxy-Ende (Nummer 35), das den Aminosäuren 512-531 entspricht. Die Peptidzahl 36 entspricht dem Aminoende von L2 ORF (Aminosäuren 2-21), die Zahl 37 sind die Aminosäuren 17-36 usw. Die beiden Peptide am L2-Carboxy-Terminus (Nummern 65 und 66) wurden 21 Residualpeptide synthetisiert, dies führt dazu, daß ihre Aminosäurepositionen 437-457 bzw. 453-473 sind. Die Aminosäuresequenzen der meisten immunoreaktiven Peptide sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Symbole in dieser Tabelle werden durch die Tabelle 2 erläutert. Die Aminosäuresequenzen aller Peptide, die in den Fig. 13 bis 19 verwendet werden, sind in der Tabelle 3 gezeigt. Die Peptide wurden nach dem Peptidsyntheseverfahren mit einer Vielzahl von festen Phasen unter Verwendung von t-Boc-Aminosäuren (Bachem AG, Bubendorf, Schweiz) und p-Methylbenzhydrylamin-Harz (Fluka AG, Buchs, Schweiz) hergestellt. Die Entfernung der Schutzgruppen von den Formyltriptophan-und Methioninsulfoxid- Resten wurde durch Spaltung mit 25% Fluorwasserstoff erreicht. Die Peptide wurden dann mit flüssigem Fluorwasserstoff vom Harz abgespaltet, wobei eine Vorrichtung mit mehreren Gefäßen verwendet wurde.
Vierundsechzig Seren von Patientinnen mit entweder einem Karzinom in situ (CIN Grad 3) oder ausbreitungsfähigen Gebärmutterhalskarzinomen wurden erhalten. Die entsprechenden Biopsieproben des Gebärmutterhalses wurden entweder durch Southern Blott- (32 Fälle) oder durch Dot-Blot-Hybridisierung (32 Fälle) mit 32-P-markierten Proben geklonter HPV 16 und HPV 18 auf das Vorhandensein von HPV DNA analysiert, wie es beschrieben wurde. HPV 16 wurde in 32 Fällen nachgewiesen und HPV 18 in 4 Fällen. Es standen dreißig Seren von Patient innen mit HPV 16-tragenden Gebärmutterhalsgeschwulsten in ausreichenden Mengen zur Verfügung, so daß sie mit allen unterschiedlichen synthetischen Peptiden geprüft werden konnten.
Es wurden 22 Seren von Patientinnen mit anderen Tumoren erhalten. 38 Seren wurden von gesunden Frauen erhalten.
Die synthetischen Peptide wurden in 10 mM Carbonatpuffer, pH = 9,6, verdünnt und der halben Fläche von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) in einer Konzentration von 20 ug Peptid/ml zugesetzt. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur gelassen. Nach einer Waschung mit PBS-0,05% Tween 20 (PBS-T) wurden die Platten mit 10% Serum vom Lamm (durch Wärme inaktiviert; Flow) in PBS inaktiviert und 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Inaktivierungslösung wurde dann weggeworfen, und die Platten wurden gründlich gegen Papier geschlagen. Die Humanseren wurden 1:30 in 10% Serum vom Lamm/PBS verdünnt, das den Platten zugegeben worden war, und konnten 120 Minuten lang bei 37ºC reagieren. Die Platten wurden dann fünfmal mit PBS-T gewaschen. Um die gebundenen Antikörper nachzuweisen, wurde ein monoklonaler Antikörper gegen Human-IgA, der mit Peroxidase von Meerrettich markiert war, 1:500 in 10% Serum vom Lamm/PBS verdünnt, 120 Minuten lang bei 37ºC auf den Platten inkubiert. Die Platten wurden danach fünfmal mit PBS-T gewaschen und mit 20 mg/ml 2,2'-Azino-di(3-Ethylbenzthiazolinsulfonat(6)deammoniumsalz (ABTS) entwickelt, das in 0,1 m Citratpuffer, pH = 4, mit 0,9% Wasserstoffperoxid auf 1:50 verdünnt war. Die Absorptionsmaße wurden nach 60 Minuten bei 415 nm aufgezeichnet. Zum Nachweis von IgG wurden die Platten gewaschen und 60 Minuten lang bei 37ºC mit 10% Serum vom Lamm/PBS inaktiviert. Danach wurde ein Konjugat aus Human-IgG-Antikörper vom Hasen-alkalischer Phosphatase (Dako), in 10% Serum vom Lamm-PBS auf 1:1000 