DE3650184T2

DE3650184T2 - Zellenfreier t-zellenantigenrezeptor und klinische verwendung.

Info

Publication number: DE3650184T2
Application number: DE3650184T
Authority: DE
Inventors: Michael Brown; Stephen Ip; Patrick Kung
Original assignee: T Cell Sciences Inc
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1985-12-03
Filing date: 1986-12-02
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2006-12-03
Also published as: WO1987003600A1; AU6772587A; DE3650184D1; EP0616811A1; ATE116329T1; EP0248887A1; EP0248887B1; KR960001741B1; KR880700816A; AU617980B2; US5436319A; EP0248887A4

Description

1. Einführung

Die vorliegende Erfindung betrifft zellfreie T-Zell-Antigenrezeptoren und deren Verwendung bei Diagnostika und Therapeutika. Die vorliegend definierten und beschriebenen zellfreien T-Zell- Antigenrezeptoren werden freigesetzt von T-Zellinien in Kultur und in Individuen mit Störungen oder Erkrankungen, bei denen es zu einer T-Zell-Antwort kommt. Diese freigesetzten Rezeptoren weichen von dem zellulären membrangebundenen Rezeptor ab und können therapeutisch oder diagnostisch für bestimmte T-Zell- Malignitäten oder andere Krankheiten oder Störungen eingesetzt werden, bei denen T-Zell-Antworten auftreten oder ausgelöst werden, einschließlich einiger infektiöser Krankheiten, Krebs, solider Tumore, Autoimmunkrankheiten, Allergien, etc.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Zellkulturüberständen, Zelllysaten und in menschlichen Seren.

