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GEBIET DER ERFINDUNG.
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Mismatch-Reparaturgene. Sie betrifft
insbesondere das Gebiet der In-situ-Mutagenese einzelliger Organismen.
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STAND DER
TECHNIK
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Innerhalb
der letzten vier Jahre wurde die genetische Ursache für das erbliche
kolorektale Karzinom ohne Polyposis (HNPCC), auch bekannt als Lynch-Syndrom II, für die Mehrheit
von Verwandten erforscht, die von der Krankheit betroffen sind (Liu,
B., Parsons, R., Papadopoulos, N., Nicolaides, N.C., Lynch, H.T.,
Watson, P., Jass, J.R., Dunlop, M., Wyllie, A., Peltomaki, P., de
la Chapelle A., Hamilton, S.R., Vogelstein, B., und Kinzler, K.W.
1996. Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis
colorectal cancer patients. Nat. Med. 2: 169-174). Die molekulare
Basis von HNPCC beinhaltet die genetische Instabilität, die von
einer defekten Mismatch-Reparatur (MMR) herrührt. Die Patentanmeldung CA-A-2
240 609 (The John Hopkins University) offenbart ein Verfahren zur
Herstellung hypermutierbarer Zellen oder Tiere durch Einbringen
dominant negativer Allele eines Mismatch-Reparaturgens. Bis heute
wurden in Menschen sechs Gene identifiziert, die Proteine codieren
und die an dem MMR-Prozess
teilzunehmen scheinen, einschließlich der mutS-Homologen GTBP,
hMSH2 und hMSH3 und der mutL-Homologen hMLH1, hPMS1 und hPMS2 (Bronner,
C.E., Baker, S.M., Morrison, P.T., Warren, G., Smith, L.G., Lescoe,
M.K., Kane, M., Earabino, C., Lipford, J., Lindblom, A., Tannergard,
P., Bollag, R.J., Godwin, A., R., Ward, D.C., Nordenskjold, M.,
Fishel, R., Kolodner, R., und Liskay, R.M. 1994. Mutation in the
DNA-mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary non-polyposis
colon cancer. Nature 368:258-261; Fishel, R., Lescoe, M., Rao, M.
R. S., Copeland, N. J., Jenkins, N. A., Garber, J., Kane, M., und
Kolodner, R. 1993. The human mutator gene homolog MSH2 and its association
with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell 7: 1027-1038; Leach,
F. S., Nicolaides, N. C, Papadopoulos, N., Liu, B., Jen, J., Parsons,
R., Peltomaki, P., Sistonen, P., Aaltonen, L. A., Nystrom-Lahti,
M., Guan, X. Y., Zhang, J., Meltzer, P. S., Yu, J. W., Kao, F. T.,
Chen, D. J., Cerosaletti, K. M., Fournier, R. E. K., Todd, S., Lewis,
T., Leach, R. J., Naylor, S. L., Weissenbach, J., Mecklin, J. P.,
Jarvinen, J. A., Petersen, G. M., Hamilton, S. R., Green, J., Jass,
J., Watson, P., Lynch, H. T., Trent, J. M., de la Chapelle, A.,
Kinzler, K. W., und Vogelstein, B. 1993. Mutations of a mutS homolog
in hereditary non-polyposis colorectal cancer. Cell 75: 1215-1225; Nicolaides,
N. C., Papadopoulos, N., Liu, B., Wei, Y. F., Carter, K. C., Ruben,
S. M., Rosen, C. A., Haseltine, W. A., Fleischmann, R. D., Fraser,
C. M., Adams, M. D., Venter, C. J., Dunlop, M. G., Hamilton, S.
R., Petersen, G. M., de la Chapelle, A., Vogelstein, B., und Kinzler,
K. W. 1994. Mutations of two PMS homologs in hereditary nonpolyposis
colon cancer. Nature 371: 75-80; Nicolaides, N. C., Palombo, F.,
Kinzler, K. W., Vogelstein, B., und Jiricny, J. 1996. Molecular
cloning of the N-terminus of GTBP. Genomics 31: 395-397; Palombo,
F., Hughes, M., Jiricny, J., Truong, O., Hsuan, J. 1994. Mismatch
repair and cancer. Nature 36: 417; Palombo, F., Gallinari, P., Iaccarino,
I., Lettieri, T., Hughes, M. A., Truong, O., Hsuan, J. J., und Jiricny,
J. 1995. GTBP, a 160-kilodalton protein essential for mismatch-binding
activity in human cells. Science 268: 1912-1914; Papadopoulos, N.,
Nicolaides, N. C., Wei, Y. F., Carter, K. C., Ruben, S. M., Rosen,
C. A., Haseltine, W. A., Fleischmann, R. D., Fraser, C. M., Adams,
M. D., Venter, C. J., Dunlop, M. G., Hamilton, S. R., Petersen,
G. M., de la Chapelle, A., Vogelstein, B., und Kinzler, K. W. 1994.
Mutation of a mutL homolog is associated with hereditary colon cancer.
Science 263: 1625-1629). Keimbahnmutationen in 4 dieser Gene (hMSH2,
hMLH1, hPMS1, und hPMS2) wurden in HNPCC-Verwandten identifiziert
(Bronner, C. E., Baker, S. M., Morrison, P. T., Warren, G., Smith,
L. G., Lescoe, M. K., Kane, M., Earabino, C., Lipford, J., Lindblom,
A., Tannergard, P., Bollag, R. J., Godwin, A., R., Ward, D. C.,
Nordenskjold, M., Fishel, R., Kolodner, R., und Liskay, R. M. 1994.
Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLHI is associated
with hereditary non-polyposis
colon cancer. Nature 368: 258-261; Leach, F. S., Nicolaides, N.
C., Papadopoulos, N., Liu, B., Jen, J., Parsons, R., Peltomaki,
P., Sistonen, P., Aaltonen, L. A., Nystrom-Lahti, M., Guan, X. Y.,
Zhang, J., Meltzer, P. S., Yu, J. W., Kao, F. T., Chen, D. J., Cerosaletti,
K. M., Fournier, R. E. K., Todd, S., Lewis, T., Leach R. J., Naylor,
S. L., Weissenbach, J., Mecklin, J. P., Jarvinen, J. A., Petersen,
G. M., Hamilton, S. R., Green, J., Jass, J., Watson, P., Lynch,
H. T., Trent, J. M., de la Chapelle, A., Kinzler, K. W., und Vogelstein,
B. 1993. Mutations of a mutS homolog in hereditary non-polyposis
colorectal cancer. Cell 75: 1215-1225; Liu, B., Parsons, R., Papadopoulos,
N., Nicolaides, N. C., Lynch, H. T., Watson, P., Jass, J. R., Dunlop,
M., Wyllie, A., Peltomaki, P., de la Chapelle, A., Hamilton, S.
R., Vogelstein, B., und Kinzler, K. W. 1996. Analysis of mismatch
repair genes in hereditary non-polyposiscolorectal
cancer patients. Nat. Med. 2: 169-174; Nicolaides, N. C., Papadopoulos,
N., Liu, B., Wei, Y. F., Carter, K. C., Ruben, S. M., Rosen, C.
A., Haseltine, W. A., Fleischmann, R. D., Fraser, C. M., Adams,
M. D., Venter, C. J., Dunlop, M. G., Hamilton, S. R., Petersen,
G. M., de la Chapelle, A., Vogelstein, B., und Kinzler, K. W. 1994.
Mutations of two PMS homologs in hereditary nonpolyposis colon cancer.
Nature 371: 75-80; Papadopoulos, N., Nicolaides, N. C., Wei, Y.
F., Carter, K. C., Ruben, S. M., Rosen, C. A., Haseltine, W. A.,
Fleischmann, R. D., Fraser, C. M., Adams, M. D., Venter, C. J.,
Dunlop, M. G., Hamilton, S. R., Petersen, G. M., de la Chapelle,
A., Vogelstein, B., und Kinzler, K. W. 1994. Mutation of a mutL
homolog is associated with hereditary colon cancer. Science 263:
1625-1629). Obwohl der Mutator-Effekt, der aus der MMR-Defizienz
hervorgeht, jede beliebige DNA-Sequenz beeinflussen kann, sind Mikrosatelliten-Sequenzen
besonders empfindlich gegenüber
MMR-Anomalien (Modrich, P. 1994. Mismatch repair, genetic stability,
and cancer. Science 266: 1959-1960). Die Mikrosatelliteninstabilität (MI) ist
daher ein geeigneter Indikator für
defiziente MMR. Neben ihrem Vorkommen in fast allen Tumoren, die
in HNPCC-Patienten vorkommen, findet man MI in einer kleinen Fraktion
sporadischer Tumore mit bestimmten molekularen und phänotypischen
Eigenschaften (Perucho, M. 1996. Cancer of the microsattelite mutator
phenotype. Biol Chem. 377: 675-684).
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HNPCC
wird in einer autosomal dominanten Weise vererbt, so dass die normalen
Zellen der betroffenen Familienmitglieder ein mutiertes Allel des
relevanten MMR-Gens (vererbt von einem betroffenen Elternteil) und
ein Wildtyp-Allel
(vererbt von einem nicht betroffenen Elternteil) enthalten. Während der
frühen
Stadien der Tumorentwicklung wird jedoch das Wildtypallel über eine
somatische Mutation inaktiviert, was die Zelle ohne funktionelles
MMR-Gen hinterlässt
und was zu einem schweren Defekt der MMR-Aktivität führt. Da eine somatische Mutation
zusätzlich
zu einer Keimbahnmutation zur Erzeugung einer defekten MMR in den
Tumorzellen erforderlich ist, wird dieser Mechanismus gewöhnlich analog
zur biallelischen Inaktivierung der Tumorsuppressorgene, die andere
vererbte Krebsarten initiieren, als einer bezeichnet, der zwei Treffer
birgt, (Leach, F. S., Nicolaides, N. C., Papadopoulos, N., Liu,
B., Jen, J., Parsons, R., Peltomaki, P., Sistonen, P., Aaltonen, L.
A., Nystrom-Lahti, M., Guan, X. Y., Zhang, J., Meltzer, P. S., Yu,
J. W., Kao, F. T., Chen, D. J., Cerosaletti, K. M., Fournier, R.
E. K., Todd, S., Lewis, T., Leach R. J., Naylor, S. L., Weissenbach,
J., Mecklin, J. P., Jarvinen, J. A., Petersen, G. M., Hamilton,
S. R., Green, J., Jass, J., Watson, P., Lynch, H. T., Trent, J.
M., de la Chapelle, A., Kinzler, K. W., und Vogelstein, B. 1993.
Mutations of a mutS homolog in hereditary non-polyposis colorectal cancer.
Cell 75: 1215-1225; Liu, B., Parsons, R., Papadopoulos, N., Nicolaides,
N. C., Lynch, H. T., Watson, P., Jass, J. R., Dunlop, M., Wyllie,
A., Peltomaki, P., de la Chapelle, A., Hamilton, S. R., Vogelstein,
B., und Kinzler, K. W. 1996. Analysis of mismatch repair genes in
hereditary non-polyposis colorectal cancer patients. Nat. Med. 2:
169-174; Parsons, R., Li, G. M., Longley, M. J., Fang, W. H., Papadopolous,
N., Jen, J., de la Chapelle, A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B.,
und Modrich, P. 1993. Hypermutability and mismatch repair deficiency in
RER+ tumor cells. Cell 75: 1227-1236). Übereinstimmend
mit diesem Zwei-Treffer-Mechanismus behalten die nicht-neoplastischen
Zellen der HNPCC-Patienten gewöhnlich
nahezu normale Mengen der MMR-Aktivität aufgrund der Anwesenheit
des Wildtypallels.