verdünnt, 120 Minuten lang bei 37ºC angewendet. Nach fünfmaligem Waschen mit PBS-T und einmaligem Waschen mit 0,1 m Diethanolamin-Puffer, pH = 9,6, wurden 1 mg/ml Phosphatase- Substrat (Sigma) in 0,1 m Diethanolamin-Puffer, pH = 9,6/1 mM MgCl&sub2;, zugesetzt, und die Platten wurden nach 90 Minuten bei 405 nm abgelesen. Zum Nachweis der IgM-Antikörper wurden die Platten wie oben beschrieben gewaschen und inaktiviert und danach mit einem Konjugat von Human-IgM-Antikörper-Glucoseoxidase (Sera-lab) in einer Verdünnung von 1:800 in 10% Serum vom Lamm/PBS 120 Minuten lang inkubiert. Als Substrat wurden 0,36 mg/ml ABTS, 2,4% Glucose, 8 ug/ml Peroxidase von Meerrettich (Sigma) in 0,1 m Phosphatpuffer, pH = 6,0, verwendet. Die Platten wurden nach 60 Minuten bei 415 nm abgelesen. Ein Absorptionsmaß von 0,1 oder mehr über dem Hintergrund (das gleiche Serum auf unbeschichteten Vertiefungen) wurde als positive Reaktion angesehen. Als interner Standard wurden 30 HPV 16-positive Seren in jedem Test mit dem bekannten antigenen Peptid HKSAIVTLTYDSEWQRDQC vom E2 ORF von HPV 16 zur Reaktion gebracht. Die Absorptionsmaße der ELISA wurden im Verhältnis zu diesem internen Standard eingestellt, um eine mögliche Veränderung innerhalb der Untersuchung zu kompensieren.
Die ELISA-Absorptionsmaße, wobei die Absorptionsmaße des gleichen Serums abgezogen sind, das mit den unbeschichteten Vertiefungen reagierte, wurden durch einen zweiseitigen nicht metrischen Reihentest (Mann-Whitney-Test) nach statistisch signifikanten Unterschieden zwischen der Patientengruppe mit dem HPV 16-tragenden Gebärmutterhalsgeschwür und der Kontrollgruppe analysiert.
Die komplette Aminosäuresequenz von L1- und L2-Proteinen vom HPV-Typ 16 wurden als Satz von 66 synthetischen Peptiden mit einer Länge von 20 Aminosäuren und bei gegenseitiger Überlappung von 5 Resten synthetisiert. Alle Peptide wurden mit ELISA auf ihre Reaktivität mit IgA-, IgG- oder IgM-Antikörpern in 30 Seren von Patientinnen mit HPV 16-tragenden Gebärmutterhalsgeschwulsten untersucht. Einige Bereiche des L1-Proteins waren regulär mit IgA-Antikörpern reaktiv, die in diesen Seren vorhanden waren, dies ist in Fig. 13 gezeigt, die die IgA-Reaktivität für das L1-Protein zeigt. Jeder Punkt zeigt den Wert des Absorptionsmaßes (OD) für ein Serum, das mit dem Peptid reagierte, dessen Zahl unten auf der Abszisse angegeben ist. Der Wert des Absorptionsmaßes für das gleiche Serum wurde abgezogen, wenn es mit unbeschichteten Vertiefungen reagiert hatte. Dreißig Seren von Patient innen mit HPV 16-tragenden Gebärmutterhalsgeschwulsten wurden mit 1:30 verdünnt und mit 35 synthetischen Peptiden mit zwanzig Resten zur Reaktion gebracht, die die gesamte Aminosäuresequenz von L1 ORF von HPV 16 repräsentieren. Gebundene IgA-Antikörper wurden mit einem IgA(α-Ketten)-spezifischen, mit Enzym konjugierten monoklonalen Antikörper nachgewiesen. Die IgA-Reaktion war gegenüber den Peptiden besonders stark, die vom inneren Bereich des Proteins abgeleitet sind, den die Aminosäuren 167 bis 271 bedecken, dies entspricht den Peptiden 12-18. Außerhalb dieses immunoreaktiven Hauptbereiches gab es einige zusätzliche immunoreaktive Epitope, insbesondere das Aminoende des Proteins (Peptid 1), das Peptid 8 (Aminosäuren 102-121) und einige Epitope, die auf der Seite des Carboxyendes des immunoreaktiven Hauptbereiches angeordnet sind, insbesondere die Peptide 21 und 31 (die den Aminosäuren 302-321 bzw. 452-471 entsprechen).