2. Hintergrund der Erfindung

Die Beschreibung der im Rahmen der vorliegenden Anmeldung zitierten Veröffentlichungen erfolgt, um den die vorliegende Erfindung betreffenden Stand der Technik eingehender zu beschreiben.
Die primären Zellen des Immunsystems sind kleine weiße Blutzellen, die Lymphozyten genannt werden und sich von Stammzellen im Knochenmark ableiten. Die Differenzierung einer Lymphozytenklasse wird im Thymus vollendet. Demgemäß werden diese Lymphozyten T-Zellen genannt.
T-Zellen zirkulieren durch die Blut- und Lymphgefäße des Körpers und können fremde eindringende Substanzen, Allergene, Tumore und Autoantigene erkennen und mit diesen reagieren. Trotz ihrer mikroskopisch beobachteten gleichförmigen Morphologie bestehen T-Zellen aus einer heterogenen Population dreier Hauptunterklassen: den zytotoxischen Zellen, die virusinfizierte Zellen zerstören; und zwei Unterklassen, bezeichnet mit Helfer- und Suppressorzellen, die die Antikörper produzierenden B-Zellen regulieren.
Ein T-Zell-Klon ist eine T-Zelle, von der sich eine Population identischer T-Zellen durch klonale Expansion ableitet. Über die molekulare Beschaffenheit des T-Zell-Antigenrezeptors wurde in den frühen 80er Jahren von verschiedenen Forschergruppen berichtet (Allison et al., 1982, J. Immunol. 129 : 2293-2300; Kappler et al., 1983, Cell 35 : 295-302; Acuto et al., 1983, J. Exp. Med. 158 : 1368-1373). Wie in diesen Berichten dargelegt, ist der T- Zell-Antigenrezeptor ein heterodimeres Glykoprotein, welches aus zwei glykosylierten Polypeptiden zusammengesetzt ist, von denen eines mit u-Kette und das andere mit u-Kette bezeichnet wird. Ein T-Zell-Antigenrezeptor ist normalerweise auf der Oberfläche einer jeden T-Zelle vorhanden. Jede T-Zelle erkennt eine einzelne antigene Determinante in Assoziation mit einem Protein eines Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (MHC-Protein). Sämtliche T-Zellen, die sich von einem T-Zell-Klon ableiten, besitzen identische T-Zell-Antigenrezeptoren und erkennen dieselbe antigene Determinante in Assoziation mit demselben MHC-Protein.
Die α- und β-Ketten des T-Zell-Antigenrezeptors eines T-Zell- Klons sind jeweils zusammengesetzt aus einer einmaligen Kombination von Domänen, die mit variabel (V), Verschiedenheit (D), verknüpfend (J), konstant (C) (Siu et al., 1984, Cell 37 : 393; Yanagi et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 3430), und hypervariabel bezeichnet werden (Patten et al., 1984, Nature 312 : 40; Becker et al., 1985, Nature 317 : 430). In jedem T-Zell- Klon ist die Kombination von V-, D- und J-Domänen von sowohl der α- als auch der β-Kette bei der Antigenerkennung in einer Weise beteiligt, die für den T-Zell-Klon in einmaliger Weise charakteristisch ist, und definiert eine einmalige Bindungsstelle, was auch unter Idiotyp des T-Zell-Klons bekannt ist. Demgegenüber ist die C-Domäne nicht bei der Antigenbindung beteiligt.
Zusätzlich zu den α- und β-Ketten ist ein drittes, davon verschiedenes Gen isoliert und als T-Zell-Rezeptor-γ-Gen bezeichnet worden. Die Sequenz und Organisation des γ-Gens sind ähnlich den Immunglobulin-Genen und den Genen für die α- und β-Kette des T- Zell-Antigenrezeptors (Hayday et al., 1985, Cell 40 : 259-269). Das γ-Gen wird lediglich in T-Zellen exprimiert. Tonegawa und Mitarbeiter legten nahe, daß T-Zell-Antigenrezeptoren einiger T- Zellen aus einer γ-Kette und einer β-Kette aufgebaut sind (S. Tonegawa, The Molecules of the Immune System, Scientific American, Seiten 122-131, Oktober 1985).
Die α- und β-Ketten des T-Zell-Antigenrezeptors eines T-Zell- Klons definieren ferner eine Vielzahl von antigenen Determinanten, die von Antikörpern gegen den Antigenrezeptor erkannt werden können. Ein Antikörper, der lediglich mit dem T-Zell-Klon reagiert oder lediglich die Antigenbindung mit dem Antigenrezeptor des T-Zell-Klons, gegen den er gezogen worden ist, inhibiert, wird als anti-klontypisch bezeichnet (Kappler et al., 1983, Cell 35 : 295-302; Boylston et al., 1984, Eur. J. Immunol. 14 : 273; Acuto et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1326). Wenn eine antigene Determinante, die durch die α- oder β-Ketten oder beide definiert ist, auf der Oberfläche einer relativ beschränkten Anzahl von T-Zell-Klonen vorhanden oder mit diesen assoziiert ist, wird die Determinante als minor Framework-Determinate des T-Zell-Antigenrezeptors bezeichnet (Acuto et al., 1985, J. Exp. Med. 161: 1326; Bigler et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1450). Wenn eine antigene Determinante, die durch die α- oder β-Kette oder beide definiert ist, auf der Oberfläche einer relativ großen Anzahl oder sämtlicher T-Zell-Klone vorhanden oder mit diesen assoziiert ist, wird die Determinante als major Framework- Determinante des T-Zell-Antigenrezeptors bezeichnet (Brenner et al., 1984, J. Exp. Med. 160 : 541; Spits et al., 1985, J. Immunol. 135 : 1922).
Die Natural-Killer (NK)-Zellen haben sich, obgleich ihnen die meisten der mit den drei Hauptunterklassen der T-Zellen assoziierten Oberflächen-Differenzierungsantigene fehlen, als Mitglieder der T-Zell-Abstammung erwiesen und werden von vielen als Unterklasse der T-Zellen angesehen. Die NK-Zellen werden durch ihre Fähigkeit charakterisiert, ohne apparente vorherige Immunisierung eine direkte Zytotoxizität gegen spezifische Zielzellen, z. B. Krebszellen, zu vermitteln (Ritz et al., 1985, Science 228: 1540; Robertson, 1985, Nature 317 : 768). Es ist beobachtet worden, daß einige NK-Zellen auf ihren Oberflächen einen heterodimeren Rezeptor aufweisen, der zur Antigenerkennung ohne spezifische MHC-Protein-Assoziationen in der Lage ist. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sollen sämtliche Bezugnahmen auf Antigenrezeptoren heterodimere Antigenrezeptoren einschließen, die sich von der Oberfläche von T-Zellen und NK-Zellen ableiten, sofern nichts anderes angegeben ist.
Es ist nahegelegt worden, daß der T-Zell-Antigenrezeptor nichtkovalent mit dem T3-Proteinkomplex auf der Membran assoziiert ist (Borst et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 5135). Der T3-Proteinkomplex ist aus drei verschiedenen membranassoziierten Polypeptidketten zusammengesetzt, die als T3-γ, T3-δ und T3-&epsi; bekannt sind (Van den Elsen et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 2920). Diese T3-Protein-Antigenrezeptor-Assoziierung kann demonstriert werden durch Immunpräzipitationsversuche mit Antikörpern gegen den T3-Proteinkomplex und durch Comodulations- oder Mutantenstudien, bei denen der Antigenrezeptor und der T3- Proteinkomplex auf der Membran gemeinsam verschwinden oder erscheinen können (Ohashi et al., 1985, Nature 316 : 606).
Bisher ist die Messung der T-Zell-Antigenrezeptoren beschränkt gewesen auf den Nachweis T-Zell-assoziierter Antigenrezeptoren durch eine Vielzahl immunologischer Techniken unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen den Antigenrezeptor. Derartige Messungen sind routinemäßig durchgeführt worden durch Bindung von Fluoreszenz-konjugierten monoklonalen Antikörpern an T-Zellen und nachfolgender zellulärer Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsorter oder einem ähnlichen Durchflußzytometer (Acuto et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1326). Eine derartige Zellanalyse liefert Informationen über den Prozentgehalt von T- Zellen, die den Rezeptor in einer gegebenen Probe exprimieren, wobei die Genauigkeit und Verläßlichkeit einer derartigen routinemäßigen Analyse jedoch auf 1 bis 2% oder mehr an positiven Zellen in einer Probe unter Anwendung verfügbarer Durchflußzytometer beschränkt ist. Darüber hinaus ist die Zellanalyse arbeitsaufwendig und erfordert häufig frische, lebende Zellen und ausgebildetes, eingeweihtes Personal.
Der molekulare Mechanismus der Wechselwirkung zwischen T-Zell- Antigenrezeptor und Antigen ist Gegenstand intensiver Forschungsanstrengungen (Robertson, 1985, Nature 317 : 768). Es ist gezeigt worden (Watts et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5480), daß T-Zell-Klone in der Lage sind, membrangebundene Antigene zu binden, die mit MHC-Proteinen assoziiert sind. Rao et al. (Rao et al., 1984, Cell 36 : 879) berichteten jedoch, daß einige Antigene in Abwesenheit eines MHC-Proteins an die Antigen-reaktiven T-Zell-Klone binden können. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht (Davis, 1985, Biotechnology 13 : 858) über die Bindung von Liganden an den T-Zell-Antigenrezeptor wurden rekombinante DNA-Techniken angewendet, um ein Hybridmolekül herzustellen, bei dem T-Zell-Antigenrezeptor-Regionen innerhalb der Immunglobulin-Frameworks enthalten sind. In diesem Bericht ist jedoch über keine immunologischen Reaktivitäten gegen die Hybridmoleküle berichtet worden.
Zwischen 1975 und 1981 wurde eine Reihe von Artikeln veröffentlicht über die Charakterisierung von "T-Zell-Antigenrezeptoren" in Maus- und Rattensystemen (Krawinkel et al., 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4 : 285; Binz und Wigzell, 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4 : 275; Binz und Wigzell, 1981, J. Exp. Med. 154: 1261). Diese "T-Zell-Antigenrezeptoren" sind nicht die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen "T- Zell-Antigenrezeptoren" (vgl. Allison et al., 1982, J. Immunol. 129 : 2293-2300; Kappler et al., 1983, Cell 35 : 295-302; Acuto et al., 1983, J. Exp. Med. 158 : 1368-1373; Hayday et al., 1985, Cell 40 : 259-269; Kranz et al., 1985, Science 227 : 941). Krawinkel et al., 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4 : 285; Binz und Wigzell, 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4: 275 und Binz und Wigzell, 1981, J. Exp. Med. 154 : 1261, beschreiben ein mit "T-Zell-Antigenrezeptor" bezeichnetes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 150.000 bis 180.000 Dalton. Dieser "Antigenrezeptor" wird weiter charakterisiert als ein Dimer mit einer Proteinuntereinheit mit einem Molekulargewicht von etwa 70.000 Dalton. Bei Mäusen ist die variable Region dieses "Antigenrezeptors" auf dem Chromosom 12 lokalisiert (Binz und Wigzell, 1981, J. Exp. Med. 154 : 1261). Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebene T-Zell-Antigenrezeptor weist ein Molekulargewicht von etwa 90.000 Dalton auf (Allison et al., 1982, J. Immunol. 129 : 2293-2300; Kappler et al., 1983, Cell 35: 295-302; Acuto et al., 1983, J. Exp. Med. 158 : 1368-1373). Darüber hinaus bestehen die Strukturen der Untereinheit dieses Antigenrezeptors aus heterodimeren glykosylierten Polypeptiden, bezeichnet als α-, β- oder γ-Kette mit Molekulargewichten von ungefähr 45.000 Dalton, 40.000 Dalton bzw. 30.000 Dalton (Kranz et al., 1985, Science 227 : 941). Die chromosomalen Lokalisationen der variablen Regionen in Mäusen sind: α, Chomosom 14 (Kranz et al., 1985, Science 227 : 941); β, Chromosom 6 (Caccia et al., 1984, Cell 37 : 1091); und γ, Chromosom 13 (Kranz et al., 1985, Science 227 : 941).
1982 wurde berichtet, daß das externe Abstoßen des T3-Proteins durch menschliche T-Zell-Klone künstlich durch Zugabe eines Anti-T3-Protein-Antikörpers zu diesen kultivierten T-Zellen induziert werden könnte. Jedoch wurde weder in vivo noch in vitro ein spontanes Abstoßen oder Freisetzen des T3-Proteins beobachtet (Reinherz et al., 1982, Cell 30 : 735).
Fujimoto et al. (Fujimoto et al., 1983, J. Exp. Med. 159 : 752) entwickelten einen Enzym-gekoppelten Immunoassay (ELISA) für den Nachweis von menschlichen T-Zell-Oberflächen-Antigenen in löslicher Form. Bei Untersuchung von Seren und Kulturüberständen von verschiedenen Zellinien wurde gefunden, daß das Leu-2-Antigen, nicht aber Leu-1 oder Leu-3 anwesend waren. Die Anmelder sind sich ferner bewußt über die am 19. April 1985 im Namen von David Nelson et al. eingereichte anhängige US-Patentanmeldung Nr. 724 897 mit dem Titel "Soluble Interleukin-2 Receptor As A Disease Indicator And A Method Of Assaying The Same", übertragen auf die Amerikanische Regierung. Diese auf die Befunde von Rubin et al. (Rubin et al., 1985, J. Immunol. 135 : 3172) basierende Patentanmeldung betrifft den löslichen oder freigesetzten Interleukin 2-Rezeptor, von dem man annimmt, daß er mit dem T-Zell- Wachstumsfaktor Interleukin 2 interagiert. Ferner ist den Anmeldern das US-Patent Nr. 4 550 086 von Reinherz et al. bekannt, welches monoklonale Antikörper beschreibt, die in spezifischer Weise an die "Oberflächen-Erkennungsstruktur" von T-Zellen binden. Weder die Veröffentlichung von Fujimoto noch die Patentanmeldung von Nelson, die Veröffentlichung von Rubin oder das Patent von Reinherz offenbaren die Existenz eines zellfreien oder freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors sowie Verfahren zum Nachweis und zur Messung desselben in einer biologischen Flüssigkeit oder Verfahren zu seiner diagnostischen und therapeutischen Verwendung.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft zellfreie T-Zell-Antigenrezeptoren und deren Verwendung bei der Diagnose und Therapie von bestimmten Krankheiten oder Störungen, bei denen eine T-Zell- Antwort hervorgerufen wird oder beteiligt ist. Die Erfindung basiert teilweise auf einer Reihe von Erkenntnissen: (a) bestimmte T-Zell-Linien in Kultur setzen spontan ihre Antigenrezeptoren in die Kulturflüssigkeit frei (z. B. während der Log- Phase des Wachstums); (b) die freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptoren können von Zellen gebildet werden, die niemals einen membrangebundenen Antigenrezeptor exprimieren; (c) bestimmte Krankheiten oder Störungen, bei denen T-Zell-Antworten ausgelöst werden oder beteiligt sind (z. B. Autoimmunkrankheit, Organtransplantat/Transplantatabstoßung, Transplantat gegen Empfänger- Reaktion, T-Zell-Malignitäten, Krebs, solide Tumore, Allergien und bestimmte infektiöse Krankheiten), sind in vivo charakterisiert durch Anwesenheit spezifischer freigesetzter T-Zell-Antigenrezeptoren in Körperflüssigkeiten; (d) diese freigesetzten Rezeptoren existieren in einer Formenvielfalt, die von den Zellmembran-gebundenen Rezeptorspezies abweicht, und die mit anderen T-Zell-Determinanten wie dem T3-Antigen komplexiert sein können; und (e) die Erfindung basiert ferner teilweise auf der weiteren Erkenntnis, daß der freigesetzte T-Zell-Antigenrezeptor trotz der Variation hinsichtlich der Form des freigesetzten Rezeptors oder des freigesetzten Rezeptor-Komplexes durch besondere Anti- Rezeptor-Antikörper definiert werden kann; im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden Immunoassays beschrieben, die zur Identifizierung derartiger freigesetzter T-Zell-Antigenrezeptormoleküle angewendet werden können.
Die erfindungsgemäßen zellfreien Antigenrezeptoren können Monomere, Homodimere oder Heterodimere von Peptiden oder Polypeptiden mit Bezug auf die α-, β-, γ- oder δ-Ketten oder Untereinheiten des T-Zell-Antigenrezeptors (vgl. den folgenden Abschnitt 3.1 für Definitionen) umfassen und Fragmente und/oder Derivate davon einschließen, die mit einem weiteren Molekül wie einer T- Zell-Determinante komplexiert sein können oder auch nicht.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf diagnostische Assays, die auf dem Nachweis oder der Quantifizierung des zellfreien Rezeptors oder Rezeptor-Komplexes in Proben eines Patienten basieren. Bei Patienten, die an Krankheiten oder Störungen leiden, bei denen eine T-Zell-Antwort hervorgerufen wird oder beteiligt ist, wird der T-Zell-Antigenrezeptor in einem Grundumsatz freigesetzt, der von dem normalen Zustand abweicht, wodurch der freigesetzte Rezeptor in Körperflüssigkeiten akkumuliert wird. Als Ergebnis kann eine erhöhte Konzentration an dem freigesetzten Rezeptor mit bestimmten Krankheiten korreliert werden. Es werden schnelle, sensitive und kostengünstige Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen des freigesetzten Rezeptors in einer Körperflüssigkeit offenbart, die für die Diagnose und die Überwachung einer Krankheit bei einem Patienten geeignet sein können. Da die zellfreien Rezeptoren in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden können, die mit Hilfe relativ nicht-invasiver Techniken erhalten werden können, wird ein besonderer Vorteil bei der Diagnose von Störungen oder Krankheiten erzielt, bei denen normalerweise invasive Biopsie-Verfahren (z. B. abgestoßene Herz- oder Nierentransplantate und dergleichen) erforderlich wären oder die keiner Biopsie zugeführt werden können (z. B. inoperable oder unzugängliche Tumore).
Die Erfindung bezieht sich ferner auf diagnostische und therapeutische Zusammensetzungen, in denen der freigesetzte T-Zell- Antigenrezeptor mit diagnostisch oder pharmazeutisch verträglichen Trägern vermischt ist. Diese Verfahren können bei der Diagnose und Therapie von Krankheiten und Störungen besonders geeignet sein, bei denen Immunglobuline nicht schnell reagieren. Es ist bekannt, daß sowohl T-Zellen als auch B-Zellen in spezifischer Weise Antigene erkennen (S. Tonegawa, The Molecules of the Immune System, Scientific American, Seiten 112-131, Oktober 1985; Robertson, 1985, Nature 317 : 768). Obgleich es anerkannt ist, daß T-Zellen ungleich B-Zellen gewöhnlich Antigene in Assoziation mit MHC-Proteinen erkennen, ist nicht klar, ob Epitope auf einem Antigen, die von T-Zellen oder B-Zellen erkannt werden können, miteinander in Beziehung stehen. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht von G.S. Bixler und M.Z. Atassi (Bixler und Atassi, 1985, Biotechnology 3 : 47) wurde der Schluß gezogen, daß die Regionen eines von B-Zellen erkannten Proteinmoleküls (Antikörperbindung) auch von T-Zellen erkannt werden können. Die T-Zellen können jedoch zusätzliche Bereiche des Moleküls erkennen, für die bisher keine nachweisbaren Antikörperreaktionen beobachtet worden sind. Diese Befunde legen nahe, daß der einmalige Mechanismus der T-Zell-Erkennung bei diagnostischen und therapeutischen Anwendungen zum Nachweis von krankheitsbedingten Antigenen geeignet ist (Bixler und Atassi, 1985, Biotechnology 3 : 47). Durch die Existenz der vorliegend offenbarten zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren wird für diese Anwendungen eine neue Quelle für Reagenzien bereitgestellt.

