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Erfindungsgebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Gebiete der Mikrobiologie und Immunologie
und insbesondere Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose von
Erkrankungen, die durch Treponema pallidum, beispielsweise Syphilis,
verursacht werden. Insbesondere befasst sich die Erfindung mit der
Feststellung von spezifischen, antigenen Proteinen und Peptiden,
die für
Treponema pallidum einzigartig sind.
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Erfindungshintergrund
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Treponema
pallidum (T. pallidum) ist eine mikroaerophile Spirochäte, die
Syphilis verursacht, eine systemische Venenerkrankung mit vielfachen,
klinischen Erscheinungen. Weitere eng verwandte Treponemas verursachen
Pinta (Treponema carateum), Drehschwindel (Treponema pallidum, Unterart
pertenue) und Bejel (Treponema pallidum, Unterart endemicum).
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Im
Jahr 1996 wurde in den „US-Centers
for Disease Control and Prevention" von über 11000 Fällen der primären und
sekundären
Syphilis berichtet. Die Anfangsinfektion verursacht ein Geschwür an der
Infektionsstelle; jedoch bewegen sich die Bakterien durch den Körper und
zerstören
mit der Zeit viele Organe. Obwohl die Behandlung mit Penicillin
in den frühen
Phasen erfolgreich sein kann, können
die frühen
Symptome der Syphilis sehr milde verlaufen, und manche Leute suchen
nicht die Behandlung, wenn sie gerade infiziert worden sind. Diese
Verzögerung
der Behandlungssuche ist leidvoll, weil die Zerstörung der
Organe bei fortgeschrittener Syphilis nicht umgekehrt werden kann.
Ebenso nimmt die Gefahr der Übertragung
und des Erwerbs des menschlichen Immunmangelvirus (HIV) zu, der über offene,
durch die Syphilis erzeugte Geschwüre AIDS verursacht.
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Medizinische
Fachleute beschreiben den Verlauf der Syphiliserkrankung so, dass
er in den folgenden Stufen erfolgt: die primäre, sekundäre, verborgene und tertiäre (späte) Stufe.
Eine infizierte Person, die nicht behandelt worden ist, kann andere
Personen während
der ersten beiden Stufen infizieren, die gewöhnlich ein bis zwei Jahre dauern.
Die Bakterien verbreiten sich vom Anfangsgeschwür einer infizierten Person
auf die Haut oder die schleimigen Membranen des Genitalbereichs,
des Munds oder des Anus eines Sexualpartners. Die Bakterien können auch
durch eine verletzte Haut oder durch andere Körperteile eindringen. In den
späten Stufen
kann eine unbehandelte Syphilis, obwohl sie nicht ansteckend ist,
ernste Herzunregelmäßigkeiten, mentale
Störungen,
Blindheit, andere neurologische Probleme und sogar den Tod verursachen.
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Das
erste Symptom der primären
Syphilis ist ein Geschwür,
das Schanker genannt wird. Der Schanker kann innerhalb von zehn
Tagen bis drei Monaten nach dem Befall auftreten, aber generell
tritt er in zwei bis sechs Wochen auf. Der Schanker wird gewöhnlich auf
demjenigen Körperteil
gefunden, der dem Geschwür des
Partners gegenüberliegt,
beispielsweise auf dem Penis, den Schamlippen oder der Vagina. Ein
Schanker kann sich auch auf dem Hals, der Zunge, den Lippen oder
anderen Körperteilen
entwickeln. Weil der Schanker schmerzlos sein und innerhalb des
Körper
auftreten kann, wird er möglicherweise
nicht bemerkt. Obwohl der Schanker unabhängig davon, ob die Person behandelt
wurde oder nicht, innerhalb von wenigen Wochen wieder verschwindet,
wenn die Infektion während
der primären
Stufe nicht behandelt worden ist, wird er bei etwa einem Drittel
der so infizierten Personen in die chronischen Stufen der Syphilis übergehen.
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Die
sekundäre
Syphilis wird oft durch einen Hautausschlag begleitet, der durch
braune Entzündungsstellen
von der Größe eines
Pennys gekennzeichnet ist. Die Entzündungsstelle verschwindet auf
jeden Fall wieder nach drei bis sechs Wochen nach dem Auftreten
des Schankers. Während
die Entzündungsstellen
den ganzen Körper
befallen können,
treten sie gewöhnlich
eher an den Handflächen
und Fußsohlen
auf. Weil die aktiven Bakterien in diesen Entzündungsstellen vorhanden sind,
kann jeder sexuale oder nicht sexuale Körperkontakt mit einer verletzten
Haut einer infizierten Person die Infektion in dieser Stufe verbreiten.
Der Hautausschlag heilt gewöhnlich
in mehreren Wochen oder Monaten wieder ab. Weitere Symptome können ebenfalls
auftreten, beispielsweise mildes Fieber, Erschöpfung, Kopfschmerzen, Halsentzündung, unregelmäßiger Haarverlust
und geschwollene Lymphdrüsen über den
ganzen Körper.
Diese Symptome können
sehr milde sein und wie der Schanker der primären Syphilis ohne Behandlung
wieder verschwinden.
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Die
Anzeichen der sekundären
Syphilis kommen und gehen während
der nächsten
ein bis zwei Jahre. Wenn sie nicht behandelt wird, kann die Syphilis
in eine verborgene Stufe übergehen,
in der die Erkrankung nicht mehr ansteckend ist und in der keine
Symptome mehr vorhanden sind. Obwohl manche Individuen, die nicht
behandelt wurden, keine weiteren Konsequenzen der Erkrankung erdulden
müssen,
entwickeln etwa zwei Drittel derjenigen, die die sekundäre Syphilis
haben, die Komplikationen der späten
oder tertiären
Syphilis.
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In
der tertiären
Stufe der Syphilis zerstören
Bakterien das Herz, die Augen, das Gehirn, das Nervensystem, die
Knochen, die Gelenke oder fast jeden anderen Körperteil. Diese Stufe kann
jahrelang, wenn nicht gar jahrzehntelang, dauern. Die späte Syphilis
kann zur Geisteskrankheit, Blindheit, zu anderen, neurologischen
Problemen, zur Herzerkrankung und sogar zum Tod führen.
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Während der
frühen
Stufen der Infektion können
die Syphilisbakterien auch häufig
in das Nervensystem eindringen, und etwa 3-7% der Personen mit unbehandelter
Syphilis entwickeln Neurosyphilis. Die Entwicklung der Neurosyphilis
kann jedoch bis zu zwanzig Jahre dauern, und einige Personen mit
Neurosyphilis entwickeln überhaupt
keine Symptome. Diejenigen, die Symptome aufweisen, können Kopfschmerzen,
steife Nacken und Fieber bekommen, wobei diese Störungen von
einer Entzündung
der Gehirnhaut herrühren.
Die Größen und
die Symptome eines Schlags, beispielsweise Steifheit, Schwäche oder
Sichtprobleme können ebenfalls
Patienten mit Neurosyphilis Kummer bereiten. Obwohl die Neurosyphilis
behandelt werden kann, kann die Behandlung schwieriger sein, und
ihr Verlauf kann unterschiedlich zu dem von Personen mit HIV sein.
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Die
Wirkungen der Syphilis auf schwangere Frauen sind besonders zwingend
wegen der Folgewirkungen auf das ungeborene Kind. Es ist wahrscheinlich,
dass eine unbehandelte, schwangere Frau mit aktiver Syphilis die
Infektion auf ihr ungeborenes Kind überträgt. Etwa 25% der Schwangerschaftsfälle führen zur
Totgeburt oder zu einem nachgeburtlichen Tod. Zwischen 40-70% dieser
Schwangerschaftsfälle
ergeben ein syphilisinfiziertes Kind. Einige Kinder mit kongenitaler
Syphilis können
Symptome bei der Geburt aufweisen, aber die meisten entwickeln Symptome
zwischen zwei und drei Wochen nach der Geburt. Diese Symptome können Entzündungen,
Hautausschläge,
Fieber, geschwollene Leber und Milz, Gelbsucht, Anämie und
verschiedene Verformungen umfassen. Vorsicht muss bei der Behandlung
eines Kinds mit kongenitaler Syphilis walten, weil die nässenden
Entzündungen
infektiös
sind. Selten bleiben die Syphilissymptome bei Kindern unentdeckt. Wenn
infizierte Kleinkinder ältere
Kinder und Teenager werden, können
sie Symptome der Spätstufensyphilis entwickeln,
die Knochen-, Zahn-, Augen-, Ohren- und Gehirnschäden umfasst.
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Aufgrund
der manchmal ernsten und lebensbedrohenden Wirkungen der Syphilisinfektion
und des Risikos der Übertragung
oder Zuziehung von HIV ist eine spezifische und frühe Diagnose
der Infektion wichtig. Die Syphilis ist jedoch manchmal „der große Imitator" genannt worden,
weil ihre frühen
Symptome denen vieler anderer Erkrankungen ähneln. Deshalb verlässt sich
ein Arzt gewöhnlich
nicht auf eine Feststellung von Anzeichen und Symptomen der Syphilis,
sondern führt
sowohl eine mikroskopische Identifizierung der Syphilisbakterien
als auch Blutprüfungen
durch.
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Um
Syphilis durch eine mikroskopische Identifizierung des Bakteriums
zu diagnostizieren, kann der Arzt eine Schabeprobe von der Oberfläche eines
Geschwürs
oder Schankers nehmen und diese unter einem besonderen „Dunkelfeld"-Mikroskop prüfen, um den Organismus zu entdecken.
Das Dunkelfeldmikroskop erfordert jedoch erhebliche Kenntnisse und
ist gegen eine Missinterpretation anfällig. Aus diesen Gründen werden
die meisten Syphilisfälle
serologisch diagnostiziert. Die Blutprüfungen, die oft zur Feststellung
des Auftretens von Syphilis verwendet werden, sind die VDRL-Prüfung (Veneral
Disease Research Laboratory) und die RPR-Prüfung (Rapid Plasma Reagent).
Diese nicht treponemalen Prüfungen
verwenden natürliche
Lipide, Kardiolipin und Lezithin, um Antikörper gegen nicht spezifische
Antigene während
einer aktiven Syphilisinfektion festzustellen.
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Doch
ist eine der Beschwerden über
die nicht treponemalen Prüfungen
deren Mangel an Spezifizität im
Vergleich zu den treponemalen Prüfungen.
Aufgrund des Auftretens von falschen positiven und falschen negativen
Ergebnissen bei der Verwendung nicht treponemaler Prüfungen ist
gewöhnlich
mehr als eine Blutprüfung
nötig.