Demgegenüber waren sehr wenige Peptide, die vom L2-Protein abgeleitet sind, mit den IgA-Antikörpern in diesen Seren reaktiv, wie es in Fig. 14 gezeigt ist, die die IgA-Reaktivität gegenüber dem L2-Protein zeigt. Fig. 13 zeigt einen ähnlichen Versuch, außer das die Seren mit 31 synthetischen Peptiden mit zwanzig Resten zur Reaktion gebracht wurden, die die gesamte Aminosäuresequenz von L2 ORF von HPV 16 darstellen. Das Haupt- Epitop war in der Mitte des Proteins angeordnet (Peptid 49, Aminosäuren 197-216). Es wurden auch andere Epitope im Aminoendteil des Proteins nachgewiesen (Peptide 37-38, Aminosäuren 17-41), wohingegen der Teil des Carboxyendes von L2 weniger reaktiv war.
Die IgG-Reaktivität des L1-Proteins war geringer als die IgA- Reaktivität. Es wird auf Fig. 15 Bezug genommen, die die IgG- Reaktivität gegenüber dem L1-Protein zeigt. Es wurde ein ähnlicher Versuch wie in Fig. 13 angewendet, außer daß ein IgG(γ- Ketten)-spezifischer, mit Enzym konjugierter Antikörper vom Hasen angewendet wurde. Obwohl der hauptsächliche IgA-immunoreaktive Bereich (Peptide 12-18) ebenfalls mit IgG-Antikörpern immunoreaktiv war, war die IgG-Reaktivität auch mit verschiedenen Epitopen außerhalb dieses Bereiches gleich stark, z. B. mit dem Peptid 24 (Aminosäuren 347-366).
Das L2-Protein hatte wenige IgG-reaktive Epitope, dies ist in Fig. 16 gezeigt, die die IgG-Reaktivität für L2-Protein darstellt. Es wurde ein ähnlicher Versuch wie in Fig. 13 vorgenommen, außer daß ein IgG(γ-Ketten)-spezifischer, mit Enzym konjugierter Antikörper vom Hasen angewendet wurde, und daß die Seren mit 31 synthetischen Peptiden mit zwanzig Resten reagierten, die die gesamte Aminosäuresequenz von L2 ORF von HPV 16 darstellen. Dies ähnelt dem, was wir für die IgA-Reaktivität dieses Proteins gefunden haben. Wir haben auch gefunden, daß das Peptid 49, daß das hauptsächliche IgA-reaktive Epitop dieses Proteins darstellt, das hauptsächliche IgG-reaktive Epitop ist. Es wurde auch gefunden, daß das IgA-reaktive Epitop am Aminoende von L2 (Peptide 37-38) IgG-reaktiv ist (Fig. 4).
Die IgM-Reaktivität gegenüber dem L1-Protein war auf einige Epitope entlang der Gesamtlänge des Proteins verteilt, wie es in Fig. 17 gezeigt ist, die die IgM-Reaktivität gegenüber dem L1-Protein zeigt. Es wurde ein ähnlicher Versuch wie in Fig. 13 vorgenommen, außer daß ein IgM(My-Ketten)-spezifischer, mit Enzym konjugierter Antikörper der Ziege angewendet wurde. Interessanterweise wurde die hauptsächliche IgM-Reaktivität gegen Peptide gefunden, die mit IgG- oder IgA-Antikörper nicht sehr immunoreaktiv sind, z. B. die Peptide 9, 13 und 23 (Aminosäurepositionen 122-142, 182-202 und 332-352).
Die IgM-Immunoreaktivität des L2-Proteins ähnelte der für IgA und IgG dadurch, daß die L2-Peptide viel weniger reaktiv als die L1-Peptide waren. Es wird auf Fig. 18 Bezug genommen, die die IgM-Reaktivität gegenüber dem L2-Protein zeigt. Es ist ein ähnlicher Versuch wie in Fig. 13, außer daß ein IgM(My-Ketten)- spezifischer, mit Enzym konjugierter Antikörper der Ziege angewendet wurde und daß die Seren mit 31 synthetischen mit zwanzig Resten reagierten, die die gesamte Aminosäuresequenz von L2 ORF von HPV 16 darstellen. Tatsächlich war in mehr als 4 von 30 Seren nicht ein einziges L2-Peptid immunoreaktiv mit IgM. Die sieben immunoreaktivsten Peptide (Peptide 8, 12, 13, 14, 16, 17 und 24) wurden mit einer Platte von 60 Kontrollseren auch auf die IgA-, IgG- und IgM-Reaktivität untersucht, von denen 22 von Patientinnen mit irrelevanten Tumoren und 38 von gesunden Spendern erhalten wurden. Die meisten dieser Peptide zeigten eine deutliche Immunoreaktivität mit nur weniger als 