3.1. Definitionen

Die folgenden, im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendeten Begriffe haben die nachfolgend dargelegten Bedeutungen:

Anti-Rezeptor-Antikörper:

Ein Antikörper, der mit einem Epitop des T-Zell-Antigenrezeptors reagiert. Anti-Rezeptor-Antikörper können anti-klontypische, Anti-minor Framework- oder Anti-major Framework-Antikörper umfassen.

Anti-klontyoischer Antikörper:

Ein Antikörper, der lediglich mit dem T-Zell-Klon reagiert oder der lediglich die Antigenbindung an den Antigenrezeptor des T-Zell-Klons inhibiert, gegen den der Antikörper gezogen wurde. In der ebenfalls anhängigen Stammanmeldung Nr. 804 289 wurden die anti-klontypischen Antikörper als "anti-idiotypische" Antikörper definiert. Diese Terminologie ist hier modifiziert worden, um eine Verwechslung mit anti-idiotypischen Antikörpern zu vermeiden, die die Antigen-kombinierende Stelle von Immunglobulinen definieren. Demgemäß beschreibt der hier verwendete begriff "anti-klontypische Antikörper" Antikörper, die die Antigen-kombinierende Stelle eines bestimmten T- Zell-Antigenrezeptors definieren.

Anti-minor Framework-Antikörper:

Ein Antikörper, der die minor Framework-Determinante des T-Zell-Antigenrezeptors definiert und α- oder β-Ketten oder beide umfaßt, die auf der Oberfläche einer relativ begrenzten Anzahl von T-Zell-Klonen vorhanden oder damit assoziiert sind. Im allgemeinen erkennen Antikörper gegen minor Framework-Determinanten weniger als 20% der peripheren T-Zellen eines gesunden Individuums.

Anti-maior Framework-Antikörper:

Ein Antikörper, der die major Framework-Determinante des T-Zell-Antigenrezeptors definiert und die α-Kette oder die β-Kette oder beide umfaßt, die auf der Oberfläche einer relativ großen Anzahl oder sämtlicher T-Zell- Klone vorhanden oder damit assoziiert sind. Im allgemeinen erkennen Antikörper gegen major Framework-Determinanten mindestens 20% der peripheren T-Zellen eines gesunden Individuums.
Obgleich die Abgrenzung zwischen dem Vorhandensein auf einer relativ begrenzten Anzahl von T-Zell-Klonen und der Anwesenheit auf einer relativ großen Anzahl oder auf allen T-Zell-Klonen nicht immer präzise ist, werden die Fachleute auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, diese Abgrenzung verstehen und erkennen und die meisten gegebenen antigenen Determinanten leicht entweder als minor oder major Framework-Determinante klassifizieren. Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird jede antigene Determinante, der sich ein Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet nicht bedienen würde, als minor Framework-Determinante definiert.

