DE69114500T2 - Verfahren zum absuchen einer bibliothek. - Google Patents
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Description
- Eine genomische DNS-"Bibliothek" wird durch Verdauung genomischer DNS eines speziellen Organismus mit einem geeigneten Restriktionsenzym, Verknüpfen der genomischen DNS-Fragmente mit Vektoren und Einführen der DNS-Fragment-haltigen Vektoren in eine Wirtszellpopulation erstellt. Komplementäre DNS (cDNS) ist DNS, die mit Hilfe eines Enzyms, der reversen Transkriptase, hergestellt worden ist. Diese kann einen komplementären DNS-Strang mit Hilfe eines mRNS-Strangs als Matrize synthetisieren. Eine cDNS-Bibliothek wird durch Verdau von cDNS mit einem geeigneten Restriktionsenzym, Verknüpfen der cDNS-Fragmente mit Vektoren und Einführen der cDNS-Fragment-haltigen Vektoren in eine Wirtszellpopulation hergestellt. Beispielsweise wird in Molecular doning von Sambrok, Fritsch & Maniatis, zweite Auflage, Seiten 9.5-9.6 das Erstellen einer DNS-Fragmentbibliothek durch Einführen der DNS-Fragmente als künstliche Hefechromosomen (YACs) in Hefewirtszellen beschrieben.
- Zur Herstellung einer DNS- oder cDNS-Bibliothek werden die DNS-Stücke in eine ungeordnete Ansammlung Tausender oder Millionenen Bruchstücke fragmentiert. Um eine Wirtszelle, die eine bestimmte DNS-Sequenz (z. B. einen bestimmten DNS-Klon) besitzt, zu isolieren, muß die gesamte Bibliothek abgesucht werden. Radioaktiv oder anders markierte Nucleinsäure-Sonden werden üblicherweise zum Absuchen einer DNS- oder cDNS-Bibliothek verwendet. Nudeinsäure-Sonden identifizieren eine bestimmte DNS- Sequenz durch einen in vitro Hybridisierungsvorgang zwischen der komplementären DNS-Sequenz in der Sonde und dem DNS-Klon.
- Ein bestimmter DNS-Klon, der derartig identifiziert und isoliert worden ist, kann der Sondensequenz angrenzende DNS enthalten. Ein Ende des DNS-Klons kann folglich als neue Sonde verwendet werden, um die gleiche oder eine andere DNS-Bibliothek erneut zu durchmustern, um einen zweiten DNS-Klon, der eine überlappende Sequenz mit dem ersten Klon besitzt, zu erhalten. Durch den Erhalt einer Reihe überlappender DNS-Klone kann eine physikalische Karte eines genomischen Bereichs eines Chromosoms erstellt werden. Dieses Verfahren wird als Chromosome- Walking bezeichnet, weil jeder isolierte überlappende DNS-Klon ein Schritt weiter auf dem Chromosom ist. Jeder DNS-Klon kann ebenfalls untersucht werden, um seine physikalische Beziehung zu einer zuvor kartierten genetischen Funktion zu bestimmen, und demgemäß liefert eine Reihe überlappender DNS-Klone eine physikalische Karte eines Chromosoms, die mit der Karte der genetischen Funktionen übereinstimmt.
- Chromosome-walking wird beispielsweise verwendet, um ein interessierendes Gen, wie beispielsweise von dem man vermutet, daß es eine Krankheit oder anderen Zustand bedingt, zu identifizieren und zu lokalisieren. Dies wird mit Hilfe eines DNS-Fragments durchgeführt, das einen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) zeigt, der zeigt, daß er (z. B. physikalisch auf dem gleichen Chromsomenbereich lokalisiert ist) mit einem Gen genetisch verknüpft, das eine Erkrankung, Zustand oder Phänotyp verursacht oder damit einhergeht, oder eines DNS-Segments, das einem derartigen RFLP benachbart ist, als in vitro Hybridisierungssonde, um eine DNS Bibliothek abzusuchen und größere DNS-Fragmente zu gewinnen, in denen die gesamte oder ein Teil der Sondensequenz repräsentiert ist.
- Die Zweckdienlichkeit eines beliebigen, derart iso lierten DNS-Klons ist, daß er DNS umfaßt, die der RFLP- Sequenz benachbart ist, die zunehmend näher an der Position des gesuchten Gens ist als der ursprüngliche RFLP. Um einen Schritt näher zu kommen, wird ein markiertes Molekül hergestellt, das mit einem Ende des neu isolierten DNS-Klons übereinstimmt und zum erneuten Absuchen der Bibliothek mit dem Ziel verwendet wird, DNS-Klone zu isolieren, die mit der im ersten DNS-Klon gefundenen Sequenz überlappen und die zunehmend näher an dem interessierenden Gen liegen als die Ausgangssonde oder der er ste isolierte DNS-Klon. Dieses Verfahren wird je nach Bedarf wiederholt und mit den daraus resultierenden DNS- Klonen werden genetische Untersuchungen durchgeführt, um zu abzuschätzen, ob sie näher an dem interessierenden Gen liegen. Um über eine Entfernung von 10 Millionen Basenpaaren mit Hilfe der zur Zeit verfügbaren Chromosome- walking Techniken zu wandern, können je nach verwendetem DNS-Vektor Klonierungssystem 1000 bis 20000 Schritte benötigt werden. Jede zur Verminderung des für einen einzigen "Walking-Schritt" erforderlichen Arbeitsaufwands entwickelte Anwendung oder eine Anwendung, die ein multiples gleichzeitig durchgeführtes walking erlaubt, würde von großem Vorteil sein.
- Die für die Erstellung einer vollständigen Bibliothek genomischer DNS benötigte Anzahl an DNS-Klonen wird durch die Genomgröße und der DNS-Klonierungskapazität des Vektors bestimmt, der zur Klonierung und der Verbreitung der genomischen DNS-Segmente verwendet wird. Das Erstellen und Absuchen genomischer DNS- Bibliotheken von Organismen mit großen Genomen ist arbeits- und zeitintensiv. Die Entwicklung von Vektoren mit einer Kapazität für große DNS-Klone, war bei der Reduzierung des Arbeitsaufwandes hilfreich, der beim Absuchen genomischer Bibliotheken anfällt. Dennoch bleibt das Absuchen von Bibliotheken zeitaufwendig, langsam und arbeitintensiv.
- Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung eines interessierenden DNS-Fragments (eines Ziel-DNS-Fragments) aus einer DNS Fragmentbibliothek in einer eukaryontischen Wirtszelle, die auf einer homologen Rekombination zwischen dem Ziel- DNS-Fragment und einer im zielenden Vektor vorhandenen DNS beruht, die in die DNS-Fragmentbibliothek eingeführt wird. Sie betrifft außerdem zielende Vektoren und DNS Fragmentbibliotheken, die in eukaryontischen Wirtszellen, wie hier beschrieben, erstellt werden.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um eine DNS-Fragmentbibliothek abzusuchen, die in einer eukaryontischen Wirtszelle erstellt wurde, in der eine genetische Rekombination (Informationsaustausch zwischen einer in einem Chromosom vorhandenen DNS und einer in die Wirtszelle eingeführten DNS) mit Hilfe der homobgen Rekombination stattfindet. In einer Anwendung, wo die eukaryontischen Wirtszelle Hefe ist, erfolgt die genetische Rekombination im wesentlichen ausschließlich durch homologe Rekombination. In Wirtszellen werden DNS- Fragmente in Form von künstlichen Chromosomen vermehrt, die zusätzlich zu einem DNS-Fragment-Insert alle für das Chromosom notwendigen DNS-Sequenzen umfassen, um an der Wirtszell-Replikation und mitotischen Segregation auf die gleiche Art und Weise wie die natürlich vorkommenden Wirtszellchromosomen teilzunehmen. Normalerweise kommen die künstlichen Chromosomen in einer Kopie oder einer niedrigen Kopiezahl in der Wirtszelle vor.
- Das vorliegende Verfahren benutzt einen zielenden Vektor oder Transportmittel, das: 1) eine DNS-Sequenz, die als zielende DNS bezeichnet wird, die mindestens teilweise zum Ziel-DNS-Fragment homolog ist, und ein selektierbares Markergen umfaßt, das unter geeigneten Bedingungen in Wirtszellen funktionsfähig ist und 2) in der Wirtszelle nicht replizierbar ist. Bevorzugt wird ein Doppelstrangbruch in die zielende DNS eingeführt, die im zielenden Vektor vorhanden ist, der im allgemeinen zirkulär ist, wenn er aus einem E. coli-Wirt gereinigt wird. Alternativ kann eine Lücke durch Ausführung zweier Schnitte in die zielende DNS eingeführt werden (z. B. mit einem geeignet gewählten Restriktionsenzym oder -enzymen). Der Bruch oder die Lücke, der/die den Vektor linearisiert, liefert DNS-Enden, die eine homologe Rekombination mit den künstlichen Chromosomen-Sequenzen der wirtszelle stimulieren und die Effizienz einer stabilen Transformation durch homologe Rekombination steigert.
- Der zielende Vektor wird in die DNS- Fragmentbibliothek enthaltenden Zellen eingeführt, um eine gemischte Population von Wirtszellen herzustellen, von denen einige den zielenden Vektor enthalten und einige nicht. Die resultierende Wirtszellpopulation wird unter Bedingungen gehalten, die für eine homologe Rekombination zwischen der schon in der Zelle vorhandenen DNS (z. B. vor Einführung des zielenden Vektors) und homologen Sequenzen, wie beispielsweise die in dem zielenden Vektor, geeignet sind. Anschließend wird die Zellpopulation Bedingungen ausgesetzt, die für eine Selektion der Wirtszellen geeignet sind, in denen eine homologe Rekombination stattgefunden hat. Weil der zielende Vektor nicht in der Wirtszelle replizieren kann, kann eine stabile Transformation mit dem selektierbaren Markergen nur durch eine homologe Rekombination erfolgen. Das selektierbare Markergen wird repliziert und verleiht folglich nur den Wirtszellen einen stabilen Phänotyp, in denen eine homologe Rekombination erfolgte. Die Identifizierung derartiger Wirtszellen --und folglich der Wirtszellen, die das interessierende DNS-Fragment enthalten-- erfolgt durch Kultivieren der Wirtszellpopulation unter Bedingungen (z. B. Kultivieren auf einem geeigneten Medium), in denen nur die Wirtszellen überleben können, wo eine homologe Rekombination und stabile Transformation mit replizierbaren Sequenzen stattgefunden hat. Das Wachstum der transformierten Wirtszellen ist ein Hinweis auf das Vorhandensein des Ziel-DNS-Fragments. Es werden als ein Ergebnis die ein Ziel-DNS-Fragment enthaltenden Wirtszellen von solchen Wirtszellen getrennt bzw. isoliert, die das Ziel-DNS-Fragment nicht enthalten. Das Ziel-DNS-Fragment kann mit Hilfe bekannter Techniken aus der Wirtszelle entfernt und sequenziert oder manipuliert werden (z.B. subkloniert oder kartiert).
- Alternativ kann die zielende DNS und ein zur Selektion in Hefe selektierbares Markergen in Hefewirtszellen, die die DNS-Fragmentbibliothek enthalten, durch Paarung eines Hefestammes, der die zielende DNS und das selektierbare Markergen auf einem replizierenden linearen Hefeplasmid enthält, mit die Bibliothek enthaltenden Hefewirtszellen eingeführt werden. In dieser Anwendung müssen die beiden Hefestämme gegensätzliche Paarungstypen besitzen. Die homologe Rekombination erfolgt zwischen dem linearen zielenden Plasmid und einer YAC-Bibliothek, die zur zielenden DNS homologe DNS besitzt, was zwei lineare Moleküle liefert, von denen jedes ein YAC ist. In einer Anwendung besitzt das lineare Plasmid einen negativ selektierbaren Marker, der die zielende DNS-Sequenz flankiert. Jedes der beiden Rekombinationsprodukte trägt einen der zwei negativ-selektierbaren Marker&sub1; was eine unterschiedliche Selektion der beiden Rekombinationsprodukte möglich macht. In einer weiteren Anwendung des Verfahrens, in der Hefestämme mit gegensätzlichem Paarungstyp verwendet werden, wird ein replizierendes Hefeplasmid derart hergestellt, daß die zielende DNS und ein erstes selektierbares Markergen aus dem Hefe-Replikon durch Rekombinationsereignisse freigesetzt werden können und ein zweites selektierbares Markergen, das ein negativ selektierbares Markergen ist, zur Isolierung des Replikons selbst verwendet wird.
- Die oben beschriebenen replizierbaren Hefeplasmide können durch Transformation in Wirtszellen eingeführt werden, die YACs enthalten.
- In einer bevorzugten Anwendung wird die DNS- Fragmentbibliothek in Hefe, wie beispielsweise Saccharomyces (S.) cerevisiae oder Schizosaccharomyces (S.) pombe erstellt, in denen DNS-Fragmente in künstlichen Hefechromosomen (YAC) vorhanden sind. Jede Hefewirtszelle enthält ein oder wenige YACs, die in einer oder wenigen Kopien vorliegen. Ein YAC umfaßt zusätzlich zu dem DNS-Fragment all die DNS-Sequenzen, die ein Chromosom benötigt, um in Hefe zu replizieren, die Chromosomen auf ihre Nachkommen zu segregieren und die Chromosomenenden zu stabilisieren. In dieser Anwendung ist der verwendete zielende Vektor ein bakterielles Plasmid oder ein anderer Vektor, der in Hefe nicht repliziert und zielende DNS und ein selektierbares, in Hefe funktionsfähiges Markergen umfaßt. Der zielende Vektor, der vorzugsweise durch Einführen eines Doppelstrangbruchs innerhalb der zielenden DNS des bakteriellen Plasmids linearisiert worden ist, wird in Hefezellen eingeführt. Die resultierende gemischte Hefezellpopulation wird unter geeigneten Bedingungen gehalten, um eine homologe Rekombination zwischen der zielenden DNS und der Ziel-DNS in dem YAC stattfinden zu lassen. Anschließend werden die mit der zielenden DNS und dem selekierbaren Markergen stabil transformierten Hefezellen selektiert. Eine stabile Transformation der Hefezellen verleiht ihnen einen selektierbaren Phänotyp, wie beispielsweise eine Antibioticumresistenz oder eine nutritive Prototrophie, wie beispielsweise eine Aminosäure- oder Nucleosid-Prototrophie. Ein Wachstum der Hefezellen unter Bedingungen, die nur ein Überleben der stabil transformierten Zellen zulassen, ist ein Hinweis auf das Vorhandensein der Ziel- DNS-Sequenz. Die Ziel-DNS kann aus der Hefezelle entfernt werden und mit Hilfe bekannter Techniken sequenziert oder manipuliert werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls für das vorliegende Verfahren zweckdienliche Vektoren. Vektoren umfassen zielende Vektoren, die im allgemeinen bakterielle Plasmide sind, die nicht in Hefe replizieren, und umfassen zielende DNS und ein in Hefe funktionsfähiges selektierbares Markergen. Sie können ebenfalls einen bakteriellen Replikationsursprung und ein Markergen zur Selektion in Bakterien umfassen. YAC Arm-Vektoren, die in der vorliegenden Verfahren zweckdienlich sind, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Diese umfassen ein in Hefe selektierbares Markergen, einen bakteriellen Replikationsursprung, ein selektierbares bakterielles Markergen, ein Hefe-Telomer und eine oder mehrere Klonierungsstellen, in die die zielende DNS eingeführt oder in den Vektor inseriert wird. Zusätzlich können YAC Arm-Vektoren Hefe-Centromer-Sequenzen und einen Hefe-Replikationsursprung umfassen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eukaryontische Wirtszellen, insbesondere Hefezellen, die wie hier beschrieben konstruiert werden und zweckdienlich für die Erstellung von YAC-Bibliotheken sind, aus denen mit dem beanspruchten Verfahren ein interessierendes DNS- Fragment identifiziert und isoliert werden kann. Zusätz lich betrifft die vorliegende Erfindung DNS-Fragmentbibliotheken, insbesondere YAC-Bibliotheken, die in derartigen eukarontischen Wirtszellen erstellt werden.