10% dieser Kontrollseren, dies ist in Fig. 19 gezeigt, die die mit der Erkrankung verbundene Reaktivität synthetischer Peptide zeigt. In Fig. 19 sind vier der stark immunoreaktiven synthetischen Peptide gezeigt, die deutliche Unterschiede der Reaktivität zwischen 30 Seren von HPV 16-tragenden Gebärmutterhalsgeschwulsten (HPV 16 Scc) und einer Kontrollgruppe von 16 Seren von Patientinnen mit anderen Tumoren oder von gesunden Spendern (Kontrolle) hatten. Jeder Punkt kennzeichnet den Wert des Absorptionsmaßes bei der ELISA, wobei der Wert des Absorptionsmaßes auf den unbeschichteten Vertiefungen abgezogen ist. Bei der IgM-Reaktivität für das Peptid 8 wurde eine große Empfindlichkeit für den Nachweis der HPV 16-tragenden Gebärmutterhalsgeschwulst gefunden: 70%. Die Spezifität dieses Testes betrug 95% (3/60 Kontrollseren waren reaktiv). Die IgG-Reaktivität für das Peptid 24 zeigte eine große Spezifität: 97% (2/60 Kontrollseren waren reaktiv), jedoch eine geringere Empfindlichkeit: 53% (16/30 Patientenseren reagierten). Die IgA-Reaktivitäten gegenüber den Peptiden 14 und 16 hatten jeweils Empfindlichkeiten von etwa 60% und eine Spezifität von gerade noch mehr als 90% (Fig. 19), und die Immunoreaktivität von diesen positiven Seren lag innerhalb der höchsten angezeigten Werte (vergleiche Fig. 1-6).
Indem gezeigt wird, daß das Peptid immunoreaktiv ist, haben die Erfinder definiert, daß es ein Epitop enthält, das mit Humanseren reaktiv ist. Dieses Epitop, das in dieser Peptidsequenz enthalten ist, ist nicht absolut von der exakten Sequenz des Peptids abhängig, es kann auch in einer Vielzahl geringfügiger Modifikationen des ursprünglichen Peptid enthalten sein. Diese Modifikationen umfassen Verlängerungen, Verkürzungen, Cyclisierungen und Aminosäuresubstitutionen. Gelegentlich ergibt sich die Frage, ob ein solches modifiziertes Peptid als ein neues Peptid angesehen werden sollte, das ein neues Epitop enthält. Durch vergleichende Immunoassays mit dem ursprünglichen Peptid und seiner Modifikation ist die Bestimmung unkompliziert, ob das modifizierte Peptid wesentlich immunoreaktiv mit Antikörpern für das ursprüngliche Peptid ist und folglich das gleiche Epitop enthält. Es sollte betont werden, daß ein Peptid auf vielen verschiedenen Wegen hergestellt werden kann. Hier wurden Peptidsynthesen durch Verfahren der organischen Chemie verwendet, diese gleichen Peptide können jedoch auch durch viele andere Maßnahmen erzeugt werden, z. B. durch Expressionssysteme für rekombinante DNA.
Es ist klar, daß die hier gegebene Beschreibung der Verfahren als Beispiel dient und die vorliegende Erfindung nicht einschränken soll. Der Immunoassay kann z. B. auf vielen verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Der Nachweis der Antikörper, die an das spezifische Antigen gebunden sind, kann z. B. mit verschiedenen Antikörpern für Antikörper (Antikörper-Antikörper) oder mit anderen Verbindungen mit einer Affinität für diese Antikörper erreicht werden, z. B. Protein A oder Protein G. Diese Reagenzien können auf viele verschiedene Weisen markiert werden, z. B. radioaktiv (Radioimmunoassay), mit Fluorescein (Fluorimmunoassay) oder enzymatisch (enzymgebundener Immunoassay), ELISA oder EIA). Ein spezieller Fall des enzymatischen Immunoassay liegt vor, wenn Antigen-Antikörper-Komplexe auf Gewebeabschnitten nachgewiesen werden. Ein solches Verfahren wird stattdessen als Immunofärbung oder Immunohistocytochemie bezeichnet, obwohl das zugrundeliegende Prinzip ähnlich wie für ELISA ist.