α- und β-Untereinheiten oder -Ketten:

Die α- und β-Untereinheiten des T-Zell-Antigenrezeptors weisen eine relative Molekülmasse (Mr) von ungefähr 50.000 bzw. 40.000 Dalton auf. Gene, die sich während der Ontogenie der T-Zelle umgruppieren und für die β-Untereinheit (Yanagi et al., 1984, Nature 308 : 145-149; Hedrick et al., 1984, Nature 308 : 153-158) und für die α-Untereinheit (Chien et al., 1984, Nature 312 : 31-35; Saito et al., 1984, Nature 312 : 36-40; Sim et al., 1984, Nature 312 : 771-775) kodieren, sind entweder durch subtraktive Hybridisierung oder durch Sondierung mit Oligonukleotiden isoliert worden.
Ein einzigartiges Merkmal der menschlichen α- und β-Ketten des T-Zell-Antigenrezeptors sind die beobachtete Comodulation (Meuer et al., 1983, J. Exp. Med. 157 : 705-719), Coimmunpräzipitation (Reinherz et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 4104- 4108; Oettgen etal., 1984, J. Biol. Chem. 259 : 12039-12048) und die erforderliche Coexpression (Weiss und Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160 : 1284-1299) der α- und β-Moleküle mit dem T3-Glykoprotein, wodurch eine Verwandtschaft dieser beiden Strukturen nahegelegt wird. Anschließend wurde die direkte physikalische Assoziation der beiden Proteinkomplexe demonstriert, indem die α- und β-Moleküle mit dem T3-Glykoprotein chemisch vernetzt und die Komponenten des vernetzten Komplexes als β-Untereinheit und als T3-Glykoprotein (Mr 28.000)-Untereinheit identifiziert wurden (Brenner et al., 1985, Cell 40 : 183-190). Ein T3-Gegenstück ist in ähnlicher Weise mit dem murinen α- und β-T-Zell-Antigenrezeptor assoziiert (Allison et al., 1985, Nature 314 : 107-109; Samelson und Schwartz, 1984, Immunol. Rev. 81 : 131-144).

γ- und δ-Untereinheiten oder -Ketten:

Ein drittes Gen, das sich in T-Zellen umgruppiert und mit γ bezeichnet wird, ist in der Maus (Saito et al., 1984, Nature 309 : 757-762; Krunz et al., 1985, Nature 313 : 752-755; Hayday et al., 1985, Cell 40 : 259- 269) und im Menschen (Lefranc et al., 1985, Nature 316 : 464-466; Murre et al., 1985, Nature 316 : 549-552) identifiziert worden. Zwischen dem γ-Gen des Menschen und der Maus bestehen jedoch hinsichtlich seiner genetischen Struktur größere Unterschiede. Beispielsweise weist die cDNA des menschlichen γ-Gens fünf potentielle Stellen für eine N-verknüpfte Glykosylierung im γ- Genprodukt auf, wohingegen derartige Stellen in dem murinen γ- Gen bemerkenswerterweise nicht vorhanden sind. Demgemäß weist das menschliche γ-Genprodukt ein höheres Molekulargewicht auf, was aufgrund seiner genetischen Sequenz nicht vorhergesagt werden kann.
Die Umgruppierungen des γ-Gens geschehen in Lymphozyten mit Suppressor-zytotoxischen als auch mit Helfer-Phänotypen und können eine große Anzahl an γ-Ketten bilden. Die Funktion des γ- Gens ist jedoch unbekannt. Darüber hinaus sind weder das von dem γ-Gen kodierte Protein noch seine mögliche Assoziation mit anderen Strukturen (wie im Falle von α-, β- und T3-Glykoproteinen) definiert worden. Beim Menschen machen es die multiplen Glykosylierungsstellen unmöglich, die Natur und Größe der γ-Polypeptidstruktur akkurat vorherzusagen. Kürzlich ist ein Polypeptid von 55 kD als mutmaßliche γ-Untereinheit identifiziert worden.
Das δ-T-Zell-Rezeptor-Polypeptid weist ein Molekulargewicht von etwa 40.000 Dalton auf und kann mit der γ-Untereinheit ein T3- assoziiertes Heterodimer bilden. Die γ- und δ-Untereinheiten sind in den am 3. Juli 1986 eingereichten, ebenfalls anhängigen Anmeldungen Nrn. 882 100 und 881 825 sowie in der folgenden Veröffentlichung eingehender beschrieben: Brenner et al., 1986, Nature 322 : 145-149. Diese Arbeiten beschreiben ebenfalls Anti- Framework-Antikörper, die diese neuen T3-assoziierten Polypeptide definieren.

T3-Proteinkomplex:

Der T3-Proteinkomplex ist aus drei verschiedenen Membran-assoziierten Polypeptidketten zusammengesetzt, die als T3-γ, T3-δ und T3-&epsi; bekannt sind (Van den Elsen et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 2920). Diese Assoziation von T3-Protein und Antigenrezeptor kann mittels Immunpräzipitationsstudien mit Antikörpern gegen den T3-Proteinkomplex und mittels Comodulations- oder Mutantenstudien demonstriert werden, bei denen der Antigenrezeptor und der T3-Proteinkomplex auf der Membran gemeinsam erscheinen oder verschwinden (Ohashi et al., 1985, Nature 316 : 606).
Mit dem vorliegend verwendeten Begriff "T-Zelle" werden Zellen definiert, die vom Thymus abstammen und T-Zell-Antigenrezeptor- Moleküle exprimieren.

4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Chromatogramm und veranschaulicht die Molekülgröße von aus Überständen von T-Zell-Linien-Kulturen abgeleiteten, freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptoren nach Bestimmung durch HPLC-Gelfiltration.
Fig. 2 ist ein Chromatogramm und veranschaulicht die Molekülgröße von freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptoren im Serum von Patienten mit einer T-Zell-Leukämie nach Bestimmung durch HPLC- Gelfiltration.

5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft zellfreie oder freigesetzte T-Zell-Antigenrezeptoren, Immunoassays, die den Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Zellkulturüberständen, Zelllysaten und Körperflüssigkeiten erlauben, sowie diagnostische und therapeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Überwachung und Behandlung bestimmter Krankheiten oder Störungen, bei denen eine T-Zell-Antwort hervorgerufen wird oder beteiligt ist.
Die Erfindung basiert teilweise auf der anfänglichen Erkenntnis, daß bestimmte kultivierte T-Zell-Linien spontan besondere Antigenrezeptoren in die Kulturflüssigkeit freisetzen (beispielsweise während der Log-Phase des Wachstums), und daß zellfreie Antigenrezeptoren von Zellen freigesetzt werden können, die die membrangebundene Form niemals exprimieren. Die vorliegend beschriebenen freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptoren weichen von den Zellmembran-gebundenen Antigenrezeptoren ab und scheinen in einer Formenvielfalt zu existieren, wobei einige mit anderen T- Zell-Determinanten wie dem T3-Antigen komplexiert sein können.
Die Erfindung basiert ferner teilweise auf einer anderen Erkenntnis, wonach die freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptoren oder Rezeptor-Komplexe trotz ihrer heterogenen Größe verläßlich identifiziert werden können unter Verwendung von Anti-Rezeptor-Antikörpern, einschließlich - aber nicht beschränkt auf - Anti-major Framework-, Anti-minor Framework- und anti-klontypischer Antikörper, die besondere Epitope auf dem freigesetzten T-Zell-Rezeptor oder Rezeptor-Komplex definieren. Die Anti-Rezeptor-Antikörper können zur Identifizierung, Isolierung oder Aufreinigung der zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren verwendet werden. Kombinationen dieser Antikörpermoleküle können bei den nachfolgend detaillierter beschriebenen Immunoassays eingesetzt werden zum Nachweis und Identifizieren bestimmter Klassen der erfindungsgemäßen zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren.
Die Erfindung basiert ferner teilweise auf der weiteren Erkenntnis, daß spezifische T-Zell-Antigenrezeptoren unter bestimmten Bedingungen in vivo von T-Zellen in die umgebende Körperflüssigkeit freigesetzt werden. Derartige Umstände, die zur Freisetzung von T-Zell-Antigenrezeptoren in vivo führen, schließen Krankheiten oder Störungen ein, bei denen eine T-Zell-Antwort hervorgerufen wird oder beteiligt ist, wie beispielsweise Autoimmunkrankheiten, Organtransplantat/Transplantatabstoßung, Transplantat gegen Empfänger-Reaktion, T-Zell-Malignitäten, Krebs, solide Tumore, bestimmte infektiöse Krankheiten, Allergien und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die vorliegend beschriebenen Immunoassays können angewendet werden, um die Anwesenheit des freigesetzten Rezeptors oder Rezeptor-Komplexes in biologischen Proben zu untersuchen, und sie können zur Diagnose oder zur Überwachung von Patienten mit Störungen oder Krankheiten angewendet werden, bei denen T-Zell-Antworten hervorgerufen werden oder beteiligt sind, die erhöhte Serumwerte für den Rezeptor oder Rezeptor-Komplex aufweisen. Zusätzlich können die zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren ihrerseits diagnostisch und/oder therapeutisch bei Krankheiten oder Zuständen angewendet werden, denen mit Immunglobulinen nicht auf einfache Weise beizukommen ist.
Zum Zwecke der Klarheit wird die Erfindung in den nachfolgenden Unterabschnitten beschrieben: (a) die Natur des zellfreien T- Zell-Antigenrezeptors; (b) der Nachweis des zellfreien T-Zell- Antigenrezeptors; und (c) die Verwendung des zellfreien T-Zell- Antigenrezeptors zur Diagnose, Überwachung und Therapie von Krankheiten oder Störungen, bei denen T-Zell-Antworten hervorgerufen werden oder beteiligt sind.

