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CN111593132B - 一种基于tp0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法 - Google Patents

一种基于tp0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法 Download PDF

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CN111593132B CN202010526821.4A CN202010526821A CN111593132B CN 111593132 B CN111593132 B CN 111593132B CN 202010526821 A CN202010526821 A CN 202010526821A CN 111593132 B CN111593132 B CN 111593132B
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Abstract

本发明公开了一种基于TP0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法，涉及一种对梅毒螺旋体不同菌株的分子分型方法，所述方法利用梅毒螺旋体属TP0136蛋白异质性建立。本发明方法通过检测梅毒螺旋体不同菌株TP0136基因异质性，用于区分梅毒螺旋体不同亚型，弥补了梅毒分子分型检测方法的不足；具有检测结果确切、灵敏度高的特点，易于推广。

Description

一种基于TP0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的 分子分型方法
技术领域
本发明涉及一种对梅毒螺旋体不同菌株的分子分型方法，具体涉及一种基于非诊断或治疗目的的TP0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体感染所致的一种性传播疾病，位居我国乙类传染病第三位。梅毒螺旋体的先天传播是发展中国家导致胎儿和围产儿死亡的首要因素。梅毒螺旋体感染引起的早期黏膜损害(硬下疳)为HIV提供进入人体门户，使感染和传播HIV的危险性增加，对公众健康造成严重威胁。因此，有效防控梅毒螺旋体感染迫在眉睫。梅毒螺旋体分子分型系统不仅是开展梅毒分子流行病学研究的重要手段，有助于阐述基因型别与菌株的毒力、侵袭性之间的关系，而且可以评价基因型别与病程分期、疾病结局以及临床耐药之间的关系，为制定梅毒螺旋体防治策略及其效果评价提供依据。
美国疾控中心研究团队根据梅毒螺旋体菌株间arp基因重复片段个数差异，将arp具有分为以2～22共21个亚型；根据tpr EGJ基因酶切后RFLP图谱，将tpr分为a～p共16个亚型，创立了梅毒螺旋体分子分型方法，俗称CDC分型。随后，Marra等根据TP0548基因异质性采用测序技术，将TP0548基因分为a～i共9个亚型。Katz等根据rpsA基因G重复数目差异，将rpsA分为8～11共4个亚型。由于rpsA分型效率不佳，因此目前更多研究团队选择将CDC和TP0548分型法结合起来，称为新的分型方法。近年来，研究者对多个可变位点进行分析，试图选取TP0279、TP0558、TP0326等新的基因位点用于临床鉴别，但分型效率均不理想。因此，现有的梅毒螺旋体分型方法不仅无法满足临床梅毒诊断需求，而且无法区分我国近90％梅毒感染者中梅毒螺旋体分子型别，无法准确的用于我国梅毒分子流行病学研究及用于临床评估，临床迫切需要一种更有效的梅毒螺旋体分子分型方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种快速、准确、简便、适于区分梅毒螺旋体不同菌株的分子分型方法，以便于梅毒螺旋体感染的鉴别诊断和分子流行病学研究。我们前期研究发现，在梅毒螺旋体不同菌株中TP0136存在基因异质性。利用这一特点，本文通过研究梅毒螺旋体不同菌株中TP0136基因异质性，建立一种新的梅毒螺旋体分子分型方法。本发明利用梅毒螺旋体不同菌株TP0136存在的基因异质性，基于分子生物学技术，建立新的TP0136分子分型方法，并与传统三基因分型法相结合，建立的TP0136分子分型方法，有助于梅毒螺旋体分子流行病学研究，揭示梅毒螺旋体属分子分型与临床特性之间的关联，还有助于传统梅毒螺旋体分子分型体系的进一步完善。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种基于非诊断或治疗目的的TP0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法，所述方法利用梅毒螺旋体属TP0136蛋白异质性建立；具体步骤为：梅毒螺旋体属菌株传代和提取；梅毒螺旋体属TP0136序列分析和引物设计；梅毒螺旋体属TP0136DNA扩增、测序和分型。