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Die
Fähigkeit
zur Veränderung
der Signaltransduktionswege durch Manipulation einer Genproduktfunktion,
entweder durch Überexpression
des Wildtyp-Proteins oder eines Fragmentes davon oder durch Einbringen
von Mutationen in spezifische Proteindomänen des Proteins, d.h. die
so genannte dominant negative Inhibitormutante, wurde über ein
Jahrzehnt in dem Hefesystem Saccharomyces cerevisiae von Hershkowitz (Nature
329 (6136): 219-222, 1987) beschrieben. Es wurde gezeigt, dass eine Überexpression
der Wildtyp-Genprodukte zu einem ähnlichen dominant negativen
Inhibitor-Phänotyp
führen
kann, und zwar am ehesten aufgrund des "Aussättigens" eines Faktors, wie
eines Proteins, das in geringen Mengen zugegen ist und für die Aktivität nötig ist;
die Entfernung des Proteins durch Binden an einen hohen Spiegel
seines mutmaßlichen
Partners führt
zum gleichen Nettoeffekt, was zur Inaktivierung des Proteins und
dem dazugehörigen
Signaltransduktionsweg führt.
Eine neuere Arbeit von Nicolaides et. al. (Nicolaides NC, Littman
SJ, Modrich P, Kinzler KW, Vogelstein B 1998. A naturally occurring
hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype.
Mol Cell Biol 18: 1635-1641) hat den Nutzen der Einbringung dominant
negativer inhibitorischer Mismatch-Reparaturmutanten in Säugetierzellen
zur Verleihung globaler DNA-Hypermutierbarkeit gezeigt. Die Fähigkeit
zur Manipulation des MMR-Prozesses und daher der Anstieg der Mutierbarkeit
des Zielwirtsgenoms nach Belieben, in diesem Beispiel einer Säugetierzelle,
ermöglicht
die Erzeugung innovativer Zellsubtypen oder Varianten der ursprünglichen
Wildtypzellen. Diese Varianten können
unter einen spezifischen gewünschten
selektiven Prozess gestellt werden, dessen Ergebnis ein neuer Organismus
ist, der ein oder mehrere veränderte
biologische Moleküle
exprimiert und der ein neues Merkmal hat. Das Konzept der Erzeugung
und Einbringung dominant negativer Allele eines Gens, einschließlich der
MMR-Allele, in Bakterienzellen führt
Berichten zufolge zu genetisch veränderten prokaryontischen Mismatch-Reparaturgenen.
(Aronshtam A, Marinus MG. 1996. Dominant negative mutator mutations
in the mutL gene of Escherichia coli. Nucleic Acids Res 24: 2498-2504;
Wu TH, Marinus MG. 1994. Dominant negative mutator mutations in
the mutS gene of Escherichia coli. J Bacteriol 176: 5393- 400; Brosh RM Jr,
Matson SW. 1995. Mutations in motif II of Escherichia coli DNA helicase
II render the enzyme nonfunctional in both mismatch repair and excision
repair with differential effects on the unwinding reaction. J Bacteriol
177: 5612-5621). Darüber
hinaus wurde eine veränderte
MMR-Aktivität gezeigt,
wenn MMR-Gene aus verschiedenen Arten, einschließlich Hefe, Säugetierzellen,
und Pflanzen überexprimiert
werden (Fishel, R., Lescoe, M., Rao, M. R. S., Copeland, N. J.,
Jenkins, N. A., Garber, J., Kane, M., und Kolodner, R. 1993. The
human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary
nonpolyposis colon cancer. Cell 7: 1027-1038; Studamire B, Quach
T, Alani, E. 1998. Saccharomyces cerevisiae Msh2p and Msh6p ATPase
activities are both required during mismatch repair. Mol Cell Biol
18: 7590-7601; Alani E, Sokolsky T, Studamire B, Miret JJ, Lahue
RS. 1997. Genetic and biochemical analysis of Msh2p-Msh6p: role
of ATP hydrolysis and Msh2p-Msh6p subunit interactions in mismatch
base pair recognition. Mol Cell Biol 17: 2436-2447; Lipkin SM, Wang
V, Jacoby R, Banerjee Basu S, Baxevanis AD, Lynch HT, Elliott RM,
und Collins FS. 2000. MLH3: a DNA mismatch repair gene associated
with mammalian microsatellite instability. Nat. Genet. 24: 27-35).
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Es
gibt einen stetigen Bedarf an Verfahren zur genetischen Manipulation
geeigneter Hefestämme
zur Steigerung ihrer Leistungseigenschaften und Fähigkeiten.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines
Verfahrens, mit dem Hefezellen hypermutierbar gemacht werden.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung hypermutierbarer
Hefezellen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines Verfahrens zum Mutieren eines interessierenden Gens in einer
Hefe.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Herstellung hypermutierbarer Hefen.
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur
Wiederherstellung einer normalen Mismatch-Reparaturaktivität zu hypermutierbaren
Zellen nach der Stammauswahl.
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Diese
und andere Aufgaben der Erfindung werden durch ein oder mehrere
der folgenden Ausführungsformen
bereitgestellt. In einer Ausführungsform
wird ein Verfahren zur Herstellung einer hypermutierbaren Hefe bereitgestellt.
Ein Polynukleotid mit einem dominant-negativen Allel eines Mismatch-Reparaturgens, das
induzierbar gesteuert wird, so dass die Expression des dominant
negativen Allels geschwächt
oder eliminiert wird, wird in eine Hefezelle eingebracht. Die Zelle
wird somit hypermutierbar.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
wird eine homogene Zusammensetzung gezüchteter hypermutierbarer Hefezellen
bereitgestellt. Die Hefezellen umfassen ein dominant negatives Allel
eines Mismatch-Reparaturgens, das induzierbar gesteuert wird, so
dass die Expression des dominant negativen Allels abgeschwächt oder
eliminiert werden kann.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer Mutation in
einem interessierenden Gen bereitgestellt. Eine Hefezellkultur mit
dem interessierenden Gen und einem dominant negativen Allel eines
Mismatch-Reparaturgens, das induzierbar gesteuert wird, so dass
die Expression des dominant negativen Allels abgeschwächt oder
eliminiert wird, wird gezüchtet.
Die Hefezelle ist hypermutierbar. Die Zellen der Kultur werden getestet,
und es wird bestimmt, ob das interessierende Gen eine Mutation birgt.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zum Erzeugen einer Mutation in
einem interessierenden Gen bereitgestellt. Eine Hefezelle mit dem
interessierenden Gen und einem Polynukleotid, das ein dominant negatives
Allel eines Mismatch-Reparaturgens codiert, das induzierbar gesteuert wird,
so dass die Expression des dominant negativen Allels geschwächt oder
eliminiert werden kann, wird gezüchtet,
so dass man eine Population mutierter hypermutierbarer Hefezellen
erzeugt. Die Population mutierter hypermutierbarer Hefezellen wird
unter Merkmalselektionsbedingungen gezüchtet. Hefezellen, die unter
Merkmalselektionsbedingungen wachsen, werden untersucht, und es
wird bestimmt, ob das interessierende Gen eine Mutation trägt.
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Ebenfalls
wird ein Verfahren zur Erzeugung einer erhöhten hypermutierbaren Hefe
erfindungsgemäß bereitgestellt.
Eine Hefezelle wird einem Mutagen ausgesetzt. Die Hefezelle hat
eine defekte Mismatch-Reparatur (MMR) aufgrund der Anwesenheit eines
dominant negativen Allels von mindestens einem MMR-Gen, das induzierbar
gesteuert wird, so dass die Expression des dominanten negativen
Allels geschwächt
oder eliminiert werden kann. Eine verstärkte Mutationsrate der Hefezelle
wird aufgrund des Einwirkens des Mutagens erzielt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer
Mismatch-Reparatur (MMR)-profizienten Hefe mit neuen Output Traits
bereitgestellt. Eine Hefezelle mit einem interessierenden Gen und
einem Polynukleotid, das ein dominant negatives Allel eines Mismatch-Reparaturgens
codiert, das induzierbar gesteuert wird, so dass die Expression
des dominant negativen Allels abgeschwächt oder eliminiert wird, wird
gezüchtet,
so dass eine Population mutierter hypermutierbarer Hefezellen erzeugt wird.
Die Population mutierter hypermutierbarer Hefezellen wird unter
Merkmalselektionsbedingungen gezüchtet.
Die Hefezellen, die unter Merkmalselektionsbedingungen gezüchtet werden,
werden untersucht, und es wird bestimmt, ob das interessierende
Gen eine Mutation trägt.
Normale Mismatch-Reparaturaktivität wird in den Hefezellen wiederhergestellt.
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Diese
und andere Ausführungsformen
der Erfindung versorgen das Fachgebiet mit Verfahren, die eine verstärkte Mutierbarkeit
in Hefe erzeugen können,
und stellen einzellige eukaryontische Organismen bereit, die potentiell
geeignete Mutationen tragen, so dass neue Output Traits für kommerzielle
Anwendungen erzeugt werden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Entdeckung der vorliegenden Erfindung ist, dass hypermutierbare
Hefe durch Verändern
der Aktivität
der endogenen Mismatch-Reparaturaktivität von Wirtszellen hergestellt
werden kann. Dominant negative Allele von Mismatch-Reparaturgenen steigern
beim Einbringen und Exprimieren in Hefe die Rate der spontanen Mutationen
durch Reduzieren der Effizienz der endogenen Mismatch-Reparatur-vermittelten
DNA-Reparaturaktivität,
wodurch die Hefe gegenüber
genetischen Veränderungen
stark anfällig,
d.h. hypermutierbar, gemacht wird. Hypermutierbare Hefe kann dann
zum Durchmustern auf Mutationen in einem Gen oder einer Reihe von
Genen in varianten Geschwistern verwendet werden, die ein oder mehrere
Output Traits aufweisen, die man bei Wildtyp-Zellen nicht vorfindet.
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Der
Prozess der Mismatch-Reparatur, der auch als Mismatch-Proofreading
bezeichnet wird, ist ein in der Evolution hochkonservierter Prozess,
der durch Proteinkomplexe durchgeführt wird, die in den verschiedensten
Zellen, von Prokaryontenzellen, wie Bakterienzellen, bis hin zu
komplexeren Säugetierzellen
beschrieben werden (Modrich, P. 1994. Mismatch repair, genetic stability,
and cancer. Science 266: 1959-1960; Parsons, R., Li, G. M., Longley,
M., Modrich, P., Liu, B., Berk, T., Hamilton, S. R., Kinzler, K.
W., und Vogelstein, B. 1995. Mismatch repair deficiency in phenotypically
normal human cells. Science 268: 738-740; Perucho, M. 1996. Cancer
of the microsattelite mutator phenotype. Biol Chem. 377: 675-684).
Ein Mismatch-Reparaturgen codiert eines der Proteine eines solchen
Mismatch-Reparatur-Komplexes. Man möchte zwar nicht durch eine bestimmte
Theorie des Wirkmechanismus gebunden sein, ein Mismatchreparaturkomplex
erfasst jedoch wahrscheinlich Verformungen der DNA-Helix, die aus
der nicht-komplementären Paarung
von Nukleotidbasen hervorgehen. Die nicht-komplementäre Base
des neueren DNA-Strangs wird ausgeschnitten, und die ausgeschnittene
Base wird durch die geeignete Base ersetzt, die komplementär ist zu
dem älteren
DNA- Strang. Auf diese
Weise eliminieren die Zellen viele Mutationen, die aufgrund von
Fehlern in der DNA-Replikation auftreten, was zu einer genetischen
Stabilität
der Geschwisterzellen führt,
die von der Parentalzelle hergeleitet sind.