5.1. Die Natur des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors

Die erfindungsgemäßen zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren umfassen eine Population von Molekülen, die eine beträchtliche Heterogenität in ihrer Größe aufweisen, deren Molekulargewichte im Bereich von etwa 180 kD bis etwa 20 kD betragen. Die erfindungsgemäßen zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren können Monomere, Homodimere oder Heterodimere von Peptiden oder Proteinen umfassen, die mit den α,- β,- γ- oder δ-Ketten des T-Zell-Antigenrezeptors in Beziehung stehen (vgl. Abschnitt 3.1 für Definitionen) einschließlich Fragmente und/oder Derivate davon, die mit einem anderen Molekül wie einer T-Zell-Determinante komplexiert sein können oder auch nicht. Die Fragmente oder Derivate der Rezeptormoleküle können funktional sein, d. h. sie können in der Lage sein, an ein Antigen zu binden, das mit einem MHC-Protein oder einem NK-Antigenrezeptor assoziiert sind, die in der Lage sind, das Antigen zu binden. Derartige Fragmente der zellfreien Antigenrezeptoren können Fragmente einschließen, die Epitope der major oder minor Framework-Determinanten, den Klontyp des Moleküls oder die konstanten, variablen oder hypervariablen Regionen einschließen, sie sind aber nicht darauf beschränkt.
Trotz dieser Vielfalt der molekularen Größe und Form sind die erfindungsgemäßen zellfreien Antigenrezeptoren ausreichend stabil, damit sie unter Verwendung von Anti-Rezeptor-Antikörpern, die Epitope auf den zellfreien Rezeptoren definieren, definitiv identifiziert werden können. Beispiele für monoklonale Antikörper und Immunoassays, die zur Identifizierung des zellfreien T- Zell-Antigenrezeptors eingesetzt werden können, werden in dem folgenden Abschnitt 5.2. und den nachfolgenden Beispielen eingehender beschrieben.
Die erfindungsgemäßen zellfreien Antigenrezeptoren können hergestellt werden durch Aufreinigung von Zellen, die in hohem Maße zellfreie Rezeptoren freisetzen, sowie durch rekombinante DNA- Technologie oder durch chemische Syntheseverfahren. Beispielsweise können die zellfreien Rezeptoren aus einer Anzahl von Zellen gereinigt werden, die Rezeptoren freisetzen, einschließlich T-Zellen, T-Zell-Linien, NK-Zellen, T-Zell-T-Zell-Hybridome und Wirtszellen, die gentechnisch verändert wurden, um freigesetzte Rezeptoren zu produzieren. Wir haben herausgefunden, daß die zellfreie Form des T-Zell-Antigenrezeptors aus kultivierten Zellen gereinigt werden kann, die einen zytoplasmatischen T- Zell-Antigenrezeptor aufweisen und die zellfreie Form freisetzen, nicht aber die membrangebundene Form des Rezeptors exprimieren. Ein Beispiel für eine derartige Zytoplasma-positive, Membran-negative Zellinie, die die zellfreie Form des T-Zell- Antigens freisetzt, ist die T-Zell-Linie Molt 4. Der erfindungsgemäße zellfreie T-Zell-Antigenrezeptor kann ebenfalls aus T- Zell-T-Zell-Hybridom-Zellinien gereinigt werden, die den T-Zell- Antigenrezeptor exprimieren und freisetzen. Derartige T-Zell- Hybridom-Verfahren sind bekannt und können in Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung angewendet werden (vgl. z. B. Gallagher et al., 1986, J. Immunol. Methods 90 : 57; vgl. auch Imai et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8708). Alternativ können rekombinante DNA-Techniken angewendet werden, um auf gentechnischem Wege Zelltransformanten zu erhalten, die die freigesetzten Rezeptoren produzieren. Diesbezüglich können Nukleotidsequenzen, die für die α-, β-, γ- oder δ-Ketten des T-Zell-Antigenrezeptors oder Teilbereiche davon kodieren unter die Kontrolle geeigneter Expressionselemente (Promotoren, Enhancer, etc.) plaziert werden, um die rekombinanten DNA-Moleküle zu produzieren, die im Fall der Verwendung zur Transformation geeigneter Wirtszellen die Expression und Freisetzung des T-Zell-Antigenrezeptors oder geeigneter Fragmente davon steuern. Aufgrund der Degeneriertheit des DNA-Codes schließen diese Nukleotid-Sequenzen Derivate und Substitutionen ein, die bei den translatierten Aminosäureketten zu stummen Veränderungen führen.
Alternativ können die Rezeptoren mittels chemischer Syntheseverfahren produziert werden. Hierbei können die Untereinheiten, aus denen die Monomere oder Dimere aufgebaut werden, die die zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren bilden, auf bekannte Weise synthetisiert werden (Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149). Diese Untereinheiten können Aminosäuresequenzen umfassen, die mit sämtlichen oder mit Teilbereichen der für die α-, β-, γ- und δ-Ketten des T-Zell-Antigenrezeptors erhaltenen Sequenzen übereinstimmen oder im wesentlichen übereinstimmen, einschließlich Modifikationen und Substitutionen innerhalb der Aminosäure- Sequenz, die zu stummen Veränderungen führen. Derartige Modifizierungen schließen Substitutionen der Aminosäurereste ein, die im wesentlichen äquivalente Säure-Base-Eigenschaften und/oder Eigenschaften der Hydrophilie/Hydrophobie aufweisen.
Die zellfreien Antigenrezeptoren können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren einschließlich chromatographischer Verfahren, elektrophoretischer Verfahren und immunologischer Verfahren auf gereinigt werden, wobei sich die Verfahren jedoch nicht darauf beschränken. Immunaffinitätsverfahren und chromatographische Verfahren einschließlich HPLC (Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie) sind besonders geeignet für die Aufreinigung des zellfreien Antigenrezeptors; vgl. folgender Abschnitt 5.2., in dem Antikörper beschrieben werden, die bei derartigen Immunaufreinigungsschritten verwendet werden könnten; vgl. auch die folgenden Fig. 1 und 2, sowie Siliciano et al., 1986, Cell 47 : 161-171, für Beispiele derartiger Aufreinigungsverfahren.
Die Fähigkeit des gereinigten zellfreien Antigenrezeptors zur Beibehaltung seiner Stabilität und Valenz, die den Rezeptor befähigen, sein spezifisches Antigen zu binden, wird anhand der vorliegenden Beispiele veranschaulicht und durch vor kurzem veröffentlichte Ergebnisse (vgl. Siliciano et al., 1986, Gell 47 : 161-171) gestützt, die die Fähigkeit von aus Zelllysaten stammenden T-Zell-Antigenrezeptoren zur Bindung an ein Antigen veranschaulichen.