进一步的，所述的梅毒螺旋体属包括9株梅毒苍白密螺旋体和广东省内临床梅毒患者分离的23株梅毒苍白密螺旋体临床分离株；所述9株梅毒苍白密螺旋体包括NicholsHouston株、Nichols Seattle株、Nichols Dallas株、DAl-1株、Bal73-1株、Seattle81-4株、Chicago株、MexicoA株、SS14株。
进一步的，步骤(1)中所述的梅毒螺旋体属菌株传代是在新西兰白兔睾丸内进行的。
进一步的，步骤(1)中所述的梅毒螺旋体属菌株提取中所用到的1X细胞裂解缓冲液中包含10mM Tris，0.1M EDTA，0.5％SDS；2X细胞裂解缓冲液中包含20mM Tris-HCl,0.2MEDTA,1％SDS。
进一步的，步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属TP0136DNA扩增时所用到的引物序列如SEQ ID NO:1-3所示。
进一步的，步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属TP0136DNA扩增时所用到的PCR扩增反应试剂为每50μL PCR扩增反应试剂含5μL待检测DNA样本、200μM dNTPs、5μL10×Go TaqPCR缓冲液、1.5mM MgCl 2、0.6μM TP0136引物、0.5U热启动Taq PCR聚合酶。
进一步的，步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属TP0136DNA扩增时的条件控制为95℃变性10min；95℃1min、60℃2min、72℃1min，共45个循环；最后72℃延伸10min。
进一步的，步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属TP0136DNA测序是将PCR扩增的产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定及纯化回收，双向DNA测序法进行测序。
相较于现有技术而言，本发明具有如下有益效果：
本发明方法通过检测梅毒螺旋体不同菌株TP0136基因异质性，用于区分梅毒螺旋体不同亚型，弥补了梅毒分子分型检测方法的不足；具有检测结果确切、灵敏度高的特点，易于推广。
附图说明
图1是梅毒螺旋体TP0136基因的PCR产物电泳图；
其中，左侧为梅毒TP0136基因扩增产物；右侧为DNA分子量标准。
图2是梅毒螺旋体TP0136基因的分型结果图；
其中，根据梅毒螺旋体TP0136基因的异质性共分为6个亚型，其中NicholsHouston、Bal73-1和Chicago的基因序列一致，分为第一型；Nichols Dallas和NicholsSeattle的基因序列一致，分为第二型；其余四型分别依次为Dal-1、Seattle 81-4、SS14和Mexico A。
具体实施方式
一种基于非诊断或治疗目的的TP0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法，所述方法利用梅毒螺旋体属TP0136蛋白异质性建立；步骤为：梅毒螺旋体属菌株传代和提取；梅毒螺旋体属TP0136序列分析和引物设计；梅毒螺旋体属TP0136 DNA扩增、测序和分型。具体如下：
(一)梅毒螺旋体的新西兰白兔睾丸传代和培养：
9株梅毒螺旋体的新西兰白兔睾丸传代和分离：取2mL冻存的1×108Tp/毫升的9株梅毒苍白密螺旋体(包括Nichols Houston株、Nichols Seattle株、Nichols Dallas株、DAl-1株、Bal73-1株、Seattle81-4株、Chicago株、MexicoA株、SS14株)标准株接种于新西兰白兔睾丸，每个睾丸接种1毫升。9株梅毒苍白密螺旋体通过新西兰白兔睾丸内接种法，在新西兰白兔睾丸中进行增殖。在进行感染实验前，所有新西兰白兔经性病研究实验室(Venereal Disease Research Laboratory,VDRL)和荧光梅毒螺旋体抗体吸附(fluorescent treponemal antibody-absorbed,FTA-ABS)检测以排除兔梅毒螺旋体T.paraluiscuniculi的感染。仅VDRL和FTA-ABS阴性动物用于该实验。每天检查兔睾丸是否出现睾丸炎，每三天抽血检测血清中VDRL和FTA-ABS指标。待新西兰白兔形成睾丸炎以及血清中VDRL和FTA-ABS指标转阳，安乐死新西兰白兔后，无菌手术下切取睾丸，切碎并离心制备成1×108Tp/毫升的菌悬液。