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Einige
Wildtyp-Allele sowie dominant negative Allele verursachen sogar
in der Anwesenheit eines Wildtyp-Allels in der gleichen Zelle einen
bezüglich
der Mismatch-Reparatur defizienten Phänotyp. Ein Beispiel für ein dominant
negatives Allel eines Mismatch-Reparaturgens ist das Humangen hPMS2-134,
das eine Verkürzungsmutation
an Codon 134 trägt
(Parsons, R., Li, G. M., Longley, M., Modrich, P., Liu, B., Berk,
T., Hamilton, S. R., Kinzler, K. W., und Vogelstein, B. 1995. Mismatch
repair deficiency in phenotypically normal human cells. Science
268: 738-740; Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW,
Vogelstein B 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer
a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18: 1635-1641). Die
Mutation bewirkt, dass das Produkt dieses Gens anormal an der Position
der 134. Aminosäure
abbricht, was zu einem verkürzten
Polypeptid führt,
das die N-terminalen 133 Aminosäuren
enthält.
Eine solche Mutation bewirkt einen Anstieg der Mutationsrate, die
in Zellen nach der DNA-Replikation zunehmen. Die Expression eines
dominant negativen Allels eines Mismatch-Reparaturgens führt zu einer
Störung
der Mismatch-Reparaturaktivität,
sogar in der Anwesenheit des Wildtyp-Allels. Jedes Mismatch-Reparaturallel,
das eine solche Wirkung herbeiführt,
kann erfindungsgemäß verwendet
werden, unabhängig
davon, ob es sich um einen Wildtyp handelt oder verändert ist,
ob es von Säugetieren,
Hefe, Pilz, Amphibien, Insekten, Pflanzen oder Bakterien hergeleitet
ist. Die Verwendung von überexprimierten
Wildtyp-MMR-Genallelen von Mensch, Maus, Pflanzen und Hefe in Bakterien
verursacht eine dominant negative Wirkung auf die MMR-Aktivität der bakteriellen
Wirte (Aronshtam A, Marinus MG. 1996. Dominant negative mutator
mutations in the mutL gene of Escherichia coli. Nucleic Acids Res
24: 2498-2504; Wu TH, Marinus MG. 1994. Dominant negative mutator
mutations in the mutS gene of Escherichia coli. J Bacteriol 176:
5393-400; Brosh RM Jr, Matson SW. 1995. Mutations in motif II of
Escherichia coli DNA helicase II render the enzyme nonfunctional
in both mismatch repair and excision repair with differential effects
on the unwinding reaction. J Bacteriol 177: 5612-5621; Lipkin SM,
Wang V, Jacoby R, Banerjee-Basu S, Baxevanis AD, Lynch HT, Elliott
RM, und Collins FS. 2000. MLH3: a DNA mismatch repair gene associated
with mammalian microsatellite instability. Nat Genet 24: 27-35).
Dies legt nahe, dass die Störung
des Mehrkomponenten-MMR-Proteinkomplexes durch Einbringung von MMR-Komponenten von anderen
Spezies in die Hefe bewerkstelligt werden kann.
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Dominant
negative Allele eines Mismatch-Reparaturgens können aus den Zellen von Menschen,
Tieren, Hefe, Bakterien, Pflanzen oder anderen Organismen erhalten
werden. Das Durchmustern der Zellen auf defekte Mismatch-Reparaturaktivität kann solche
Allele identifizieren. Die Mismatch-Reparaturgene können mutiert
oder Wildtyp sein. Die Hefe-Wirts-MMR kann mutiert sein oder nicht.
Der in dieser Anmeldung verwendete Begriff Hefe umfasst einen beliebigen
Organismus aus dem Reich der Eukaryonten, einschließlich aber nicht
eingeschränkt
auf Saccharomyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp., Kluyveromyces
sp., und andere Pilze (Gellissen, G. and Hollenberg, CP. Gene 190(1)
87-97, 1997). Diese Organismen können
beispielsweise chemischen Mutagenen oder einer Bestrahlung ausgesetzt
werden, und sie können
auf defekte Mismatch-Reparatur untersucht werden. Genomische DNA,
cDNA, mRNA oder Protein aus einer beliebigen Zelle, die ein Mismatch-Reparaturprotein
codiert, können
auf Variationen von der Wildtypsequenz analysiert werden. Dominant-negative
Allele eines Mismatch-Reparaturgens können ebenfalls künstlich
erzeugt werden, beispielsweise durch Produktion von Varianten des
hPMS2-134-Allels oder anderer Mismatch-Reparatur-Gene (Nicolaides
NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW, Vogelstein B 1998. A naturally
occurring hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator
phenotype. Mol Cell Biol 18: 1635-1641). Verschiedene Techniken der
stellengerichteten Mutagenese können
verwendet werden. Die Eignung solcher Allele, unabhängig davon, ob
sie natürlich
oder künstlich
sind, zur Verwendung bei der Erzeugung von hypermutierbarer Hefe
kann durch Testen der Mismatch-Reparaturaktivität bewertet
werden (mit Verfahren, die beschrieben sind in Nicolaides NC, Littman
SJ, Modrich P, Kinzler KW, Vogelstein B 1998. A naturally occurring
hPMS2 mutation can confer a dominant negative mutator phenotype.
Mol Cell Biol 18: 1635-1641), die durch das Allel in der Anwesenheit von
einem oder mehreren Wildtyp-Allelen verursacht wird, so dass bestimmt
wird, ob es sich um ein dominant negatives Allel handelt.
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Eine
Hefe, die ein Wildtyp-Mismatch-Reparaturallel oder ein dominant
negatives Allel eines Mismatch-Reparaturgens überexprimiert, wird hypermutierbar.
Dies bedeutet, dass die spontane Mutationsrate dieser Hefe verglichen
mit der Hefe ohne solche Allele erhöht ist. Der Grad der Erhöhung der
spontanen Mutationsrate kann mindestens 2fach, 5fach, 10fach, 20fach,
50fach, 100fach, 200fach, 500fach oder 1000fach von derjenigen der
normalen Hefe sein, und wird als Funktion der Hefeverdopplung/Std.
gemessen.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung wird ein Polynukleotid, das ein Wildtyp- oder eine dominant
negative Form eines Mismatch-Reparaturproteins codiert, in Hefe
eingebracht, wobei das dominant negative Allel induzierbar gesteuert
wird, so dass die Expression des dominant negativen Allels abgeschwächt oder
eliminiert werden kann. Das Gen kann ein beliebiges dominant negatives
Allel sein, das ein Protein codiert, das Teil eines Mismatch-Reparaturkomplexes
ist, beispielsweise mutS-, mutL-, mutH- oder mutY-Homologe von Bakterien-,
Hefe-, Pflanzen- oder Säugetiergenen
(Modrich, P. 1994. Mismatch repair, genetic stability, and cancer. Science
266: 1959-1960; Prolla, T. A, Pang, Q., Alani, E., Kolodner, R.
A., und Liskay, R. M. 1994. MLH1, PMS1, and MSH2 Interaction during
the initiation of DNA mismatch repair in yeast. Science 264: 1091-1093). Das
dominant negative Allel kann natürlich
vorkommen oder im Labor hergestellt werden. Das Polynukleotid kann
in der Form von genomischer DNA, cDNA, RNA oder eines chemisch synthetisierten
Polynukleotids oder Polypeptids sein. Das Molekül kann durch Transformation,
Elektroporation, Paarung, Teilchenbeschuss, oder ein anderes in
der Literatur beschriebenes Verfahren in die Zelle eingebracht werden.
-
Transformation,
wird hier als ein beliebiges Verfahren verwendet, wodurch ein Polynukleotid
oder Polypeptid in eine Zelle eingebracht wird. Das Transformationsverfahren
kann in einer Hefekultur mit einer Suspension von Zellen durchgeführt werden.
Die Hefe kann ein beliebiger Typ sein, der in das Reich der Eukaryonten
eingeteilt wird, wie durch internationale Übereinkommen.
-
Im
Allgemeinen erfolgt die Transformation mit einer Suspension von
Zellen, jedoch können
auch andere Verfahren verwendet werden, solange ein ausreichender
Bruchteil der behandelten Zellen das Polynukleotid oder Polypeptid
enthält,
damit transfizierte Zellen gezüchtet
und verwendet werden können.
Das Proteinprodukt des Polynukleotids kann transient oder stabil
in der Zelle exprimiert werden. Techniken für die Transformation sind dem
Fachmann bekannt. Verfügbare
Techniken zur Einbringung eines Polynukleotids oder eines Polypeptids
in die Hefezelle umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf
Elektroporation, virale Transduktion, Zellfusion, die Verwendung
von Sphaeroplasten oder chemisch kompetenter Zellen (beispielsweise
Calciumchlorid), und Verpackung des Polynukleotids zusammen mit
Lipid für
die Fusion mit den interessierenden Zellen. Sobald eine Zelle mit
dem Mismatch-Reparaturgen oder Protein transformiert wurde, kann
die Zelle entweder in einer Flüssigkultur
oder auf einer Festagarmatrix, wie einer Petrischale, vermehrt und
bearbeitet werden. Ist die transfizierte Zelle stabil, wird das
Gen mit einem beständigen
Spiegel für
viele Zellgenerationen exprimiert, und es ergibt sich ein stabiler
hypermutierbarer Hefestamm.
-
Eine
isolierte Hefezelle kann aus einer Hefekultur durch chemische Auswahl
von Stämmen
mittels Antibiotikaselektion eines Expressionsvektors erhalten werden.
Ist die Hefezelle von einer einzelnen Zelle hergeleitet, wird sie
als Klon definiert. Techniken für
die Einzelklonierung von Mikroorganismen wie Hefe sind im Stand
der Technik bekannt.
-
Ein
Polynukleotid, das eine dominant negative Form eines Mismatch-Reparaturproteins
codiert, kann in das Genom von Hefe eingebracht werden oder wird
auf einem extrachromosomalen Plasmid vermehrt, wie dem 2-Mikron-Plasmid.
Die Auswahl von Klonen, die einen Mismatch-Reparaturgenexpressionsvektor
enthalten, kann erfolgen durch Plattieren von Zellen auf synthetischem
Komplettmedium, dem die entsprechende Aminosäure oder ein anderer essentieller
Nährstoff
fehlt, wie beschrieben (J.C. Schneider und L. Guarente, Methods
in Enzymology 194: 373, 1991). Die Hefe kann eine beliebige Art
sein, für
die geeignete Techniken verfügbar
sind, zur Herstellung transgener Mikroorganismen, wie beispielsweise,
aber nicht eingeschränkt
auf Gattungen, wie Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Hansenula,
Kluyveromyces und andere.
-
Jedes
Verfahren zur Herstellung von transgener Hefe, das im Stand der
Technik bekannt ist, kann verwendet werden. Gemäß einem Verfahren zur Herstellung
eines transgenen Mikroorganismus wird das Polynukleotid durch ein
dem Fachmann bekanntes Verfahren in die Hefe eingebracht. Anschließend wird
die Hefekultur unter Bedingungen gezüchtet, die auf Zellen selektieren,
in denen das Polynukleotid, das das Mismatch-Reparaturgen codiert,
entweder in das Wirtsgenom als stabile Gesamtheit eingebaut wird,
oder auf einem selbstreplizierenden extrachromosomalen Plasmid vermehrt
wird, und das Protein, das von dem Polynukleotidfragment codiert
wird, wird transkribiert und anschließend zu einem funktionellen
Protein in der Zelle translatiert. Sobald die transgene Hefe gentechnisch
so verändert
wurde, dass sie das Expressionskonstrukt enthält, wird sie dann vermehrt,
so dass eine transgene Hefekultur erzeugt wird und sie unbegrenzt
fortgesetzt wird.