- Das Verfahren, die zielenden Vektoren, YAC Vektoren und DNS-Fragmentbibliotheken der vorliegenden Erfindung sind zur Identifizierung und Isolierung eines Ziel-DNS- Fragments zweckdienlich, das eine genomische DNS oder cDNS sein kann und ein vollständiges Gen, ein Genab schnitt oder eine andere DNS-Sequenz sein kann. Die DNS in den DNS-Fragmentbibliotheken, die mit diesem Verfahren abgesucht werden, kann beliebiger Art sein, wie beispielsweise DNS aus Säugetieren (insbesondere Menschen), Pflanzen, Insekten, Vögeln, Fischen, Crustaceen, Mollusken, Viren und Protozoen. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um ein Gen, das mit einer bestimmten Krankheit oder Konditionierung assoziert ist, verwandte Gene innnerhalb eines Organismen-Genoms und cDNS zu identifizieren und zu isolieren.
- Ferner können, wie hier beschrieben, physikalisch benachbarte DNS-Sequenzen in einer YAC-Bibliothek in Hefezellen (oder einer anderen DNS-Fragment Bibliothek) identifiziert und zum Erstellen einer physikalischen Chromosomen-Karte verwendet werden. Das heißt, die vor liegende Erfindung ist für ein Chromosome-Walking zweckdienlich. In dieser Anwendung wird zuerst ein YAC, das ein Ziel-DNS-Fragment enthält, mit Hilfe des beanspruchten Verfahrens, das auf der homologen Rekombination beruht und hier beschrieben ist, isoliert und ein Ende des Fragments wird subkloniert. In vielen Fällen werden beide Enden subkloniert, um die korrekte Richtung des weiteren Wanderns zu bestimmen. Das Ende des ersten Ziel-DNS- Fragments wird dann als die zielende DNS verwendet, die in dem zielenden Vektor vorhanden ist, der in die YAC- Bibliothek eingeführt wird. Ein zweites Ziel-YAC wird isoliert, das als einen Teil das Ziel-DNS Fragment besitzt, das teilweise die erste Ziel-DNS in der Sequenz überlappt. Das zweite Ende wird subkloniert und als zielende DNS in einem zielenden Vektor verwendet, der in die YAC Bibiliothek eingeführt wird. Dies führt zur Isolierung eines dritten YAC, das ein Ziel-DNS-Fragment enthält, das teilweise die Sequenz des zweiten Ziel-DNS Fragments überlappt. Dieser Prozeß führt zur Isolierung einer Reihe von YACs, die teilweise überlappende Ziel- DNS-Fragmente enthalten, und kann so häufig wiederholt werden, wie es zur Erstellung der gewünschten physikalischen Karte benötigt wird. Das Chromosome-Walking kann mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit Hilfe einer DNS durchgeführt werden, die einen Restriktions- Längenpolymorphismus (oder RFLP) zeigt als Ziel-DNS in dem zielenden Vektor, um eine YAC-Bibliothek abzusuchen. Ein Ende der so isolierten Ziel-DNS wird subkloniert oder isoliert und die resultierende Sequenz wird zur Isolierung eines benachbarten DNS-Fragments verwendet. Dies wird so oft wiederholt, wie es für die Erstellung der physikalische Karte erforderlich ist und noch besser, um ein gewünschtes Gen, mit dem beispielsweise der RFLP assoziert ist, zu erreichen.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung besitzt zahlreiche Vorteile gegenüber anderen Methoden zum Absuchen von DNS-Bibliotheken. Zum Beispiel ist es möglich, eine DNS-Fragment Bibliothek mehrmals gleichzeitig abzusuchen. Die Bibliotheken werden als Klonpool aufbewahrt und folglich entfällt die Arbeit, eine auf vielen Membranfiltern verteilte Bibliothek aufzubauen und abzu suchen. Die für das Absuchen einer Bibliothek benötigte Zeit verringert sich erheblich im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.
- Abbildung 1 zeigt die Identifizierung von Ziel-DNS- Fragmenten in einer YAC-Bibliothek durch das homologe Rekombinationsselektionsverfahren der vorliegenden Erfindung. Das YAC umfaßt Telomere (Pfeilspitzen), Centromere/Hefe-Replikationsursprünge (schwarze Kreise) und ein DNS-Fragment; beim Klon Nr. 3 ist innerhalb des DNS-Fragments ein Ziel-DNS-Fragment (schwarzes Rechteck).
- Abbildung 2 zeigt das Zielen (homologe reziproke Rekombination) zur Herstellung eines YAC, das für eine Selektion markiert ist.
- Abbildung 3 zeigt die Selektion durch homologe Rekombination eines DNS-Klons aus einer YAC-Bibliothek mit Hilfe der Ein-Schritt-Genzerstörung.
- Abbildung 4 ist eine Karte des Plasmids p184DLARG. B: BamHI; Sm: SmaI; P: PstI; ARG4: Hefe ARG4 Gen (der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung an); Cm: Chloramphenicol-Resistenzgen; ORI (pACYC184): Replikationsursprung von pACYC184; --------: hypothetische Ziel- Sequenz, die in die Klonierungsstelle inseriert wird.
- Abbildung 5 ist ein Restriktionsenzym- und eine Southern-Blot-Analyse der Klone, die durch Zielen mit menschlichen epsilon- und beta-Globin-Sequenzen ausgewählt werden.
- Abbildung 6 ist DNS aus acht Kolonien, die durch Absuchen mit Fragment 8A isoliert wurden. Spur 1-4: Klone 8A.1, 8A.2, 8A.3 und 8A.4; Spur 5: Plasmid p184-8A. Spur 6-7: Klone 8A.5 und 8A.6; Spur 8: ein Beispiel für eine DNS, die aus einer Kolonie isoliert wurde, die keine lineare Einheitslängen-Bande zeigt; Spur 9: Klon 8A.11. 1 Mikrogramm Hefe-Gesamt-DNS wurde in den Spuren 1-4 und 5- 9 aufgetragen. 2 Nanogramm Plasmid p184-8A wurde in Spur 5 aufgetragen. Die elektrophoretisch aufgetrennten DNS- Proben (alle mit KpnI verdaut) wurden auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer ³²P-markierten ARG4 DNS- Sonde hybridisiert. Der Pfeil markiert die Position der linearen Einheitslängen-Bande bei 8,3 kb.
- Abbildung 7 zeigt DNS von jedem der positiven Klone, die mit XhoI und entweder mit KpnI (die durch Absuchen mit Fragment 8A isoliert wurden) oder AvaI (die durch Absuchen mit Fragment 10B isoliert wurden) verdaut wurden. Die Proben wurden auf einem 1%igem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, auf einen Nylonfilter transferiert und mit ³²P-markiertem pBR322 (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) hybridisiert. Spur 1-7: Klone 8A.1, 8A.2, 8A.3, 8A.4, 8A.5, 8A.6, 8A.11 (alle durch Absuchen mit Fragment 8A isoliert); Spur 8- 10: Klone 10B.6, 10B.29, 10B.41 (durch Absuchen mit Fragment 10B isoliert).
- Abbildung 8 zeigt die YAC DNS-Analyse auf Anwesenheit von linearen Einheits-Fragmenten, die an die ARG4 DNS-Sonde hybridisieren: Spur 1: EcoNI Verdau von Plasmid p184DLARG/PCRF.5, das das 852 Basenpaar PstI-Fragment aus den menschlichen ADA Locus Klonen in der PstI-Schnittstelle von 184DLARG enthält. 1 Nanogramm des verdauten Plasmids wurde geladen; Spur 2-3: nichts (keine Proben geladen); Spur 4-6: EcoNI verdaute YAC DNS (ungefähr 1 Mikrogramm) aus den Tranformationskandidaten 184ADA.B, 184ADA.C und 184ADA.D. Die elektrophoretisch aufgetrennten Proben wurden auf eine Nylonmembran transferiert und mit einem ³²P-markierten ARG4 DNS-Fragment hybridisiert. Der Pfeil zeigt die Position des mit EcoNI linearisierten Plasmids p184DLARG/PCF.5 (5,2 kb).
- Abbildung 9 ist eine schematische Darstellung einer Anwendung des vorliegenden homologen Rekombinationsverfahrens, wo ein Ziel-DNS enthaltendes YAC durch Rekombination mit einem linearen Hefe-Plasmid identifiziert wird.
- Die folgenden Hinterlegungen wurden bei der American Type Culture Collection (28. Juni 1990) unter den angegebenen Hinterlegunsnummern gemacht. Diese Hinterlegungen entsprachen den Bedingungen des Budapester Vertrags.
- 1. Saccharomyces cerevisiae Stamm TD7-16d, ATCC Nr. 74010.
- 2. Plasmid p184DLARG, ATCC Nr. 40832.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung des Anmelders, daß das Verfahren der homologen Rekombination, die in eukaryontischen Zellen stattfindet, zum Absuchen einer in eukaryontischen Zellen erstellten DNS- Fragmentbibliothek und zur Identifizierung und Isolierung eines interessierenden DNS-Fragments, das als Ziel-DNS- Fragment bezeichnet wird, verwendet werden kann.
- Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung eines interessierenden DNS-Fragments, als Ziel-DNS-Fragment bezeichnet, aus einer in einem eukaryontischen Wirt erstellten DNS-Bibliothek, in dem eine genetische Rekombination durch homologe Rekombination erfolgt. Das Ziel-DNS-Fragment liegt im allgemeinen in einem größeren Fragment, das in der eukaryontische Wirtzelle enthalten ist. Die zur Herstellung der DNS- Bibliotheken verwendete DNS kann eine cDNS oder genomische DNS sein, die menschlichen oder anderen Ursprungs ist. Ein Ziel-DNS-Fragment wird mit dem vorliegenden Verfahren durch Einführen eines nicht replizierenden zielenden Transportmittels, das die zielende DNS und ein geeignetes selektierbares Markergen enthält, in die DNS Fragment Bibliothek und durch Identifizierung eukaryontischer Wirtszellen, in denen eine homologe Rekombination zwischen der Ziel-DNS und zielender DNS erfolgt, identifiziert. Eine homologe Rekombination führt zu einer stabilen Integration der zielenden DNS und des selektier baren Markergens in die DNS der Wirtszellen, deren Identifizierung auf einem selektierbaren Phänotyp beruht, der als ein Ergebnis der stabilen Transformation der Wirtszellen mit dem selektierbaren Markergen übertragen wird. Beispielsweise werden sie aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, unter Bedingungen (z. B. in Anwesenheit einer Substanz oder in Abwesenheit eines essentiellen Nährstoffs) zu wachsen, die mit einem Wachstum der Wirtzellen, in denen eine stabile Integration nicht stattgefunden hat, nicht vereinbar sind.
- Die in dem vorliegenden Verfahren verwendete DNS- Bibliothek ist eine Population eukaryontischer Wirtszellen, wie beispielsweise Hefezellen, die eine Einheit enthalten, wie beispielsweise ein künstliches Chromosom, das ein DNS-Fragment-Insert umfaßt und in den Wirtszellen repliziert wird. Die DNS-Bibliothek wird auf ein oder mehrere DNS-Fragment-Inserts durchmustert, die in dem künstlichen Chromosom vorhanden sind, wobei das gesamte oder ein Teil des künstlichen Chromosoms ein Ziel-DNS- Fragment ist, durch Einführen eines zielenden Transportmittels in die eukaryontischen Wirtzellen, wie beispielsweise ein bakterielles Plasmid, das in den eukaryontischen Wirtszellen nicht replizierbar ist und eine zielende DNS-Sequenz (z.B. eine DNS-Sequenz, die zumindest teilweise zu der Ziel-DNS homolog ist) und ein selektierbares Markergen umfaßt, das für eine Selektion der Wirtszellen nutzbar ist. Die das zielende Transportmittel enthaltenden Wirtszellen werden unter geeigneten Bedin gungen für eine zu erfolgende homologe Rekombination zwischen der zielenden DNS-Sequenz und der Ziel-DNS kultiviert. Mit dem selektierbaren Marker stabil transformierte Wirtszellen werden anschließend identifiziert (z. B. durch Identifizierung der Wirtszellen, die in der Lage sind unter Bedingungen zu wachsen, unter denen nicht stabil transformierte Zellen nicht wachsen können und sterben> .
- In einer spezifischen Anwendung der vorliegenden Erfindung, die in den folgenden Beispielen veranschaulicht wird, ist die DNS-Bibliothek eine Hefezellpopulation, die künstliche Chromosomen enthält, die ein DNS-Fragment-Insert tragen, und die Ziel-DNS enthaltenden Wirtszellen werden aus dieser YAC-Vektor Bibliothek identifiziert und isoliert.
- Ein zielendes Transportmittel, wie beispielsweise ein bakterielles Plasmid, das in Hefe nicht replizierbar ist, wird in eine Population der Hefewirtszellen eingeführt, die die YAC-Bibliothek enthalten. Das bakterielle Plasmid umfaßt eine zielende DNS-Sequenz, die zumindest teilweise zur interessierenden Ziel-DNS homolog ist, und ein in Hefe funktionsfähiges selektierbares Markergen. Vorzugsweise wird das zielende Plasmid mit einer Restriktionsendonuklease innerhalb der zielenden DNS- Sequenz geschnitten, wodurch ein Doppelstrangbruch innerhalb der zielenden DNS-Sequenz eingeführt wird, wodurch das rekombinante bakterielle Plasmid linearisiert wird und rekombinogene DNS-Enden bereitstellt, um den Prozeß der homologen Rekombination mit den YAC-Sequenzen zu stimulieren. Als ein Resultat erhöht sich die Effizienz der homologen Rekombination. Weil das Plasmid in Hefe nicht replizierbar ist, kann eine stabile Transformation mit dem selektierbaren Marker nur durch eine homologe Rekombination erlangt werden.