Die Rate der falschen positiven Ergebnisse und die Notwendigkeit
multipler Blutprüfungen
wird bei solchen Individuen erhöht,
die unter Autoimmunstörungen,
bestimmten Virusinfektionen und anderen Zuständen leiden, die eine wesentliche
Gewebezerstörung
oder einen Leberbefall umfassen. Obwohl die treponemalbasierenden
Prüfungen,
beispielsweise die fluoreszierende, treponemale Antikörperabsorption (FTA-ABS)
und die T.-pallidum-Hemagglutinationsanalyse (TPHA), verwendet werden
kann, um ein positives Prüfungsergebnis
zu bestätigen,
sind die treponemal-basierenden Prüfungen teurer und schwieriger
bei ihrer Verwendung als nicht treponemale Prüfungen. Die treponemalen Prüfungen können auch
nicht als Prüfungen für die Fürsorge nach
der Behandlung verwendet werden, weil sie positiv bleiben, sogar
nach der Auslöschung der
Infektion.
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Einige
treponemale Prüfungen,
die zur Zeit in Gebrauch sind, hängen
von der Feststellung von Proteinen ab, die in der T.-pallidum-zytoplastischen
Membran verankert sind. Die Feststellung dieser Proteine ist besonders
schwierig wegen des ungewöhnlichen
Aufbaus der T.-pallidum-Membran, die im Wesentlichen aus Lipiden
besteht, die dazu neigen, diese Proteine vor der Feststellung zu „schützen". Diese Schutzwirkung
verzögert
oft die Immunantwort des Wirts, so dass häufig falsche, negative, serologische
Ergebnisse entstehen.
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Gegenwärtig verfügbare, treponemale
Prüfungen
hängen
hauptsächlich
von der Feststellung von Antikörpern
für die
zytoplasmischen, membranverankerten Lipoproteinen ab. Die Antwort
auf diese Proteine wird typischerweise wegen des Fehlens der Oberflächenaufnahme
dieser Proteine verzögert,
weil die Außenmembran
hauptsächlich
aus Lipiden besteht und proteinarm ist. Die Prüfungen führen oft zu verwirrenden und
ungenauen Ergebnissen, weil diese Lipoproteine hoch antigen und
für die
langdauernde Antwort in den treponemalen Prüfungen verantwortlich sind.
Wegen dieser letztgenannten Eigenschaft können die treponemalen Prüfungen nicht
eine akute Infektion von einer vergangenen Infektion unterscheiden.
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Die
Syphilis wird gewöhnlich
mit Penicillin behandelt, das durch eine Injektion verabreicht wird.
Andere Biotika werden für
die Patientenbehandlung verwendet, wenn eine Allergie gegen Penicillin
vorliegt. Ein Patient verliert typischerweise die Fähigkeit,
Syphilis 24 Stunden nach dem Therapiebeginn zu übertragen. Deshalb ist es wichtig,
dass die Patienten, die sich einer Behandlung der Syphilis unterzogen
haben, durch periodische Blutprüfungen überwacht
werden, damit sicher ist, dass die Infektionskörper vollkommen zerstört werden.
Für Personen
mit Neurosyphilis kann es nötig
sein, dass sie bis zu zwei Jahren nach der Behandlung wieder geprüft werden.
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In
allen Stufen der Syphilis kann eine richtige Behandlung die Erkrankung
heilen, doch bei später
Syphilis können
die bereits aufgetretenen Schäden
der Körperorgane
nicht wieder rückgängig gemacht
werden. Die Untersuchung und die Behandlung der infizierten Individuen
oder eine sekundäre
Prevention sind die einzigen Möglichkeiten
für die
fortgeschrittenen Stufen der Syphiliserkrankung. Die Prüfung und
die Behandlung in der frühen
Schwangerschaft sind der beste Weg, um die Syphilis bei Kleinkindern
zu verhindern und sollten einen Routineteil der nachgeburtlichen
Fürsorge
bilden. Eine lebenswichtige Komponente für eine erfolgreiche Behandlung
und Prevention der Syphilis ist eine frühe und genaue Feststellung
der T.-pallidum-Infektion.
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Erkrankungen, die mit
anderen treponemalen Infektionen verbunden sind
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Die
Pinta, die durch Treponema carateum verursacht wird, ist sehr selten
geworden und auf die ariden, tropischen Länder Amerikas (insbesondere
Mexiko, Zentralamerika und Kolumbien) beschränkt. Die Erkrankung zeigt sich
in Form von primären
und sekundären
Schädigungen.
Die primären
Schädigungen
können mehrere
Jahre andauern und umfassen zusammenwachsende, pruritische Papules
an den Extremitäten,
im Gesicht, am Nacken, an der Brust oder am Bauch. Die sekundären Schädigungen
umfassen sich ausbreitende Schwäche,
schuppige Papules, so genannte Pintide. Diese können dyschromisch werden (das
bedeutet eine Farbänderung
von der normalen Farbe der Haut). Späte Schädigungen sind achromisch (ohne
Pigment).
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Die
Bejel wird von der Treponema pallidum, Unterart endemicum, verursacht
und ist durch viele Namen in örtlichen
Sprachen als Form von Syphilis bekannt, die nicht sexuell übertragen
wird und bei Kindern auftritt. Die Übertragung kann durch direkten
Kontakt und auch (im Gegensatz zu allen anderen, treponemalen Erkrankungen) über Formgebilde,
beispielsweise gemeinsame Trinkgefäße und Essgegenstände, erfolgen. Mit
Ausnahme der Tatsache, dass die vor allem in der Mundschleimhaut
auftretende, primäre
Schädigung
selten beobachtet wird, ist die Erkrankung offenbar mit Syphilis
identisch, mit Gummas, Kondylomata lata und Periostisis.
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Der
durch die Treponema pallidum, Unterart pertenue, verursachte Drehschwindel
tritt in warmen, feuchten Tropenländern auf. Die Drehschwindelerkrankung
tritt auchvorwiegend in der Form von Verletzungen auf. Die primäre Verletzung
ist eine warzenartige Hautschädigung,
die spontan heilt und der nur zweite Schädigungen folgen, die große, warzenartige
Knoten sind, die über
die Hautoberfläche
weit verteilt sind. Die späte Stufe
der Erkrankung ist durch Gummas von verschiedenen Knochen, die Nasopharynx
und auch Zerstörungsschäden der
Haut, Lymphknoten und Knochen gekennzeichnet. Die Haut über der
Gummas kann als Geschwür
auftreten. Die Erkrankung ist in primitiven, tropischen Gegenden
in Teilen Südamerikas,
Zentralafrikas und Südasien
heimisch und wird in direktem Kontakt mit der infizierten Haut verbreitet.
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Obwohl
es einige Behandlungen für
die treponemale Infektion gibt, wird die Kontrolle der treponemalen
Erkrankungen dadurch ausgeübt,
dass eine Verbreitung von Person zu Person verhindert wird. Daher
ist die frühe
Erkennung der treponemalen Infektion für die Verminderung der weitverbreiteten
Ausstreuung der betreffenden Erkrankungen wichtig.
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Gebraucht
werden deshalb genaue und verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen
für eine wirksame,
genaue, frühe
Diagnose der T.-pallidum-Infektion
und Verfahren zur Überwachung
der T.-pallidum-Therapie. Sellay et al. offenbart in „Sexually
Transmitted Diseases",
1998, 25/8, S. 408-414, die Molekülstruktur von T. pallidum,
Unterart pallidum. In der WO-A-9502186 ist eine Diagnoseanalyse
für T.
pallidum offenbart. Fraser et al. offenbart in „Science", 1998, 28/(5375), S. 375-388, das vollständige Genom
der T. pallidum.
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Gemäß einer
ersten Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Feststellung des Vorhandenseins der Treponema pallidum, von antitreponemalen
Antikörpern
oder von beidem in einer biologischen Probe vorgesehen, wobei das
Verfahren folgende Schritte aufweist:
- (a) ein
isoliertes, teponema-pallidum-saures Dauerprotein oder ein oder
mehrere isolierte, immunogene Treponema-pallidum-Peptide des sauren
Dauerproteins wird bzw. werden mit einer antikörper-enthaltenden, biologischen
Probe in Kontakt gebracht und
- (b) die Bildung eines Komplexes zwischen dem immunogenen Protein
oder Peptid und einem Antikörper der
biologischen Probe wird festgestellt, wobei das Vorhandensein des
Komplexes das Vorhandensein der Treponema pallidum, der antitreponemalen
Antikörper
oder von beidem in der biologischen Probe anzeigt.
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Gemäß einer
weiteren Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
eines isolierten, immunogenen Treponema-pallidum-Peptids vorgesehen,
das eine Aminosäurensequenz
aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die die SEQ-ID-Nrn. 2, 4, 6-18 und
konservative Änderungen
davon im Verfahrenn nach einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.
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Gemäß einer
weiteren Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
eines Antikörpers vorgesehen,
der sich speziell an ein teponema-pallidum-saures Dauerprotein oder
ein immunogenes Peptid des sauren Dauerproteins zur Feststellung
einer Treponema-pallidum-Infektion binden kann.
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Gemäß einer
weiteren Ausbildung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
eines isolierten, immunogenen Treponema-pallidum-Peptids zur Feststellung
einer Treponema-pallidum-Infektion vorgesehen, wobei dieses Peptid
eine Aminosäurensequenz
aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die die SEQ-ID-Nrn. 2-4, 6-18 und
konservative Änderungen
davon enthält.
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Gemäß einer
weiteren Ausbildung ist ein Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins
der Treponema pallidum in einer biologischen Probe vorgesehen, wobei
das Verfahren folgende Schritte aufweist:
- – ein isolierter
Antikörper,
der sich speziell an ein treponema-pallidum-saures Dauerprotein
oder an ein immunogenes Peptid des sauren Dauerproteins zur Feststellung
einer Treponema-pallidum-Infektion binden kann, wird mit einer biologischen
Probe in Kontakt gebracht und
- – die
Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und einem sauren Dauerprotein
oder Peptid wird festgestellt, das sich in der biologischen Probe
befindet, wobei das Vorhandensein des Komplexes das Vorhandensein
der Treponema pallidum anzeigt.
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Es
wird auch ein Antikörper
vorgesehen, der sich an ein treponema-pallidum-saures Dauerprotein oder
an ein immunogenes Peptid des sauren Dauerproteins binden kann,
wobei das immunogene Peptid die Aminosäuren 128-407 der SEQ-ID-Nr.
1 enthält.