-
Sobald
eine stabile transgene Hefezelle derart gentechnisch verändert wurde,
dass ein defektes Mismatch-Reparatur (MMR)-Protein exprimiert wird,
kann die Hefe so gezüchtet
werden, dass neue Mutationen in einem oder mehreren interessierenden
Zielgenen erzeugt werden, die sich in der gleichen Hefezelle befinden.
Ein interessierendes Gen kann ein beliebiges Gen sein, das natürlich in
der Hefe vorkommt oder das durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken
in den Hefewirt eingebracht wurde. Das oder die Zielgen(e) können vor
der Auswahl bekannt oder unbekannt sein. Ein Vorteil des Einsatzes
solcher transgener Hefezellen zur Induktion von Mutationen in ansässigen oder
extrachromosomalen Genen in der Hefe ist, dass man die Zellen nicht
einem mutagenen Angriff auszusetzen braucht, unabhängig davon
ob er chemisch oder durch Strahlung erfolgt, so dass eine Reihe
von statistischen Genveränderungen
in dem bzw. den Zielgenen erzeugt wird. Dies beruht auf der hocheffizienten
Natur und dem Spektrum der natürlich
vorkommenden Mutationen, die als Folge des veränderten Mismatch-Reparaturprozesses
entstehen. Es ist jedoch möglich,
das Spektrum und die Häufigkeit
der Mutationen durch gleichzeitige Verwendung von Chemie und/oder
Strahlung zusammen mit MMR-defizienten Zellen zu steigern. Die Nettowirkung
der Kombinationsbehandlung ist ein Anstieg der Mutationsrate in
der genetisch veränderten
Hefe, die sich zur Produktion neuer Output Traits eignet. Die Rate
der Kombinationsbehandlung ist höher
als die Rate bei Verwendung von nur MMR-defizienten Zellen oder nur Mutagen
mit den Wildtyp-MMR-Zellen.
-
Die
erfindungsgemäße MMR-defiziente
Hefe kann in genetischen Screens für die direkte Auswahl varianter
Subklone verwendet werden, die neue Output Traits mit kommerziell
wünschenswerten
Anwendungen aufweisen. Dies ermöglicht
die Überbrückung der
lästigen
und zeitaufwändigen
Schritte der Gen-Identifikation, -Isolation und -Charakterisierung.
-
Mutationen
können
erfasst werden durch Analyse der intern und/oder extern mutagenisierten
Hefe auf Veränderungen
in ihrem Genotyp und/oder Phänotyp.
Gene, die veränderte
Phänotypen
in MMR-defekten Mikrobenzellen produzieren, können durch jegliche einer Vielzahl
von molekularen Techniken unterschieden werden, die dem Fachmann
bekannt sind. Das Hefegenom kann beispielsweise isoliert werden,
und eine Bibliothek von Restriktionsfragmenten des Hefegenoms kann
in einen Plasmidvektor kloniert werden. Die Bibliothek kann in eine "normale" Zelle eingebracht
werden, und die Zellen, die den neuen Phänotyp aufweisen, werden gescreent.
Ein Plasmid kann aus solchen normalen Zellen isoliert werden, die
den neuen Phänotyp
und das oder die Gene aufweisen, die durch die DNA-Sequenzanalyse
charakterisiert wurden. Alternativ kann ein differentieller Messenger-RNA-Screen
eingesetzt werden, wobei Treiber- und Tester-RNA (hergeleitet von
Wildtyp bzw. neuer Mutante) verwendet werden, gefolgt von Klonierung
der differentiellen Transkripte und Charakterisierung durch Standard-Molekularbiologie-Verfahren,
die dem Fachmann bekannt sind. Wird die gesuchte Mutante von einem
extrachromosomalen Plasmid codiert, dann kann ferner nach der Coexpression
des dominant negativen MMR-Gens und des interessierenden Gens, und
nach einer phänotypischen
Selektion, das Plasmid aus mutierten Klonen isoliert werden und
durch DNA-Sequenzanalyse analysiert werden, wobei Verfahren des
Standes der Technik verwendet werden. Ein Phänotyp-Screening auf Output
Traits in MMR-defizienten
Mutanten kann durch biochemische Aktivität und/oder einen leicht beobachtbaren
Phänotyp
des veränderten
Genproduktes erfolgen. Ein mutierter Phänotyp kann ferner auch durch
Identifikation von Veränderungen
der Elektrophoresebeweglichkeit, DNA-Bindung im Falle der Transkriptionsfaktoren,
spektroskopischen Eigenschaften, wie IR, CD, Röntgenkristallographie oder
Hochfeld-NMR-Analyse oder durch andere physikalische oder strukturelle
Eigenschaften eines Proteins, das durch ein mutiertes Gen codiert
wird, erfasst werden. Man kann auch auf eine veränderte neue Funktion eines
Proteins in situ, in isolierter Form oder in Modellsystemen screenen.
Man kann auf die Veränderung
einer Eigenschaft der Hefe screenen, die mit der Funktion des interessierenden
Gens zusammenhängt,
unabhängig
davon, ob das Gen vor der Selektion bekannt oder unbekannt ist.
-
Die
erörterten
Screening- und Selektionsverfahren sollen die potentiellen Maßnahmen
zur Gewinnung neuer Mutanten mit kommerziell wertvollen Output Traits
veranschaulichen, aber sie sollen die vielen möglichen Wege, in denen Screening
und Selektion durch den Fachmann ausgeführt werden können, keinesfalls einschränken.
-
Plasmidexpressionsvektoren,
die ein Mismatch-Reparatur (MMR)-Geninsert enthalten, können in Kombination
mit einer Anzahl kommerziell verfügbarer regulatorischer Sequenzen
verwendet werden, die den zeitlichen und quantitativen biochemischen
Expressionsspiegel des dominant negativen MMR-Proteins steuern.
Die regulatorischen Sequenzen können
einen Promotor, Enhancer oder eine Kombination aus Promotor und
Enhancer umfassen, und können
entweder stromaufwärts
oder stromabwärts
des MMR-Gens eingebracht werden, so dass das Ausmaß der Expression
gesteuert wird. Die regulatorischen Sequenzen können dem Fachmann bekannt sein,
einschließlich,
aber nicht eingeschränkt
auf die AOX1-, GAP-, GAL1-, GAL10-, PHO5- und PGK-Promotoren, die
sich auf extrachromosomalen Expressionsvektoren mit hoher oder niedriger Kopienzahl
befinden oder auf Konstrukten, die über homologe Rekombination
in das Genom integriert werden. Diese Typen der regulatorischen
Systeme sind in wissenschaftlichen Veröffentlichungen offenbart worden,
und sind dem Fachmann geläufig.
-
Sobald
ein Mikroorganismus mit einem neuen gewünschten interessierenden Output
Trait erzeugt wird, wird die Aktivität der aberranten MMR-Aktivität wünschenswerterweise
durch beliebige Maßnahmen
des Standes der Technik geschwächt
oder eliminiert. Diese umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf
die Entfernung eines Induktors aus dem Kulturmedium, der für die Promotoraktivierung
verantwortlich ist, Aushärten eines
Plasmids aus einer transformierten Hefezelle und Zugabe von Chemikalien,
wie 5-Fluororotsäure
zum "Ausloopen" des interessierenden
Gens.
-
Bei
einem induzierbar gesteuerten dominant negativen MMR-Allel wird
die Expression des dominant negativen MMR-Gens angeschaltet (induziert),
so dass eine Population hypermutierbarer Hefezellen mit neuen Output
Traits erzeugt wird. Die Expression des dominant negativen MMR-Allels
kann rasch abgeschaltet werden, so dass ein genetisch stabiler Stamm
wiederhergestellt wird, der ein neues kommerziell interessantes Output
Trait zeigt. Der resultierende Hefestamm eignet sich nun als stabiler
Stamm, der bei verschiedenen kommerziellen Anwendungen angewendet
werden kann, je nach dem darauf ausgeübten Selektionsprozess.
-
In
Fällen,
bei denen genetisch defekte Mismatch-Reparatur-Hefe [Stämme, wie,
aber nicht eingeschränkt
auf: M1 (mutS) und in EC2416 (mutS delta umuDC) und mutL- oder mutY-Stämme] zur
Herleitung neuer Output Traits verwendet wird, können transgene Konstrukte verwendet
werden, die Wildtyp-Mismatch-Reparaturgene exprimieren, die zur
Komplementierung des genetischen Defekts hinreichen und daher die
Mismatch-Reparaturaktivität
des Wirts nach der Merkmalselektion wiederherstellen [Grzesiuk,
E. et. al. (Mutagenesis 13; 127-132,1998); Bridges, B. A., et. al.
(EMBO J. 16: 3349-3356, 1997); LeClerc, J. E., Science 15:1208-1211, 1996); Jaworski,
A. et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 11019-11023, 1995)]. Die
resultierende Hefe ist genetisch stabil und kann für verschiedene
kommerzielle Anwendungen eingesetzt werden.
-
Die
Verwendung der Überexpression
fremder (exogener, transgener) Mismatch-Reparaturgene aus Mensch und Hefe, wie
MSH2, MLH1, MLH3, usw. erzeugt, wie zuvor gezeigt, einen dominant
negativen Mutatorphänotyp
in Hefewirten (Shcherbakova, P. V., Hall, M. C., Lewis, M. S., Bennett,
S. E., Martin, K. J., Bushel, P. R., Afshari, C. A., und Kunkel,
T. A. Mol. Cell Biol. 21 (3):940-951; Studamire B, Quach T, Alani,
E. 1998. Saccharomyces cerevisiae Msh2p and Msh6p ATPase activities
are both required during mismatch repair. Mol Cell Biol 18: 7590-7601; Alani E, Sokolsky
T, Studamire B, Miret JJ, Lahue RS. 1997. Genetic and biochemical
analysis of Msh2p-Msh6p: role of ATP hydrolysis and Msh2p Msh6p
subunit interactions in mismatch base pair recognition. Mol Cell
Biol 17: 2436-2447;
Lipkin SM, Wang V, Jacoby R, Banerjee Basu S, Baxevanis AD, Lynch
HT, Elliott RM, und Collins FS. 2000. MLH3: a DNA mismatch repair
gene associated with mammalian microsatellite instability. Nat Genet
24: 27-35). Zudem wurde zuvor gezeigt, dass die Verwendung von Hefestämmen, die
prokaryontische dominant negative MMR-Gene exprimieren, sowie Wirte,
die genomische Defekte in endogenen MMR-Proteinen haben, zu einem
dominant negativen Mutatorphänotyp
führt (Evans,
E., Sugawara, N., Haber, J. E., und Alani, E. Mol. Cell. 5 (5):
789-799, 2000; Aronshtam A, Marinus MG. 1996. Dominant negative
mutator mutations in the mutL gene of Escherichia coli. Nucleic
Acids Res 24: 2498-2504; Wu TH, Marinus MG. 1994. Dominant negative
mutator mutations in the mutS gene of Escherichia coli. J Bacteriol
176: 5393-400; Brosh RM Jr, Matson SW. 1995. Mutations in motif
II of Escherichia coli DNA helicase II render the enzyme nonfunctional
in both mismatch repair and excision repair with differential effects on
the unwinding reaction. J Bacteriol 177:5612-5621). Die hier offenbarten
Befunde lehren jedoch die Verwendung der MMR-Gene, einschließlich des
Human-PMSR2-Gens (Nicolaides, N. C., Carter, K. C., Shell, B. K., Papadopoulos,
N., Vogelstein, B., und Kinzler, K. W. 1995. Genomic organization
of the human PMS2 gene family. Genomics 30: 195-206), des verwandten
PMS134-verkürzten
MMR-Gens (Nicolaides N. C., Kinzler, K. W., und Vogelstein, B. 1995.