Das ELISA-Verfahren kann auch in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden. Verfahren zur Verbesserung der ELISA-Empfindlichkeit unter Verwendung verschiedener Schichten von Antikörper-Antikörpern, Avidin-Biotin-Komplexen und Enzym-Enzym-Antikörper-Komplexen sind in der Technik allgemein bekannt. Der feste Träger zum Fixieren des Antigens ist üblicherweise Kunststoff, wie es hier beschrieben wurde, es wurde jedoch auch eine Vielzahl anderer fester Träger beschrieben, z. B. Latex oder Agarose. Es ist auch nicht erforderlich, daß das Antigen direkt auf den festen Träger fixiert werden muß. Es gibt z. B. ein allgemein verwendetes ELISA-Format, das das spezifische Antigen durch einen in der festen Phase fixierten Antikörper für das Antigen an den festen Träger fixiert, eine sog. ELISA mit Einfangen des Antikörpers oder eine Sandwich-ELISA.
Ein besonderer Fall des Immunoassay, der ein Blotting (Übertragung) des Antigens auf einen festen Träger im Blattformat beinhaltet, wird als Immun-Blotting bezeichnet. Der feste Träger ist typischerweise ein Nitrocellulose- oder Nylonblatt, es wurden jedoch auch andere Träger beschrieben. Ein typisches Merkmal dieses Verfahrens besteht auch darin, daß die Antigene vor dem Blotting durch Gelelektrophorese oder ähnliche Verfahren nach ihrer Größe getrennt werden. Der Nachweis von Antikörpern, die an ein spezifisches Antigen auf dem Blatt gebunden sind, kann in ähnlicher Weise wie bei anderen Immunoassays durchgeführt werden. Der hier beschriebene Nachweis unter Verwendung eines Antikörper-Antikörpers, der Schritt der Verbesserung des Biotin-Avidin-Komplexes und die enzymatische Markierung stellen nur ein Beispiel dieses Nachweises dar.
Es ist für Diagnoseverfahren allgemein bekannt, daß eine Kombination verschiedener Diagnoseverfahren ein Diagnoseverfahren mit besserer Empfindlichkeit und/oder Spezifität erzeugt, als die einzelnen in dieser Kombination enthaltenen Tests. Es ist selbstverständlich, daß alle hier beschriebenen Antikörpertestes miteinander oder mit anderen Tests kombiniert werden können, um einen kombinierten Diagnosetest mit optimaler Empfindlichkeit und Spezifität zu erzeugen. Tabelle 1A Serum Sekrete
Messung von IgA- und IgG-Antikörpern für PV in Serum und Sekreten. Die Extinktionskoeffizienten der ELISA-Ergebnisse basierten auf 15 Patientinnen. Ein Teil dieser Information ist in den Fig. 2, 3 und 4 dargestellt. Die statistische Analyse dieser Ergebnisse zeigt, daß die Messung der IgA-Antikörper für PV, entweder im Serum oder in Sekreten, einen Test darstellt, der nicht mit den bereits beschriebenen Tests für IgG- Antikörper für PV entweder im Serum oder in Sekreten in Wechselbeziehung steht. Tabelle 1 Peptid Nr. Peptidsequenz
Nachweis signifikant erhöhter Titer von Antikörpern gegen HPV 16 bei synthetischen Peptiden von Seren von 30 Patientinnen mit HPV 16-tragenden Gebärmutterhalsgeschwulsten im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von 60 Seren von Patientinnen mit anderen Tumoren oder von gesunden Spendern. Die Kiguren kennzeichnen die p-Werte für signifikante Unterschiede zwischen diesen beiden Parametern (Mann-Whitney-Test) NS = nicht signifikant Tabelle 2 SYMBOL AMINOSÄURE 1-Buchstabe 3-Buchstabe L-Tyrosin Glycin L-Phenylalanin L- Methionin L-Alanin L-Serin L-Isoleucin L-Leucin L-Threonin L-Valin L-Prolin L-Lysin L-Histidin L-Glutamin L-Glutaminsäure L-Tryptophan L-Arginin L-Aspartinsäure L-Asparagin L-Cystein Tabelle 3 Aminosäuresequenzen von synthetischen Peptiden, die in den Versuchen verwendet wurden, die in den Fig. 13-19 gezeigt sind. Peptid Nr. Sequenz