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Wirksame
und empfindliche Verfahren und Zusammensetzungen zur Feststellung
einer Treponema-pallidum-Infektion werden vorgesehen. Insbesondere
werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Feststellung der Treponema
pallidum (T. pallidum) vorgesehen. In Übereinstimmung mit den Verfahren
wird eine Probe für
das Vorhandensein von Proteinprodukten besonderer Gene, nämlich die
sauren Dauerproteingene (arp-Gene), analysiert. Insbesondere werden
Verfahren zur Feststellung von T. pallidum, die auf der Feststellung
von bestimmten Peptiden beruhen, und/oder von abgeschiedenen, sauren
Dauerproteinprodukten und Antikörpern
gegen diese Proteine bzw. Peptide in infizierten Individuen vorgesehen.
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Ferner
werden Verfahren vorgesehen, bei denen Proben mit Antikörpern, die
für die
T.-pallidum-Antigene spezifisch sind, beispielsweise immunogene
Proteine, unter Bedingungen kombiniert werden, die die Bildung eines
Antikörper-Antigen-Komplexes
zulassen. Insbesondere werden Verfahren vorgesehen, bei denen die
Proben mit Proteinen oder Peptiden des arp-Gens kombiniert werden.
Die Feststellung der Antikörper
zeigt das Vorhandensein der T. pallidum in einem Patienten an.
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Bei
einer bevorzugten Ausführung
der vorliegenden Erfindung werden analysenenthaltende Verfahren zur
Feststellung von verschiedenen Genprodukten der Antigensequenzen
vorgesehen.
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Bei
einer weiteren Ausführung
der vorliegenden Erfindung werden Verfahren vorgesehen, die für die Feststellung
des arp-Gens, des sauren Dauerproteins, spezifisch sind.
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Gemäß einer
weiteren Ausbildung der vorliegenden Erfindung sind Verfahren und
Zusammensetzungen zur unterschiedlichen Diagnose der treponemalen
Infektion vorgesehen. Insbesondere sind Verfahren vorgesehen, bei
denen eine spezifische Identifizierung der Treponema pallidum, Unterart
pallidum, der Treponema pallidum, Unterart pertenue und der Treponema
pallidum, Unterart endemicum möglich
ist.
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Demgemäß besteht
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, eine empfindliche
Analyse zur Feststellung der T. pallidum zu schaffen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Analyse
zu schaffen, die Proteine feststellen kann, die antigene Genprodukte
der T. pallidum feststellen kann.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur frühen
Feststellung der primären
Syphilis zu schaffen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren
und Zusammensetzungen zur unterschiedlichen Diagnose von Syphilis,
Drehschwindel und Bejel zu schaffen.
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Ebenfalls
wird ein Arbeitsgerät
zur automatisierten Punktverwendungsanalyse zur Feststellung der
T. pallidum in biologischen Proben offenbart.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur frühen
Feststellung der T. pallidum zu schaffen, das von antigenen Proteinen
unabhängig
ist, die gänzlich
in der Zytoplasmamembran des Infektionsmittels enthalten sind.
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Ebenfalls
ist ein Verfahren zur Behandlung einer T.-pallidum-Infektion offenbart,
wobei dieses Verfahren Antikörper
verwendet, die gegen antigene Genprodukte der T. pallidum gerichtet
sind.
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Eine
zusätzliche
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Immunoanalyse
zur Feststellung der antigenen Genprodukte der T. pallidum anzugeben.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur Feststellung eines sauren Dauerproteins zu schaffen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Immunoanalyse
zur Feststellung von Syphilis, Drehschwindel oder Bejel zu schaffen,
wobei dieses Verfahren ein saures Dauerprotein und/oder von diesem
Protein abgeleitete Peptide verwendet.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Feststoffteilchen
anzugeben, das bei einer zytometrieartigen Schnellflussdiagnose
der T. pallidum verwendet werden kann.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Feststoffteilchen
anzugeben, das bei einer verklebungsartigen Analyse für eine schnelle
Diagnose einer T.-pallidum-Infektion verwendet werden kann.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur Feststellung der T. pallidum zu schaffen, das eine enzymatische
Verstärkung
(ELISA) enthält.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Analyse
anzugeben, die Antikörper
für die
T. pallidum feststellen kann.
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Ein
Arbeitsgerät
für die
automatisierte Punktverwendungsanalyse zur Feststellung von Anti-T.-pallidum-Antikörper in
biologischen Proben ist ebenfalls offenbart.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Immunoanalyse
zur Feststellung von Antikörpern
gegen die T. pallidum zu schaffen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur Feststellung von Antikörpern
für ein
saures Dauerprotein zu schaffen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Immunoanalyse
zur Feststellung von Antikörpern
gegen ein saures Dauerprotein in Patienten zu schaffen, die mit
Syphilis, Drehschwindel oder Bejel infiziert sind, wobei diese Immunoanalyse
saures Dauerprotein und/oder von diesem Protein abgeleitete Peptide
verwendet.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Feststoffteilchen
vorzusehen, das bei einer zytometrieartigen Schnellflussdiagnose
einer T.-pallidum-Infektion
verwendet werden kann, wobei ein arp-Protein oder Peptide verwendet
werden.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur Feststellung von Anti-T.-pallidum-Antikörper zu schaffen, das eine
enzymatische Verstärkung
(ELISA) aufweist.
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Diese
und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung
gehen aus der Lektüre
der folgenden, ausführlichen
Beschreibung von offenbarten Ausführungen und den beigefügten Ansprüchen hervor.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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In
den Figuren ist Folgendes gezeigt:
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1 eine
schematische Darstellung eines Western-Blot-Gels, die die Fähigkeit
von syphilitischen Kaninchenseren zeigt, ein rekombinantes arp-Protein
zu erkennen,
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2 den
Aufbau eines sauren Dauerproteins, der die mogliche, membranumfassende
Domäne,
die mögliche
Stelle der Dignalpeptidase-I-Schnittstelle, das Hydrophilizitäts-Plotting
des Proteins und den möglichen
Antigenindex des Proteins zeigt,
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3 ein
Schaubild zur Darstellung der Reaktion verschiedener Peptide, die
von verschiedenen Bereichen des sauren Dauerproteins (volle Vierecke
stellen die SEQ-ID-Nr. 9, leere Kreise die SEQ-ID-Nr. 10, volle
Kreise die SEQ-ID-Nr. 13 und leere Dreiecke stellen die SEQ-ID-Nr. 14 dar) isoliert
sind, mit syphylitischen, menschlichen Seren,
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4 ein
Schaubild zur Darstellung der Ergebnisse der ELISA zur Feststellung
des Vorhandenseins von Anti-arp-Antikörpern in Menschen,
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5 die
Nukleotidsequenz für
die Treponema pallidum,
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6 die
vollständige
Aminosäurensequenzliste
für die
T. pallidum, Unterart pallidum (SEQ-ID-Nr. 2), und auch verschiedene
Arten von Wiederholungen, die in der Sequenz auftreten,
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7 die
Nukleotidsequenz für
die T. pallidum, Unterart pertenue (CDC-2),
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8 die
vollständige
Aminosäurensequenzliste
für die
T. pallidum, Unterart pertenue, die CDC-2-Reihe (SEQ-ID-Nr. 4) und
verschiedene Arten von in der Sequenz auftretenden Wiederholungen,
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9 die
Nukleotidsequenz für
die T. pallidum, Unterart endemicum (Bosnien),
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10 die
vollständige
Aminosäurensequenzliste
für die
T. pallidum, Unterart endemicum, die Bosnien-Reihe (SEQ-ID-Nr. 6)
und verschiedene Arten von in der Sequenz auftretenden Wiederholungen,
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11 die
Proteinsequenzen für
bevorzugte arp-Proteine gemäß der vorliegenden
Erfindung,
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12 zwei
Schaubilder, die zeigen, dass die akute Syphilisinfektion (primäre) in drei
Stufen eingeteilt werden kann, die auf serologischen Antworten in
Richtung auf die arp-Proteine beruhen, und
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13 ein
repräsentatives
Schaubild, das die Ergebnisse von flusszytometrischen Analysen von menschlichen
Syphilisseren zeigt, die arp-Proteine verwenden.
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Ausführliche
Beschreibung
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Die
vorliegende Erfindung wird besser verstanden werden, wenn Bezug
auf die folgende, ausführliche Beschreibung
von besonderen, hier vorhandenen Ausführungen genommen wird.
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Definitionen
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Der
hier verwendete, unbestimmte und bestimmte Artikel soll „ein oder
mehrere" bedeuten
und den Plural einschließen,
wenn nicht der Kontext ungeeignet ist.
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Die
hier verwendeten Bezeichnungen „feststellen" oder „festgestellt" sollen die Verwendung
von bekannten Techniken zur Feststellung von biologischen Molekülen, beispielsweise
immunochemische oder histologische Verfahren bedeuten und beziehen
sich auf qualitative oder quantitative Bestimmungen des Vorhandenseins
oder der Konzentration des zu untersuchenden Biomoleküls.
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Mit „isoliert" ist ein biologisches
Molekül
gemeint, das frei von mindestens einigen der Komponenten ist, mit
denen es natürlicherweise
auftritt.
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Die
hier verwendete Bezeichnung „löslich" bedeutet teilweise
oder vollständig
in einer wässrigen
Lösung
gelöst.
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Peptide und Proteine für die Verwendung
zur Feststellung der T. pallidum
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die Verwendung von
vorher unidentifizierten Antigenproteinen, die in Feststellungsanalysen
zur Diagnose von Erkrankungen verwendet werden, die durch eine T.-pallidum-Infektion,
der primären
Syphilis, verursacht werden. Obwohl eine große Anzahl von Proteinprodukten
der T. pallidum früher
bei der Syphilisdiagnose verwendet worden ist, sind spezifische,
vorher unidentifizierte Proteine für eine genaue und frühe Syphilisdiagnose
oder für
eine unterschiedliche Diagnose von Syphilis, Drehschwindel und Bejel
besonders nützlich.
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Proteine,
die speziell in bekannten Analysen verwendet werden, umfassen ein
47kD-Lipoprotein,
ein 17kD-Lipoprotein und ein 15kD-Lipoprotein, von denen die meisten
sich in der Zytoplasmamembran gewöhnlich durch Lipidmodifikation
verankert und durch die sich ergebenden Aminoendlipidhälften verankert
zeigen. Obwohl alle diese Proteine in großen Mengen in der T. pallidum
vorhanden sind und obwohl sie hoch antigen sind, besteht ein ernster
Nachteil bei ihrer Verwendung für
die Diagnose darin, dass sie Hauptproteine aufweisen, die auf die
ganze Treponema antworten und die damit eine positive Diagnose nicht
schneller ermöglichen, als
wenn die ganzen Treponemalzellen verwendet werden.