5.2. Nachweis und Identifizierung des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors

Eine Reihe von Anti-Rezeptor-Antikörpern, d. h. Anti-major Framework, Anti-minor Framework und anti-klontypisch, reagieren spezifisch mit den freigesetzten oder zellfreien T-Zell-Antigenrezeptormolekülen, zeigen jedoch keine Kreuzreaktion mit irrelevanten Zellen oder Molekülen. Derartige Anti-Rezeptor-Antikörper können eingesetzt werden, um sowohl die erfindungsgemäßen zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren als auch die im Abschnitt 5.1. definierten Fragmente und Derivate davon zu identifizieren, zu reinigen oder zu isolieren. Derartige Immunoassays und/oder Immunaffinitätsaufreinigungsverfahren können die Verwendung zusätzlicher Antikörper einschließen, die Epitope von Molekülen definieren, die mit dem zellfreien T-Zell-Antigenrezeptor komplexiert sein können.
Im allgemeinen definieren die Anti-major Framework-Antikörper wahrscheinlich einen Teil oder die gesamte konstante Region des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors und können daher eingesetzt werden, um eine Klasse von zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren nachzuweisen, zu isolieren oder zu reinigen, die die durch den Anti-major Framework-Antikörper definierte besondere konstante Region teilen. Obgleich Anti-major Framework-Antikörper Teile der konstanten Region des Rezeptormoleküls definieren können, kann aller Wahrscheinlichkeit nach auch die variable Region beteiligt sein. Im Ergebnis können die Anti-major Framework- Antikörper eingesetzt werden, um eine kleinere Untergruppe der zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren zu identifizieren, zu isolieren oder zu reinigen. Unter der Annahme, daß die konstante Region der zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren die Effektorfunktion oder die biologische Aktivität des Moleküls bestimmt, wird davon ausgegangen, daß die Anti-Framework-Antikörper eingesetzt werden können, um zellfreie T-Zell-Rezeptoren einer bestimmten Klasse, die eine gewünschte Effektorfunktion aufweist, zu identifizieren, zu isolieren oder zu reinigen.
Im Gegensatz zu den Anti-Framework-Antikörpern binden die antiklontypischen Antikörper, die die Antigen-kombinierende Stelle des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors definieren, wahrscheinlich an variable und hypervariable Regionen des Rezeptormoleküls und können eingesetzt werden, um zellfreie T-Zell-Antigenrezeptoren, die ungeachtet ihrer Effektorfunktion spezifisch für bestimmte Antigene sind, zu identifizieren, zu isolieren oder zu reinigen.
Kombinationen von Anti-Rezeptor-Antikörpern können eingesetzt werden, um zellfreie T-Zell-Antigenrezeptoren, die ein bestimmtes Antigen definieren und eine besonders erwünschte Effektorfunktion aufweisen oder zeigen, zu identifizieren, zu isolieren oder zu reinigen. Beispielsweise können Kombinationen eines anti-klontypischen Antikörpers, der die interessierende Antigenkombinierende Stelle definiert, mit einem Anti-Framework-Antikörper, der eine Untergruppe von zellfreien Rezeptoren definiert, die durch eine gewünschte Effektorfunktion charakterisiert sind, eingesetzt werden, um den gewünschten zellfreien Rezeptor zu identifizieren, zu isolieren oder zu reinigen.
Um die erfindungsgemäßen zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren zu identifizieren oder nachzuweisen, können die Anti-Rezeptor-Antikörper in jedem Immunoassaytyp eingesetzt werden, einschließlich
- aber nicht beschränkt auf - kompetitive, nicht-kompetitive und "Sandwich"-Immunreaktionen, die unter Anwendung jedes geeigneten Markers wie Radioisotope, Fluoreszenz, Enzym-Substrat-Reaktionen, kolorimetrische Farbstoffe, Immunpräzipitation, Agglutination, Komplementfixierung und dergleichen nachgewiesen werden können. Derartige Immunoassays schließen Radioimmunoassays, immunradiometrische Assays, Fluoreszenz-Immunoassays, Enzymgekoppelte Immunoassays, Protein A-Immunoassays, Immundiffusion, Immunpräzipitation, Immunelektrophorese, Komplementfixierung, Agglutinationsassays und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Immunoassays für den Nachweis des zellfreien Antigenrezeptors sind in den Beispielen beschrieben, bei denen unterschiedliche Kombinationen der Anti-Rezeptor-Antikörper mit oder ohne anderen Antikörpern, die T-Zell-Determinanten definieren, die Komplexe mit den zellfreien Rezeptoren (wie dem T3-Antigen) eingehen können, verwendet werden. In einer besonderen Ausführungsform werden Sandwich-Immunoassays beschrieben, bei denen jede Kombination von zwei Anti-Rezeptormolekülen, die nicht um dieselbe Bindungsstelle kompetieren, zum Nachweis des zellfreien T-Zell- Antigenrezeptors angewendet werden kann. Zusätzlich kann der Nachweis zellfreier Rezeptor-Komplexe in einem Sandwich-Immunoassay erfolgen unter Anwendung eines Anti-Rezeptor-Antikörpers in Kombination mit einem zweiten Antikörper, der ein mit dem Rezeptor komplexiertes Molekül definiert (z. B. das T3-Antigen). Bei den Sandwich-Immunoassays läßt man die zu untersuchende Probe mit einem immobilisierten Antikörper reagieren. Die Bindung der Probe an den immobilisierten Antikörper wird festgestellt durch Zugabe des zweiten markierten Antikörpers, der vorliegend Nachweis-Antikörper genannt wird und auf ein zweites Epitop auf dem zellfreien Rezeptormolekül oder auf dasselbe Epitop eines sich wiederholenden Epitops auf dem zellfreien Rezeptor gerichtet ist. Die Entstehung eines gebundenen Markers oder Signals zeigt die Anwesenheit des zellfreien T-Zell-Rezeptors in der Probe an. In einer alternativen Ausführungsform können ein Anti-Rezeptor-Antikörper und eine Anti-T-Zell-Determinante (z. B. Anti-T3) als immobilisierter und Nachweis-Antikörper eingesetzt werden, um freigesetzte Rezeptor-Komplexe nachzuweisen. Andere Assaybedingungen wie die Anwesenheit von Detergenzien und der verwendete Puffertyp etc. ergeben sich für den Durchschnittsfachmann bei der Durchsicht der vorliegenden Beispiele.
Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge des in einer Probe vorhandenen zellfreien Antigenrezeptors werden ebenfalls bereitgestellt. Hierzu kann jeder der oben beschriebenen Immunoassays angewendet werden, wobei parallel ein Standard eingesetzt wird, der eine bekannte Menge des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors enthält. Die Menge des beim Standard gebildeten Reaktionskomplexes kann mit der in der Probe gebildeten Menge verglichen werden. Anschließend kann die Menge an zellfreiem Antigenrezeptor auf der Grundlage dieses Vergleichs extrapoliert werden.
Bei einer besonderen Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung hat man herausgefunden, daß zwei monoklonale Anti-major Framework-Antikörper zur Identifizierung und zum Nachweis freigesetzter T-Zell-Antigenrezeptoren gut geeignet sind: die monoklonalen Antikörper W4 und β-F1 (nachfolgend bezeichnet mit BF1, wobei er in der ebenfalls anhängigen Stammanmeldung Nr. 804 289 mit 8A3 bezeichnet wird). In den meisten Fällen können die W4- und BF1-Antikörper in beiden Konfigurationen (immobilisiert und als Nachweis-Antikörper) zur Identifizierung und zum Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors eingesetzt werden; es scheint jedoch so, daß der Nachweis des zellfreien Rezeptors in Seren die Anwendung einer bestimmten Konfiguration dieser beiden Antikörper erfordert: immobilisierter Antikörper BF1 mit Nachweis-Antikörper W4.
Diese Immunoassays können angewendet werden, um freigesetzte T- Zell-Antigenrezeptoren in einer Vielzahl von Proben wie Zellkultur, Zelllysaten und in Proben eines Patienten nachzuweisen. Zusätzlich können diese selben Antikörpermoleküle zur Immunoaffinitätsaufreinigung und/oder zur Anreicherung des freigesetzten T-Zell-Rezeptors eingesetzt werden.