- Die resultierende Hefewirtszellpopulation, die stabil transformierte Hefewirtszellen (z. B. solche, in denen das Plasmid, einschließlich des selektierbaren Markergens, durch homologe Rekombination in die schon vor der Einführung des zielenden Transportmittels in den Wirtszellen vorhandene DNS stabil integriert worden ist) und nicht stabil transformierte Hefewirtszellen umfaßt, wird unter Bedingungen kultiviert, so daß nur stabil transformierte Hefezellen wachsen können. Bei einem kor rekt gezielten Ereignis wird das gesamte Plasmid durch eine homologe Rekombination zwischen der zielenden DNS- Sequenz des Plasmids und homologen Sequenzen (z. B. Ziel- DNS-Fragmente) in dem YAC in die Hefewirtszellen stabil eingebaut. In anderen Anwendungen, wenn beispielsweise ein lineares zielendes Plasmid verwendet wird, ist es allerdings nicht notwendig, daß das gesamte Plasmid stabil eingebaut wird, solange eine homologe Rekombination in einem hinreichenden Ausmaß stattfindet, um ein selektierbares Markergen in eine in Wirtszellen schon vorhandene DNS, wie beispielsweise in ein YAC, einzuführen. Nur diese wenigen Hefezellen, die Zielfragment(e) enthalten und bei denen deshalb eine homologe Rekombination mit dem zielenden Plasmid stattgefunden hat, sind aufgrund der Einführung eines in Hefe selektierbaren Markergens, das auf dem Plasmid vorhanden ist, fähig unter den angewandten Bedingungen zu wachsen (z. B. in einem Antibioticumhaltigen Medium oder einem Medium, dem ein für die nichtstabil transformierten Zellen essentieller Nährstoff fehlt> . Sie werden aufgrund des selektierbaren Phänotyps identifiziert, der durch die stabile Transformation des selektierbaren Markergens übertragen wurde.
- Um homologe Rekombinationsereignisse zwischen dem im Plasmid enthaltenen selektierbaren Hefe-Markergen und homologen Sequenzen in den Hefewirtszellen zu verhindern, ist es besser, die Wirtszellsequenzen, die zu den zielenden Vektor-Sequenzen homolog sind, zu entfernen oder meist vollständig aus dem Genom des Hefewirtsstamms zu entfernen, bevor er für die YAC-Vektor-Bibliothek verwendet wird. Alternativ können Wirtszellsequenzen, die zu einem Hefe-selektierbaren Markergen auf dem eintreffenden zielenden Plasmid homolog sind, als ein mutierter, nicht funktionsfähiger Teil des Hefechromosoms verbleiben. Bei dieser Anwendung müssen jedoch mehr positive Klone auf eine homologe Rekombination durchmustert werden, um sicher zu stellen, daß die erfolgten homologen Rekom binationsereignisse zwischen der zielenden DNS-Sequenz auf dem bakteriellen Plasmid und der auf dem YAC vorhandenen Ziel-DNS-Sequenz stattfanden.
- Abbildung 1 stellt schematisch die Isolierung der Ziel-DNS-Fragmente aus einer YAC-Vektor-Bibliothek mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung dar. Das ganz links dargestellte zielende Plasmid wird in eine Hefezellpopulation (als Ovale dargestellt) eingeführt, wobei jede Population ein DNS-YAC mit einem unterschiedlichen DNS-Fragment enthält. Das Plasmid umfaßt ein selek tierbares Markergen zur Selektion in Hefe (schräg schraffierter Bereich) und ein zielendes DNS-Fragment, (schwarzes Kästchen) in das ein Doppelstrangbruch eingeführt worden ist. In diesem Beispiel enthält eine Hefewirtszelle (#3) ein DNS-Fragment in einem YAC, das zu einer auf dem zielenden Plasmid (schwarzes Kästchen in Klon #3) vorhandenen Sequenz homolog ist. Eine Rekombination zwischen diesen beiden Sequenzen erfolgt, was zu einer stabilen Integration des auf dem Plasmid vorhandenen selektierbaren Markers in das Hefechromosom (YAC) führt. Die resultierende Zellpopulation läßt man unter Bedingungen wachsen, die für eine Selektion der mit dem selektierbaren Markergen stabil transformierten Hefewirtszellen geeignet sind. Zum Beispiel werden sie auf einem geeigneten Selektionsmedium, beispielweise einem Mangelmedium, ausplattiert. Nur die Zellen wachsen, in denen der selektierbare Marker funktionsfähig ist. Ein Zellwachstum unter diesen Bedingungen zeigt das Vorhandensein eines Ziel-DNS-Fragments an. Obwohl hier YACs als Beispiel dienen, können andere Hefe-Vektoren, wie beispielsweise YCp Vektoren (YCp50, YCp19), zur Konstruktion einer DNS-Bibliothek verwendet werden.
- Das allgemeine Schema zur Selektion eines Ziel DNS Fragments aus einer DNS YAC-Bibliothek wird in Abbildung 2 gezeigt. Abbildung 2 zeigt die Integration eines zielenden Plasmids (p184DLARG), das einen selektierbaren Marker (das Hefe ARG4 Gen; weißes Kästchen) und einen DNS-Abschnitt, der zu einer Sequenz in der DNS-YAC- Bibliothek homolog ist, (zielende DNS; dicke Linien auf dem Plasmid), trägt. Die dünnen Linien stellen ein Insert einer menschlichen oder anderen (nicht Hefe) DNS dar, die wie ein künstliches Hefechromosom (YAC) vermehrt wird. Das schwarze Kästchen ist das Ziel DNS-Fragment, eine DNS-Sequenz, die ein Teil der YAC-DNS ist, die in einem in der Bibliothek gefundenen DNS-Klon vorhanden ist und homolog zu der zielenden Sequenz ist. Die verbliebenen Teile der YAC-DNS bestehen aus den YAC-Vektor-Armen: die dicken Linien stellen die Plasmid-Vektor-Sequenzen zur Replikation und Selektion in Bakterien dar. Die schattierten Kästchen stellen die zur Selektion in Hefe verwendeten genetischen Marker (Hefe selektierbare Marker URA3 und TRP1) dar. Die schwarzen Pfeile und Kreise stellen die Telomere (TEL) und ein Centromer/beziehungsweise den Hefe-Replikationsursprung (CEN/ARS) dar. Abbildung 2a zeigt die zielende DNS (im zielenden Vektor vorhanden), die sich an das Ziel-DNS-Fragment in dem YAC anlagert. Abbildung 2b zeigt das Produkt der homologen Rekombination zwischen der zielenden DNS und dem Ziel-DNS-Fragment. Das zielende Plasmid ist einmal in der zielenden DNS an der Stelle, auf die der vertikale Pfeil in der Ziel-Sequenz zeigt, geschnitten worden. ULL zeigt das lineare Einheitslängen-Restriktionsfragment, das sich aus der Duplikation der Ziel-Sequenz (und der Restriktionsschnittstelle) auf dem YAC ergibt. Wie in Beispiel 1 beschrieben, kann ein ULL nur gebildet werden, wenn eine Integration in eine DNS-Sequenz stattfindet, die die fragliche Restriktionsenzymschnittstelle und eine hinreichende Homologie im Bereich der Schnittstelle besitzt, um eine Neusynthese (durch Reparatur) der Restriktionsenzymschnittstelle auf dem zielenden Plasmid zu ermöglichen. In Frage kommende Klonkandidaten, die einen ULL zeigen, werden als homologe Rekombinationsereignisse erachtet und weiter analysiert.
- In einer anderen Anwendung dieses Verfahrens kann ein in Hefe selektierbares Markergen auf dem einzuführenden zielenden DNS-Molekül ein bakterielles Gen sein, das zur Expression in Hefe konstruiert wurde und der Hefe eine Resistenz, z. B. das CAT oder neo Gene aus TN9 und TN903, oder bakterielle Aminosäure- oder Nukleosid- Prototrophie Gene (z. B. E. coli argH, trpC und pyrF Gene) überträgt.
- In einer weiteren Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist der zielende Vektor ein lineares DNS-Fragment, das eine zielende DNS-Sequenz umfaßt, die homolog zu einem zu identifizierenden und/oder aus der YAC Bibliothek zu isolierenden Ziel-DNS-Fragment ist. In dieser Anwendung wird ein selektierbares Markergen in die zielende DNS eingefügt, um eine zielende DNS-Sequenz herzustellen, die zwei nicht benachbarte Bereiche umfaßt. Diese Anwendung wird genauer in Beispiel II beschrieben und ist in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Der zielende Vektor, der eine lineare in Hefe nicht-replizierbare Sequenz ist, wird in die gepoolte DNS-YAC- Bibliothek, wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert. Eine homologe Rekombination erfolgt zwischen der zielenden DNS und dem Ziel-DNS-Fragment.
- Zusätzlich zu der oben beschriebenen Anwendung können andere Verfahren zur Einführung zielender DNS in Wirtszellen verwendet werden. Zum Beispiel kann eine zielende DNS, die auf einem linearen replizierenden Hefe- Plasmid vorhanden ist (Murray, A.W. und Szostak, J.W., Nature 305:189-193 (1983)), in einem Hefestamm mit einem zum Wirtsstamm gegensätzlichen Paarungstyp für die Bibliothek verwendet werden. Das lineare Plasmid besitzt die zielende DNS-Sequenz flankierende selekierbare Marker (z. B. einer an jedem Ende der zielenden DNS); wobei beide Marker sich von den bei der Herstellung der YAC-Bibliothek verwendeten unterscheiden und gegenselektiert werden können (z. B. negative selektierbare Marker, wie beispielsweise LYS2, URA3 oder CYH2). Eine homologe Rekombination zwischen zwei linearen Molekülen bildet zwei lineare Moleküle, wo jedes ein Hybrid der beiden elterlichen Moleküle ist. In dieser Anwendung, wo eine Rekombination zwischen dem zielenden linearen Plasmid und einem YAC der Bibliothek erfolgt, ist jedes der beiden Rekombinationsprodukte ein YAC, und jedes trägt einen oder zwei negativ selektierbare Marker, was eine differentielle Selektion der beiden Rekombinationsprodukte erlaubt.
- Die Grundlage dieser unterschiedlichen Selektion ist in Abbildung 9 dargestellt. Schwarze Kreise, Pfeilspitzen und weiße Rechtecke stellen centromere, telomere beziehungsweise Markergen-Sequenzen dar. Die schattierten Kästchen stellen zielende oder Ziel-Sequenzen dar. URA3&spplus;- Zellen können durch Wachstum auf einem Nukleosid-Analogon, 5-Fluorotsäure (5FOA), haltigen Medium gegenselektiert werden (getötet), während LYS2&spplus;-Zellen durch Wachstum auf einem Aminosäure-Analogon, alpha-Aminoadipinsäure (αaa), haltigen Medium gegenselektiert werden. Molekül 1 ist ein Ziel-YAC, das in einem Vektorsystem mit Hilfe von ARG4 und TRP1 als selektier bare Marker (Phänotyp arg&spplus; trp&spplus; 5FOAR αaaR) konstruiert wird. Molekül 2 ist ein lineares zielendes Plasmid, in dem die zielende Sequenz von URA3 und LYS2 flankiert ist (Phänotyp arg&supmin; trp&supmin; 5FOAS αaaS). Der Phänotyp der Zellen, die Molekül 1 und 2 nicht-rekombiniert enthalten, ist arg&spplus; trp&spplus; 5FOAS αaaS. Die Moleküle 3 und 4 sind Produkte der Rekombination zwischen Molekül 1 und 2, die sich aus einem "cross-over" zwischen der zielenden und Ziel- Sequenz ergeben. Der Phänotyp von Molekül 3 ist arg&spplus; trp&supmin; 5FOAR αaaS und kann durch Wachstum auf 5FOA Argininmangel-Platten selektiert werden. Der Phänotyp von Molekül 4 ist arg&supmin; trp&spplus; 5FOAS αaaR und kann durch Wachstum auf αaa Tryptophanmangel-Platten selektiert werden. Folglich enthalten die Zellen ein oder beide nichtrekombinante Moleküle, ebenso können Zellen, die eines der Rekombinationsprodukte enthalten, unterschiedlich selektiert werden (die Zellen enthalten das eine oder andere Rekombinationsprodukt in Folge eines zufälligen Verlustereignisses).
- In einem derartigen System werden die Hefezellen, die die zielenden lineare Plasmide enthalten, mit der gesamten Bibliothek gepaart und unter Bedingungen gehalten, die für eine spontane oder induzierte homologe Rekombination (beispielsweise durch Meiose oder UV-Bestrahlung induziert) vorteilhaft sind. Rekombinante Ziel-YACs werden auf Grund der eindeutigen Phänotypen der Rekombinantionsprodukte selektiert, die aus der homologen Rekombination zwischen der zielenden Sequenz auf dem linearen Plasmid und YAC Molekülen, die eine geeignete Zielsequenz tragen, resultieren. Jedes der beiden YAC- Produkte ist an der Position der Ziel-DNS-Sequenz verkürzt, und die differentielle Selektion wird zur seperaten Isolierung der beiden Produkte eingesetzt. Um die zwei Produkte eines einzigen Ereignisses zu isolieren, werden Hefezellen, die YACs oder lineare zielende Plasmide enthalten, vorzugsweise vor der Selektion der Rekombinanten ausplattiert oder als Verdünnungsausstrich ausgestrichen. Die Selektion wird mit Hilfe der Replika- Plattierung auf geeigneten Selektivplatten ausgeführt.
- In dieser Anwendung ist die relative Orientierung der zielenden Sequenz bezüglich der beiden (negativen) selektierbaren Marker auf dem linearen zielenden Plasmid wichtig. Eine Rekombination zwischen einem Ziel-YAC und nur einer der beiden Orientierungen des linearen zielenden Plasmids führt zu einem stabilen Rekombinanten (z. B. einem Rekombinanten mit ausschließlich einem Centromer). YAC Moleküle mit zwei Centromeren brechen häufig und zeigen nicht-stabile Phänotypen und YAC Moleküle ohne Centromer sind aufgrund des Segregationsfehlers hochgradig instabil. In einer bevorzugten Anwendung werden lineare zielende Plasmide, wo die zielende Sequenz in beiden Orientierungen vorhanden ist, hergestellt und in die Bibliothek durch getrennte Paarungen eingeführt.
- Als Alternative zur Paarung, die lineare zielende Plasmide in eine Bibliothek einführt, können lineare zielende Plasmide in YACs enthaltende Wirtszellen durch Transformation eingeführt werden, wie es im wesentlichen in Beispiel I beschrieben ist.
- In einer weiteren Anwendung kann ein in Hefe replizierendes Plasmid, das eine zielende Sequenz trägt, so hergestellt werden, daß die zielende DNS und ein selektierbarer Marker (SM1) aus dem Hefe-Replikon durch ein natürliches oder induziertes Rekombinationsereignis freigesetzt wird, so daß das Replikon selbst aufgrund eines negativen selektierbaren Markers (SM2), wie beispielsweise URA3, LYS2 oder CYH2, gegenselektiert werden kann. Beispiele für induzierbare Rekombinationssysteme, die zu diesem Zweck hergestellt werden können, sind der flp vermittelte Rekombinationpfad des Hefe 2-Micron Plasmids und das cre-lox Rekombinationssystem des Bakteriophagen P1. Das Plasmid wird in einen Hefestamm eingeführt, der den gegensätzlichen Paarungstyp zu dem Wirtstamm besitzt, der für die Bibliothek verwendet wurde. Nach Paarung mit der gesamten YAC-Bibliothek werden die zielenden DNS-Sequenz und der selektierbare Marker als nicht-replizierende Moleküle freigesetzt, und der selektierbare Marker kann nur durch eine homologe Rekombination mit einem YAC, das eine geeignete Ziel-DNS-Sequenz besitzt, stabilisiert werden. Die gezielten Rekombinanten werden durch Ausplattieren auf einem Medium selektiert, das für SM1 selektiv und für SM2 gegenselektiv ist.