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Obwohl
die Erfinder nicht wünschen,
durch die folgende Theorie gebunden zu werden, wird angenommen,
dass die ungewöhnliche
Außenmembranstruktur
der T. pallidum eine bedeutende Verzögerung der Wirtsantwort auf
die Syphilisinfektion verursacht und dass deshalb die frühen Fälle der
primären
Syphilis oft ein negative, treponemale Serologie zeigen. Die Außenmembran
oder Hülle
der T. pallidum scheint hauptsächlich
aus Lipiden mit nur einer sehr kleinen Anzahl von Proteinen zusammengesetzt
zu sein. Ferner wird angenommen, dass die in der Zytoplasmamembran
verankerten Proteine vom Wirtsimmunsystem geschützt werden, so dass sich deshalb
eine verzögerte
oder verminderte Immunantwort ergibt. Daher zeigen die auf membranverankerte
Proteine beruhenden Feststellanalysen oft eine Verzögerung der
serologischen Reaktivität, wobei
einige Patienten mit primärer
Syphilis falsche, negative Ergebnisse erzeugen.
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Im
Gegensatz zu den Proteinen, die früher bei T.-pallidum-Feststellanalysen
verwendet wurden, ermöglichen
die Proteine und Peptide gemäß der vorliegenden
Erfindung eine genaue Diagnose der T.-pallidum-Infektion in frühen Stufen.
Obwohl die Erfinder nicht an die folgende Theorie gebunden sein
möchten,
bewältigt
die Feststellung der abgeschiedenen Proteine gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung die genannten Probleme, die mit dem Aufbau der T.-pallidum-Außenmembran
verbunden sind, und diese Verfahren sind deshalb gegenüber den
bekannten Analysen besonders vorteilhaft, die sich auf geklonte,
membrangeschützte
Antigene stützen.
Ferner erzeugen abgeschiedene Antigenproteine eher eine feststellbare
Immunantwort als die membrangeschützten Antigene, wobei die Diagnose
durch die Erkennung der entsprechenden Antikörper erleichtert wird. Zusätzlich macht
die Wiederholungsnatur der Proteine diese äußerst antigen und daher für die frühe Feststellung
der Syphilis geeignet.
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Die
frühe Feststellung
ist für
die Behandlung entscheidend, da sie die darauf folgende Verschlechterung
zu sekundären
und tertiären
Syphilisformen verhindern kann, deren Symptome schwieriger und anstrengender
zu behandeln sind. Deshalb richten sich die Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung auf die Notwendigkeit der frühen Feststellung der primären Syphilis,
die bis heute einen ernsten Problembereich der Syphilisserologie
dargestellt hat. Die Nichols-Reihe der T. pallidum ist die typische
Reihe für
die T. pallidum, Unterart pallidum. Wie hier von den Erfindern beschrieben
wird, weist diese Reihe einzigartige Wiederholungssequenzen auf,
die jeweils 60 Basispaare lang sind, so dass sich ein Protein ergibt,
das vierzehn Wiederholungen enthält,
die jeweils aus 20 Aminosäuren
im Proteinkörper
zusammengesetzt sind (s. 6). Der Wiederholungsbereich
weist 6 Kodons für
Glutaminsäure
auf, und es wird angenommen, dass das Proteinprodukt ein pl von
etwa 4,3 aufweist, woraus sich der Name saures Wiederholungsprotein
(arp) herleitet. Es tritt eine geringe Änderung der 20 Aminosäuren auf,
aber die Wiederholungen bleiben zu mindestens 90% bis auf die letzten beiden
Wiederholungen in der Nichols-Reihe erhalten (seltene Substitutionen
bleiben generell erhalten). Die Nukleotidsequenz des sauren Wiederholungsproteins
ist in der Sequenzliste als SEQ-ID-Nr. 1 angegeben (s. auch 5),
und die Aminosäurensequenz
ist als SEQ-ID-Nr. 2 angegeben (s. auch 6).
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Obwohl
die Erfinder nicht auf der folgenden Theorie bestehen wollen, wird
angenommen, dass das arp-Genprodukt, das saure Wiederholungsprotein,
ein Protein aufweist, das in einer membranverankerten Form oder
in eine abgeschiedenen Form auftritt. Die Aufbaumerkmale des sauren
Wiederholungsproteins sind in 2 gezeigt
und weisen ein Hydrophobizitätsprofil
auf, und sie zeigen auch die Sequenz von einem der Wiederholungselemente
der Nichols-Reihe der T. pallidum. Das Protein weist ein leicht
basisches Aminoende auf, dem eine hydrophobe Ausweitung der Aminosäuren folgt,
die eine membranumfassende Domäne
für die membranverankerte
Form bildet. Eine Reihe von vier Alaninen tritt kurz hinter dem
Ende der möglichen
membranumfassenden Domäne
auf und bildet eine mögliche
Stelle für
eine Signalpeptidase-I-Spaltung. In der Nichols-Reihe der T. pallidum
wird der Hauptteil des Proteinrests durch Wiederholungsproteine
in Anspruch genommen, die etwa zwei Drittel des gesamten Leserahmens
in dieser Reihe bilden.
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Aktive
Teile der Immunogenbereiche des sauren Wiederholungsproteins können durch
Isolieren oder Synthetisieren von verkürzten Peptiden des sauren Wiederholungsproteins
identifiziert und dann durch Prüfen der
Peptide auf die Immunogenaktivität
geprüft
werden, wobei an sich bekannte Techniken und Verfahren verwendet
werden. Die vorliegende Erfindung richtet sich insbesondere auf
aktive Teile der Immunogendomäne des
sauren Wiederholungsproteins.
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Beispielsweise
enthält
ein bevorzugter, aktiver Teil des sauren Wiederholungsproteins etwa
die Aminosäuren
128-407 des Proteins, wie in der SEQ-ID-Nr. 1 dargelegt ist, oder besser
die Aminosäuren
168-187, wie ebenfalls in der SEQ-ID-Nr. 1 dargelegt ist, und besser
noch das Peptid, das die in der SEQ-ID-Nr. 15 dargelegte Aminosäurensequenz
aufweist.
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Bei
einer Ausführung
gemäß der vorliegenden
Erfindung weist ein bevorzugtes Protein oder Peptid für die Verwendung
in Übereinstimmung
mit den Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung das saure Wiederholungsprotein, das durch die in der SEQ-ID-Nr.
1 dargelegte Nukleotidsequenz kodiert wird, oder ein Immunogenfragment
davon auf.
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Bei
einer weiteren Ausführung
gemäß der vorliegenden
Erfindung weist ein bevorzugtes Protein oder Peptid für die Verwendung
in Übereinstimmung
mit den Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Immunogenfragment des sauren Wiederholungsproteins
auf, wobei dieses Fragment die in der SEQ-ID-Nr. 15 dargelegte Aminosäurensequenz
enthält.
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Bei
einer weiteren Ausführung
gemäß der vorliegenden
Erfindung weist ein bevorzugtes Protein oder Peptid für die Verwendung
in Übereinstimmung
mit den Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Immunogenfragment des sauren Wiederholungsproteins,
des arp3-Peptids, auf, wobei dieses Fragment die in der SEQ-ID-Nr.
9 dargelegte Aminosäurensequenz
enthält.
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Bei
einer weiteren Ausführung
gemäß der vorliegenden
Erfindung weist ein bevorzugtes Peptid für die Verwendung in Übereinstimmung
mit den Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ein aktives Fragment des sauren Wiederholungsproteins
auf, wobei dieses Fragment die in der SEQ-ID-Nr. 13 dargelegte Aminosäurensequenz
enthält.
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Bei
einer weiteren Ausführung
gemäß der vorliegenden
Erfindung weist ein bevorzugtes Peptid für die Verwendung in Übereinstimmung
mit den Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ein aktives Fragment des sauren Wiederholungsproteins
auf, wobei dieses Fragment eine der in den SEQ-ID-Nrn. 7-18 dargelegte Aminosäurensequenz
enthält.
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Der
Fachmann wird erkennen können,
dass individuelle Substitutionen, Löschungen oder Zufügungen,
die eine einzelne Aminosäure
oder einen kleinen Prozentsatz der Aminosäuren (typischerweise weniger als
5% oder noch typischer weniger als 1 %) in einer kodierten Sequenz ändern, zufügen oder
löschen,
konservativ modifizierte Variationen sind, wobei die Änderungen
die Substitution einer Aminosäure
durch eine chemisch ähnliche
Aminosäure
ergeben.
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In Übereinstimmung
mit einer Ausführung
des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Probe mit Antikörpern kombiniert, die spezifisch
für ein
Protein- oder Peptidprodukt
der Wiederholungsgensequenz unter Bedingungen sind, um einen Antikörper-Antigen-Komplex
zu bilden. Die Feststellung des Komplexes, der Antigenfangverfahren
verwendet, zeigt das Vorhandensein der T. pallidum im Patienten
an. Alternativ kann die Feststellung des Antigen-Antikörper-Komplexes,
der das Antigen als Sonde verwendet, das Vorhandensein einer vorhergehenden
oder gegenwärtigen
Infektion mit der T. pallidum anzeigen. Vorzugsweise ist das Proteinprodukt
der Wiederholungsgensequenz das saure Wiederholungsprotein oder
ein antigenes Peptidfragment davon.
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Peptid- oder
Proteinfragmente
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Das
saure Wiederholungsprotein wird vom T.-pallidum-Organismus isoliert
oder durch chemische oder biologische Verfahren synthetisiert, beispielsweise
eine Zellkultur, eine rekombinante Genexpression und eine Peptidsynthese,
wie es in den Beispielen beschrieben wird. Die rekombinante Technik
umfasst die Genverstärkung
von DNA-Quellen, die die Polymerase-Kettenreaktion verwenden, und
die Genverstärkung
von RNA-Quellen, die die umgekehrte Transkriptase/PCR verwenden.
Die Aminosäurensequenz
des sauren Wiederholungsproteins ist in der SEQ-ID-Nr. 2 dargelegt.
Die Peptide und Proteinfragmente des sauren Wiederholungsproteins
weisen vorzugsweise eine Aminosäurensequenz
innerhalb der Aminosäurensequenz
auf, die in der SEQ-ID-Nr. 2 dargelegt ist.
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Das
saure Wiederholungsprotein kann gemäß den Verfahren erzeugt werden,
die oben beschrieben sind und für
die immunogene oder antigene Aktivität geprüft sind, die dem Fachmann bekannte
Techniken und Verfahren verwenden. Beispielsweise kann das die volle
Länge aufweisende,
rekombinante, saure Wiederholungsprotein dadurch hergestellt werden,
dass das Bakulus-Genexpressionssystem oder E. coli verwendet wird,
das mit dem Expressionsvektorplasmid transformiert wird, das ein
vollständiges
arp-Gen aufweist. Die die volle Länge aufweisenden Proteine können in
individuelle Domänen
gespaltet werden oder so verarbeitet werden, dass sie verschiedene
Verfahren verwenden, beispielsweise das Verfahren, das von Enjyoji
et al. beschrieben worden ist (Biochemistry 34, S. 5725-5735, 1995).