(二)梅毒螺旋体菌株DNA的提取：
9株梅毒螺旋体菌株DNA的提取：从感染兔睾丸中提取的螺旋体经低速离心，螺旋体从兔子组织碎片中分离出来，然后使用微量离心机离心沉淀梅毒螺旋体。重新悬浮Tp于1X细胞溶解缓冲液中(含10mM Tris，0.1M EDTA，0.5％SDS)。重新悬浮Tp冷冻于-20℃或根据需要应用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)提取DNA。具体步骤如下：1)吸取20μLQIAGEN蛋白酶(或者蛋白酶K)至1.5mL离心管的底部；2)加入200μL待提取基因组的样品至离心管中；3.)加入200μL缓冲液AL至样品中，涡旋振荡15秒混匀。完全混匀以得到均一化的溶液对于保证样品的充分裂解非常重要。如果样品体积大于200μL，请等量增加蛋白酶和缓冲液AL的量。操作时注意，请不要将QIAGEN蛋白酶(或蛋白酶K)直接加入缓冲液AL中；4)56℃孵育10分钟，DNA得率在该条件下已经达到最大值，延长孵育时间不会进一步提高得率；5)快速离心，去除残留在1.5mL离心管盖子中的液滴；6)加入200μL(样品等体积)的乙醇(96-100％)，涡旋振荡15秒混匀。振荡完毕后，快速离心，去除残留在1.5mL离心管盖子中的液滴；7；将步骤6得到的混合物转移至QIAamp Mini离心管柱(在一个2mL的收集管中)。扣上盖子(在离心过程中关闭每个离心管的盖子以防止离心过程中产生气溶胶)，6000g离心1分钟。将QIAamp Min离心柱放入一个新的干净2mL接收管中，将滤液连同使用过的收集管丢弃；8)小心打开QIAamp Mini离心柱，加入500μL缓冲液AW1(注意不要将边缘环弄湿)。盖紧盖子，6000g离心1分钟。将QIAamp Mini离心柱转移至一个新的2mL收集管中，将滤液连同使用过的收集管丢弃。即使最初加入的样品量大于200μL，此步也不需要增加缓冲液AW1的用量；9)弃滤液，小心打开QIAamp Mini离心柱，加入500μL缓冲液AW2(注意不要将边缘环弄湿)。盖紧盖子，最大转速20000g离心3分钟；10)将QIAamp Mini离心柱转移到一个新的2mL收集管。最大转速20000g离心1分钟。该步骤可以帮助降低缓冲液AW2残留的可能性；11)将QIAamp Mini离心柱转移到一个新的1.5mL收集管。小心打开离心柱，加入200μL缓冲液AE或双蒸水(洗脱体积大于200μL时不适用于1.5mL收集管，因为此时离心柱下缘会于洗脱液接触，从而导致在离心过程中可能产生气溶胶；洗脱体积少于200μL会显著增加洗脱液中DNA的浓度，但会降低总的DNA得率；对于少于1μg的DNA来说，推荐使用50μL的洗脱液；使用100μL洗脱液洗涤2次与使用100μL洗脱液洗涤一次的效果差不多)。室温(15-25℃)孵育1分钟(一般来说，孵育时间延长至5分钟可以提高得率)，然后6000g离心1分钟。如果继续加入200μL缓冲液AE进行二次洗脱，可以将得率提高约15％。提取后DNA储存于-20℃。提取DNA用于PCR检测和扩增后的操作。提取后DNA储存于-20℃。
(三)梅毒螺旋体属TP0136序列分析和引物设计：
梅毒螺旋体TP0136的序列分析：从Genbank的蛋白质和DNA资料库中搜索TP0136氨基酸和核酸序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)，应用BioEdit 7.1软件(http://bioedit.software.informer.com/7.1/)对梅毒螺旋体属的9个梅毒苍白密螺旋体(Nichols Houston、Nichols Seattle、Nichols Dallas、DAl-1、Bal73-1、Seattle81-4、Chicago、MexicoA和SS14)进行多重序列比对。
密螺旋体属TP0136的引物设计：应用引物设计软件：the Primer3:WWWprimertool(http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi)对GenBank查询到Nichols标准株TP0136基因序列进行引物设计。用SignalP4.1Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测TP0136信号肽，TP0136开放阅读框架引物不含信号肽。
(四)梅毒密螺旋体TP0136DNA扩增、测序和分型：