- Als Alternative zur Paarung, die das im vorangegangenen Abschnitt beschriebene Plasmid einführt, kann das Plasmid durch Transformation, wie es im wesentlichen in Beispiel I beschrieben ist, eingeführt werden, gefolgt von einem Induktionsschritt, um das zielende Substrat aus dem Hefe-Replikon freizusetzen.
- Die oben beschriebenen Anwendungen des vorliegenden Verfahrens sind zur Identifizierung und Isolierung eines beliebigen Ziel-DNS-Fragments, das ein vollständiges Gen, ein Genabschnitt oder eine andere Nucleotidsequenz sein kann, zweckdienlich. Beispielsweise kann ein interessierendes Gen, wie beispielsweise ein β-Globin-Gen oder ein Adenosindeaminase-Gen, in einer DNS-Fragmentbibliothek mit Hilfe des beanspruchten Verfahrens identifiziert und, falls man es wünscht, aus den Wirtszellen mit Hilfe bekannter Verfahren isoliert werden. Eine Identifizierung der Ziel-DNS-Fragmente durch das vorliegende Verfahren wird in den Beispielen I, III und IV genauer beschrieben.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung, durch das ein Ziel-DNS-Fragment aus einer DNS-Bibliothek isoliert wird, ist für eine Isolierung physikalisch benachbarter DNS-Fragmente aus einer YAC-DNS-Bibliothek zum Erstellen einer physikalischen Chromosomen-Karte zweckdienlich. Das heißt, wenn es jedesmal mit einer aus einem YAC stammenden zielenden DNS, die mit einem zuvor identifizierten Bereich überlappt und sich über diesen hinaus erstreckt, wiederholt angewendet wird, ist es ein Verfahren zum Chromosome Walking. In dem vorliegenden Chromosome Walking-Verfahren wird ein in einem YAC vorliegendes Ziel-DNS-Fragment, wie oben beschrieben, isoliert. Ein Ende dieses ersten YAC-Zielfragments wird in einen Plasmid-Vektor subkloniert. Das Ende des ersten DNS- Fragments wird folglich als eine zweite zielende DNS- Sequenz verwendet, die in Hefewirtszellen eingeführt wird, die eine YAC-DNS-Bibliothek enthalten. Das Ende des ersten DNS-Fragments, das der ersten Ziel-DNS-Sequenz benachbart ist, wird dann wieder die zweite zielende DNS- Sequenz. Der hier verwendete Ausdruck "benachbart" schließt Sequenzen ein, die unmittelbar an die erste Ziel-Sequenz angrenzen und auch solche, die nahe bei oder in Nachbarschaft zu der ersten Ziel-Sequenz (z. B. von der ersten Ziel-Sequenz durch ein oder mehrere dazwischen liegende Nudeotide getrennt) liegen. Diese zweite zielende DNS-Sequenz sollte keine Homologie zu der ersten zielenden DNS-Sequenz besitzen, so daß wenn sie wieder in einem YAC an der Stelle, die mit einem zweiten DNS-Klon homolog ist, eingebaut wird, der zweite selektierte DNS- Klon eine unterschiedliche terminale Sequenz besitzt. Das terminale Subfragment aus dem zweiten DNS-Klon wird zur Isolierung des nächsten (z. B. des dritten) DNS-Klons verwendet. Jeder nachfolgende DNS-Klon wird aufgrund seiner Homologie zu dem terminalen Subfragment des zuvor isolierten DNS-Klons isoliert. Eine Reihe überlappender Klone wird durch Wiederholen dieses Verfahrens erhalten; das Verfahren wird so oft wie benötigt wiederholt, um die gewünschte physikalische Karte erstellen. Das nachfolgende Wiedergewinnen der terminalen DNS-Fragmente erlaubt ein erneutes Absuchen der gleichen oder einer zweiten Bibliothek auf überlappende Klone.
- In einer Anwendung der vorliegenden Erfindung wird das Chromosome walking durchgeführt, um die chromosomale Lokation eines interessierenden Gens, wie beispielsweise ein Krankheiten verursachendes Gen, mit Hilfe eines DNS- Fragments zu bestimmen, das einen RFLP zeigt, der genetisch mit dem interessierenden Gen verknüpft ist, oder eines dem RFLP benachbarten DNS-Fragments als zielende DNS in dem zielenden Vektor. Ein zielender Vektor, wie beispielsweise ein bakterielles Plasmid, das die RFLP zeigende DNS oder ein Fragment, das benachbart zu der RFLP zeigenden DNS ist, als zielende DNS und ein selektierbares Markergen umfaßt, wird in eine menschliche YAC DNS-Bibliothek eingeführt. Eine homologe Rekombination zwischen der zielenden DNS und einem Ziel-DNS-Fragment in der Bibliothek führt zu dem ersten Schritt der Wanderung in Richtung des interessierenden Gens. Ein das Ziel-DNS- Fragment enthaltendes YAC wird so identifiziert. Ein Ende oder beide Enden des Ziel-DNS-Fragments wird als zielende DNS in einem zielenden Vektor verwendet, um die gleiche Bibliothek erneut abzusuchen oder eine zweite Bibliothek abzusuchen, wie es oben beschrieben ist. Wie es oben ebenfalls beschrieben ist, wird dies wiederholt, wobei jedesmal ein Ende des aus dem vorausgegangenen Schritt isolierten Ziel-DNS-Fragments als zielende DNS verwendet wird. Dies wird solange fortgeführt, bis das interessierende Gen identifiziert ist oder die gewünschte physikalische Karte vervollständig ist.
- Das hier beschriebene Verfahren bezieht sich hauptsächlich auf das Absuchen von in Hefezellen konstruierten YAC-DNS-Bibliotheken durch Verwendung einer in bakteriellen Plasmiden vorhandenen zielenden DNS. Es ist allerdings verständlich, daß dies nur zur Veranschaulichung gilt und daß das vorliegende Verfahren mit Hilfe anderer Wirtszelltypen durchgeführt werden kann, vorausgesetzt daß eine genetische Rekombination zwischen vektortragender DNS und schon in den Wirtszellen vorhandener DNS durch homologe Rekombination erfolgt und daß ein geeigne ter zielender Vektor verfügbar ist.
- Geeignete eukaryontische Wirtszellen schließen Zellen ein, die normalerweise (wie sie natürlicherweise vorkommen) eine genetische Rekombination im wesentlichen ausschließlich durch homologe Rekombination durchführen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe). Der hier verwendete Ausdruck "im wesentlichen ausschließlich" bedeutet, daß eine homologe Rekombination ohne signifikantes Niveau einer nicht-homologen Rekombination unter den verwendeten Bedingungen erfolgt. Eine homologe Rekombinations-Selektion von DNS-Klonen könnte als ein Selektionsverfahren in den Zellen beliebiger Organismen verwendet werden, in denen 1) ein geeignetes DNS-Klonierungssystem existiert und 2) die Zellen durch gentechnologische Verfahren oder genetische Manipulation manipuliert oder induziert werden können, um eine Rekombination, die vorwiegend auf der DNS-Sequenz-Homologie basiert, durchzuführen oder in denen die zielende DNS so behandelt werden kann, daß sie eine homologe Rekombination als den bevorzugten Rekombinationsmodus garantiert. Mit diesen entsprechenden Kriterien kann der mit rekombinanten DNS-Techniken vertraute Fachmann eine homologe Rekombinations-Selektion der DNS-Klone aus einer DNS-Bibliothek durchführen. Derartige Organismen können umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Mus musculus und Spodoptera frugiperda.
- Saccharomyces cerevisiae ist ein bevorzugter Wirtsorganismus für die Selektion der DNS-Klone mit Hilfe der homologen Rekombination, aufgrund ihrer Fähigkeit, die Doppelstrangbrüche besitzende tranformierende DNS, auf einen Rekombinationspfad zu leiten, der praktisch ausschließlich auf einer DNS-Sequenz-Homologie beruht.
- Bestimmte Merkmale der Wirtszellen, in denen DNS- Fragmentbibliotheken konstruiert werden, sollten berücksichtigt und möglicherweise modifiziert werden, um die Verwendung derartiger Zellen in dem vorliegenden Verfahren, wie beispielsweise durch Verminderung nicht gezielter Ereignisse und folglich steigender Ineffizienz des Verfahrens, zu optimieren. Wie beispielsweise unten beschrieben, könnte es notwendig sein, den in dem zielenden Vektor vorhandenen selektiven Marker aus den Hefewirtszellen zu entfernen und zielende Vektoren so zu konstruieren, daß sie keine Sequenzen aufweisen, die homolog zu den Vektor-Sequenzen sind, die bei der Vermehrung der DNS-Bibliothek verwendet wurden.
- Es ist, wie unten beschrieben, festgelegt worden, daß das(die) selektierbare(n) Markergen(e), das(die) für den zielenden Vektor ausgewählt wurde(n), normalerweise nicht in dem Hefe-Wirtsgenom vorhanden sein sollte(n) oder aus der(die) normale(n) Chromosomenposition(en) in dem Hefewirtsstamm entfernt werden sollte(n). Ohne diese Modifikation des Hefewirtstammes könnten Rekombinationsereignisse zwischen dem selektierbaren Marker und dem Hefe-Genom in einem höheren Maße erfolgen. Für annähernd vollständige (> 99%) Erfassung des menschlichen Genoms würde eine DNS-YAC-Bibliothek mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 300 kb aus ungefähr 50 000 Klonen bestehen (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Seite 271, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1982). Um Sequenzen zu isolieren, die nur einmal in einer derartigen Bibliothek vertreten sind, sollte das Verhältnis von gezielten zu nicht gezielten Ereignissen ungefähr oder größer 50.000 zu 1 sein, wobei bei diesem Verhältnis ein nicht korrekter Klon (nicht gezielter) für jeden korrekten Klon isoliert wird. In den meisten Fällen jedoch sind die Sequenzen in dieser Bibliothek 3-5 mal vertreten, und ein Verhältnis von 10.000-17 000 zu 1 würde ausreichend sein. Nicht-gezielte Ereignisse resultieren aus einer Rekombination zwischen dem zielenden Plasmid und Homologiebereichen in der Hefezelle und können durch Verringerung eines derartigen Homologieumfangs auf ein Mindestmaß herabgesetzt werden. Wie in Beispiel V beschrieben, wurde festgestellt, daß das Entfernen der chromosomalen Kopien des auf dem verwendeten Vektor vorhandenen selektierbaren Markergens wünschenswert ist, weil es das Auftreten nicht-gezielter Ereignisse vermindert. Wie in Beispiel V beschrieben, zeigen diese Ergebnisse, daß die Selektion eines gezielten Klons (Ziel-DNS-Fragments) aus einer YAC-DNS-Bibliothek durchführbar und besonders effizient in Hefewirtszellen ist, die keine Homologie zu auf dem zielenden Vektor vorhandenen selektierbaren Markern tragen.
- Nicht-gezielte Ereignisse können ebenfalls als Ergebnis einer homologen Rekombination zwischen Sequenzen auf dem zielenden Vektor, wie beispielsweise dem Replikationsursprung des bakteriellen Plasmids oder eines Substanz-Resistenzmarkers, und homologen Sequenzen auf dem YAC-Vektor-Armen, die für die Konstruktion der Bibliothek verwendet wurde, erfolgen. Diese Homologie kann auf ein Mindestmaß herabgesetzt werden durch Konstruktion eines zielenden Vektors mit Hilfe eines Substanz-Resistenzmarkers, der in dem YAC-Vektor nicht vorhanden ist, und durch Verwendung eines bakteriellen Plasmid-Replikationsursprungs, der sich von dem auf YAC- Vektor-Armen vorhandenen Replikationsursprung unterscheidet oder nicht homolog zu diesem ist. Die im Beispiel V beschriebenen Ergebnisse bestimmen eine Häufigkeit der nicht-homologen Rekombination von ungefähr 0,003 % (1 von 30.729), was mit der in dieser Anmeldung beschriebenen Erfindung übereinstimmt. Es war möglich Hefezellen, die eine Homologie zu dem zielenden Vektor besitzen, zu selektieren, selbst wenn nur 1 von 10.000 der transformierten Zellen eine derartige Homologie besitzt. Tatsächlich wurden bei diesem geringen Verhältnis gezielte Ereignisse mehrfach (vierfach) isoliert, was zeigt, daß ein Klon, der einmal in einer Bibliothek mit 40.000 Klonen vertreten ist, isoliert werden kann.
- Für das hier beschriebene Verfahren zweckdienliche zielende Vektoren sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Zielenden Vektoren der vorliegenden Erfindung besitzen zwei Schlüsselmerkmale: sie sind in den Wirtzellen, in denen die Bibliothek erstellt worden ist, nicht replizierbar und sie umfassen eine DNS- Sequenz, als zielende DNS bezeichnet, die homolog zu einem Ziel-DNS-Fragment ist, das für den Zweck der Erfindung ein DNS-Fragment ist, das den gesamten oder einen Teil des gewünschten Klons umfaßt, der in einer DNS-Bibliothek identifiziert und daraus isoliert werden soll. Zielenden Vektoren sind im allgemeinen bakterielle Plasmide der YIp Klasse, insbesondere in Fällen, wo Hefewirtszellen verwendet werden. Geeignete Vektoren für andere Wirtszelltypen können ebenfalls mit Hilfe bekannter Techniken hergestellt werden.
- Sequenzen, die als zielende DNS in dem zielenden Vektor verwendet werden, können völlig homolog zu dem Ziel-DNS-Fragment sein, obwohl dies nicht notwendig ist. Sie müssen nur hinreichend homolog sein, so daß unter den angewandten Bedingungen eine genetische Rekombination zwischen der DNS innerhalb des Vektors, der in die Zellen eingeführt wird, und der YAC-DNS in den Zellen durch den Wirtszell-Rekombinationspfad oder -prozeß erfolgt. Vorzugsweise wird ein Doppelstrangbruch in eine zielende DNS-Sequenz eingeführt. Alternativ kann eine Doppelstranglücke eingeführt werden. Die freien, zu dem Bruch oder der Lücke benachbarten Enden können modifiziert werden, um eine Rezirkularisierung zu verhindern (z. B. durch Phosphatase-Behandlung der DNS-Enden oder durch Bildung nicht komplementärer Enden mit Hilfe zweier verschiedener Restriktionsenzyme).