In Übereinstimmung
mit dem Verfahren von Enjyoji et al. kann das rekombinante, saure
Wiederholungsprotein mit einem Verdauungsenzym, beispielsweise die
menschliche, neutrophile Elastase, behandelt und die Verdauungsmasse
gereinigt werden, wobei eine Heparinsäule verwendet wird, um Fragmente
zu gewinnen, die dann auf Immunogenizität geprüft werden.
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Alternativ
werden die Fragmente durch Verarbeitung des ganzen Proteins oder
von großen
Fragmenten des Proteins präpariert,
die die immunogene Aktivität
blockieren, um eine Aminosäure
zur Zeit zu entfernen. Jedes progressiv kürzere Fragment wird dann auf
die immunogene Aktivität
geprüft.
In ähnlicher
Weise können
Fragmente verschiedener Länge
synthetisiert und auf immunogene Aktivität geprüft werden. Durch Zunahme oder
Abnahme der Länge
eines Fragments kann der Fachmann die genaue Anzahl, die Identität und die
Sequenz der Aminosäuren
im Protein bestimmen, die für
die immunogene Aktivität
erforderlich sind, wobei eine Routineverarbeitung, die Synthese
und dem Fachmann bekannte Durchsuchungsverfahren verwendet werden.
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Die
hier verwendeten Bezeichnungen „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" sind austauschbar
und sollen ein Biomolekül
bedeuten, das aus zwei oder mehreren Aminosäuren zusammengesetzt ist, die
durch eine Peptidbindung verbunden sind.
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Der
Ausdruck „Peptide" soll Aminosäurenketten
(typischerweise L-Aminosäuren)
bedeuten, deren Alpha-Kohlenstoffe durch Peptidbindungen verbunden
sind, die durch eine Kondensierungsreaktion zwischen der Karboxylgruppe
des Alpha-Kohlenstoffs
einer Aminosäure
und der Aminogruppe des Alpha-Kohlenstoffs einer anderen Aminosäure gebildet
werden. Die Endaminosäure
an einem Kettenende (das ist das Aminoende) besitzt eine freie Aminogruppe,
während
die Endaminosäure
am anderen Kettenende (das ist das Karboxylende) eine freie Karboxylgruppe
besitzt. Als solcher bezieht sich der Ausdruck „Aminoende" (abgekürzt N-Ende) auf die freie Alpha-Aminogruppe
der Aminosäure
am Aminoende des Peptids oder auf die Alpha-Aminogruppe (Iminogruppe, wenn diese
Teil einer Peptidbindung ist) einer Aminosäure an einer anderen Stelle
im Peptid. In ähnlicher
Weise bezieht sich der Ausdruck „Karboxyende" (abgekürzt C-Ende)
auf die freie Karboxylgruppe der Aminosäure am Karboxyende eines Peptids
oder auf die Karboxylgruppe einer Aminosäure an einer anderen Stelle
im Peptid.
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Typischerweise
werden die ein Peptid darstellenden Aminosäuren in einer Reihenfolge nummeriert, wobei
am Aminoende begonnen wird und in Richtung auf das Karboxyende des
Peptids weitergezählt
wird. Wenn daher von einer Aminosäure gesprochen wird, die einer
anderen „folgt", so ist diese Aminosäure näher am Karboxyende
des Peptids als die vorhergehende Aminosäure angeordnet.
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Der
Ausdruck „Rest" wird hier so gebraucht,
dass er sich auf eine Aminosäure
bezieht, die in einem Peptid durch eine Amidbindung vorhanden ist.
Als solche kann die Aminosäure
eine natürlich
auftretende Aminosäure
sein, oder sie kann, wenn nichts Anderes gesagt ist, bekannte Analoggebilde
der natürlichen
Aminosäuren
sein, die in einer ähnlichen
Weise wie die natürlich
auftretenden Aminosäuren
arbeiten (das sind Aminosäuren-Nachahmungen).
Ferner weist eine Amidbindungs-Nachahmung
Peptidhauptteilmodifikationen auf, die dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannt sind.
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Der
Ausdruck „besteht
im Wesentlichen aus" wird
hier so verwendet, um alle diejenigen Elemente auszuschließen, die
Im Wesentlichen die wichtigen Eigenschaften der Peptide ändern würden, auf
die sich der Ausdruck bezieht. Daher schließt die Beschreibung eines Peptids,
das „im
Wesentlichen aus...besteht",
jede Substitution einer Aminosäure,
Zufügungen
oder Löschungen
aus, die im Wesentlichen die biologische Aktivität dieses Peptids ändern würden.
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Ferner
wird der Fachmann erkennen, dass, wie oben erwähnt wurde, individuelle Substitutionen,
Löschungen
und Zufügungen,
die eine einzelne Aminosäure
oder einen kleinen Prozentsatz der Aminosäuren (kleiner als 5%, typischerweise
weniger als 1 %) in einer kodierten Sequenz ändern, zufügen oder löschen, konservativ modifizierte
Variationen sind, bei denen diese Änderungen eine Substitution
einer Aminosäure durch
eine chemisch ähnliche
Aminosäure
ergeben. Konservative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche
Aminosäuren
vorsehen, sind an sich bekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten
jeweils Aminosäuren,
die konservative Substitutionen für einander bilden:
- 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
- 2) Asparaginsäure
(D), Glutaminsäure
(E);
- 3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
- 4) Arginin (R), Lysin (K);
- 5) Isoleuzin (I), Leuzin (L), Methionin (M), Valin (V) und
- 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y) Tryptophan (W).
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Die
Ausdrücke „isoliert" und „biologisch
rein" bezeichnen
ein Material, das im Wesentlichen frei von Komponenten ist, die
normalerweise dem Material in dessen Naturzustand beigefügt sind.
Daher enthalten die hier beschriebenen Peptide keine Materialien,
die normalerweise mit ihrer in-situ-Umgebung verbunden sind. Typischerweise
sind die hier beschriebenen, immunogenen Peptide mindestens zu etwa
80%, gewöhnlich
zu mindestens 90% und vorzugsweise zu mindestens etwa 95% rein,
wenn sie durch die Bandintensität
auf einem silbergefärbten
Gel gemessen werden.
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Die
Proteinreinheit oder -homogenität
kann durch eine Anzahl von an sich bekannten Verfahren festgestellt
werden, beispielsweise durch eine Elektrophorese einer Proteinprobe
mit Polyakrylamidgel, der eine Sichtprüfung auf Verfärbung folgt.
Für bestimmte
Zwecke wird eine hohe Auflösung
benötigt,
und es wird HPLC oder ein ähnliches
Mittel für
die Reinheitsprüfung
verwendet.
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Wenn
die immunogenen Peptide relativ kurz in ihrer Länge sind (d.h. kleiner als
etwa 50 Aminosäuren),
werden sie oft synthetisiert, wobei chemische Standardsynthesetechniken
für Peptide
verwendet werden.
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Die
Festphasensynthese, bei der die C-Endaminosäure der Sequenz an einem unlöslichen
Träger
angeheftet wird, gefolgt von einer sequentiellen Addition der restlichen
Aminosäuren
in der Sequenz, ist ein bevorzugtes Verfahren für die chemische Synthese der
hier beschriebenen, immunogenen Peptide. Techniken für die Festphasensynthese
sind dem Fachmann an sich bekannt.
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Alternativ
werden die hier beschriebenen, immunogenen Peptide dadurch synthetisiert,
dass die rekombinante Nukleinsäure-Methodologie
verwendet wird. Im Allgemeinen umfasst diese Methodologie die Schaffung
einer Nukleinsäuresequenz,
die die Peptide kodiert, die Platzierung der Nukleinsäure in einer
Expressionskassette unter Steuerung eines besonderen Promotors,
das Ausdrücken
des Peptids in einem Wirt, die Isolierung der ausgedrückten Peptide
und Polypeptide und falls erforderlich die Renaturierung der Peptide. Die
Techniken zur Führung
eines Fachmanns durch solche Prozeduren sind in der Literatur zu
finden.
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Wenn
die rekombinanten Peptide ausgedrückt sind, können sie gemäß Standardprozeduren
gereinigt werden, die eine Ammoniumsulfat-Ausfällung, Affinitätssäulen, eine
Säulenchromatografie,
eine Gelelektrophorese und dergleichen umfassen. Im Wesentlichen
werden reine Zusammensetzungen mit einer Homogenität von etwa
50-95% bevorzugt, und eine größere Homogenität von 80-95%
oder höher
ist noch besser für die
Verwendung als Therapeutikmittel.
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Der
Fachmann wird erkennen, dass nach der chemischen Synthese und der
biologischen Expression oder Reinigung die immunogenen Peptide eine
Ausbildung besitzen können,
die im Wesentlichen unterschiedlich zu den Naturausbildungen der
Peptidkomponenten sind. In diesem Fall ist es oft nötig, die
immunogenen Peptide zu denaturieren und zu vermindern und dann die
Peptide zu veranlassen, sich in eine biologisch und biochemisch
aktive Ausbildung zurückzufalten.
Verfahren zur Verminderung und Denaturierung von Proteinen und zur
Veranlassung der Zurückfaltung
sind dem Fachmann an sich bekannt.
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Die
Antigenität
des gereinigten Proteins kann bestätigt werden, beispielsweise
durch Aufzeigen der Reaktion mit dem T.-pallidum-Immunserum oder
mit den Anti-arp-Seren, die in einem Labortier erzeugt werden.
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Obwohl
die Erfinder nicht auf der folgenden Theorie bestehen wollen, ist
die vorliegende Erfindung besonders wünschenswert, weil die Feststellung
des sauren Wiederholungsproteins durch beispielsweise Immunoanalysen
die Nützlichkeit
des Proteins bei der Syphilisdiagnose, der Bestimmung des Immunzustands
des Patienten und bei der Einschätzung
des Fortschritts der Erkrankung beweist.
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Ein
weiterer, sehr vorteilhafter Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht
in der Fähigkeit,
die gewünschten
Proteine in großen
Mengen aus geklonten Genen zu erzeugen. Wie oben beschrieben wurde,
können
die Proteine dann in Diagnostikanalysen für die Syphiliserkennung durch
die Antikörpererkennung,
für den Antigenfang
oder für
die Entwicklung von Impfmitteln zur Behandlung der Syphilis verwendet
werden.
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Anti-T.-pallidum-Antigen-Antikörper
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Der
hier verwendete Ausdruck „Antikörper" (Einzahl und Mehrzahl)
umfasst monoklonale Antikörper, polyklonale,
chimärische,
Einzelketten-, bispezifische, simianisierte und humanisierte Antikörper und
auch Fab-Fragmente, die die Produkte eines Fab-Immunoglobulin-Expressionswörterbuchs
umfassen.