梅毒螺旋体TP0136DNA扩增：常规PCR扩增梅毒螺旋体属9株梅毒苍白密螺旋体的TP0136DNA。1型上游引物为：5’-CACAAGAGTCCGGGCCAGTG’(SEQ ID No:1)；1型下游引物为:5’-CAGCGGAGGGACCAGCAGCA’(SEQ ID No:2)，扩增产物大小为196bp。2和3型上游引物为:5’-CGCACGCCGCACGTCTATTT-3’(SEQ ID No:3)；2和3型下游引物为：5’-CAGCGGAGGGACCAGCAGCA-3’(SEQ ID No:2)，扩增产物大小分别为228和242bp。4型上游引物为:5’-CACAAGAGTCCGGACCAGTG-3’(SEQ ID No:4)；4型下游引物为：5’-CAGCGGAGGGACCAGCAGCA-3’(SEQ ID No:2)，扩增产物大小分别为196bp。5和6型上游引物为:5’-CACAAGAGTCCGGACCAGTG-3’(SEQ ID No:4)；5和6型下游引物为：5’-CAACGGAACGGCCGGCAGCA-3’(SEQ ID No:5)，扩增产物大小均为196bp。50μL PCR扩增反应试剂含：5μL待检测DNA样本、200μM dNTPs、5μL 10×Go Taq PCR缓冲液、1.5mM MgCl2、0.6μMTP0751引物、0.5U热启动Taq PCR聚合酶。扩增条件：95℃变性10min；95℃1min、60℃2min、72℃1min，共45个循环；最后72℃延伸10min。
梅毒螺旋体TP0136扩增产物测序和分型：扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(具体如附图1所示)。对PCR扩增的产物经ExoSAP-IT PCR产物纯化试剂盒纯化回收处理。当PCR扩增完成后，任何存在于PCR产物混合物中未被消耗的dNTPs和引物将影响后续反应。ExoSAP-IT利用两种水解酶，外切酶Exonuclease I和虾碱性磷酸酶ShrimpAlkalinePhosphatase，连同特殊配方的缓冲液，从PCR产物中去除不要的dNTPs和引物。外切酶I可去除剩余的单链引物和任何在PCR中产生的外来单链DNA。虾碱性磷酸酶从PCR混合物中去除残留的dNTPs，这些dNTPs可能会影响接下来的反应。ExoSAP-IT直接加入到PCR产物中然后在37℃温浴15分钟。酶在PCR的缓冲液体系中具有活性，因此不需要更换缓冲液。在处理后，ExoSAP-IT只需要简单地加热到80℃15分钟即可被灭活。使用ExoSAP-IT避免了所有凝胶或过柱纯化、沉淀、过滤、beads或磁性分离。利用ExoSAP-IT无论短的和长的PCR产物都有100％得率。应用双向DNA测序法对梅毒螺旋体属TP0136的ORF进行测序，测序结果用BioEdit7.1软件进行多重序列比对获得分型结果(具体如附图2所示)。
(五)梅毒螺旋体属TP0136分型能力验证：
应用本发明的梅毒螺旋体TP0136分型方法，对来自南方医科大学皮肤病医院的23株梅毒螺旋体临床分离株进行分型。结果显示，23株梅毒螺旋体临床分离株的型别均100％位于密螺旋体属的梅毒螺旋体亚种，提示本发明方法的特异性高。其中4株梅毒螺旋体临床分离株(GD003、GD008、GD022和GD023)为I型；16株梅毒螺旋体临床分离株(GD001、GD005、GD006、GD007、GD010、GD011、GD012、GD013、GD014、GD015、GD016、GD017、GD018、GD019、GD020、GD021)为5型；3株梅毒螺旋体临床分离株(GD002、GD004和GD009)为6型。
即使使用Arp/Tpr/TP0548三基因分型法，也仅可将23株梅毒螺旋体临床分离株分为5型(13D/d、14D/f、14D/g、15D/f、16A/e)；但若将新的密螺旋体属TP0136分子分型方法与传统三基因分型相结合，本研究中23株临床分离株可进一步分为9型(13D/d/5、13D/d/6、14D/f/1、14D/f/5、14D/f/6、14D/g/5、15D/f/1、15D/f/5、16A/e/5)，可提高分型的敏感性。
可见，采用本发明不仅特异性高(100％)，可以用于区分不同密螺旋体属的螺旋体感染，有助于临床病原体的鉴别诊断；而且可以提高传统的基因分型的敏感性，使其分型效率提高180％，有助于临床流行病学水平研究。
SEQUENCE LISTING
<110> 柯吴坚
<120> 一种基于TP0136基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法
<130> 2020
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<170> PatentIn version 3.2