- Zusätzlich zur zielenden DNS umfassen die zielenden Vektoren ein in Hefe funktionsfähiges selektierbares Markergen, einen Replikationsursprung und einen in Bakterien (z. B. E. coli) funktionsfähigen selektierbaren Marker. Das selektierbare Markergen ist ein funktionsfähiges Gen (es ermöglicht die Selektion transformierter Zellen) in dem Wirtszelltyp, der für die Konstruktion der DNS-Fragmentbibliothek verwendet wurde. Die Wahl des in Hefe selektierbaren Markergens kann unter vielen verschiedenen endogenen Hefegen-Loci z. B. ARG4, LEU2, HIS3, HIS4, THR1, URA3, TRP1 LYS2, ADE2, ADE8 und MET2 getroffen werden. Alternativ kann der in Hefe selektierbare Marker ein Markergen sein, das nicht im Hefegenom endogen vorliegt, sondern ein fremdes Gen ist, das einen selek tierbaren Phänotyp überträgt, z. B. ein für die Expression in Hefe konstruiertes bakterielles Gen und den Hefezellen eine Substanz-Resistenz (wie beispielsweise das CAT oder die neo Gene aus den Transposons Tn9 beziehungsweise Tn903) verleiht oder eine Aminosäure- oder Nucleosid-Prototrophie (wie beispielsweise E. coli argH, trpC oder pyrF Gene) auf die Hefezellen überträgt. Andere zweckdienliche selektierbare Markergene umfassen Gene, die eine Metallionentoleranz übertragen (z. B. das CUP1 Gen, das eine Resistenz gegen Kupferionen verleiht), Gene, die eine Fähigkeit übertragen, den Zellzyklus in Zellen mit einem mutierten Phänotyp zu durchlaufen und Gene, die zur Expression eines Zelloberflächenmarkers führen.
- Die für eine Selektion in Bakterien geeigneten se lektierbaren Markergene umfassen die Gene, die eine Resistenz für die Antibiotica Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin, Spectinomycin, Streptomycin, Erythromycin codieren, oder einen anderen Marker, der Biosynthese- Enzyme codierende Gene aufweist, für die ein auxotropher bakterieller Wirt existiert.
- Bakterielle Replikationsursprünge können verschiedener Abstammung sein, einschließlich von p15A (als Beispiel dient der Replikationsursprung von Plasmid pACYC184), ColE1, Phagen M13, Phagen f1, Phagen Lambda oder einem anderen Replikon, das vom Fachmann als gleichwertig betrachtet wird.
- Die konstruierten und zum Absuchen der YAC-DNS- Bibliotheken verwendeten Vektoren werden genauer in Beispiel I beschrieben und in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Das zielende Plasmid p184DLARG enthält einen in Hefe funktionsfähigen selektierbaren Marker (ARG4) und einen bakteriellen Replikationsursprung (stammt von pACYC184).
- Zielende DNS-Moleküle sind nicht auf die Moleküle der Yip Klasse beschränkt. Die zielende DNS kann ein DNS- Fragment sein, das aus einem größeren Plasmid gereinigt wurde, mit einem derartigen Plasmid, das so konstuiert ist, daß die gewünschte zielende Sequenz von, unter anderen Sequenzen, einem bakteriellen oder Hefe-Replikon unterbrochen ist. Das Plasmid ist ebenfalls so konstruiert, daß beim Schneiden mit einem Restriktionsenzym, das das Replikon von dem inneren Bereich der zielenden Sequenz freisetzt, ein in Hefe selektierbarer Marker kovalent mit den äußeren beiden Enden der zielenden Sequenz verknüpft bleibt.
- Alternativ kann ein selektierbarer Marker und eine zielenden Sequenz zusammen in vitro ligiert werden und die aus einer Kopie der zielenden Sequenz und einer Kopie des selektierbaren Markers (oder Multimere, die alternierend aus zielenden und selektierbaren Markersequenzen in einer einheitlichen Orientierung bestehen) bestehenden Ligationsprodukte gereinigt werden. Diese Ligationsprodukte werden in vitro zirkularisiert und mit einem Restriktionsenzym geschnitten, um einen Doppelstrangbruch oder eine -lücke in die zielende Sequenz einzuführen, und der selektive Marker bleibt intakt.
- Schließlich können die beiden Hälften einer zielenden Sequenz an einem selektierbaren Marker in einer einzigen Dreiwege-Ligation in vitro ligiert werden, um ein für eine Transformation geeignetes zielendes Molekül zu bilden.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, beschränkt sich aber nicht hierauf.
- Falls nicht anders vermerkt, können die Verfahren für Plasmidreinigung, Restriktionsenzymverdau der Plasmid-DNS und Gelelektophorese, die Verwendung DNS modifizierender Enzyme, Ligation, Transformation von Bakterien, Transformation von Hefe mit Hilfe des Lithiumacetat-Verfahrens, Präparation und Southern-Blot- Analyse der Hefe-DNS, Tetraden-Analyse der Hefe, Herstellung flüssiger und fester Nährmedien für E. coli und Hefe sowie sämtliche molekularbiologischen und mikrobiologischen Standardtechniken im wesentlichen durchge führt werden, wie sie von Ausubel et al. (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1987) beschrieben sind.
- Das Plasmid pYAC4 (ATCC # 67380) wurde zur Konstruktion einer Bibliothek menschlicher genomischer DNS verwendet. Die menschliche DNS wurde aus weißen Blutkörperchen isoliert (D. Burke, Dissertation, Washington University, St. Louis, Mo., 1988), mit EcoRI teilverdaut und mit den mit EcoRI und BamHI verdauten pYAC4 Armen ligiert.
- Die Ligationsmischung wurde dann zur Transformation der Hefewirtsstämme, entweder MGD131-10c oder IV-16d, mit Hilfe des Sphäroplasten-Verfahrens (Burgers, P.M.J. und Percival, K.J., Analytical Biochemistry 163:391-397 (1987)) verwendet. (Die Herstellung der Wirtstämme MGD131-10c und IV-16d mit den geeigneten Marker-Deletionen wird am Schluß des Beispiels beschrieben). Da der pYAC4 Vektor die in Hefe selektierbaren Marker TRP1 und URA3 trägt, können die Transformanten durch Wachstum auf Platten, denen Tryptophan und Uracil fehlt, selektiert werden. 11.625 YACs mit einer durchschnittlichen Größe von 190 kb (0,73 human Genom-Äquivalente) werden in den Vertiefungen von 96iger Mikrotiterplatten einzeln an gezogen; 0,1 ml wurde aus jeder Vertiefung entnommen und in drei Subpools mit jeweils ca. 4000 Klonen vereint. Zu jedem Subpool wurde ein gleiches Volumen an 30%igem Glycerin gegeben und der Subpool wurde aliquotiert und bei -70 ºC eingefroren.
- Für eine Bibliothek, die 73 % eines Genoms umfaßt, und der Annahme einer gleichmäßigen Vertretung aller Klone ist die Wahrscheinlichkeit, daß sie eine beliebige spezifische menschliche DNS-Sequenz enthält knapp über 0,5. Die Wahrscheinlichkeit, daß eins von sechs verschiedenen DNS-Fragmenten in der Bibliothek vertreten ist, ist 1-(0,5)&sup6; oder 0,98.
- Die Herstellung des zielenden Plasmids p184DLARG wird unten beschrieben und in Abbildung 4 dargestellt. Es trägt das ARG4 Hefe-Gen (Beacham, I.R. et al. (1984) Gene 29:271-279) als einen selektierbaren Marker und sein bakterieller Replikationsursprung stammt vom pACYC184 (chang, A.C.Y. und Cohen, S.N. (1978) Journal of Bacteriology 134:1141-1156.), der nur eine begrenzte Sequenzhomologie zu dem in pYAC4 verwendeten pBR322 Replikationsursprung besitzt. Die gesamte chromosomale Kopie (ein 2,0 kb HpaI-DNS-Fragment) des Arg4 ist in den Bibliothekswirtsstämmen IV-16d und MGD131-10c entfernt worden. Das 2,2 kb BclI-ClaI-Fragment aus pACYC184 (chang, A.C.Y. und Cohen, S.N., (1978), Journal of Bacteriolocry 134:1141-1156), das den p15A Replikationsursprung und das Chloramphenicol-Resistenzgen enthält, wurde mit den BamHI-AccI verdauten pMLC28 ligiert (ein Derivat von pSDC12, der die pUC18 multiple Klonierungsstelle trägt; Levinson et al., J. Mol. Appl. Gen., 2:507- 517 (1984); das Plasmid pUC18 (ATCC Nr 37253 kann anstelle von pMLC28 bei der hier beschriebenen Konstruktion von p184DLARG verwendet werden). Dieses Plasmid wird von BamHI und AccI jeweils einmal im Polylinker geschnitten. Die Ligationsmischung wurde mit SacI und HindIII verdaut, die in dem pMLC28 Polylinker schneiden, und die verdaute DNS wurde mit T4-DNS-Polymerase zur Erzeugung stumpfer Enden behandelt. Die DNS wurde unter Verdünnungsbedingungen zwecks Erleichterung der Zirkularisierung ligiert, und die Ligationsmischung wurde vor der Transformation in Bakterien mit dem Restriktionsenzym AvaII behandelt (um jedes Elternmolekül zu linearisieren). Ein Plasmid, p184DL, das nur die Sequenzen, die innerhalb des größeren der zwei BclI-ClaI Fragmente von pACYC184 lagen, und eine permutierte Version eines Teils des pMLC28 Polylinkers besitzt, wurde identifiziert. Plasmid pHpa5 (von N. Schultes und J. Szostak; Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, Boston, MA 02114, erhalten) trägt als ein 2,0 kb HpaI-Fragment das ARG4 Gen, das in die HindII-Schnittstelle von pMCL12 (ein Derivat von pSDC12, das die multiple Klonierungstelle aus pUC12 besitzt) inseriert wurde. Levinson et al., J. Mol. Appl. Gen., 2:507-517 (1984). Dieses Plasmid wurde an den das ARG4 Insert flankierenden PstI- und SmaI-Schnittstellen geschnitten, und das ARG4-Fragment wurde mit PstI-SmaI geschnittenem p184DL ligiert. Ein Plasmid, das eine einzige Kopie des in der in Abbildung 4 gezeigten Orientierung inserierten ARG4-Gens trägt, wurde isoliert und als p184DLARG bezeichnet. Abbildung 4 zeigt eine Karte des Plasmids P184DLARG.
- Genomische Fragmente für Tyrosin-Hydroxylase (Chromosom 11), das Pseudogen Metallthionein II "Chromosom 4), die unbekannten DNS-Marker D16S3 und D16S37 (Chromosom 16) und ein 1,9 kb HindIII-Fragment, das 51 des epsilon-Globingens (Chromosom 11) lokalisiert wurde, wurden in p184DLARG subkloniert und für eine Selektion der Klone aus einer YAC-Bibliothek mittels Rekombination verwendet. Mit Ausnahme des Tyrosin- Hydroxylase-Genfragments wurden alle Fragmentenden durch eine T4-DNS-Polymerase-Behandlung zu stumpfen Enden und mit SmaI geschnittenen p184DLARG ligiert. Das Tyrosin- Hydroxylase-Genfragment wurde in die BamHI-Schnittstelle des p184DLARG kloniert. Ein 1,3 kb HpaI-BamHI-Fragment von dem 5' Ende des beta-Globingens (Chromosom 11) wurde mit dem gleichen 2,2 kb BclI-ClaI-Fragment blunt-end ligiert, das zur Konstruktion von p184DLARG verwendet wurde. Die beta- und epsilon-Globin-Fragmente sind 1,3 kb beziehungsweise 1,9 kb Fragmente aus dem beta-Hämoglobin Locus auf Chromosom 11. Aus dem pHU5'beta (Treco, D., et al., Mol. Cell. Biol., 5:2029-2038, 1985) wurde das beta- Globin-Fragment (ATCC #39698) subkloniert und umfaßt die Sequenzpositionen 61.338 (HpaI-Schnittstelle) bis 62.631 (BamHI-Schnittstelle) in der HUMHBB Genbank Sequenz. Dieses Fragment umfaßt das 5'Ende des menschlichen beta- Globingens. Die AvaII-Schnittstelle an der Position 62.447 der Genbankkarte wurde verwendet, um einen Doppelstrangbruch zum Zielen einzuführen, wobei an jeder Seite des Bruchs 1,1 beziehungsweise 0,18 kb Homologie verbleibt. Die 5' epsilon-Globin-Sonde (ATCC #59157) ist ein HindIII-Fragment und umfaßt Sequenzen, die ungefähr 15 kb 5' des epsilon-Globin Gens (ATCC #59157) von den Positionen 3.266 bis 5.172 in der HUMHBB Genbank Sequenz konzentriert sind. Die ApaI-Schnittstellen an den Positionen 4.361 und 4.624 in der Karte wurden verwendet, um eine 0,26 kb Doppelstranglücke zum Zielen zu bilden, wobei an jeder Seite der Lücke 1,1 beziehungsweise 0,5 kb Homologie verbleibt.
- Die Eigenschaften der verbliebenen vier genomischen DNS-Fragmente sind: Tyrosin-Hydroxylase (Chromosom 11; 2,3 kb BamHI-Fragment; ATCC #59475; Doppelstrangbruch mit Hindih durchgeführt, 0,6 kb vom Ende); Pseudogen Metallothionein (Chromosom 4; 2,8 kb HindIII-EcoRI- Fragment; ATCC #57117; Doppelstrangbruch mit NdeI durchgeführt, 0,4 kb vom Ende); unbekannter DNS-Marker D16S3 (Chromosom 16; 115 kb HindIII-Fragment; ATCC #59447; Doppelstrangbruch mit ApaI durchgeführt, 0,75 kb vom Ende); D16S37 (Chromosom 16; 2,3 kb HindIII-Fragment; ATCC #59189; Doppelstrangbruch mit ApaI durchgeführt, 0,95 kb vom Ende).
- Jedes zielende Plasmid wurde mit einem Restrik tionsenzym linearisiert, das innerhalb der menschlichen DNS (der zielenden DNS) schneidet und 20 µg der verdauten DNS wurde verwendet, um die gepoolte Bibliothek zu transformieren. Gleiche Volumina der drei Bibliotheken-Subpools wurden aufgetaut, gemischt und in ein CM -ura -trp Medium, das jeweils 40 µg/ml Kanamycin und Ampicillin enthielt, überimpft. Diese Kultur ließ man über Nacht bei ºC und kräftigem Schütteln wachsen, und erntete sie bei einer Dichte von 1,86 x 10&sup7; Zellen/ml. Die Zellen wurden mit Hilfe des Lithiumacetat-Verfahrens transformiert (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 5, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York 1987). 20 µg des innerhalb der menschlichen DNS geschnittenen Plasmids wurden verwendet, um 7 x 10&sup8; Zellen in einem Volumen von 0,2 ml zu transformieren, und der gesamte Transformationsansatz wurde auf die Oberfläche von acht Selektionsplatten (vollständiges Minimalmedium ohne Uracil, Tryptophan und Arginin) ausplattiert und bei 30 ºC 3-7 Tage inkubiert.