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Der
Ausdruck „Antigen" bezieht sich auf
eine Einheit oder einen Bruchteil der Einheit, die eine Immunantwort
in einem Säugetier
induzieren kann. Dieser Ausdruck umfasst Immunogene und Bereiche,
die für
die Antigenizität
oder die antigenen Entscheidungsfaktoren verantwortlich sind.
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Der
hier vorgesehene Antikörper
ist ein monoklonaler oder Polyklonaler Antikörper, der ein Bindungsvermögen an ein
T.-pallidum-Antigen aufweist, das aus einem Protein oder Peptid
besteht, das für
einen immunogenen Bereich repräsentativ
ist. Ein bevorzugtes Genziel weist das arp-Gen oder ein Glied der
arp-Genfamilie auf. Der bevorzugte Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper aufgrund
seiner größeren Besonderheit für das Antigen.
Der Antikörper
ist für
das arp-Protein spezifisch und weist nur eine minimale oder gar
keine Kreuzreaktivität
zu anderen T-pallidum-Proteinen oder -Peptiden auf. Vorzugsweise
ist der Antikörper
für das abgeschiedene
Protein spezifisch, das durch das arp-Gen, das saure Wiederholungsprotein
oder ein antigenes Peptidfragment dieses Proteins kodiert wird.
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Der
bevorzugte, monoklonale Antikörper
wird durch Immunisierung eines Tiers, beispielsweise einer Maus,
Ratte oder eines Kaninchen, mit einem ganzen Genproduktprotein,
beispielsweise dem sauren Wiederholungsprotein oder eines Peptids
dieses Proteins, präpariert.
Milzzellen werden von den immunisierten Tieren abgezogen sowie Hybridkörper, die
durch Verschmelzung von sensilibierten Milzzellen mit einer Myelomzelllinie,
beispielsweise murine SP2/O-Myelomzellen (ATCC, Manassas, VA), erzeugt
werden. Die Zellen werden eingeführt,
um durch Zufügen
von Polyethylenglykol zu verschmelzen. Die Hybridkörper werden
durch Beschichten der Zellen in einem Auswahlmedium chemisch ausgewählt, das
Hypoxanthin, Aninopterin und Thymidin (HAT) entrhält.
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Die
Hybridkörper
werden nacheinander auf die Fähigkeit
untersucht, monoklonale Antikörper
gegen die t.-pallidum-immunogenen Proteine zu erzeugen. Die immunogenen
Proteine, die für
Untersuchungszwecke verwendet werden, werden von analysierten Arten
gewonnen. Alternativ können
solche Proteine rekombinante Peptide enthalten, die gemäß an sich
bekannter Verfahren hergestellt werden. Die Antikörper erzeugenden
Hybridkörper,
die sich an die immunogenen Proteinpräparierungen binden, werden
geklont, erweitert und für
eine zukünftige
Produktion gefroren abgelagert. Der bevorzugte Hybridkörper erzeugt
einen monoklonalen Antikörper,
der einen IgG-Isotyp aufweist.
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Der
bevorzugte, polyklonale Antikörper
wird von immunisierten Tieren, beispielsweise von Mäusen oder
Kaninchen, mit den oben beschriebenen, immunogenen Proteinen oder
Peptiden präpariert.
Blut wird nacheinander von Tieren gesammelt, und die Antikörper werden
in Seren auf Bindungsreaktivität
mit den immunogenen Proteinen untersucht, vorzugsweise auf die Antigene,
die mit dem oben beschriebenen, monoklonalen Antikörper reagieren.
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Entweder
der monoklonale Antikörper
oder der polyklonale Antikörper
oder beide können
direkt mit einem erkennbaren Kennzeichen für die Identifizierung der T.
pallidum in einer biologischen Probe, wie sie oben beschrieben wurde,
gekennzeichnet werden. Kennzeichnungen für die Verwendung in Immunoanalysen
sind dem Fachmann allgemein bekannt und umfassen Enzyme, Radioisotope
und fluoreszierende, lumineszierende und chromogene Substanzen einschließlich gefärbter Partikel,
beispielsweise Kollodialgold und Latexkügelchen. Die Antikörper können auch
an eine Festphasensubstanz gebunden werden, um die Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes
von den nicht reagierenden Komponenten in einer Immunoanalyse zu
erleichtern. Beispielhafte Festphasensubstanzen umfassen Mikrotiterplatten,
Prüfröhren, magnetische,
plastische oder Glas-Kügelchen
und Gleitkörper,
sind aber auf diese nicht beschränkt.
Verfahren zur Ankopplung von Antikörpern an Festphasensubstanzen
sind dem Fachmann an sich bekannt.
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Alternativ
kann der Antikörper
durch eine Reaktion mit gekennzeichneten Substanzen indirekt gekennzeichnet
werden, die eine Affinität
zu Immunoglobulin, beispielsweise Protein A oder G oder sekundäre Antikörper, zeigen.
Der Antikörper
kann mit einer zweiten Substanz vereinigt werden und mit einer dritten
Kennzeichnungssubstanz festgestellt werden, die eine Affinität zu der
zweiten mit dem Antikörper
vereinigten Substanz aufweist. Beispielsweise kann der Antikörper mit
Biotin vereinigt werden, wobei die Kennzeichnung Avidin oder Streptavidin
verwendet wird. In ähnlicher
Weise kann der Antikörper
mit Hapten vereinigt und die Antikörper-Hapten-Verbindung festgestellt werden, wobei
Anti-Hapten-Antikörper
als Kennzeichnung verwendet werden. Diese und weitere Verfahren
der Kennzeichnung von Antikörpern
und Analysenverbindungen sind dem Fachmann an sich bekannt.
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Bei
einer bevorzugten Ausführung
ist der Antikörper
durch die Reaktivität
mit einem zweiten Antikörper indirekt
gekennzeichnet, der mit einem erkennbaren Kennzeichen versehen worden
ist. Der zweite Antikörper ist
vorzugsweise ein solcher, der sich an Antikörper eines Tiers bindet, von
dem der monoklonale Antikörper abgeleitet
ist. Mit anderen Worten, wenn der monoklonale Antikörper ein
Mausantikörper
ist, dann ist der gekennzeichnete zweite Antikörper ein Antimaus-Antikörper. Für den monoklonalen
Antikörper,
der in der unten beschriebenen Analyse zu verwenden ist, ist diese
Kennzeichnung vorzugsweise ein antikörperbeschichtetes Kügelchen,
insbesondere ein magnetisches Kügelchen.
Für den
polyklonalen Antikörper,
der in der hier beschriebenen Immunoanalyse zu verwenden ist, ist
die Kennzeichnung vorzugsweise eine elektrochemilumineszierende
Substanz.
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T.-pallidum-Immunoanalyse
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Eine
hochempfindliche T.-pallidum-Immunoanalyse, die ein oder mehrere
rekombinante oder isolierte Proteine oder Peptide für die Feststellung
der oben beschriebenen T.-pallidum-Antikörper verwendet, ist vorgesehen.
Die Immunoanalyse ist für
die Feststellung des Vorhandenseins der T.-pallidum-Infektion in einer Verschiedenheit
von Proben, insbesondere biologischen, von menschlichen, animalischen,
biologischen Flüssigkeiten
nützlich.
Die Probe kann von irgendeiner Quelle gewonnen werden, in der der
T.-pallidum-Organismus
existieren kann.
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Bei
einer ersten bevorzugten Ausführung
ist die Immunoanalyse derart ausgebildet, dass das antigene Protein
oder Peptid verwendet wird, um das Vorhandensein der T.-pallidum-Antikörper festzustellen.
Dies wird dadurch erreicht, dass die Festphasensubstanz mit dem
Protein oder den Peptiden beschichtet wird. Danach wird die biologische
Probe mit der beschichteten Oberfläche bebrütet, damit die Antikörper sich
an das Protein bzw. die Peptide binden kann.
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Ein
beispielhafter Mechanismus wird zur Bebrütung der biologischen Probe
und der beschichteten Oberfläche
bei einer Temperatur über
der Raumtemperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 20-45°C für etwa 10-150
Minuten verwendet. Besser noch werden die biologische Probe und
die beschichtete Oberfläche
bei einer Temperatur von etwa 37°C
für die
Dauer von etwa 60 Minuten bei Dunkelheit bebrütet. Die Ergebnisse dieser
Immunoanalyse sorgen für
eine direkte Anzeige der T.-pallidum-Infektion.
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Es
sei darauf hingewiesen, dass der Fachmann ein oder mehrere der oben
beschriebenen Antigene (arp-Peptide oder -Protein) bei jeder heterogenen oder
homogenen (Konkurrenz-)Immunoanalyse zur Feststellung der T.-pallidum-Infektion
verwenden kann. Wie oben erwähnt
wurde, werden die Peptide für
die Verwendung in der hier vorgesehenen Immunoanalyse auf die Festphasensubstanz
in einer Schicht aufgebracht. Die Festphasensubstanz kann jeden
Artikel aufweisen, der für
diesen Zweck geeignet ist. Geeignete Artikel sind dem Fachmann an
sich bekannt und umfassen Latexpartikel, Filterpapier und Glaskügelchen;
sie sind jedoch auf diese Artikel nicht beschränkt. Die bevorzugte Festphasensubstanz
ist eine kommerziell verfügbare ELISA-Mikrotiterplatte,
beispielsweise die Immunlon-2HBTM-Platte,
die von Dynex Technologies, Chantilly, Virginia, bezogen werden
kann.
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In Übereinstimmung
mit dem bevorzugten Verfahren werden das an eine Festphasensubstanz
gebundene Antigen und die den Antikörper enthaltende Flüssigkeit
für eine
genügende
Zeitspanne unter Bedingungen zusammen zur Reaktion gebracht, die
die Bindung des Antikörpers
an das Antigen fördern.
Der Fachmann sei darauf hingewiesen, dass die Reagenzien der Immunoanalyse
und die Proben in verschiedenen Kombinationen und Reihenfolgen reagieren
können.
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Ein
physikalisches Mittel wird verwendet, um die an die Festphasensubstanz
gebundenen Reagenzien von den ungebundenen Reagenzien zu trennen,
beispielsweise das Filtrat der Partikel, das Abgießen der
Reaktionslösungen
von den beschichteten Röhren
oder Sonden, die magnetische Trennung, die Kapillarwirkung und andere,
dem Fachmann an sich bekannte Mittel. Es sei darauf hingewiesen,
dass ein getrenntes Waschen der Festphasensubstanz im Verfahren
inbegriffen sein kann.