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ggtgggaacg gtgtcgccgc gggtggggcg ggctgtcctg caaacgccag cagttccagc 180
ggagggacca gcagca 196
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Claims (1)

1.一种基于非诊断或治疗目的的 TP0136 基因异质性用于区分梅毒螺旋体不同亚型的分子分型方法，其特征在于，所述方法利用梅毒螺旋体属TP0136 蛋白异质性建立，具体步骤为：
步骤(1)梅毒螺旋体属菌株传代和菌株DNA提取；
步骤(2)梅毒螺旋体属TP0136 序列分析和引物设计；
步骤(3)梅毒螺旋体属TP0136 DNA 扩增、测序和分型；
所述的梅毒螺旋体属包括 9 株梅毒苍白密螺旋体和广东省内临床梅毒患者分离的23株梅毒苍白密螺旋体临床分离株；所述 9 株梅毒苍白密螺旋体包括Nichols Houston 株、Nichols Seattle 株、Nichols Dallas 株、DAl-1 株、Bal73-1 株、 Seattle81-4 株、Chicago 株、MexicoA 株、SS14 株；
步骤(1)中所述的梅毒螺旋体属菌株传代是在新西兰白兔睾丸内进行的；
步骤(1)中所述的梅毒螺旋体属菌株DNA提取中采用的1×细胞裂解缓冲液中包含10mM Tris，0.1M EDTA，0.5％SDS；
步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属 TP0136DNA 扩增时采用的引物序列如 SEQ ID NO:1-5所示；
步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属 TP0136DNA 扩增时采用的 PCR 扩增反应试剂为每50μL PCR 扩增反应试剂含 5μL 待检测DNA 样本、200μM dNTPs、5μL 10×GoTaq PCR 缓冲液、1.5mM MgCl2、0.6μM TP0136 引物、0.5U 热启动Taq PCR 聚合酶；
步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属 TP0136DNA 扩增时的条件控制为 95℃变性 10min；95℃1min、60℃2min、72℃1min，共 45 个循环；最后 72℃延伸 10min；
步骤(3)中所述的梅毒螺旋体属 TP0136DNA 测序是将PCR 扩增的产物经 1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定及纯化回收，双向 DNA 测序法进行测序。
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CN1185255C (zh) * 1999-06-14 2005-01-19 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 检测梅毒密螺旋体的组合物和方法
RU2013102163A (ru) * 2013-01-18 2014-07-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения и Российской Федерации (ФГБУ "ГНЦДК" Минздрава России) Комплекс специфических антигенов treponema pallidum для использования в иммуносерологических исследованиях при диагностике сифилиса
CN109324185A (zh) * 2018-10-26 2019-02-12 柯吴坚 一种用于区分梅毒早晚期感染的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Wujian Ke等.Treponema pallidum subsp. pallidum TP0136 Protein Is Heterogeneous among Isolates and Binds Cellular and Plasma Fibronectin via its NH2-Terminal End.PLOS Neglected Tropical Diseases.2015,图1，第10页结果第1部分. *

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