- Die Transformanten wurden mittels Restriktionsenzymverdau- und Southern-Hybridisierungs-Ananlyse analysiert. Aus jedem Kandidaten wurde DNS präpariert und mit dem gleichen Restriktionsenzym verdaut, das zur Linearisierung des zielenden Plasmids verwendet wurde. Der Southern Blot wurde mit einer ³²P-markierten ARG4-DNS hybridisiert. Homologe Integrationsereignisse werden durch Hybridisierung einer einzigen Bande, die exakt die gleiche Größe wie das linearisierte transformierende DNS- Molekül (die Einheitslängen-Bande (ULL); Abbildung 2) besitzt, identifiziert. Eine ULL kann nur gebildet werden, wenn eine Integration in eine DNS-Sequenz erfolgt, die die fragliche Restriktionsenzymschnittstelle enthält und eine ausreichende Homologie um diese Schnittstelle besitzt, um eine Neusynthese (durch Reparatur) der Restriktionsenzymschnittstelle auf dem zielenden Plasmid zu ermöglichen. Kandidaten, die eine ULL zeigen, werden als homologe Integrationsereignisse betrachtet und weiter analysiert. Lineare Einheitslängen wurden bei 6 der 21 analysierten epsilon-Globin Kandidaten und bei 3 der 14 beta-Globin Kandidaten beobachtet. Keine linearen Einheitslängen wurden für andere verwendete zielende Sequenzen beobachtet.
- Abbildung 5 zeigt eine Restriktionsenzym- und Southern-Blot-Ananlyse der mittels Zielen mit menschlichen epsilon- und beta-Globin Sequenzen ausgewählten Klonen. Auf der linken Seite wurde DNS aus neun als arg&spplus; selektierten Klonen mit AvaII verdaut (das zur Einführung eines Doppelstrangbruchs in die beta-Globin zielende Sequenz verwendete Enzym). Auf der rechten Seite wurde DNS aus neun als arg&spplus; selektierten Klonen mit Apal verdaut (das zur Einführung eines Doppelstrangbruchs in die epsilon-Globin zielende Sequenz verwendete Enzym). Die Sternchen markieren die Klone, die korrekt mittels homologer Rekombination ausgewählt wurden. Die mit M markierten Spuren wurden mit gereinigtem beta-Globin zielenden Plasmid, verdaut mit AvaII (linke Seite), oder gereinigtem epsilon-Globin zielenden Plasmid, verdaut mit ApaI (rechte Seite), geladen. Die Größe dieses Marker-Fragments ist mit der vorausgesagten Größe für ein korrekt gezieltes Ereignis identisch. Die Pfeilspitzen zeigen die für korrekt gezielte Ereignisse vorausgesagte Fragmentgröße von 5,6 kb auf der linken Seite und 6,2 kb auf der rechten Seite. Die Hybridisierung wurde mit ³²P- markierter ARG4 DNS durchgeführt.
- Drei der beta- und epsilon-Globin-Positiven wurden mittels CHEF-Gelelektrophorese (Chu, G., Vollrath, D., und David, R.W. Science, 234:1582-1585 (1986)) und Restriktionsenzym- und Southern-Hybridisierungs-Analysen mit epsilon- und beta-Globin-DNS als geeignete Sonden weiter untersucht. Diese Analyse zeigte, daß alle sechs YACs identisch sind und sowohl beta- als auch epsilon- Globin-DNS tragen, wie dies erwartet wurde, da diese beiden Gene nur 40 kb voneinander entfernt auf dem menschlichen Chromosom 11 liegen. In allen sechs YACs ist die ARG4-DNS in ein YAC mit 190 kb integriert worden, und die p184DLARG-Konstrukte sind, wie vorausgesagt, in die homologe DNS innerhalb des Globin-Locus integiert worden.
- Die homologe Rekombination ist erfolgreich angewen det worden, um bestimmte Gene aus einer DNS-YAC-Bibliothek zu isolieren. Die isolierten YACs enthalten den gesamten beta-Globin-Locus mit mindesten 16 kb 5' des epsilon-Gens bis zu dem beta-Globin Gen zusammen mit ca. 130 kb flankierender DNS. Nachdem die Bibliothek über 14 Monate bei -70 ºC gelagert worden war, wurde zusätzlich ein ähnliches Selektionsprotokoll mit der gleichen DNA- YAC-Bibliothek durchgeführt, was eine Isolierung von YACs aus dem β-Globin-Locus ergab. Es wurde folglich hier zum erstenmal gezeigt, daß es möglich ist, Klone aus einer menschlichen DNA-YAC-Bibliothek mittels homologer Rekombiantionsselektion zu isolieren.
- Die Herstellung eines S. cerevisiae Stamms, der chromosomale Deletionen von ARG4 (MGD131-10c) oder ARG4 und TRP1 (IV-16d) besitzt, kann wie folgt durchgeführt werden:
- Das interne 2,0 kb HpaI-Fragment, das das gesamte Strukturgen und die regulatorischen Elemente für das Argininosuccinat-Lyase-Hefegen (ARG4) trägt, wird mittels Verdau mit HpaI und Religation der DNS unter Verdünnungsbedingungen (1 µl/ml) aus einem Flasmid entfernt, das aus dem 11 kb BamHI-Fragment besteht, welches aus p(SPO13)2 (Wang, H-T., et al., Molecular and Cellular Biology, 7:1425-1435, 1987) isoliert und in die BamHI- Schnittstelle von pUC19 (ATCC #37254) inseriert wurde. Das resultierende Plasmid wird mit Barnhi verdaut und in einen S. cerevisae Stamm mit Wildtyp-Allelen für ARG4, TRP1, URA3 und Leu2 und einem beliebigen nicht revertierbaren his3&supmin; Allel eingeführt. Die Transformation wird in Verbindung mit einem beliebigen Plasmid, das Hefe CEN und ARS Elemente und das Hefe HIS3 Gen besitzt, unter Standard-co-Transformationsbedingungen durchgeführt (Ausubel et al., 1989, Kapitel 13). Ein für diesen Zweck verwendbares Plasmid kann ohne weiteres durch Subklonieren des 1,7 kb BamHI-Fragments aus PBR15 (ATCC #37062) in die BamHI-Schnittstelle von YCp50 (ATCC #37419) hergestellt werden. His&spplus; Zellen werden auf eine Arginin-Auxotrophie mittels Replika-Plattierung auf CM - Arginin Platten durchmustert. His&spplus; arg&supmin; Zellen läßt man in Abwesenheit der Selektion auf HIS3 wachsen und einzelne Kolonien werden isoliert und auf Histidin-Auxotrophie durchmustert. DNS aus his&supmin; arg&supmin; Kolonien wird hergestellt und mittels Restriktionsenzym- und Southern Blot-Analyse untersucht, um Transformanten mit einer ARG4 Deletion (arg4Δ) zu identifizieren. Dieses Protokoll wurde verwendet, um den in Beispiel 1 oben verwendeten Stamm MGD131-10c herzustellen.
- In einem Hefestamm mit einem gegensätzlichen Paarungstyp als dem oben verwendeten und mit ebenfalls mutierten Allelen für LFU2 und URA3 (leu2&supmin;, ura2&supmin;) wurde ein identisches Verfahren durchgeführt, aber es wurde ein lineares DNS-Fragment verwendet, das eine Deletion des Hefegenes für N-(5'-Phosphoribosyl)-Anthranilat-Isomerase (TRP1) besitzt. Dies wird erreicht, indem man das Bamill-XhoI-Fragment aus pBR322-Sc4120 (Stinchcomb, D.T., et al., Journal of Molecular Biology, 158:157-179, 1982) in ein BamHI-XhoI geschnittenes pGEM7 (Promega, Madison, Wisconsin) subkloniert und anschließender Deletion des 1,2 kb EcoRI-Fragments, das TRP1 und ARS1 enthält. Das resultierende Plasmid, pK2, wird mit BamHI und XhoI verdaut und mit einem HIS3-CEN-ARS Plasmid wie das oben beschriebene co-transformiert, auf Histidin-Prototrophe selektiert und entsprechend der oben grob umrissenen Strategie Zellen mit der TRP1 Deletion (trp1Δ) identifiziert. Diese Zellen werden mit den arg4Δ tragenden Zellen gepaart und für die zwei Deletionen heterozygote Diploide werden isoliert. Diesen Stamm, TD7-16d (ATCC Hinterlegungsnummer 74010; Genotyp: a/α, arg4Δ/ARG4, LEU2/leu2- 3.112, ura3-52/URA3, trp1- 289/trp1Δ, ade2-101/ade2-101, cyhS/cyhr, (CYH2/cyh2), his3Δ1/his3Δ1) läßt man sporulieren und unterzieht ihn einer Tetraden-Analyse, und Sporen mit geeignetem Phänotyp untersucht man mittels Restriktionsenzym- und Southern-Blot-Analyse, um einen Starnmm mit den arg4Δ und trp1Δ Allelen (z. B. den haploiden Stamm IV-16d) zu identifizieren.
- Das Verfahren der Ein-Schritt-Genzerstörung (Rothstein, R.J., Methods in Enzymology, 101:202-211, Academic Press, New York, 1983) kann zur Anwendung bei der Selektion mittels homologer Rekombination von Klonen aus DNS-Bibliotheken adaptiert werden. In dieser Anwendung wird ein selektierbarer Marker in die zielende Sequenz inseriert. Die zielende Sequenz mit dem eingeschlossenen selektierbaren Marker wird anschließend als ein einziges lineares Fragment isoliert (wie in Abbildung 3 graphisch dargestellt) und in eine vereinte DNS-YAC- Bibliothek, wie in Beispiel I beschrieben, transformiert. Als ein Ergebnis der homologen Rekombination zwischen dem zielenden Molekül und spezifischen DNS-Klonen innerhalb der Bibliothek entstehen korrekt gezielte Klone, die eine einzige Kopie der zielenden Sequenz besitzen, die durch die Anwesenheit des selektierbaren Markers zerstört ist, und diese wandern nach einem Restriktionsverdau- und Southern-Blot-Analyse unter Verwendung entweder von ARG4 oder der zielenden Sequenz als radioaktiv markierte Sonde an bestimmte und voraussagbare Positionen. Dies steht im Gegensatz zu dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren, in dem die korrekt gezielten DNS-Klone zwei ununterbrochene Kopien der zielenden Sequenz, die den selektierbaren Marker flankieren, besitzen.
- Abbildung 3 stellt die Selektion eines DNS-Klons aus einer DNS-YAC-Bibliothek durch homologe Rekombination mit Hilfe der Ein-Schritt-Genzerstörung dar. Die dünne Linie stellt ein DNS-Insert in Form eines künstlichen Hefechromosoms (YAC) dar. Das schwarze Kästchen ist das DNS-Fragment, eine DNS-Sequenz, die einen Teil des in der Bibliothek gefundenen DNS-YAC-Klons darstellt, die zu der zielenden Sequenz homolog ist. In dem Diagramm ist die zielende Sequenz (schwarze Kästchen) durch Insertion des ARG4 Hefe-Gens (weißes Kästchen) modifiziert worden. Die restlichen Teile des DNS-YAC bestehen aus den YAC Vektorarmen: die dicken Linien stellen die Plasmid- Sequenzen zur Replikation und Selektion in Bakterien dar.
- Die schattierten Kästchen stellen die zur Selektion in Hefe verwendeten genetischen Marker (die in Hefe selektierbaren Marker URA3 und TRP1) dar. Die schwarzen Pfeilspitzen und der schwarze Kreis stellen die Telomere (TEL) und ein Centromer/beziehungsweise den Hefe-Replikationsursprung (CEN/ARS) dar. Abbildung 3a zeigt die Anlagerung des zielenden Moleküls an die Ziel-Sequenz auf dem DNS- YAC. Abbildung 3b zeigt das Produkt der homologen Rekombination zwischen den zielenden und Ziel-Sequenzen, wobei die zielende Sequenz die Ziel-Sequenz ersetzt hat.
- Als spezifisches Beispiel dieser Anwendung des Grundgedankens wird das 1,9 kb 5' epsilon-Globin-Fragment (siehe Beispiel I) in die HindIII-Schnittstelle von pUC18 (ATCC #37253) subkloniert. Das resultierende Plasmid wird mit Apal verdaut, wobei ein 0,26 kb ApaI Fragment aus dem Zentralbereich des 5' epsilon-Globin-Inserts herausfällt. Die ApaI 3' überhänge werden mit der T4-DNS-Polymerase entfernt, und das resultierende Material wird mit dem gereinigten ARG4 2,0 kb HpaI-Fragment ligiert (Beacham, I.R., Gene, 29:271-279, 1984). Das resultierende Plasmid mit dem die 5' epsilon-Globin-Sequenz zerstörenden ARG4 wird mit HindIII verdaut und in die DNS-YAC-Bibliothek, wie in Beispiel I beschrieben, transformiert. In diesem dargestellten spezifischen Beispiel wurde 0,26 kb der 5' epsilon-Globin-DNS durch die ARG4-Sequenz ersetzt, da ApaI mehrmals in der zielenden Sequenz schneidet. Bei Enzymen, die in der zielenden Sequenz einmal schneiden, wird das Resultat jedoch eine einfache Insertion sein.
- Wir verwendeten eine Durchmusterung mittels homologer Rekombination, um einen Klon von dem bekannt war, daß er innerhalb der Bibliothek vorlag, aus der Bibliothek zu gewinnen. Da der Vektorarm, der das TRP1 Gen in den mit pYAC4 konstruierten YACs enthält, ein Plasmid Replikon und einen selektierbaren Marker (das eine Ampicillin-Resistenz verleihendes beta-Lactamase-Gen) enthält, wurde die "Plasmid-Rescue"-Technik zur Isolierung terminaler Fragmente von zwei in dem Vektor pYAC4 konstruierten YACs verwendet. Das Restriktionsenzym XhoI schneidet an einer einzigen Stelle innerhalb des TRP1 Vektorarms, nämlich an der Verbindung zwischen dem Telomer und den pBR322 Sequenzen. Ein vollständiger Verdau der YAC-DNS mit XhoI sollte ein Restriktionsfragment ohne Telomer-Sequenzen liefern, das ein funktionsfähiges Plasmid-Replikon und einen Ampr Marker besitzt und ein menschliches DNS-Segment trägt, das im ursprünglichen YAC-Klon an den Vektorarm angrenzte und sich bis zur terminalen Xhoi-Schnittstelle in dem menschlichen DNS-Insert erstreckt.