Analysis of the 5'region
of PMS2 reveals heterogenous transcripts and a novel overlapping
gene. Genomics 29: 329-334), der Pflanzen-Mismatchreparaturgene
(US-Patent Nr. S. N. 09/749,601) und solcher Gene, die homolog sind
zu den 134 N-terminalen Aminosäuren
des PMS2-Gens zur Erzeugung von hypermutierbarer Hefe.
-
DNA-Mutagene
können
in Kombination mit MMR-defizienten Hefewirten verwendet werden,
um die hypermutierbare Produktion von genetischen Veränderungen
zu steigern. Dies reduziert weiterhin die MMR-Aktivität und eignet
sich zur Erzeugung von Mikroorganismen mit kommerziell relevanten
Output Traits.
-
Die
Fähigkeit
zur Erzeugung hypermutierbarer Organismen mittels dominant negativer
Allele kann zur Erzeugung innovativer Hefestämme verwendet werden, die neue
Output Traits zeigen, welche sich für eine Anzahl von Anwendungen
eignen, einschließlich,
aber nicht eingeschränkt
auf die Herstellungsindustrie, für die
Herstellung neuer Biochemikalien, zum Entgiften schädlicher
Chemikalien, und zwar entweder Nebenprodukte der Herstellungsverfahren
oder solche, die in Katalysatoren verwendet werden, sowie die Remediation der
Toxine unterstützen,
die in der Umgebung zugegen sind, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf
Polychlorbenzole (PCBs), Schwermetalle und andere umweltschädliche Mittel.
Neue Hefestämme
können
für eine
verstärkte
Aktivität
ausgewählt
werden, so dass entweder eine gesteigerte Quantität oder Qualität eines therapeutischen
Protein- oder Nichtprotein-Moleküls mittels
Biotransformation hervorgebracht werden kann. Biotransformation
ist die enzymatische Umwandlung eines chemischen Zwischenprodukts
in das nächste
Zwischenprodukt oder Produkt in einem Weg oder Schema durch eine
Mikrobe oder einen Extrakt, der von der Mikrobe hergeleitet ist.
Es gibt viele Beispiele für
eine Biotransformation in der Verwendung für die kommerzielle Herstellung
wichtiger biologischer und chemischer Produkte, einschließlich Penicillin
G, Erythromycin, und Clavulansäure.
Organismen, die sich zur Umwandlung "roher" Materialien in fortgeschrittene Zwischenprodukte
und/oder Endprodukte eignen, können
auch eine Biotransformation ausüben
(Berry, A. Trends Biotechnol. 14 (7): 250-256). Die Fähigkeit
zur Steuerung der DNA- Hypermutierbarkeit
in Wirts-Hefestämmen
mit einer dominant negativen MMR (wie oben beschrieben) ermöglicht die
Erzeugung varianter Subtypen, die für neue Phänotypen von kommerziellem Interesse
ausgewählt
werden können,
einschließlich,
aber nicht eingeschränkt
auf Organismen, die toxinresistent sind, die Fähigkeit haben, ein Toxin in
situ zu zersetzen oder die Fähigkeit
zur Umwandlung eines Moleküls
aus einem Zwischenprodukt in entweder ein fortgeschrittenes Zwischenprodukt
oder ein Endprodukt haben. Andere Anwendungen, die dominant negative
MMR-Gene zur Produktion einer genetischen Veränderung von Hefewirten für neue Output
Traits verwenden, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf
rekombinante Produktionsstämme,
die höhere
Mengen eines rekombinanten Polypeptids produzieren, sowie die Verwendung
veränderter
endogener Gene, die Chemikalien transformieren oder Produktions-Downstream-Prozesse
katalysieren können.
Ein regulierbarer dominant negativer MMR-Phänotyp kann zur Produktion eines
Hefestammes mit einem kommerziell vorteilhaften Output Trait verwendet
werden. Mit diesem Verfahren können
einzellige Hefezellen, die eine dominant negative MMR exprimieren,
direkt auf den interessierenden Phänotyp selektiert werden. Sobald
eine selektierte Hefe mit einem spezifizierten Output Trait isoliert
wurde, kann die hypermutierbare Aktivität des dominant negativen MMR-Allels durch verschiedene
Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, abgeschaltet werden. Wird
beispielsweise das dominant negative Allel von einem induzierbaren
Promotorsystem exprimiert, kann der Induktor entfernt oder abgereichert
werden. Solche Systeme umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf
Promotoren, wie den lactoseinduzierbaren GALi-GAL10-Promotor (M.
Johnston und R. W. Davis, Mol. Cell Biol. 4: 1440, 1984); den phosphatinduzierbaren
PHO5-Promotor (A. Miyanohara, A. Toh-e, C. Nosaki, F. Nosaki, F.
Hamada, N. Ohtomo, und K. Matsubara. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80: 1, 1983); die Promotoren der Alkoholdehydrogenase I (ADH) und
3-Phosphoglyceratkinase (PGK), die als konstitutiv angesehen werden,
aber reprimiert bzw. dereprimiert werden können, wenn Hefezellen in nicht
fermentierbaren Kohlenstoffquellen gezüchtet werden, wie beispielsweise
aber nicht eingeschränkt
auf Lactat (G. Ammerer, Methods in Enzymology 194: 192, 1991; J. Mellor,
M. J. Dobson, N. A. Roberts, M. F. Tuite, J. S. Emtage, S. White,
D. A. Lowe, T. Patel, A. J. Kingsman, und S. M. Kingsman, Gene 24:
563, 1982); S. Hahn und L. Guarente, Science 240: 317, 1988); Alkoholoxidase (AOX)
in Pichia pastoris (Tschopp, JF, Brust, PF, Cregg, JM, Stillman,
CA, und Gingeras, TR. Nucleic Acids Res. 15 (9): 3859-76, 1987;
und der thiaminreprimierbare Expressionspromotor nmt1 in Schizosaccharomyces pombe
(Moreno, MB, Duran, A., und Ribas, JC. Yeast 16 (9): 861-72, 2000).
Hefezellen können
durch eine beliebige Maßnahme
transformiert werden, die dem Fachmann bekannt ist, einschließlich chemischer
Transformation mit LiCI (Mount, R. C., Jordan, B. E., und Hadfield,
C. Methods Mol. Biol. 53: 139-145, 1996) und Elektroporation (Thompson,
JR, Register, E., Curotto, J., Kurtz, M. und Kelly, R. Yeast 14
(6): 565-71, 1998). Mit DNA transformierte Hefezellen können für das Wachstum
durch eine Vielzahl von Verfahren selektiert werden, einschließlich, aber
nicht eingeschränkt
auf selektierbare Marker (URA3; Rose, M., Grisafi, P., und Botstein,
D. Gene 29: 113, 1984; LEU2; A. Andreadis, Y., Hsu, M., Hermodson,
G., Kohlhaw, und P. Schimmel. J. Biol. Chem. 259: 8059, 1984; ARG4;
G. Tschumper und J. Carbon. Gene 10: 157, 1980; und HIS3; K. Struhl, D.
T. Stinchcomb, S., Scherer, und R. W. Davis Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 76: 1035, 1979) und Medikamente, die das Wachstum von Hefezellen
hemmen (Tunicamycin, TUN; S. Hahn, J., Pinkham, R. Wei, R., Miller, und
L. Guarente. Mol. Cell Biol. 8: 655, 1988). Rekombinante DNA kann
wie oben beschrieben in Hefe eingebracht werden, und die Hefevektoren
können
in der Hefezelle entweder extrachromosomal oder in einen spezifischen
Locus integriert enthalten sein. Hefeexpressionsvektoren auf extrachromosomaler
Basis können
entweder auf hoher Kopienzahl beruhende (wie der 2 μm Vektor
Yep13; A.B. Rose und J.R. Broach, Methods in Enzymology 185: 234,
1991), Centromervektoren mit niedriger Kopienzahl, die autonom replizierende
Sequenzen (ARS) enthalten, wie YRp7 (M. Fitzgerald-Hayes, L. Clarke,
und J. Carbon, Cell 29: 235, 1982) sowie Integrationsvektoren, die
es ermöglichen,
dass das interessierende Gen in den spezifizierten Locus in dem Wirtsgenom
eingebracht wird, und auf stabile Weise vermehrt wird (R. J. Rothstein,
Methods in Enzymology 101: 202, 1991) sein. Die ektopische Expression
von MMR-Genen in Hefe kann nach Belieben durch eine Reihe von Verfahren
abgeschwächt
oder vollständig
eliminiert werden, einschließlich,
aber nicht eingeschränkt auf
die Entfernung des spezifischen chemischen Induktors aus dem Medium
(beispielsweise Abreichern von Galactose, die die Expression des
GAL10-Promotors in Saccharomyces cerevisiae antreibt, oder Methanol, welches
die Expression des AOX1-Promotors in Pichia pastoris antreibt),
extrachromosomal replizierende Plasmide, die vom Expressionsplasmid "ausgehärtet" werden können durch
Anzucht der Zellen unter nicht-selektiven Bedingungen (beispielsweise
können
YEp13 enthaltende Zellen in der Anwesenheit von Leucin vermehrt
werden) und Zellen, bei denen Gene in das Genom integriert sind,
können
mit Chemikalien gezüchtet werden,
die den eingefügten
Locus dazu bringen, "auszuloopen" (beispielsweise
können
Integranten, die URA3 besitzen, auf den Verlust des insertierten
Gens durch das Wachstum von Integranten auf 5-Fluororotsäure selektiert
werden (J. D. Boeke, F. LaCroute und G. R. Fink. Mol. Gen. Genet.
197: 345-346, 1984)). Unabhängig
davon, ob durch Entzug von Induktor oder Behandlung von Hefezellen mit
Chemikalien, führt
die Entfernung der MMR-Expression zur Wiederherstellung einer genetisch
stabilen Hefezelllinie. Danach ermöglicht das Fehlen der mutierten
MMR, dass die endogene Wildtyp-MMR-Aktivität in der Wirtszelle DNA normal
repariert. Die neu erzeugten mutierten Hefestämme, die neue selektierte Output
Traits aufweisen, eignen sich für einen
weiten Bereich an kommerziellen Verfahren oder für die Gen/Protein-Entdeckung
zur Identifikation neuer Biomoleküle, die an der Erzeugung eines
bestimmten Output Traits beteiligt sind. Es wurde zwar dokumentiert, dass
die MMR-Defizienz zu einem sogar 1000fachen Anstieg der endogenen
DNA-Mutationsrate eines Wirts führen
kann, jedoch gibt es keine Gewährleistung,
dass die MMR-Defizienz allein ausreicht, jedes Gen in der DNA des
Wirtsbakteriums zu verändern,
damit veränderte
Biochemikalien mit neuer bzw. neuen Aktivitäten erhalten werden. Daher
kann die Verwendung chemischer Mutagene und ihrer jeweiligen Analoga,
wie Ethidiumbromid, EMS, MNNG, MNU, Tamoxifen, 8-Hydroxyguanin,
sowie anderen, wie sie gelehrt werden in: Khromov-Borisov, N. N., et.
al. (Mutat. Res. 430: 55-74, 1999); Ohe, T., et. al. (Mutat. Res.