5.3. Verwendung des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors und/oder des Rezeptor-Komplexes zur Diagnose und Therapie

Es gibt mindestens zwei Ansatzpunkte für die Verwendung des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors auf dem Gebiet der Diagnostik: (a) der zellfreie T-Zell-Antigenrezeptor kann als nachweisbarer Marker für Störungen oder Krankheiten eingesetzt werden, bei denen T-Zell-Antworten hervorgerufen werden oder beteiligt sind, die zur Akkumulation der zellfreien Rezeptoren in Körperflüssigkeiten führen; und (b) der zellfreie T-Zell-Antigenrezeptor kann seinerseits als Sonde eingesetzt werden, die auf ein spezifisches, von dem Rezeptor erkanntes krankheitsbedingtes Antigen gerichtet ist. Jeder Ansatzpunkt bietet seinen besonderen Vorteil.
Die Verwendung von zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren oder Rezeptor-Komplexen als Marker basiert auf unserer Erkenntnis, daß zellfreie Rezeptoren in erhöhten Mengen in Patienten mit bestimmten Störungen oder Krankheiten und insbesondere solchen gefunden werden, bei denen T-Zell-Antworten hervorgerufen werden oder beteiligt sind. Im Ergebnis kann der freigesetzte T-Zell- Antigenrezeptor als Marker zur Diagnose und Überwachung der Störung oder der Krankheit eingesetzt werden. Derartige Störungen oder Krankheiten können T-Zell-Malignitäten, Autoimmunkrankheiten, Organtransplantat/Transplantatabstoßung, Transplantat gegen Empfänger-Reaktion, Krebs, solide Tumore, Allergien und bestimmte infektiöse Krankheiten einschließen, die von einem Virus, einem Pilz, einem Parasit oder einem Bakterium hervorgerufen werden können, wobei die möglichen Störungen oder Krankheiten nicht darauf beschränkt sind.
Ferner kann eine Vielzahl von T-Zell-Klonen in einem Individuum gleichzeitig auf, mehr als ein Pathogen ansprechen (Emmrich und Meuer, 1985, Immunology Today 6 : 197). Es ist deshalb beabsichtigt, daß das Serum aus dem Individuum eine Mischung verschiedener Typen freigesetzter T-Zell-Antigenrezeptoren enthält. Die quantitative Messung eines jeden Typs des freigesetzten Rezeptors ermöglicht die Diagnose und die Überwachung eines Patienten mit multiplen Infektionen oder einer Krankheit, bei der eine Mehrzahl von Pathogenen beteiligt ist.
Demgemäß können Proben eines Patienten auf die Anwesenheit und/ oder die Menge an freigesetztem T-Zell-Antigenrezeptor oder Rezeptor-Komplex untersucht werden, um die Diagnose und die Überwachung der Krankheit zu erleichtern. Die zu untersuchenden Proben eines Patienten können biologische Flüssigkeiten umfassen, die Blut, Plasma, Serum, Speichel, Urin, Spinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Amnionflüssigkeit und Kranialflüssigkeit einschließen, nicht aber darauf beschränkt sind. Die Menge an freigesetztem Rezeptor oder Rezeptor-Komplex kann quantifiziert werden, indem parallel ein Standard getestet wird, der eine bekannte Konzentration des bestimmten Rezeptors oder Rezeptor- Komplexes enthält. Immunoassays unter Anwendung des vorliegend beschriebenen Anti-Rezeptors und anderer Antikörper sind für diesen Ansatz besonders geeignet. Diagnostische Assays, bei denen der zellfreie oder freigesetzte T-Zell-Antigenrezeptor als Marker verwendet wird, bieten den Vorteil, daß sie für den Patienten weniger invasiv sind, da Körperflüssigkeiten untersucht werden können, wodurch invasive Biopsietechniken vermieden werden.
Die Verwendung der zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren oder Rezeptor-Komplexe als diagnostische Sonden basiert auf der Fähigkeit der zellfreien Rezeptoren, besondere Antigene, die für bestimmte Krankheiten charakteristisch sind, in spezifischer Weise zu erkennen und zu binden, wobei diese als krankheitsbedingte Antigene bezeichnet werden. Diese Ausführungsform der Erfindung beinhaltet die Verwendung des zellfreien Rezeptors als Sonde zum in vitro Nachweis der krankheitsbedingten Antigene in Proben eines Patienten oder zur Identifizierung der Lokalisierung der krankheitsbedingten Antigene in vivo. Wenn das durch den zellfreien Rezeptor definierte krankheitsbedingte Antigen in vivo freigesetzt wird, können die Körperflüssigkeiten des Patienten unter Anwendung der zellfreien Rezeptoren als Sonde auf Anwesenheit und/oder die Menge des freigesetzten krankheitsbedingten Antigens untersucht werden. Hierzu können die zellfreien Rezeptoren in geeigneter Weise markiert werden, um Reaktionskomplexe in der Probe des Patienten nachzuweisen, die sich zwischen den zellfreien Rezeptoren und dem krankheitsbedingten Antigen gebildet haben. Wenn das krankheitsbedingte Antigen nicht freigesetzt wird, können die markierten zellfreien Rezeptoren in vivo zur Lokalisierung des krankheitsbedingten Antigens verwendet werden. In beiden Ausführungsformen bieten die zellfreien Rezeptoren große Vorteile bei der Diagnose von Krankheiten oder Störungen, die durch Antigene charakterisiert sind, die nicht von Immunglobulinen erkannt werden (vgl. Kradin et al., 1986, "T Cell Involvement in Tumors", 6. Int. Congr. Immunol. Abstr. Nr. 4.23.29, Toronto, Kanada, Juli 1986; Rosenberg et al., 1985, N. Engl. J. Med. 313 : 1485; und Rosenberg et al., 1986, Science 233 : 1318). Darüber hinaus können nicht-invasive Techniken zur Analyse von Körperflüssigkeiten eines Patienten angewendet werden, wenn das krankheitsbedingte Antigen verbreitet oder freigesetzt wird. Wenn das krankheitsbedingte Antigen nicht verbreitet wird, ist die Verwendung von freigesetzten T- Zell-Antigenrezeptoren als diagnostische Sonde insbesondere dann vorteilhaft, wenn der Tumor oder die Malignität an einer Stelle lokalisiert ist, die nicht einer Biopsie zugeführt werden kann.
Die erfindungsgemäßen zellfreien T-Zell-Antigenrezeptoren können auch als therapeutische Zusammensetzungen in -einer Mischung mit pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen eingesetzt werden. Hierzu kann ein zellfreier T-Zell-Antigenrezeptor, der ein besonderes Antigen definiert und eine besondere Effektorfunktion besitzt (z. B. einen immunsuppressiven oder immunpotenzieren Effekt), in einer therapeutisch wirksamen Dosis bei der Behandlung spezifischer Störungen oder Krankheiten eingesetzt werden. Beispielsweise können zellfreie Antigenrezeptoren, die immunsuppressive Effektorfunktionen aufweisen und Antigene definieren, die bei Autoimmunkrankheiten beteiligt sind, zur spezifischen Unterdrückung der gegen das besondere Antigen gerichteten Autoimmunantwort verwendet werden. Demgegenüber können Antigenrezeptoren, die immunpotenzierende Effektorfunktionen aufweisen und Target-Antigene auf infizierten Zellen, Krebszellen oder Tumorzellen definieren, zur spezifischen Hervorrufung und Potenzierung einer gegen das besondere Krebs- oder Tumor-Antigen gerichteten Immunantwort eingesetzt werden. Die zellfreien Antigenrezeptoren können daher in Target-spezifischer Weise zur Modulation von Immunantworten verwendet werden und bieten damit große Vorteile gegenüber Therapien, die das Immunsystem in unspezifischer Weise stimulieren oder unterdrücken.
Alternativ können Toxine und den Stoffwechsel betreffende Blokkierungsverbindungen, die Zellen abtöten oder das Wachstum hemmen, chemisch mit dem zellfreien T-Zell-Antigenrezeptor oder mit Fragmenten oder Derivaten davon, die für die abzutötenden Zielzellen spezifisch sind, verknüpft werden. Die Verabreichung derartiger Verbindungen in therapeutisch wirksamen Dosierungen könnte zu einer zielgerichteten Therapie führen.
Andere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich für den Durchschnittsfachmann unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele.