- Eine Gruppe von 161 YACs innerhalb der Bibliothek wurden unter Verwendung des Hefewirtsstammes MGD131-10c hergestellt (Genotyp a leu2-3.112 ADE2 cyh2r hisΔ1 trp1- 289 agr4Δ ura3-52). Gesamt-DNS aus zwei Klonen dieser Gruppe wurden mit XhoI verdaut, unter Verdünnungsbedingungen ligiert, um eine intramolekulare Zirkularisierung zu fördern, und in E. coli transformiert (alle Schritte wurden im wesentlichen, wie in Ausubel et al., 1988 )oben) beschrieben, durchgeführt). Aus Ampicillin resistenten Kolonien wurde die Plasmid-DNS isoliert und einer Restiktionsenzym-Analyse unterzogen. Bei einem menschlichen DNS-Fragment aus jedem der beiden geretteten Plasmide wurden anschließend mittels einer T4-DNS- Polymerase-Behandlung stumpfe Enden hergestellt und in die SmaI-Schnittstelle von p184DLARG ligiert. Die Fragmente 10B und 8A sind 1 beziehungsweise 4 kb Fragmente menschlicher DNS, die zu den TRP1 Vektorarmen benachbart in zwei verschiedenen YACs liegen. Die resultierenden Konstrukte (Plasmid p184-108 und p184-8a) wurden mit einer Reihe Restriktionsenzymen verdaut, die p184DLARG nicht schneiden, zwecks Identifizierung eines Enzyms, das innerhalb der menschlichen DNS schneidet, um ein Zielen zu fördern. 20 µg von jedem Konstrukt wurde mit dem geeigneten zielenden Enzym verdaut und für das im wesentlichen in Beispiel 1 beschriebene Absuchen der Bibliothek verwendet. Fragment 8A enhält eine einzige KpnI-Schnittstelle, die 2,8 kb von einem Ende entfernt liegt, und dieses Enzym wurde zum Einführen eines einzigen Doppelstrangbruchs innerhalb der in p184-8A inserierten Sequenz verwendet. Fragment 10B enthält eine einzige AvaI-Schnittstelle, die 0,5 kb von einem Ende entfernt liegt, und dieses Enzym wurde zum Einführen eines einzigen Doppelstrangbruchs innerhalb der in p184-10B inserierten Sequenz verwendet.
- Elf arg&spplus; Kolonien, die durch das Absuchen mit Klon 8A erhalten wurden, wurden isoliert und analysiert. Ähnlich wie Stamm IV-16d (Beispiel 1) besitzt der Stamm MGD131-10c eine das ganze ARG4 Gen umfassende 2 kb Deletion. Jedoch unterscheiden sich die beiden Stämme hinsichtlich ihres LEU2 Genotyps; IV-16d ist leu&spplus; und MGD131-10c besitzt einen leu Phänotyp. Sieben der 11 Kolonien zeigten einen leu&supmin; Phänotyp, was vermuten läßt, daß sie tatsächlich unabhängige Isolate des urprünglichen YAC, von dem Klon 8A abstammt, darstellen (mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit, da der Stamm MGD131-10c nur der Wirt von 161 der 11.625 YACs (1,4%) der Bibliothek ist). Siebzehn arg&spplus; Kolonien, die durch das Absuchen mit Klon 10B erhalten wurden, wurden isoliert und analysiert. Drei der 17 Kolonien zeigten einen leu&supmin; Phänotyp. Das Vorhandensein des leu&supmin; Markers läßt stark vermuten, daß diese Kolonien Isolate des ursprünglichen YAC von dem der Klon 10B abstammte, darstellen.
- Aus jeder der sieben leu&supmin; Kolonien, die durch Absuchen mit Klon 8A isoliert wurden, und auch aus einer der leu&spplus; Kolonien wurde DNS hergestellt. Die DNS wurde mit dem gleichen Enzym verdaut, das für die Lineansierung des transfomierenden DNS-Moleküls (KpnI) verwendet wurde. Ein Southern-Blot dieser Verdaus wurde mit einer ³²P-markierten ARG4 DNS als Sonde hergestellt. Wie in Beispiel 1 beschrieben, sollte ein homologes Integrationsereignis eine Hybridisierung an ein einziges Fragment mit exakt der gleichen Größe wie das linearisierte transformierende DNS-Molekül (in Beispiel 1 als lineares Einheitslängen-Fragment oder ULL bezeichnet) zeigen. Von den acht analysierten Klonen stellen alle sieben in Stamm MGD13L-10c (die leu&supmin; Kolonien) homologe Ereignisse dar, während der einzige analysierte leu&spplus; Transformant dies nicht war (Abbildung 6). Folglich waren sieben von elf isolierten Klonkandidaten korrekt gezielte Ereignisse. Eine ähnliche Analyse wurde mit jeder der drei mittels Absuchen mit Klon 10B isolierten leu&supmin; Kolonien durchgeführt. Alle drei Kolonien zeigten ein ULL auf der Southern Blot Analyse, während 14 leu&spplus; Transformanten dies nicht zeigten.
- Um zu bestätigen, daß die drei homologen Ereignisse, die mittels Absuchen mit Klon 10B isoliert wurden und die sieben homologen, die mittels Absuchen mit Klon 8A isoliert wurden, unabhängige Isolate des gleichen YACs darstellen, haben wir die Enden der YACs in diesen zehn Klonen kartiert. Abbildung 7 zeigt das Ergebnis dieser Analyse. Drei Banden in jeder Spur stimmen offensichtlich mit dem ULL, dem linken und dem rechten Arm des YAC überein. Die Banden in allen sieben mit 8A isolierten YACs wandern an identische Positionen und an andere aber identische Positionen in allen drei mit 10B isolierten YACs. Diese Daten zeigen, daß die Entfernung zu der nächsten KpnI-Schnittstelle in jedem Ende der sieben 8A YACs identisch ist, während die drei 10B YACs ein ähnliches Verhalten für die Positionen ihrer terminalen AvaII- Schnittstelle zeigen.
- Die synthetischen Oligonucleotide 06 und 07-2 wurden verwendet, um in einer Polymerase-Ketten-Reaktion ein 1.376 Basenpaar-Fragment des menschlichen Ada-Gens, das mit der Position 34.243-35.618 (HUMDAG Genbank Eintrag) übereinstimmt, aus einer gesamten menschlichen genomischen DNS, die aus den peripheren Blut-Leukozyten isoliert wurde, zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment wurde mit PstI verdaut, und das 852 Basenpaar-Subfragment, das mit der HUMADAG Position 34.349-35.201 übereinstimmt, wurde isoliert und in die PstI-Schnittstelle von Plasmid p184DLARG (Beispiel 1) kloniert, um p184DLARG/PCRF.5 herzustellen. Eine Insert-Orientierung wurde gewählt (wo die HUMADAG Position 34.349 benachbart zu dem 3'ende des ARG4 Hefe-Gens in p184DLARG liegt). Das resultierende Plasmid wurde gereinigt und 20 Mikrogramm wurden an der einzigen EcoNI-Schnittstelle innerhalb des menschlichen ABA-Inserts (stimmt mit der HUMADAG Position 34.657 überein) vor der Tranformation in die gepoolte YAC-Bibliothek linearisiert. Die Transformation der gepoolten YAC-Bibliothek wurde exakt, wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die YAC- Bibliothek mit 3.585 zusätzlichen Klonen aus insgesamt 15.210 Klonen bestand, die ungefähr 1,2 Genom-Aquivalente darstellen.
- Vier arg&spplus; Transformanten wurden isoliert. Drei von diesen werden in Abbildung 8 gezeigt und alle drei zeigten ein lineares Einheitslängen-Fragment auf dem Restriktionsenzym-Verdau mit EcoNI und Southern-Blot- Analyse. Die Analyse des vierten Transformanten bestätigte, daß er das gleiche Insert wie YAC 184ADA.C und 184ADA.D besitzt. Alle vier Transformanten besitzen ein YAC ähnlicher Größe mit ca. 200 kb, was durch eine CHEF- Gelelektrophorese bestimmt wurde. Die Intensität der ULL- Bande in der aus YAC 184ADA.B hergestellten DNS und andere Daten zeigen, daß in YAC 184ADA.B multiple Tandem- Integrationen des zielenden Plasmids stattgefunden haben.
- Ein Vergleich eines repräsentativen YAC, YAC 184ADA.C, mit menschlicher genomischer DNS mittels Restriktionsenzym- und Southern Hybridisierungs-Analyse mit Hilfe mehrerer Sonden und Restriktionsverdaus bestätigte, daß dieses YAC tatsächlich Sequenzen aus dem menschlichen ADA Locus enthält. OLIGONUCLEOTID 06
- Die Basen, Nr. 1-24, stimmen mit den Positionen 34.243-34.266 im HUMADAG GENBANK Eintrag überein. OLIGONUCLEOTID 07-2
- Die Basen, Nr 7-29, stimmen mit den Positionen 35,618-35,596 des HUMADAG Genbank Eintrags überein. Die Basen 1-6 stimmen mit einer der vier möglichen Erken nungssequenzen für das Restriktionsenzym BstYI überein, die zwecks Vereinfachung der Klonierung eingefügt wurden.
- Orr-Weaver et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, 10:6354-6358 (1981)) zeigten, daß ein das LEU2 Hefe- Gen tragendes Plasmid leu&spplus;-Transformanten mit einer Häufigkeit von 1,4-1,7 pro µg DNS ergibt, wenn ein Doppelstrangbruch in dem pBR322 Teil des Plasmids eingeführt wurde. Dies ist 1/10 der Häufigkeit mit der leu&spplus; Transformantenentstehen, wenn das Zielen auf das LEU2- Gen durch einen Doppelstrangbruch in LEU2-Sequenzen gesteuert wurde (12-17 pro µg DNS). Entsprechend bilden sich, wenn ein HIS3 enthaltendes Plasmid innerhalb der pBR322 Sequenzen geschnitten wurde, his&spplus; Transformanten mit 1/60 der sonst beobachteten Rate, wenn das gleiche Plasmid innerhalb von HIS3 geschnitten wurde. In beiden Fällen konnte gezeigt werden, daß die nicht gezielten Prototrophen die Ergebnisse der Rekombination zwischen dem Plasmid und den mutierten chromosomalen leu2&supmin; und his3&supmin; Genen waren. Folglich würde das Absuchen einer Bibliothek auf einen Klon aus 50.000 mittels homologer Rekombination ohne eine Deletion des chromosomalen LEU2 Gens ein Ergebnis von 5.000 leu&spplus; Transformanten erwarten lassen, die durch eine homologe Rekombination mit dem Hefe-Genom entstehen, wenn das zielende Plasmid LEU2 trägt, sogar wenn ein Doppelstrangbruch in einem anderen Teil des Plasmids eingeführt worden ist. Die Ergebnisse lassen jedoch vermuten, daß eine Deletion der chromosomalen LEU2 und HIS3 Kopien praktisch alle nicht-gezielten Ereignisse ausschließt.
- Der Vorteil von chromosomalen Deletionen in Wirtszellen für den Verfahrenszweck wurde folgendermaßen bestimmt: Ein Plasmid&sub1; das das ARG4 ("Ziel") und URA3 ("Marker") Hefe-Gene trägt, wurde in eine Hefezellmischung nach Einführen eines Doppelstrangbruchs in die einzige BclI-Schnittstelle in der ARG4-Sequenz transformiert. Alle Zellen in der Mischung besaßen eine Homo logie zu URA3, aber nur 1 von 1.000 oder 1 von 10.000 besaßen eine Homologie zu ARG4. Dieses Verdünnungsexperiment bestimmt die relative Häufigkeit von gezielten und nicht gezielten Ereignissen. Beispielsweise zeigt bei der Verwendung von 1 µg DNS in einer 1 zu 1000 Verdünnung die Isolierung von 5 Kolonien mittels homologer Rekombination bei ARG4, daß 5.000 Zellen theoretisch zu einem gezielten Ereignis fähig waren, aber nur 5/5.000 Zellen tatsächlich die notwendige Homologie zu ARG4 besaßen. Die zielende Häufigkeit entspricht deshalb 5.000 gezielten Ereignissen pro µg in einer unverdünnten Kultur. Falls im gleichen Experiment 5 Kolonien isoliert worden wären, die von einer Homologie zu ARG4 unabhängig wären (Rekombination an URA3 oder sonstwo, nicht gezielte Ereignisse), ist die Häufigkeit dieser nicht gezielten Ereignisse 5 pro µg, und das Verhältnis von gezielten zu nicht gezielten Ereignissen in diesem Experiment wäre 1.000 zu 1.
- Mit der 1 zu 1.000 Verdünnung wurden 78 gezielte Transformanten isoliert (durch Rekombination mit ARG4; entspricht 78.000 gezielten Ereignissen) und 17 durch Rekombination sonstwo (nicht gezielte Ereignisse). Bei einer Verdünnung von 1 zu 10.000 wurden vier gezielte Ereignisse (entspricht 40.000 gezielten Ereignissen) und sieben nicht gezielte Ereignisse isoliert. Das Verhältnis von gezielten zu nicht gezielten Ereignissen ist folglich (78.000 + 40.000) geteilt durch (17 + 7), oder 4.917 zu 1. Dieses Verhältnis würde ungefähr 10 nicht korrekte Ereignissen für jedes korrekte Ereignis ergeben, wenn eine Bibliothek auf eine Sequenz, die in 1 der 50.000 YACs vorhanden ist, abgesucht wird, dies ist für eine allgemeine Akzeptanz vielfach zu hoch, obwohl die Verwendung von URA3 als zielender Marker gegenüber der Verwendung der LEU2 oder HIS3 Marker, die in den zielenden Untersuchungen zuvor verwendet wurden, eindeutig bevorzugt wird (Orr-Weaver et al., 1981). 84% (16 der 19 analysierten) der nicht gezielten Ereignisse waren tatsächlich der Rekombination zwischen dem URA3-Marker auf dem Plasmid und dem chromosomalen ura3&supmin;-Locus zuzuschreiben. Wenn es keine Homologie zwischen dem zielenden Plasmid und dem chromosomalen ura3&supmin; Locus gäbe, dann würden die nicht gezielten Ereignisse, die aus der Homologie zu dem ura3&supmin;-Locus resultieren, aus der Untersuchung entfernt werden, und das Verhältnis auf 30.729 zu 1 steigen. Bei diesem Verhältnis würde eine Sequenz, die 3 mal in 50.000 YACs vorhanden wäre, 1,8 mal korrekt für jedes nicht gezielte Ereignis gezielt. Dieses Verhältnis würde ebenfalls das bevorzugte Verhältnis von einem korrekten Ereignis pro 1,6 nicht korrekte Ereignisse ergeben, wenn eine Bibliothek auf eine nur einmal in 50.000 YACs vorhandene Sequenz abgesucht wird.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß die Selektion eines gezielten Klons aus einer YAC-DNS-Bibliothek durchführbar und besonders effizent in Hefewirtszellen ist, die keine Homologie zu einem auf einem zielenden Vektor vorhandenen selektierbarenmarker besitzen.
Claims (20)
1. Ein homologes Rekombinationsverfahren zur Identifi
zierung und Isolierung eines Ziel-DNS-Fragments aus einer
in eukaryontischen Wirtszellen konstruierten
DNS-Fragmentbibliothek, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen der DNS-Fragmentbibliothek
einer DNS, die in eine Population eukaryontischer
Wirtszellen eingeführt ist, in denen eine
genetische Rekombination zwischen in die eukaryontischen
Wirtszellen eingeführter und in den eukaryontischen
Wirtszellen vorhandener DNS durch homologe
Rekombination stattfindet;
b) Einbau eines selektierbaren Markergens und
einer zielenden DNS-Sequenz, die miteinander
verbunden sind, in die Population der
eukaryontischen Wirtszellen, die die DNS-
Fragmentbibliothek enthalten, wodurch eine
gemischte Population eukaryontischer Wirtszellen
gebildet wird, wobei das selektierbare Markergen
zur Selektion in der Wirtszelle ist, und die
zielende DNS-Sequenz teilweise homolog zum Ziel-
DNS-Fragment der eingeführten DNS ist,
c) Halten der gemischten Population
eukaryontischer Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um
eine homologe Rekombination stattfinden zu lassen,
wodurch nur eukaryontische Wirtszellen, die das
Ziel-DNS-Fragment der eingeführten DNS enthalten,
stabil mit dem selektierbaren Markergen und der
zielenden DNS-Sequenz transformiert sind als ein
Ergebnis der homologen Rekombination zwischen dem
Ziel-DNS-Fragment und der zielenden DNS-Sequenz,
und es werden stabil transformierte eukaryontische
Wirtszellen mit einem selektierbaren Phänotyp
gebildet; und
d) Kultivieren des Produkts von Schritt (c)
unter geeigneten Bedingungen zur Selektion stabil
transformierter eukaryontischer Wirtszellen mit
einem selektierbaren Phänotyp.