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Die
bei der Immunoanalyse gebildete Antigen-Antikörper-Komplex wird unter Verwendung
von dem Fachmann an sich bekannten Verfahren festgestellt. Die Komplexe
werden antimenschlichen Immunoglobulin-Antikörpern ausgesetzt, die mit einer
erkennbaren Markierung (Marker) gekennzeichnet worden sind. Solche
Marker umfassen chemilumineszente Kennzeichnungen, beispielsweise
Meerrettichperoxidase, elektrochemilumineszierende Kennzeichnungen,
beispielsweise FITC, und enzymatische Kennzeichnungen, beispielsweise
Alkaliphosphatase, β-Galaktosidase
und Meerrettichperoxidase. Vorzugsweise wird der feststellende Antikörper durch
Zufügen
einer Peroxidase-Kennzeichnung modifiziert.
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Der
gekennzeichnete Komplex wird dann durch die Verwendung einer Feststelltechnik
oder eines Instruments festgestellt, die bzw. das für die Feststellung
der verwendeten Kennzeichnung typisch ist. Vorzugsweise werden die
Komplexe mit einem ELISA-Leser, beispielsweise dem Ceres 900 HDL
(Biotek Instrument, Inc., Winooski, Vermont), zur Feststellung der
Peroxidase analysiert. Alternativ kann ein Becton-Dickinson-FACS-Sotierer
(Franklin Lakes, New Jersey) zur Feststellung der FITC-Kennzeichnung
verwendet werden. Lösliches
Antigen oder Antikörper
können
mit magnetischen Kügelchen
bebrütet
werden, die mit unspezifischen Antikörpern in einem identischen
Analysenformat beschichtet sind, um die Hintergrundwerte der in der
Analyse analysierten Proben festzustellen.
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Bei
einer zweiten bevorzugten Ausführung
ist die Immunoanalyse derart ausgebildet, dass sie die monoklonalen
(oder polyklonalen) Anti-arp-Antikörper verwendet, um das Vorhandensein
von arp-Peptiden und/oder Proteinen der T. pallidum in einer biologischen
Flüssigkeit
festzustellen. Dies wird dadurch erreicht, dass eine biologische
Probe bebrütet
wird, damit sich das Protein oder Peptid an den Antikörper binden
kann. Ein beispielhafter Mechanismus ist die Bebrütung bei
einer Temperatur über
der Raumtemperatur, vorzugsweise bei 20-45°C für etwa 10-150 Minuten oder
besser bei etwa 37°C
für 60 Minuten,
bei Dunkelheit. Die Ergebnisse dieser Immunoanalyse sorgen für eine direkte
Anzeige des Vorhandenseins der T.-pallidum-Infektion.
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Dem
Fachmann wird klar sein, dass ein oder mehrere der oben beschriebenen
Antikörper
in jeder heterogenen oder homogenen Konkurrenzimmunoanalyse zur
Feststellung einer T.-pallidum-Infektion verwendet werden kann.
Wie oben erwähnt
wurde, wird der Antikörper
für die
Verwendung bei der hier vorgesehenen Immunoanalyse mit einer erkennbaren
Kennzeichnung versehen oder an eine Festphasensubstanz angekoppelt. Vorzugsweise
werden sowohl ein monoklonaler Antikörper als auch ein polyklonaler
Antikörper
bei der Analyse verwendet, wobei der monoklonale Antikörper an
eine Festphasensubstanz gekoppelt und der polyklonaler Antikörper mit
einer erkennbaren Kennzeichnung versehen wird. Die Festphasensubstanz
kann jeden Partikel aufweisen, der für diese Verwendung geeignet
ist, die dem Fachmann an sich bekannt ist, wobei Latexpartikel, Filterpapier
und Glaskügelchen
verwendet werden, die Verwendung aber nicht auf diese beschränkt ist.
Die bevorzugte Festphasensubstanz ist eine kommerziell verfügbare ELISA-Mikrotiterplatte,
beispielsweise die Immunolon-2HBTM-Platte,
die von Dynex Technologies, Chantilly, Virginia, bezogen werden
kann.
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In Übereinstimmung
mit dem bevorzugten Verfahren werden die Probe und der an eine Festphasensubstanz
gebundene Antikörper
für eine
ausreichende Zeitspanne unter Bedingungen miteinander zur Reaktion
gebracht, die die Bindung des Antikörpers an das immunogene Protein
in der Probe fördern.
Das immunogene Protein weist vorzugsweise das saure Wiederholungsprotein
auf. Der Fachmann wird darauf hingewiesen, dass die Immunoanalysen-Reagenzien und die
Probe in verschiedenen Kombinationen und Reihenfolgen zur Reaktion
gebracht werden können.
Ein physikalisches Mittel wird verwendet, um die an die Festphasensubstanz
gebundenen Reagenzien von den ungebundenen Reagenzien zu trennen,
beispielsweise die Filtration der Partikel, das Abgießen der
Reaktionslösungen
von beschichteten Röhren
oder Sonden, die magnetische Trennung, die Kapillarwirkung und andere,
dem Fachmann an sich bekannte Mittel. Es sei auch darauf hingewiesen,
dass ein getrenntes Waschen der Festphasensubstanz im Verfahren
inbegriffen ist.
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Die
bei der Immunoanalyse gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe werden unter
Verwendung von Immunoanalysenverfahren festgestellt, die dem Fachmann
bekannt sind, einschließlich
der Sandwich-Immunoanalysen und Konkurrenzimmunoanalysen. Die Antigen-Antikörper-Komplexe
werden den Antikörpern
ausgesetzt, die denen ähnlich
sind, die zum Fangen des Antigens verwendet werden, die aber mit
einer erkennbaren Kennzeichnung versehen worden sind. Geeignete
Kennzeichnungen sind: chemilumineszente Kennzeichnungen, beispielsweise
Meerrettichperoxidase, elektrochemilumineszente Kennzeichnungen,
beispielsweise Ruthenium und Aequorin, biolumineszente Kennzeichnungen,
beispielsweise Luziferase, und fluoreszente Kennzeichnungen, beispielsweise
Alkaliphosphatase, β-Galaktosidase und
Meerrettichperoxydase. Vorzugweise wird die Kennzeichnung durch
Elektrochemilumineszenz festgestellt. Besser wird der feststellende Antikörper durch
Zufügen
einer Peroxydase-Kennzeichnung modifiziert.
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Der
gekennzeichnete Komplex wird dann unter Verwendung einer Feststelltechnik
oder eines Instruments festgestellt, die bzw. das für die Feststellung
der verwendeten Kennzeichnung spezifisch ist. Vorzugsweise werden
die Komplexe mit einem ELISA-Leser, beispielsweise dem Ceres 900
HDL (Biotek Instrument, Inc., Winooski, Vermont), zur Feststellung
der Peroxidase analysiert. Alternativ kann ein Becton-Dickinson-FACS-Sotierer
(Franklin Lakes, New Jersey) zur Feststellung der FITC-Kennzeichnung verwendet
werden. Lösliches
Antigen oder Antigene können
mit magnetischen Kügelchen
bebrütet
werden, die mit unspezifischen oder spezifischen Antikörpern in
einem identischen Analysenformat beschichtet sind, um die Hintergrundwerte
der in der Analyse analysierten Proben festzustellen.
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Analyseneigenschaften
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Die
hier vorgesehene Immunoanalyse erlaubt die Feststellung der T. pallidum
in einer Probe, wobei eine realistische Anzeige der Infektionsfolgen
hinsichtlich der Offenbarung der Erkrankung erlaubt wird.
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Die
hier beschriebene Feststellanalyse ist deshalb wirksam, weil sie
auf der Feststellung von immunogenen oder antigenen Proteinen beruht,
die für
spezifische Gensequenzen oder Antikörper für diese Proteine repräsentativ
sind. Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren arbeiten die Feststellanalysen
gemäß der vorliegenden
Erfindung nicht mit membrangebundenen, antigenen Proteinen, die
typischerweise mit der T. pallidum verbunden sind, und deshalb,
da die Feststellung die Erkennung abgeschiedener Proteine umfasst,
werden die Ergebnisse nicht durch Proteine behindert, die durch
Zytoplasmamembranen verankert oder geschützt sind. Die Feststellung,
die auf abgeschiedenen Proteinen beruht, wird bevorzugt, weil sie
eher eine frühe
Immunantwort im Vergleich mit membranverankerten Proteinen hervorbringen.
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Die
Analyse ist auch aus epidermiologischen Gründen wertvoll, weil sie dazu
verwendet werden kann, die Schwere von Infektionen bei einem Patienten
zu identifizieren. Beispielsweise kann eine große Menge an sauren Wiederholungsproteinen
mit vorgeschrittenen Stufen der Erkrankung korreliert werden. Das
ist besonders wichtig, weil die Diagnose der Erkrankung in einem
frühen
Stadium zu einer frühen,
wirksamen Behandlung führen
kann, wodurch eine Verschlechterung zu späteren, ernsteren Zuständen verhindert
wird. Im Gegensatz zu der hier beschriebenen Analyse werden die
gegenwärtig
verfügbaren
Analysen für
die T. pallidum generell für
ungenau und unwirksam gehalten, weil sie eine bedeutende Prozessdauer
erfordern und sich auf die Feststellung von antigenen Markern verlassen,
die typischerweise membrangebundene Proteine sind.
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Im
Gegensatz zu den bekannten, zur Zeit verwendeten Analysen stellt
das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung die T. pallidum durch Erkennung von abgeschiedenen, antigenen
Proteinen oder Antikörper
für diese
Proteine fest. Der Vorteil dieser Erkennungsart besteht darin, dass
die Analyse weder von der Erkennung des Parasiten in Teilchenform
noch von der Feststellung des Vorhandenseins von membrangebundenen
Proteinen abhängig
ist, die gewöhnlich
vom Wirtsimmunsystem geschützt
werden. Die auf dem Vorhandensein von abgeschiedenen Proteinantigenen
beruhende Feststellung erhöht
einerseits die Empfindlichkeit des Verfahrens und vermindert andererseits
die Zeitperioden für
die genaue Diagnose, wobei eine Erkennung der primären Syphilis
ermöglicht
wird.
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Differentialdiagnose der
T.-pallidum-Infektion
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Zusätzlich zum
Vorsehen von Nukleotid- und Aminosäurensequenzen für die T.
pallidum, Unterart pallidum (SEQ-ID-Nr. 1 bzw. 2), sieht die vorliegende
Erfindung auch vorher unidentifizierte Nukleotid- und Aminosäurensequenzen
vor, die der T. pallidum, Unterart pertenue (SEQ-ID-Nr. 3 bzw. 4
und 6), und der T. pallidum, Unterart endemicum (SEQ-ID-Nr.