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem Papillomavirus (PV) für Diagnosezwecke, insbesondere zur Diagnose von mit PV verbundenen Geschwulsten, auf dem Körperfluid oder Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis durchgeführt wird, indem im Körperfluid oder Gewebe IgA-Antikörper für L2-codiertes Papillomavirusprotein mit etwa 64 kDa, das L1-codierte Papillomavirusprotein mit etwa 54 kDa, als auch jeder Antikörpertyp für ein Papillomavirus-Virionprotein mit etwa 28 kDa, ein Papillomavirus-Virionprotein mit etwa 14 kDa oder für ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz bestimmt wird, die durch die Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

besteht,

oder für solche Modifikationen aller Peptide dieser Gruppe, die mit Antikörpern für das ursprüngliche Peptid im wesentlichen immunoreaktiv sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Antikörper menschlichen Ursprungs sind und die nachzuweisende Infektion eine HPV-Infektion oder eine mit HPV verbundene Erkrankung ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Vorhandensein von Antikörpern durch einen Immunoassay bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Immunoassay ELISA ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Immunoassay Immun- Blotting ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Nachweis auf einem Sekret vorgenommen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Nachweis auf einem Gebärmutterhalssekret vorgenommen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Nachweis für die Diagnose von Gebärmutterhalsgeschwulsten vorgenommen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Sekret mit einem Abstrichtupfer, einem Pinsel oder einem Spatel entnommen wird und in einem flüssigen Verdünnungsmittel davon abgewaschen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Nachweis auf einem Serum durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Nachweis durchgeführt wird, indem im Körperfluid oder Gewebe das Vorhandensein von IgG-Antikörpern für das Papillomavirus-Virionprotein mit etwa 28 kDa, ein Papillomavirus-Virionprotein mit etwa 14 kDa oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz bestimmt wird, die durch die Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