2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin (i) die
eukaryontischen Wirtszellen Hefewirtszellen sind, die
zielende DNS in einem replizierenden linearen Vektor
vorhanden ist, der in Hefezellen enthalten ist, die von einem
gegensätzlichen Paarungstyp zum Paarungstyp der
Hefewirtszellen sind und als Hefezellen bezeichnet sind,
die die zielende DNS enthalten, und die zielende DNS in
Hefewirtszellen durch Paarung von Hefewirtszellen mit
Hefezellen, die die zielende DNS enthalten, eingeführt
wird; oder
(ii) der zielende DNS-Vektor ein lineares DNS-Fragment
ist, wobei die zielende DNS-Sequenz durch die Insertion
des selektierbaren Markergens zur Selektion der
eukaryontischen Wirtszelle unterbrochen ist.
3. Ein homologes Rekombinationsverfahren zur Identifi
zierung und Isolierung eines Ziel-DNS-Fragments aus einer
in eukaryontischen Wirtszellen konstruierten
DNS-Fragmentbibliothek, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen einer DNS-Fragmentbibliothek in
einer Population eukaryontischer Wirtszellen, in
denen eine genetische Rekombination zwischen in die
eukaryontischen Wirtszellen eingeführter DNS und in
den eukaryontischen Wirtszellen vorhandener DNS
durch homologe Rekombination stattfindet;
b) Einführen eines selektierbaren Markergens und
einer zielenden DNS-Sequenz, die miteinander
verbunden sind, in die Population der
eukaryontischen Wirtszellen, die die DNS-
Fragmentbibliothek enthalten, wodurch eine
gemischte Population eukaryontischer Wirtszellen
gebildet wird, wobei das selektierbare Markergen
zur Selektion in der Wirtszelle ist, und die
zielende DNS-Sequenz teilweise homolog zu einem
Ziel-DNS-Fragment der eingeführten DNS ist,
c) Halten der gemischten Population
eukaryontischer Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um
eine homologe Rekombination stattfinden zu lassen,
wobei das Ziel-DNS-Fragment enthaltende
eukaryontische
Wirtszellen stabil mit dem selektierbaren
Markergen und der in dem zielenden DNS-Vektor
vorhandenen zielenden DNS-Sequenz transformiert sind
als ein Ergebnis einer homologen Rekombination
zwischen dem Ziel-DNS-Fragment und der zielenden DNS-
Sequenz, und es werden stabil transformierte
eukaryontische Wirtszellen mit einem selektierbaren
Phänotyp gebildet; und
d) Kultivieren des Produkts von Schritt (c)
unter geeigneten Bedingungen zur Selektion stabil
transformierter eukaryontischer Wirtszellen mit
einem selektierbaren Phänotyp.
4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, worin (i) das
zielende DNS-Molekül ein zielendes Plasmid mit
beispielsweise einem in die zielende DNS-Sequenz eingeführten
Doppelstrangbruch ist, oder
(ii) das Ziel-DNS-Fragment CDNS ist.
5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, worin (A) das
zielende Plasmid ein YIp Plasmid ist, und DNS-Fragmente in
eukaryontischen Wirtszellen in künstlichen Chromosomen
vorhanden sind, wobei die künstlichen Chromosomen
zusätzlich sämtliche DNS-Sequenzen aufweisen, die für die
Teilnahme der Chromosomen an der Wirtszellreplikation und
Chromosomen-Segregation notwendig sind; oder
(B) das Ziel-DNS-Fragment ist: eine Säuger DNS-Sequenz,
die eine intergene DNS-Sequenz ist; eine menschliche DNS-
Sequenz, die eine intergene DNS-Sequenz ist; eine
pflanzliche DNS-Sequenz, die eine intergene DNS-Sequenz ist;
ein Säuger-Gen oder ein Teil davon; ein menschliches Gen
oder ein Teil davon; oder ein pflanzliches Gen oder ein
Teil davon.
6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das selek
tierbare Markergen aus der Gruppe der Gene gewählt ist,
die eukaryontischen Wirtszellen einen selektierbaren
Phänotyp verleihen, und der selektierbare Phänotyp ist:
Antibiotikumresistenz, nutrititive Prototrophie,
Metallionentoleranz, Fähigkeit, den Zellzyklus zu
durchlaufen oder Expression eines Zelloberflächenmarkers.
7. Ein homologes Rekombinationsverfahren zur
Identifizierung und Isolierung eines Ziel-DNS-Fragments in einer
in Hefezellen konstruierten DNS-Fragmentbibliothek, wobei
das Verfahren die Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen einer DNS-Fragmentbibliothek in
einer Population Hefewirtszellen, worin
DNS-Fragmente in künstlichen Hefechromosomen vorhanden
sind, und eine Hefewirtszelle ein künstliches
Hefechromosom oder eine low-copy-number künstlicher
Hefechromosomen enthält;
b) Einführen eines selektierbaren Markergens zur
Selektion in Hefe, das an eine zielende DNS
gebunden ist, die teilweise homolog zu einem Ziel-DNS-
Fragment ist, in die Hefezellen, die die
DNS-Fragmentbibliothek enthalten, wodurch eine gemischte
Population Hefezellen gebildet wird;
c) Halten der gemischten Hefezellpopulation
unter geeigneten Bedingungen für eine homologe
Rekombination zwischen zielender DNS und in den
künstlichen Hefechromosomen vorhandenen Ziel-DNS-
Fragmenten, wodurch Hefezellen, die das Ziel-DNS-
Fragment enthalten, stabil mit dem selektierbaren
Markergen und der zielenden DNS-Sequenz
transformiert sind als ein Ergebnis der homologen
Rekombination zwischen dem Ziel-DNS-Fragment und der
zielenden DNS-Sequenz, und es werden stabil
transformierte Hefezellen mit einem selektierbaren Phänotyp
gebildet; und
d) Kultivieren des Produkts von Schritt (c)
unter geeigneten Bedingungen zur Selektion von
Hefezellen mit einem selektierbaren Phänotyp.
8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das zielende
DNS-Molekül ein lineares DNS-Fragment ist, worin die
zielende DNS-Sequenz durch die Insertion des selektierbaren
Markers für Hefe in der zielenden DNS unterbrochen wird.
9. Ein homologes Rekombinationsverfahren zur
Identifizierung und Isolierung eines Ziel-DNS-Fragments in einer
in Hefezellen konstruierten DNS-Fragmentbibliothek, wobei
das Verfahren die Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen einer DNS-Fragmentbibliothek in
einer Population aus Hefewirtszellen, worin DNS-
Fragmente in künstlichen Hefechromosomen vorhanden
sind, und eine Hefewirtszelle ein künstliches
Hefechromosom oder eine low-copy-number künstlicher
Hefechromosomen enthält;
b) Einführen eines in Hefe nicht-replizierenden
zielenden DNS-Vektors in die Hefezellen, die die
DNS-Fragmentbibliothek enthalten, wobei der
zielende DNS-Vektor ein selektierbares Markergen zur
Selektion in Hefe besitzt, und die zielende DNS
teilweise zu einem Ziel-DNS-Fragment homolog ist,
wodurch eine gemischte Hefezellpopulation gebildet
wird;
c) Halten der gemischten Hefezellpopulation
unter geeigneten Bedingungen für eine homologe
Rekombination zwischen zielender DNS und in den
künstlichen Hefechromosomen vorhandenen Ziel-DNS-
Fragmenten, wodurch Hefezellen, die das Ziel-DNS-
Fragment enthalten, stabil mit dem selektierbaren
Markergen und der im zielenden DNS-Vektor
enthaltenen zielenden DNS-Sequenz transformiert sind als
ein Ergebnis der homologen Rekombination zwischen
dem Ziel-DNS-Fragment und der zielenden DNS-
Sequenz, und es werden stabil transformierte
Hefezellen mit einem selektierbaren Phänotyp gebildet;
und
d) Kultivieren des Produkts von Schritt (c)
unter geeigneten Bedingungen zur Selektion von
Hefezellen mit einem selektierbaren Phänotyp.
10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der zielende
DNS-Vektor ein Plasmid ist und der selektierbare Phänotyp
ist: Antibiotikumresistenz, nutrititive Prototrophie,
Metallionentoleranz, Fähigkeit, den Zellzyklus zu
durchlaufen oder Expression eines Zelloberflächenmarkers; und
beispielsweise worin das zielende Plasmid einen in die
zielende DNS eingeführten Doppelstrangbruch besitzt.
11. Ein homologes Rekombinationsverfahren zur
Identifizierung und Isolierung eines Ziel-DNS-Fragments in einer
künstlichen Hefechromosombibliothek, wobei das Verfahren
die Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen einer künstlichen
Hefechromosombibliothek in einer Population
Hefewirtszellen, worin DNS-Fragmente in künstlichen
Hefechromosomen vorhanden sind und eine Einzelkopie
oder eine low-copy-number künstlicher
Hefechromosomen in Hefewirtszellen vorhanden ist;
b) Einführen eines zielenden Plasmids, das ein
in Hefe nicht-replizierendes bakterielles Plasmid
ist, in die künstliche Hefechromosombibliothek von
(a), wobei das zielende Plasmid ein selektierbares
Markergen zur Selektion in Hefe und eine zielende
DNS mit einem Doppelstrangbruch besitzt;
c) Halten des Produkts von Schritt (b) unter
geeigneten Bedingungen für eine homologe
Rekombination zwischen der zielenden DNS und in den
künstlichen Hefechromosomen vorhandenen
Ziel-DNS-Fragmenten, wobei homologe Rekombination zwischen einem
Ziel-DNS-Fragment und zielender DNS Hefewirtszellen
bildet, die einen selektierbaren Phänotyp besitzen;
und
d) Selektion der Hefewirtszellen, die den in
Schritt (c) verliehenen selektierbaren Phänotyp
besitzen.
12. Ein Verfahren gemäß Anspruch 10 oder Anspruch 11,
worin das Ziel-DNS-Fragment ist: eine Säuger DNS-Sequenz,
die eine intergene DNS-Sequenz ist; eine menschliche DNS-
Sequenz, die eine intergene DNS-Sequenz ist; eine
pflanzliche DNS-Sequenz, die eine intergene DNS-Sequenz ist;
ein Säuger-Gen oder ein Teil davon; ein menschliches Gen
oder ein Teil davon; oder ein pflanzliches Gen oder ein
Teil davon.
13. Ein mit dem Verfahren gemäß Anspruch 6 oder
Anspruch 12 isoliertes DNS-Ziel-Fragment, das eine Säuger
DNS-Sequenz ist, die eine intergene DNS-Sequenz ist; eine
menschliche DNS-Sequenz, die eine intergene DNS-Sequenz
ist; eine pflanzliche DNS-Sequenz, die eine intergene
DNS-Sequenz ist; ein Säuger-Gen oder ein Teil davon; ein
menschliches Gen oder ein Teil davon; oder ein
pflanzliches Gen oder ein Teil davon.
14. Ein Verfahren gemäß Anspruch 11, worin der
selektierbare Phänotyp ist: Antibiotikumresistenz, nutrititive
Prototrophie, Metallionentoleranz, Fähigkeit, den
Zellzyklus zu durchlaufen oder Expression eines
Zelloberflächenmarkers.
15. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, das des weiteren
Isolieren angrenzender DNS-Segmente aus der
DNS-Fragmentbibliothek umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte
umfaßt:
a) Subklonieren eines Ziel-DNS-Fragmentendes,
das mit dem Verfahren gemäß Anspruch 9 erhalten
wird, in einen zielenden DNS-Vektor, der in Hefe
nicht-replizierend ist, wobei der zielende
DNS-Vektor ein selektierbares Markergen zur Selektion in
Hefe besitzt, wodurch ein zielender DNS-Vektor
gebildet wird, der subklonierte DNS enthält, die das
Ende des zuvor isolierten DNS-Fragments ist;
b) Einführen des zielenden Vektors, der in (a)
als nachfolgende zielende DNS gebildet wird, in die
bereitgestellte DNS-Fragmentbibliothek;
c) Halten des Produkts von (b) unter geeigneten
Bedingungen für eine homologe Rekombination
zwischen zielender DNS und Ziel-DNS-Fragmenten in der
DNS-Fragmentbibliothek, wodurch Hefezellen gebildet
werden, die stabil mit dem selektierbaren Markergen
und zielender DNS transformiert sind als ein
Ergebnis der homologen Rekombination zwischen dem Ziel-
DNS-Fragment und der zielenden DNS-Sequenz und
einen selektierbaren Phänotyp besitzen;
d) Kultivieren des Produkts von Schritt (c)
unter geeigneten Bedingungen zur Selektion von
Hefezellen, in denen eine homologe Rekombination
stattgefunden hat;
e) Selektion der in Schritt (d) gebildeten
Hefezellen, die einen selektierbaren Phänotyp besitzen;
f) Subklonieren eines Ziel-DNS-Fragmentendes,
das in (e) selektierten Hefezellen vorhandenen ist,
in einen zielenden DNS-Vektor wie in Schritt (a);
und
g) Wiederholen der Schritte (b) bis (e) je nach
Bedarf; und beispielsweise worin der zielende DNS
Vektor ein bakterielles Plasmid mit einem
Doppelstrangbruch innerhalb der zielenden DNS ist, und
der selektierbare Phänotyp ausgewählt ist aus der
Gruppe enthaltend: Antibiotikumresistenz,
nutrititive Prototrophie, Metallionentoleranz und
Komplementation der unvollständigen Funktion eines
Gens, das für das Durchlaufen des Zellzyklus
essentiell ist.
16. Saccharomyces cerevisiae mit einer chromosomalen
Deletion der gesamten codierenden Region zweier oder
mehrerer selektierbarer Markergene, die beispielsweise
nutrititive Prototrophie verleihen.
17. Ein
Saccharomyces cerevisiae TD7-16d (ATCC 74010);
Saccharomyces cerevisiae IV-16d; und
Saccharomyces cerevisiae MGD131-10c.
18. Plasmid p184DLARG und funktionelle Äquivalente
davon.
19. Ein in Hefe nicht replizierendes Plasmid, das
umfaßt:
a) Ein selektierbares Hefe-Markergen;
b) Einen bakteriellen Replikationsursprung;
c) Ein selektierbares Bakterien-Markergen; und
d) Eine Klonierungsstelle zur Insertion einer
zielenden DNS.
20. Saccharomyces cerevisiae mit einer chromosomalen
Deletion des Argininsuccinat-Lyase-Gens und einer
chromosomalen Deletion des N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilat-
Isomerase-Gens.
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