5 bzw. 6 und 7) entsprechen. Daher kann der
Fachmann die Techniken verwenden, die von der vorliegenden Erfindung
für die
unterschiedliche Diagnose der T.-pallidum-Infektion angegeben sind, und dabei
ermitteln, ob die Erkrankung T. pallidum, Unterart pallidum, T.
pallidum, Unterart pertenue, oder T. pallidum, Unterart pertenue,
vorliegt. Diese Ermittlung ist besonders für die frühe Erkennung und Identifizierung
der Infektion wertvoll, weil sie die Kontrolle der weiteren Verbreitung
erleichtert. Ferner ermöglicht
die spezifische Identifizierung jeder der Treponema-Unterarten die
Entwicklung spezifischer Antikörper,
die bei den therapeutischen Behandlungen verwendet werden können. Ein
weiterer Vorteil der spezifischen Identifizierung der besonderen
Unterart besteht darin, dass die Bestätigung der besonderen Erkrankung,
entweder Syphilis, Drehschwindel oder Bejel, erfolgen kann, so dass
geeignete Maßnahmen
ergriffen werden können,
um die verschiedenen Symptome entweder zu verhindern oder mindestens
zu vermindern.
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Obwohl
die Erfinder nicht auf der folgenden Theorie bestehen wollen, wird
angenommen, dass die Antikörpertiter
gegen das arp-Protein abfallen werden, wenn der Organismus eliminiert
worden ist. Dies legt nahe, dass die die arp-Peptide bzw. -Proteine für die Immunoerkennung
der antitreponemalen Antikörper
verwendenden Analysen dazu benutzt werden können, zwischen den akuten Infektionen
und den vergangenen Infektionen zu unterscheiden.
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Die
Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1
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Eigenschaften
des sauren Wiederholungsproteins
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Die
Gene, die für
die sauren Wiederholungsproteine der T. pallidum (Nichols-Reihe, CDC-2-Reihe
und Bosnien-Reihe) wurden geklont. Die Nukleotidsequenzen sind in
den SEQ-ID-Nrn. 1, 3 und 5 (Genbank-Zugang Nr. Afo15824) wiedergegeben.
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Das
arp-Protein der Nichols-Reihe ist durch eine Membrandomäne, eine
Signalpeptidase-I-Schnittstelle und 14 fast identische Wiederholungen
gekennzeichnet (s. 2). Der obere Teil der 2 stellt
das Hydrophobizitätsblotting
des Proteins gemäß dessen
primärer
Sequenz dar. Das Meiste des Proteins ist hydrophil, und deshalb
wird angenommen, obwohl die Erfinder nicht auf der folgenden Theorie
bestehen wollen, dass diese Eigenschaft dem Proteinantigenindex
(unterer Teil der 2) entspricht. Am N-Anschlussende gibt es
eine Erweiterung der hydrophoben Aminosäuren (aa27-aa43), die den Abfall im Hydrophobizitätsplotting bildet.
Dieser Bereich ist die mögliche
membranumfassende Domäne.
Sofort nach der membranumfassenden Domäne tritt eine mögliche Signalpeptidase-I-Schnittstelle auf.
Das bedeutendste Merkmal des arp-Proteins sind die 14 fast identischen
Wiederholungen, von denen jede eine Länge von 20 Aminosäuren aufweist.
Die Wiederholungen weisen sehr viele Glutaminsäuren auf, so dass das niedrige,
vorgenannte pl von 4,3 bestätigt wird.
Die Wiederholungen werden aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in vier Typen
klassifiziert. Die Wiederholungen des Typs II betragen 42% der Gesamtwiederholungen
(6 von 14) und waren der vorherrschende Typ. Es wird vorausgesagt,
dass die Meisten der T.-pallidum-Arten diesen Wiederholungstyp aufweisen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass die
aus diesem Wiederholungsbereich stammenden Proteine die nützlichsten
bei der Serodiagnose sind. Dies wird unten gezeigt.
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Beispiel 2
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Mögliche Verwendungen der arp-Proteine
bei der Syphilisdiagnose
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Die
folgenden Studien waren auf die weiteren Eigenschaften des arp-Proteins
mit dem Schwerpunkt im Bereich der immunogenen Peptide gerichtet.
Die nun identifizierten, immunogenen Peptide dienen als Ziele für den Aufbau
von immunodiagnostischen Arbeitsgeräten, die eine verbesserte und überlegene
Empfindlichkeit aufweisen.
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Nach
der Entdeckung des Hydrophobizitätsplotting
des arp-Proteins und dessen antigenen Indexes gemäß der Proteinsequenz
stellten die Erfinder zuerst die Hypothese auf, dass bestimmte Bereiche
des arp-Proteins immunogen sein können. Die Peptidfragmente aus
dem Wiederholungsbereich des Proteins wurden präpariert und für die Immunisierung
von Kaninchen verwendet. Es wurde entdeckt, dass die Seren von peptidimmunisierten
Kaninchen das ausgedrückte,
rekombinante Protein von einem arp-gen-enthaltenden Plasmid erkannten. Ferner
erkannten die Seren von treponemal infizierten Kaninchen ebenfalls
dieses rekombinante Protein (Western Blottanalysen sind in 1 gezeigt:
Säule 1
= gesamtes T.-pallidum-Protein, das durch Anti-T.-pallidum-Serum
identifiziert wird; Säule
2 = Antipeptid-[1, 2, 3]-Seren, die verfehlten, das arp in den gesamten
T.-pallidum-Proteinextrakten zu identifizieren; Säule 3 =
rekombinantes arp-Protein, das durch Anti-arp-Peptidserum identifiziert wird; Säule 4 =
arp-Protein, das durch Anti-T-pallidum-Serum
identifiziert wird; Säule
5 = vorherige Ausblutungskontrolle [Blutung unmittelbar vor der
Antigeninjektion]).
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Beispiel 3
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Immunantwort in Richtung
auf die Peptide des T. pallidum-Wiederholungsproteins
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Aus
verschiedenen Bereichen des arp-Proteins abgeleitete Peptide wurden
bei diesem Experiment verwendet (s. 1). Syphilitische,
menschliche Seren wurden in einer ELISA-Analyse verwendet, um die
Reaktivität
in Richtung dieser Peptidfragmente festzustellen. Die syphilitischen
Seren waren entweder schnelle plasmareagenzien-(RPR)-positiv oder
-negativ (RPR+ oder RPR–)
gemäß kommerziellen
RPR-Prüfgeräten. Es
wurde entdeckt, dass die Meisten der positiven RPR-Seren mit den
arp-Peptiden 3, 7 und 9 stark reagierten, während keines der negativen
RPR-Seren mit einem der Peptide reagierte. Die Reaktivität wurde
bei einer Verdünnung
von 1:100 festgestellt (die meisten kommerziellen ELISA-Geräte verwenden
eine Verdünnung
von 1:20 für
die Feststellung).
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Weitere
Peptide (Peptide 1-12, mit Ausnahme von 3, 7 und 9) waren entweder
vom N-Anschlussende oder C-Anschlussende des arp-Proteins oder von
Wiederholungen des Typs I, III oder IV abgeleitet. Obwohl die Erfinder
nicht auf die folgende Feststellung bestehen wollen, zeigen die
Analysen, die auf den Reaktivitäten dieser
syphilitischen Seren auf die Peptide beruhen, dass einer der immunogenen
Bereiche an Aminosäuren DVPK
gebunden ist.
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Die
Ergebnisse dieser Studie sind in 3 grafisch
dargestellt.
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Beispiel 4
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Sequenzvergleiche zwischen
den arp-Proteinen der T.-pallidum-Unterarten
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Die
arp-Gene der beiden Typreihen CDC-2 und Bosnien von jeder der T.-pallidum-Unterarten
T.-pallidum, Unterart pertenue, und T.-pallidum, Unterart endemicum,
wurden geklont und geprüft.
Die Gensequenzen zeigten eine bedeutende Homologie mit der Nichols-Reihe
der T.-pallidum, Unterart pallidum. Das 5'-Ende und das 3'-Ende der Gene der drei Unterarten sind
vollständig
identisch, während
die Wiederholungsbereiche einige Änderungen aufwiesen. Die interessante
Beobachtung war, dass das übersetzte
arp-Protein der beiden Unterarten einen einzelnen Wiederholungstyp,
den Typ II, zeigten, der der domonante Typ in der Nichols-Reihe
ist. Dieser Befund bestätigt,
dass diejenigen Peptide, die in Bereichen mit dem dominanten Wiederholungstyp
(Typ II) synthtisiert worden sind, immunogen sind (wie in 4 gezeigt
ist). Die anderen Wiederholungen (Typen I, III und IV) sind ebenfalls
immunogen.
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Beispiel 5
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ELISA-Analyse, die eine
arp-peptid-klassifizierte Syphilisinfektion in zwei Stufen verwendet
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Das
Peptid arp-Nr.9 (SEQ-ID-Nr. 15) wurde bei diesem Experiment verwendet
(8). Die Seren von Patienten mit akuter Syphilisinfektion
wurden in einer ELISA-Analyse geprüft. Alle Patienten bei dieser
Studie hatten positive PCR-Reaktionen
in ihren Geschwürproben.
Es stellte sich heraus, dass die Patienten in Klassen eingeteilt
werden können,
und zwar in eine frühe
Infektion (IgM-positiv), eine Zwischeninfektion (sowohl IgM- als
auch IgG-positiv) und eine späte
Infektion (nur IgG-positiv).
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Beispiel 6
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Schnelle, flussmetrische
Analysen der Syphilisinfektion
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Ein
Flusszytometer ist routinemäßig in Immunologielaboratorien
verwendet worden. Die LuminexTM-Gesellschaft
hat ein System entwickelt, mit dem eine Diagnose von vielen Erkrankungen
und Erkranungsmarker leicht vervielfacht werden können. Gängige Prüfungen,
die entwickelt worden sind oder gerade entwickelt werden, umfassen
die menschlichen Zytokine (IL-2, 3, 4,6 usw.) und virale und bakterielle
Infektionen (HIV, Hepatitis usw.). Die Peptide arp-Nr. 9 wurden
an Biotin-Moleküle
angekoppelt. Dieses mit Biotin versetzte Peptid wurde ferner an
Strepavidin-Kügelchen
gebunden, die von der LuminexTM-Gesellschaft bezogen wurden.
Zwei Seren wurden mit diesem System geprüft. Es war klar, dass die positiven
RPR-Seren in der Analyse stark reagierten, während die normalen RPR-Seren
eine sehr geringe Hintergrundmenge der fluoreszierenden Antwort
aufwiesen (9). Dieses Ergebnis zeigte die
Möglichkeit
der Vervielfachung der arp-Peptidkügelchen gemäß der vorliegenden Erfindung
gegenüber
anderen, klinischen Prüfungen,
die das Luminex-System verwenden.
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