429: 189-199, 1999); Hour, T. C. et. al. (Food Chem. Toxicol. 37:
569-579, 1999);
Hrelia, P., et. al. (Chem. Biol. Interact. 118: 99-111, 1999); Garganta,
F., et. al. (Environ. Mol. Mutagen. 33: 75-85, 1999); Ukawa-Ishikawa
S., et. al. (Mutat. Res. 412: 99-107, 1998); www.ehs.utah.edu/ohh/mutagens,
etc. zur weiteren Steigerung des Spektrums an Mutationen und zur
Steigerung der Wahrscheinlichkeit der Gewinnung von Veränderungen
in einem oder mehreren Genen verwendet werden, die wiederum Wirtshefe
mit einem oder mehreren gewünschten
Output Traits erzeugen. Die Mismatch-Reparaturdefizienz führt zu Wirten
mit einer gesteigerten Beständigkeit
gegenüber
der Toxizität
durch Chemikalien mit DNA-schädigender
Aktivität.
Dieses Merkmal ermöglicht
die Erzeugung zusätzlicher
genetisch diverser Wirte, wenn Mismatch-defiziente Hefe solchen
Mitteln ausgesetzt wird, was ansonsten aufgrund der toxischen Wirkungen
solcher chemischen Mutagene unmöglich
wäre [Colella,
G., et. al. (Br. J. Cancer 80: 338-343, 1999); Moreland, N. J., et. al.
(Cancer Res. 59: 2102-2106, 1999); Humbert, O., et. al. (Carcinogenesis
20: 205-214, 1999); Glaab, W. E., et. al. (Mutat. Res. 398: 197-207,
1998)]. Darüber
hinaus ist die Mismatch-Reparatur für die Reparatur chemisch induzierter
DNA-Addukte verantwortlich, so dass die Blockierung dieses Verfahrens
theoretisch die Zahl, Typen, Mutationsrate und genomische Veränderungen
einer Hefe 1 steigern kann [Rasmussen, L. J. et. al. (Carcinogenesis
17: 2085-2088, 1996); Sledziewska Gojska, E., et. al. (Mutat. Res.
383: 31-37, 1997); und Janion, C. et. al. (Mutat. Res. 210: 15-22,
1989)]. Neben den oben aufgeführten
Chemikalien können
andere Typen von DNA-Mutagenen ionisierende Strahlung einschließen, und
UV-Strahlung, die bekanntlich DNA- Mutagenese in Hefe auslöst, kann
auch zur potentiellen Steigerung dieses Prozesses verwendet werden
(Lee CC, Lin HK, Lin JK. 1994. A reverse mutagenicity assay for alkylating
agents based on a point mutation in the beta-lactamase gene at the
active site serine codon. Mutagenesis 9: 401-405; Vidal A, Abril
N, Pueyo C. 1995. DNA repair by Ogt alkyltransferase influences
EMS mutational specificity. Carcinogenesis 16:817-821). Diese Mittel,
die für
Wirtszellen extrem toxisch sind und daher zu einer Abnahme der tatsächlichen
Poolgröße veränderter
Hefezellen führen,
werden in MMR-defizienten Wirten stärker toleriert und ermöglichen
somit ein angereichertes Spektrum und einen Grad der genomischen Mutagenese.
-
Die
vorstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein.
Ein vollständigeres
Verständnis
lässt sich
anhand der folgenden spezifischen Beispiele erhalten, die hier lediglich
zu Veranschaulichungszwecken gegeben sind, und die den Schutzbereich
der Erfindung keinesfalls einschränken sollen.
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1: Erzeugung
von induzierbaren MMR-dominant negativen Allelvektoren und Hefezellen,
die die Expressionsvektoren enthalten.
-
Hefeexpressionskonstrukte
wurden hergestellt, um zu bestimmen, ob das humane PMS2-verwandte Gen
(hPMSR2) (Nicolaides et al. Genomics 30 (2): 195-206) und das humane
PMS 134-Gen (Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW, Vogelstein
B 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer a dominant
negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18: 1635-1641) die Hefe-MMR-Aktivität inaktivieren
können und
damit die Gesamt-Frequenz der genomischen Hypermutation steigern
können,
deren Folge die Erzeugung varianter Verwandten-Zellen mit neuen
Output Traits nach der Wirtsselektion ist. Für diese Untersuchungen wurde
ein Plasmid, das die hPMS134-cDNA codiert, durch eine Polymerasekettenreaktion
(PCR) verändert.
Das 5'-Oligonukleotid
hat die folgende Struktur: 5'-ACG
CAT ATG GAG CGA GCT GAG AGC TCG AGT-3', das die NdeI-Restriktionsstelle CAT
ATG enthält.
Das 3'-Oligonukleotid
hat die folgende Struktur: 5'-GAA
TTC TTA TCA CGT AGA ATC GAG ACC GAG GAG AGG GTT AGG GAT AGG CTT
ACC AGT TCC AAC CTT CGC CGA TGC-3', das eine EcoRI-Stelle GAA TTC und
das 14 Aminosäureepitop
für den
V5 Antikörper
enthält.
Die Oligonukleotide wurden für
die PCR unter Standardbedingungen verwendet, welche umfassten: 25
PCR-Zyklen (95°C
für 1 Minute,
55°C für 1 Minute,
72°C für 1,5 Minuten
für 25
Zyklen, gefolgt von 3 Minuten bei 72°C). Das PCR-Fragment wurde durch
Gelelektrophorese gereinigt und in pTA2.1 (Invitrogen) durch Standard-Klonierungsverfahren
kloniert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
3. Auflage, 2001), so dass das Plasmid pTA2.1-hPMS134 erzeugt wurde.
pTA2.1-hPMS134 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, so
dass das Insert freigelassen wurde, das in die EcoRI-Restriktionsstelle
von pPIC3.5K (Invitrogen) kloniert wurde. Die folgende Strategie,
die der obigen ähnelt,
zur Klonierung von humanem PMS134, wurde zur Konstruktion eines
Expressionsvektors für
das humane verwandte Gen PMSR2 verwendet. Zuerst wurde das hPMSR2-Fragment
durch PCR amplifiziert, so dass zwei Restriktionsstellen eingebracht
wurden, und zwar eine NdeI-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine Eco
RI-Stelle am 3'-Ende
des Fragmentes. Das 5'-Oligonukleotid,
das für
die PCR verwendet wurde, hatte die folgende Struktur: 5'-ACG CAT ATG TGT
CCT TGG CGG CCT AGA-3',
das die NdeI-Restriktionsstelle
CAT ATG enthält.
Das für
die PCR verwendete 3'-Oligonukleotid
hatte die folgende Struktur: 5'-GAA
TTC TTA TTA CGT AGA ATC GAG ACC GAG GAG AGG GTT AGG GAT AGG CTT
ACC CAT GTG TGA TGT TTC AGA GCT-3', das eine EcoRI-Stelle GAA TTC und
das V5-Epitop zur Ermöglichung
der Antikörper-Erfassung
enthielt. Das Plasmid, das humanes PMSR3 in pBluescript SK enthielt
(Nicolaides et al. Genomics 30 (2): 195-206,1995) wurde als PCR-Ziel
mit den vorstehenden hPMS2-spezifischen
Oligonukleotiden verwendet. Nach 25 PCR-Zyklen (95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute,
72°C für 1,5 Minuten
für 25
Zyklen, gefolgt von 3 Minuten bei 72°C) wurde das PCR-Fragment durch
Gelelektrophorese gereinigt und in pTA2.1 (Invitrogen) durch Standard-Klonierungsverfahren
kloniert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Dritte Auflage, 2001), so dass das Plasmid pTA2.1-hR2 erzeugt wurde.
pTA2.1-hR2 wurde anschließend
mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten, so dass das Insert freigesetzt
wurde (es gibt zwei EcoRI-Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle
von pTA2.1, die das Insert flankieren), und dann in den Hefe-Expressionsvektor
pPIC3.5K (Invitrogen) eingeführt wurde.
-
Pichia
pastoris-Hefezellen wurden mit dem pPIC3.5K-Vektor, pPIC3.5K-pms134
und pPIC3.5K-hR2 wie folgt transformiert. Zuerst wurden 5 ml YPD
(1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 1% Dextrose)-Medium mit einer
einzelnen. Kolonie von einer YPD-Platte (wie die YPD-Flüssigkeit,
aber mit 2% Difco-Agar pro Platte) angeimpft und unter Schütteln über Nacht
bei 30°C
inkubiert. Die Übernachtkultur
wurde zum Animpfen von 500 ml YPD-Medium (200 μl Übernachtkultur) verwendet,
und die Kultur bei 30°C
inkubiert, bis die optische Dichte bei 600 nm 1,3 bis 1,5 erreichte.
Die Zellen wurden dann abzentrifugiert (4000 × g für 10 min), und dann 2 × in sterilem
Wasser (ein Volumen jedes Mal) ewaschen, dann wurden die Zellen
in 20 ml 1M Sorbit suspendiert. Die Sorbit/Zell-Suspension wurde
abzentrifugiert (4000 × g
für 10
min) und in 1 ml 1M Sorbit suspendiert. 80 μl der Zellsuspension wurde mit
5 bis 10 μg linearisierter
Plasmid-DNA gemischt und in einer 0,2 cm Küvette untergebracht, Pulslänge 5 bis
10 msec bei einer Feldstärke
von 7500 V/cm. Anschließend
wurden die Zellen in 1 ml 1 M Sorbit verdünnt und in ein 15 ml Röhrchen überführt und
für 1 bis
2 Std. ohne Schütteln
bei 30°C inkubiert.
Anschließend
wurden die Zellen abzentrifugiert (4000 × g für 10 min) und in 100 μl sterilem
Wasser suspendiert, und 50 μl/Platte
wurden auf der geeigneten Selektionsmediumplatte ausgestrichen.
Die Platten wurden 2 bis 3 Tage bei 30°C inkubiert und Kolonien zur
weiteren Untersuchung auf YPD-Platten überführt.
-
BEISPIEL 2: Erzeugung
von hypermutierbarer Hefe mit induzierbaren dominant negativen Allelen
der Mismatch-Reparaturgene.
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Hefe-Klone,
die humanes PMS2-Homolog PMS-R2 oder leeren Vektor exprimieren,
wurden in BMG (100 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 6,0, 1,34% YNB (Hefe-Stickstoff-Base),
4 × 10–5%
Biotin, 1% Glycerin) Flüssigkultur
für 24
Std. bei 30°C
gezüchtet.
Anderntags wurden die Kulturen 1:100 in MM-Medium (1,34% YNB, 4 × 10–5%
Biotin, 0,5% Methanol) verdünnt
und unter Schütteln
bei 30°C
inkubiert. Die Zellen wurden zur Mutantenselektion 24 und 48 Std.
nach der Methanol-Induktion
wie nachstehend beschrieben (siehe Beispiel 3) entfernt.
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BEISPIEL 3: Dominant negative
MMR-Gene können
neue genetische Varianten und kommerziell lebensfähige Output
Traits in Hefe produzieren.