besteht,

oder für solche Modifikationen aller dieser Peptide der Gruppe, die mit Antikörpern für das ursprüngliche Peptid im wesentlichen immunoreaktiv sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die IgG-Antikörper menschlichen Ursprungs sind und die nachzuweisende Infektion eine HPV-Infektion oder eine mit HPV verbundene Erkrankung ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Vorhandensein von Antikörpern durch einen Immunoassay bestimmt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Immunoassay ELISA ist.

15. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Immunoassay Immun- Blotting ist.

16. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Nachweis auf einem Sekret vorgenommen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin der Nachweis auf einem Gebärmutterhalssekret vorgenommen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin der Nachweis für die Diagnose von Gebärmutterhalsgeschwulsten vorgenommen wird.

19. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Sekret mit einem Abstrichtupfer, einem Pinsel oder einem Spatel entnommen wird und in einem flüssigen Verdünnungsmittel davon abgewaschen wird.

20. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Nachweis auf einem Serum durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Nachweis durchgeführt wird, indem im Körperfluid oder Gewebe das Vorhanden sein von IgM-Antikörpern für eine Aminosäuresequenz bestimmt wird, die durch die Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

besteht,

oder für solche Modifikationen aller dieser Peptide dieser Gruppe, die mit den Antikörpern für das ursprüngliche Peptid im wesentlichen immunoreaktiv sind.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die IgM-Antikörper menschlichen Ursprungs sind und die nachzuweisende Infektion eine HPV-Infektion oder eine mit HPV verbundene Erkrankung ist.

23. Verfahren nach Anspruch 21, worin das Vorhandensein von Antikörpern durch einen Immunoassay bestimmt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin der Immunoassay ELISA ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23, worin der Immunoassay Immun- Blotting ist.

26. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Nachweis auf einem Sekret vorgenommen wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, worin der Nachweis auf einem Gebärmutterhalssekret vorgenommen wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin der Nachweis für die Diagnose von Gebärmutterhalsgeschwulsten vorgenommen wird.

29. Verfahren nach Anspruch 26, worin das Sekret mit einem Abstrichtupfer, einem Pinsel oder einem Spatel entnommen wird und in einem flüssigen Verdünnungsmittel davon abgewaschen wird.

30. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Nachweis auf einem Serum durchgeführt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Nachweis durchgeführt wird, indem im Körperfluid oder Gewebe das Vorhandensein von IgA-Antikörpern für ein Papillomavirus-Virionprotein mit etwa 28 kDa, ein Papillomavirus-Virionprotein mit etwa 14 kDa, oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz bestimmt wird, die durch die Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

besteht,

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin die IgA-Antikörper menschlichen Ursprungs sind und die nachzuweisende Infektion eine HPV-Infektion oder eine mit HPV verbundene Erkrankung ist.

33. Verfahren nach Anspruch 31, worin das Vorhandensein von Antikörpern durch einen Immunoassay bestimmt wird.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin der Immunoassay ELISA ist.

35. Verfahren nach Anspruch 33, worin der Immunoassay Immun- Blotting ist.

36. Verfahren nach Anspruch 31, worin der Nachweis auf einem Sekret vorgenommen wird.

37. Verfahren nach Anspruch 36, worin der Nachweis auf einem Gebärmutterhalssekret vorgenommen wird.

38. Verfahren nach Anspruch 37, worin der Nachweis für die Diagnose von Gebärmutterhalsgeschwulsten vorgenommen wird.

39. Verfahren nach Anspruch 36, worin das Sekret mit einem Abstrichtupfer, einem Pinsel oder einem Spatel entnommen wird und in einem flüssigen Verdünnungsmittel davon abgewaschen wird.

40. Verfahren nach Anspruch 31, worin der Nachweis auf einem Serum durchgeführt wird.