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Die
Fähigkeit
zur Expression der MMR-Gene in Hefe, wie in Beispiel 2 dargestellt,
zeigt die Fähigkeit zur
Erzeugung der genetischen Veränderungen
und neuer Phänotypen
in Hefe, die dominant negative MMR-Gene exprimieren. In diesem Beispiel
lehren wir den Nutzen dieses Verfahrens zur Erzeugung von Eukaryontenstämmen mit
kommerziell relevanten Output Traits.
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HERSTELLUNG EINES URACILABHÄNGIGEN HEFESTAMMES
-
Ein
Beispiel des Nutzens ist die Erzeugung eines Hefestammes, der in
Bezug auf ein bestimmtes Stoffwechselprodukt, wie eine Aminosäure oder
ein Nukleotid, mutiert ist. Die gentechnische Veränderung
eines solchen Hefestammes ermöglicht
die rekombinante Manipulation des Hefestammes für die Einbringung der Gene
für ein
skalierbares Verfahren zur Rekombinantenproduktion. Es wurde gezeigt,
dass MMR in Hefe zur Erzeugung von Mutanten manipuliert werden kann,
denen die Fähigkeit
zur Produktion spezifischer Molekülbausteine fehlt, indem das
folgende Experiment durchgeführt
wurde. Hefezellen, die ein methanolinduzierbares humanes PMS2-Homolog
exprimieren, d.h. hPMS2-R2 (wie in Beispiel 1 oben beschrieben)
wurden über
Nacht in BMY-Medium gezüchtet,
dann 1:100 verdünnt
und in MM-Medium überführt, was
zur Aktivierung des AOX-Promotors und zur Produktion des hPM5-R2-MMR-Gens führt, das
sich in der Hefezelle befindet. Kontrollzellen wurden auf die gleiche
Weise behandelt; diese Zellen enthalten den pPIC3.5-Vektor in Hefe
und haben kein Insert. Die Zellen wurden 24 und 48 Std. inkubiert
und dann auf uracilabhängige
Mutationen wie folgt selektiert. Die Zellen wurden auf 5-FOA-Medium plattiert
(Boeke, J. D., LaCroute, F., und Fink, G. R. Mol. Gen. Genet. 197:
345-345, 1984). Die Platten wurden folgendermaßen hergestellt: (2X Konzentrat
(steril filtriert); Hefe-Stickstoff-Base 7 g; 5-Fluororotsäure 1 g;
Uracil 50 mg; Glucose 20 g; Wasser auf 500 ml; Zugeben zu 500 ml
4% Agar (autoklaviert) und Gießen
von Platten. Die Zellen werden auf 5-FOA-Platten plattiert (0, 24 und
48 Std. Zeitpunkte) und 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Die Daten aus einem
typischen Experiment sind in der Tabelle 1 gezeigt. Es wurden keine
uracilabhängigen
Klone in der nicht induzierten oder induzierten Kultur in Hefezellen
beobachtet, die den "leeren" Vektor enthalten,
wohingegen solche Zellen, die das MMR-Gen hPMS2-R2 enthalten, Klone
besitzen, die auf dem Selektionsmedium wachsen können. Man beachte, dass die
nicht-induzierte Kultur von hPMS2-R2 keine Kolonien aufweist, die
gegen 5-FOA resistent sind, was zeigt, dass das Gen induziert werden
muss, damit der neue Phänotyp
erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass die Mutagene (wie Ethylmethylsulfonat)
zu einer niedrigen Zahl von ura-Mutanten führen und dass die spontane
Mutationsrate zur Erzeugung dieser Klasse von Mutanten niedrig ist
(Boeke, J. D., LaCroute, F. and Fink, G. R. Mol. Gen. Genet. 197:
345-346, 1984).
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Tabelle
1: Erzeugung von uracilabhängigen
Pichia pastoris-Hefezellen. # veranschaulicht eine 24 Std. Methanol-Induktion
und @ eine 48 Std. Induktion. Zum Vergleich ist eine Wildtyp-Hefezelle,
behandelt/unbehandelt, gezeigt (Galli, A. und Schiestl, R.H. Mutat.
Res. 429(1): 13-26, 1999).
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ERZEUGUNG VON WÄRMEBESTÄNDIGEN PRODUZENTENSTÄMMEN
-
Ein
Beispiel für
einen kommerziellen Nutzen ist die Erzeugung der wärmeresistenten
Rekombinantprotein-Produzentenstämme.
Bei einem skalierbaren Verfahren der Rekombinantenherstellung führt eine
Fermentation im Großmaßstab von
Prokaryonten und Eukaryonten zur Erzeugung von übermäßiger Wärme in der Kultur. Diese Wärme muss
durch physikalische Maßnahmen
abgeführt
werden, wie die Verwendung von Kühlmänteln, die
die Kultur umgeben, während
sie aktiv wächst
und das Produkt erzeugt. Die Produktion eines Hefestammes, der einem
Hochtemperaturwachstum effizient widerstehen kann, ist vorteilhaft
für die
Rekombinantenherstellungsverfahren im Großmaßstab. Zu diesem Zweck kann
der Hefestamm, wie beschrieben in Beispiel 2 in der Anwesenheit
von Methanol gezüchtet
werden, so dass das dominant negative MMR-Gen induziert wird, und
die Zellen für
verschiedene Zeiten (beispielsweise 12, 24, 36 und 48 Std.) gezüchtet werden, dann
plattiert werden und bei erhöhten
Temperaturen inkubiert werden, so dass auf Mutanten selektiert wird, die
einem Hochtemperaturwachstum (beispielsweise 37°C oder 42°C) widerstehen. Diese Stämme eignen sich
für die
Fermentationsentwicklung und die Vergrößerung von Verfahren und sollte
zu einer Abnahme der Herstellungskosten führen, da man die Fermentation
seltener kühlen
muss.
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ERZEUGUNG VON HOCHREKOMBINANTEN
PROTEINPRODUZENTENSTÄMMEN
UND STÄMMEN
MIT WENIGER ENDOGENER PROTEASEAKTIVITÄT
-
Hefe
ist ein wertvoller Rekombinanten-Herstellerorganismus, da sie ein
einzelliger Organismus ist, der billig zu züchten ist und der sich leicht
zur Fermentation im Maßstab
anbietet. Darüber
hinaus falten sich viele eukaryontische Proteine, die sich bei Expression
in Escherichia coli-Systemen nicht effizient falten können, mit der
richtigen Konformation in Hefe und sind strukturell identisch zu
ihren Säugetier-Gegenstücken. Es
gibt verschiedene innere Einschränkungen
für viele
Proteine, die in Hefe exprimiert werden, einschließlich Über- und/oder
unzureichende Glykosylierung des rekombinanten Proteins, Proteolyse
durch endogene Hefeenzyme und unzureichende Sekretion von rekombinantem
Protein aus dem Inneren der Hefezelle zum Medium (was die Reinigung
erleichtert). Zur Erzeugung von Hefezellen mit dieser Fähigkeit
zur Übersekretion
von Proteinen oder mit geringerer endogener Proteaseaktivität und/oder
mit geringerer Hyperglykosylierungsaktivität können Hefezellen, wie in Beispiel
1 beschrieben, mit Methanol für
12, 24, 36 und 48 Std. gezüchtet
werden und Hefezellen, selektiert auf die Fähigkeit zur Übersekretion
des interessierenden Proteins, unterglykosylieren es oder eine Zelle
mit abgeschwächter
oder ohne Proteaseaktivität.
Ein solcher Stamm eignet sich zur Rekombinanten-Herstellung oder
anderen kommerziellen Zwecken und kann mit dem oben beschriebenen
wärmeresistenten
Stamm kombiniert werden. Es entsteht beispielsweise eine mutierte
Hefezelle, die gegenüber Hochtemperaturwachstum
resistent ist und die große
Mengen Protein in das Medium sezernieren kann.
-
Ähnliche
Ergebnisse wurden mit anderen dominant negativen Mutanten, wie PMSR2,
PMSR3 und den humanen MLH1-Proteinen beobachtet.
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BEISPIEL 4: Mutationen,
die im Wirtsgenom von Hefe durch defekte MMR erzeugt wurden, sind
genetisch stabil.
-
Wie
in Beispiel 3 beschrieben führt
die Manipulation des MMR-Wegs in Hefe zu Veränderungen in dem Wirtsgenom
und der Fähigkeit
zur Selektion auf neue Output Traits, beispielsweise der Fähigkeit
einer Hefezelle zur Benutzung eines spezifischen Nährstoffs.
Es ist wichtig, dass die durch den MMR-Weg eingebrachten Mutationen
genetisch stabil sind und auf die Tochterzellen verteilt werden,
sobald der Wildtyp-MMR-Weg wiederhergestellt ist. Zur Bestimmung
der genetischen Stabilität
von Mutationen, die in das Hefegenom eingebracht werden, wurde das
folgende Experiment durchgeführt.
Fünf unabhängige Kolonien
von pPIC3.5K-hPMS2-R2, die ura– sind, 5 Wildtyp-Kontrollzellen
(URA+) und 5 pPIC3.5K-transformierte Zellen ("leerer Vektor") wurden über Nacht
von einer isolierten Kolonie in 5 ml YPD (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton und
1% Dextrose) bei 30°C
unter Schütteln
gezüchtet.
Das YPD-Medium enthält
sämtliche
Nährstoffe,
die nötig
sind, damit eine Hefe wächst,
einschließlich
Uracil. Anschließend
wurde 1 μl
der Übernachtkultur,
die eine optische Dichte (OD) hatte, wie gemessen bei 600 nM > 3, 0, auf eine OD600 von 0, 01 in YPD verdünnt, und die Kultur unter Schütteln bei
30°C für weitere
24 Std. inkubiert. Dieses Verfahren wurde 3 weitere Male für insgesamt
5 Über-Nacht-Inkubationen
wiederholt. Dies ist das Äquivalent
von mehr als 100 Generationen von Verdopplungen (von der anfänglichen
Kolonie auf der Platte zum Ende der letzten Über-Nacht-Inkubation. Zellen
(5 unabhängige
Kolonien, die ura– sind und 5 Wildtypen)
wurden dann auf YPD-Platten bei einer Zelldichte von 300 bis 1000
Zellen/Platte plattiert, und für
zwei Tage bei 30°C
inkubiert. Die Zellen von diesen Platten wurden auf die folgenden
Platten replikaplattiert und auf das Wachstum nach drei Tagen Inkubation
bei 30°C bewertet;
Synthetic Complete (SC) SC-ura (1,34 Hefe-Stickstoff-Base und Ammoniumsulfat;
4 × 10–5%
Biotin; angereichert mit allen Aminosäuren; KEIN zusätzliches
Uracil; 2% Dextrose und 2% Agar); SC + URA (genauso wie SC-ura,
aber angereichert mit 50 mg Uracil/Liter Medium) und YPD-Platten.
Sie wurden in der folgenden Reihenfolge replikaplattiert. SC-ura,
SC-Complete, YPD. Ist das neue Output Trait, das sich im Hefegenom
befindet, das durch Expression des mutierten MMR erzeugt wurde (in
diesem Beispiel das humane Homolog von PMS2, hPMS2-R2) instabil,
sollten die uracilabhängigen
Zellen einen uracil-unabhängigen
Phänotyp
zurück "revertieren". Ist der Phänotyp stabil,
sollte das Wachstum der mutierten Zellen unter nichtselektiven Bedingungen
zu Hefezellen führen,
die ihre Lebensfähigkeitsabhängigkeit
auf die exogene Anreicherung mit Uracil aufrechterhalten. Wie aus
den in der Tabelle 2 gezeigten Daten ersichtlich, ist der uracilabhängige Phänotyp stabil,
wenn die Hefezellen unter nichtselektiven Bedingungen gezüchtet werden,
was zeigt, dass der MMR-erzeugte Phänotyp, der von dieser Mutation
in einem der Uracil-Biosyntheseweggene hergeleitet ist, genetisch stabil
ist.
-
-
Diese
Daten zeigen den Nutzen des Einsatzes eines induzierbaren Expressionssystems
und eines dominant negativen MMR-Gens in einem Eukaryontensystem
zur Erzeugung genetisch veränderter
Stämme. Der
in diesem Beispiel entwickelte Stamm, ein Hefestamm, der nun die
Zugabe von Uracil für
das Wachstum benötigt,
ist als Stamm für
die Rekombinantenherstellung potentiell geeignet; durch Konstruktion
eines Expressionsvektors, der das Wildtyp-URA3-Gen auf einem Integrationsplasmid
oder einem extrachromosomalen Vektor trägt, kann man nun Transformieren
und neue Zellen erzeugen, die das interessierende Protein exprimieren.
Man kann auch andere innewohnende Zellen in Hefezellen modifizieren
und auf Mutationen in Genen selektieren, die andere nützliche
Phänotypen
ergeben, wie die Fähigkeit
zur Durchführung
einer neuen Biotransformation. Man kann auch ein Gen extrachromosomal
in einer Hefezelle exprimieren, die eine veränderte MMR-Aktivität besitzt,
wie oben beschrieben, und auf Mutationen im extrachromosomalen Gen
selektieren. Daher kann die Hefezellmutante auf ähnliche Weise wie oben beschrieben
unter einen spezifischen selektiven Druck gestellt werden und ein
neues Protein mit kommerziell wichtigen biochemischen Merkmalen
selektiert werden. Diese Beispiele sind lediglich als Veranschaulichungen.
aufzufassen und sollen den erfindungsgemäßen Schutzbereich keinesfalls
einschränken.
Sobald eine Mutation in das interessierende Gen eingebracht wurde,
wird schließlich
wie oben beschrieben die MMR-Aktivität geschwächt oder vollständig ausgeschaltet. Das
Ergebnis ist eine Hefezelle, die eine stabile Mutation in dem oder
den interessierenden Zielgenen enthält.
-
BEISPIEL 5: Verstärkte Erzeugung
von MMR-Defizienter Hefe und chemische Mutagene zur Erzeugung neuer Output
Traits.
-
Es
wurde vorher dokumentiert, dass die MMR-Defizienz eine erhöhte Mutationsfrequenz
und eine erhöhte
Beständigkeit
gegenüber
toxischen Auswirkungen chemischer Mutagene (CM) und ihren jeweiligen Analoga
ergibt, wie beispielsweise, aber nicht eingeschränkt auf solche, wie Ethidiumbromid,
EMS, MNNG, MNU, Tamoxifen, 8-Hydroxyguanin, sowie andere, die in
folgenden Veröffentlichungen
aufgelistet sind, aber nicht auf diese eingeschränkt sind: Khromov-Borisov,
N. N., et. al. Mutat. Res. 430: 55-74, 1999; Ohe, T., et. al. (Mutat.
Res. 429: 189-199, 1999; Hour, T. C. et. al. Food Chem. Toxicol.
37: 569-579, 1999; Hrelia, P., et. al. Chem. Biol. Interact. 118:
99-111, 1999; Garganta, F., et. al. Environ. Mol. Mutagen. 33: 75-85,
1999; Ukawa-Ishikawa S., et. al. Mutat. Res. 412: 99-107, 1998;
www.ehs.utah.edu/ohh/mutagens; Marcelino LA, Andre PC, Khrapko K,
Coller HA, Griffith J, Thilly WG. Chemically induced mutations in
mitochondrial DNA of human cells: mutational spectrum of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. Cancer Res
1998 Jul 1; 58 (13): 2857-62; Koi M, Umar A, Chauhan DP, Cherian
SP, Carethers JM, Kunkel TA, Boland CR. Human chromosome 3 corrects
mismatch repair deficiency and microsatellite instability and reduces
N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
tolerance in colon tumor cells with homozygous hMLHI mutation. Can
res 1994 54: 4308-4312, 1994. Die Mismatchreparatur provoziert Chromosomenaberrationen
in Hamsterzellen, die mit Methylierungsmitteln oder 6-Thioguanin,
aber nicht mit Ethylierungsmitteln, behandelt wurden. Die Fähigkeit
der CMs, die Mutationshäufigkeit
in MMR-defizienten
Hefezellen zu steigern, wurde gezeigt, indem vorhergesagt wurde,
dass die Einwirkung der CMs auf Hefezellen in der Anwesenheit oder
Abwesenheit von Methanol (das die Expression des ansässigen humanen
Homologs zu PMS2, hPMS2-R2
induziert) zu einer Zunahme von Mutationen in der Hefezelle führt.
-
Hefezellen,
die hPMS2-R2 (induziert oder nicht-induziert) und leere Vektorkontrollzellen
exprimieren, werden (wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben)
für 24
Std. gezüchtet,
und in MM-Medium wie oben beschrieben verdünnt. Anschließend wurden
die Zellen in MM mit oder ohne steigende Menge an Ethylmethansulfonat
(EMS) von 0, 1, 10, 50, 100, und 200 μM inkubiert. 10 μl Aliquote
der Kultur (verdünnt
in 300 μl
MM) und inkubiert für
30 min, 60 min und 120 min, gefolgt von Plattieren der Zellen auf
5-FOA-Platten, wie in Beispiel 3 oben beschrieben. Die Mutanten
werden wie oben selektiert und bewertet. Wir sagen voraus, dass
die Frequenz der ura-Mutanten in den mit Methanol induzierten PMS2-R2-Kulturen
verglichen mit dem nicht induzierten Parental- oder Wildtyp-Stamm ansteigt. Bei
einer weiteren Ergänzung
dieses Beispiels werden Zellen, die humanes PMS2-R2 enthalten, für 24 und
48 Std. induziert und dann mit EMS mutagenisiert. Dies ermöglicht,
dass das MMR-Gen vollständig
aktiv ist und in hohen Mengen exprimiert wird, wodurch es zu einem
Anstieg der Zahl der erhaltenen ura–-Mutanten
kommt. Wir sagen voraus, dass die Anzahl der erhaltenen ura–-Mutanten
in der nicht induzierten Parentalkontrolle oder in den Wildtyp-Zellen mit "leerem Vektor" sich nicht ändern wird.
-
Dieses
Beispiel zeigt die Verwendung des Einsatzes eines regulierten dominant
negativen MMR-Systems plus chemischer Mutagene, zur Produktion der
gesteigerten Zahlen genetisch veränderter Hefestämme, die
auf neue Output Traits selektiert werden können. Dieses Verfahren eignet
sich zur Erzeugung solcher Organismen für kommerzielle Anwendungen,
wie beispielsweise, aber nicht eingeschränkt auf Rekombinantenherstellung,
Biotransformation, und veränderte
Biochemikalien mit gesteigerten Aktivitäten. Man kann auch Veränderungen
der Proteinaktivität
von ektopisch exprimierten Proteinen erhalten, die sich auf extrachromosomalen
Expressionsvektoren befinden, ähnlich
den in Beispiel 4 oben beschriebenen.
-
BEISPIEL 6: Alternative
Verfahren zur Hemmung der Hefe-MMR-Aktivität
-
Die
Hemmung der MMR-Aktivität
in einem Wirtsorganismus kann durch Einbringen eines dominant negativen
Allels wie in den vorstehenden Beispielen gezeigt erzielt werden.
Diese Anwendung lehrt auch den Einsatz der Verwendung regulierter
Systeme zur Steuerung der MMR in Hefe zur Erzeugung der genetischen Diversität und Output
Traits für
kommerzielle Anwendungen. Zusätzliche
Verfahren zur Regulation der Suppression der MMR-Aktivität eines
Wirtes sind durch Verwendung genetischer Rekombination zum Ausknocken der
Allele eines MMR-Gens in der interessierenden Zelle. Dies kann bewerkstelligt
werden durch Einsatz der homologen Rekombination, die das endogene
MMR-Gen unterbricht; 2) Blockieren der MMR-Protein-Dimerisierung
mit anderen Untereinheiten (die für die Aktivität erforderlich
ist) durch Einbringen von Polypeptiden oder Antikörpern in
den Wirt durch Transfektionsverfahren, die routinemäßig vom
Fachmann verwendet werden (beispielsweise Elektroporation); oder
3) Senken der Expression eines MMR-Gens mit Antisense-Oligonukleotiden.
-
MMR-Gene-Knockouts:
-
Wir
möchten
unterbrochene Targeting-Vektoren eines bestimmten MMR-Gens erzeugen,
und dieses in das Hefegenom mit Standardverfahren des Standes der
Technik einbringen. Hefe, die Hypermutabilität aufweist, eignet sich zur
Produktion von genetisch verschiedenen Nachkommen für kommerzielle
Anwendungen. Hefe hat Bestätigungen
mit Northern- und biochemischen Standard-Techniken zufolge (wie in der Literaturstelle
31 beschrieben) die Expression des MMR-Gens verloren. Die MMR-Gen-Loci
können
ausgeknockt werden, Stämme
auf neue Output Traits selektiert werden und MMR durch Einbringen
eines Wildtyp-MMR-Gens wiederhergestellt werden, so dass der KO-Locus-komplementiert
wird. Andere Strategien umfassen die Verwendung von KO-Vektoren,
die einen MMR-Genlocus anzielen können, Selektieren auf Wirts-Output
Traits und dann "Spleißen" des KO-Vektors vom Genom
nach der Strangerzeugung.
-
Blockierung von Peptiden.
-
MMR-Untereinheiten
(MutS- und MutL-Proteine) wechselwirken und bilden aktive MMR-Komplexe. Die
Peptide können
die Bindung von zwei Proteinen durch kompetitive Hemmung spezifisch
hemmen. Das Einbringen von Peptiden oder Antikörpern in Zellen in konservierte
Domänen
eines bestimmten MMR-Gens zur Unterbrechung der Aktivität ist für den Fachmann
einfach. Die Hefe wird auf den Verlust der Expression der MMR-Aktivität durch
Northern- und/oder biochemische Standard-Techniken verifiziert (wie
beschrieben in Nicolaides NC, Littman SJ, Modrich P, Kinzler KW,
Vogelstein B 1998. A naturally occurring hPMS2 mutation can confer
a dominant negative mutator phenotype. Mol Cell Biol 18: 1635-1641).
Hefe, die Hypermutierbarkeit aufweist, eignet sich zur Produktion
genetisch diverser Verwandter für
kommerzielle Anwendungen.
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Diskussion
-
Die
oben erhaltenen Ergebnisse führen
zu mehreren Schlussfolgerungen. Zuerst führt die Expression von dominant
negativen MMR-Proteinen zu einem Anstieg der Mikrosatelliten-Instabilität und Hypermutierbarkeit
in Hefe. Die Hypermutierbarkeit der Hefezelle beruht auf der Hemmung
der innewohnenden biochemischen MMR-Aktivität in diesen Wirten. Dieses
Verfahren beansprucht die Verwendung der MMR-Gene und ihrer codierten
Produkte für
die Erzeugung der hypermutierbaren Hefe zur Produktion neuer Output
Traits für kommerzielle
Anwendungen.
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BEISPIELE
FÜR MMR-GENE
UND CODIERTE POLYPEPTIDE
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