6. Beispiel: Nachweis von freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptoren und Rezeptor-Komplexen

Die folgenden Beispiele beschreiben vielfältige Immunoassays, die zum Nachweis des Vorhandenseins eines freigesetzten T-Zell- Antigens in zellfreien Überständen von T-Zell-Kulturen, T-Zell- Lysaten und in menschlichen Seren angewendet werden können. Die molekulare Beschaffenheit des freigesetzten T-Zell-Antigens in der Zellkultur und in menschlichen Seren nach Analyse durch Charakterisierung der mittels HPLC-Gelfiltration derartiger Proben erhaltenen Fraktionen ist ebenfalls beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, daß der T-Zell-Antigenrezeptor in einer Vielzahl von Formen freigesetzt werden kann, und daß die freigesetzte Form von membrangebundenen Rezeptoren abweichen kann. Der Nachweis erhöhter Mengen des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten mit bestimmten T-Zell-Malignitäten oder infektiösen Krankheiten wird ebenfalls beschrieben. Diese Ergebnisse zeigen, daß Analysen, mit denen die Serumwerte des freigesetzten T-Zell-Antigens gemessen werden, bei der Überwachung bestimmter T-Zell-Malignitäten oder infektiöser Krankheiten eine diagnostische Bedeutung haben können.
In sämtlichen der folgenden Beispiele wurden T-Zell-Linien und B-Zell-Linien, erhältlich bei der American Type Culture Collection (ATCC) oder vielen Universitätslabors, in RPMI 1640 (eine von Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y., bezogene Kulturflüssigkeit) mit 10% fötalem Kälberserum bei 37ºC und 5% CO&sub2; kultiviert und gehalten. Kulturüberstände aus Kulturen dieser Zellinien in der Log-Phase des Wachstums wurden geerntet mit einer Zelldichte von 1 Million Zellen pro Milliliter. In sämtlichen Fällen waren die Variabilitäten größer als 99%. Die Überstände wurden mittels Zentrifugation für 1 Stunde bei 50.000·g von Membranfragmenten befreit. In einigen Fällen wurde ein zusätzlicher Schritt der Filtration durch ein 0,22 im Filter (Arco LC13, Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan) angewendet.
Die in den folgenden Unterabschnitten eingesetzte HPB-ALL T-Zell-Linie ist eine weit verbreitete Zellinie (vgl. z. B. Borst et al., 1986, J. Immunol. 136 : 601-607; Lanier et al., 1986, J. Immunol. 137 : 2286-2292; und Weiss et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6998-7002).

6.1. Zelluläre Spezifität von Antikörpern, die T-Zell-Antigenrezeptoren definieren

Wie bereits zuvor ausgeführt wurde, gibt es mindestens drei unterschiedliche Typen von Antikörpern gegen T-Zell-Antigenrezeptoren, nämlich den Anti-major Framework-, Anti-minor Framework- und den anti-klontypischen Antikörper (vgl. Definitionen im obigen Abschnitt 3.1.). Die zellulären Reaktivitäten eines repräsentativen Antikörpers eines jeden Typs wurden durch Immunfluoreszenz oder mittels Immunpräzipitation gemessen und sind in Tabelle I dargestellt. Tabelle I Reaktivität von Zellinien gegenüber unterschiedlichen Typen monoklonaler Anti-T-Zell-Antigenrezeptor-Antikörper * Zell-Linie Antikörper-Reaktivität Anti-major Framework Anti-minor Framework (% positiv) HPB-ALL Anti-Klontyp HPB-ALL T-Zelle (Leukämie) Jurkat T-Zelle (Lymphom) CEM T-Zelle periphere T-Zellen eines gesunden Individuums Daudi B-Zelle
* Die Reaktivitäten wurden mittels zellulärer Immunfluoreszenz oder durch Immunpräzipitation untersucht. Beispiele für verwendete Antikörper:
Anti-klontypisch: Kappler et al., 1983, Cell 35 : 295-302; Boylston et al., 1984, Eur. J. Immunol. 14 : 273; Acuto et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1326;
Anti-minor Framework: Acuto et al., 1985, J. Exp. Med. 161: 1326; Bigler et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1450;
Anti-major Framework: Bigler et al., 1985, J. Exp. Med. 161: 1450; Brenner et al., 1984, J. Exp. Med. 160 : 541; Spits et al., 1985, J. Immunol. 135 : 1922.
In diesem Beispiel reagierte der Anti-major Framework-Antikörper mit sämtlichen T-Zellen, nicht jedoch mit den B-Zellen. Der Anti-minor Framework-Antikörper reagierte mit einer Leukämie (HPB-ALL)-T-Zell-Linie und einigen peripheren T-Zellen, nicht jedoch mit einer anderen Lymphom (Jurkat)-T-Zell-Linie, einer leukämischen (CEM)-T-Zell-Linie oder einer Lymphom (Daudi)-B- Zell-Linie. Der anti-klontypische Antikörper reagierte lediglich mit der spezifischen T-Zell-Linie, gegen die er gezogen wurde, d. h. der HPB-ALL T-Zell-Linie.
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt unter Verwendung von drei Anti-major Framework-Antikörpern zur immunzytochemischen Färbung mehrerer etablierter menschlicher Zellinien. Diese Antikörper BF1, W4 und W12 waren nicht in der Lage zur Immunpräzipitation des T-Zell-Antigenrezeptors von der Oberfläche von Molt 4, einer menschlichen T-Zell-Linie, die sich mittels Flußzytometrie hinsichtlich eines Oberflächen-T3-Rezeptor-Komplexes als negativ erwiesen hatte. Eine immunzytochemische Färbung von Molt 4 zeigte jedoch eine starke Reaktivität im Zytoplasma sowohl gegenüber den Anti-major Framework-Antikörpern als auch gegenüber Anti-T3-Antikörpern. Diese Ergebnisse zeigen, daß Molt 4 eine zytoplasmatische Form des T-Zell-Antigenrezeptors, nicht aber eine membrangebundene Form exprimiert.

6.2. Aus kultivierten T-Zellen freigesetzte T-Zell-Antigenrezeptoren

Die folgenden Experimente wurden entwickelt und durchgeführt, um zu untersuchen, ob lösliche T-Zell-Antigenrezeptoren spontan von kultivierten T-Zellen freigesetzt werden. Zellfreie Überstände kultivierter T-Zellen wurden auf das Vorhandensein von freigesetztem T-Zell-Rezeptor unter Anwendung eines Sandwich-Immunoassays analysiert, bei dem ein Typ von Anti-Rezeptor-Antikörper (d. h. entweder anti-klontypisch, Anti-minor Framework- oder Anti-major Framework) immobilisiert wurde. Die Bindung von in dem Kulturüberstand vorhandenen freigesetzten T-Zell-Rezeptoren an den immobilisierten Antikörper wurde nachgewiesen durch Zugabe eines markierten Anti-Rezeptor-Antikörpers, der ein abweichendes Epitop des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors definiert (nachfolgend bezeichnet als Nachweis-Antikörper).
Die zu untersuchenden zellfreien Überstände wurden hergestellt, indem Überstände aus Kulturen der Log-Phase geerntet wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 50.000·g für 1 Stunde pelletiert. Membranfragmente wurden entfernt, indem die geklärten Überstände durch Filter mit einer Porengröße von 0,22 um filtriert wurden.
Um die Anti-Rezeptor-Antikörper zu immobilisieren, wurden Mikrotiterplatten (Immulon I, bezogen von Dynatech, Alexandria, Virginia) über Nacht bei 4ºC mit einem der Anti-Rezeptor-Antikörper in einer Konzentration von 2,5 ug/ml in phosphatgepufferter Saline (PBS) beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA) behandelt, um jegliche verbleibenden Stellen der Platte, von denen die Proteine in nicht-spezifischer Weise absorbiert werden könnten, zu blockieren. Die Platten wurden anschließend mit 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, in 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20, bezogen von Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) gewaschen.
Die zu analysierenden zellfreien und membranfreien Kulturüberstände (100 ul Aliquots) wurden verdünnt mit einem geeigneten Puffer, z. B. 0,01 M Tris, 0,15 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 mM Iodacetamid, 1 ug/ml Pepstatin und 10 ug/ml N-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TCPK), ph- Wert 8,0, enthaltend 1% Nonidet P-40 (NP40, Polyoxyethylen-(9)- p-tert.-octylphenol, ein ionisches Detergenz umfassend ein Octylphenolethylenoxid-Kondensat enthaltend durchschnittlich 9 Mol Ethylenoxid pro Molekül, bezogen von Sigma Chemical Company). Die verdünnten Proben wurden zu den beschichteten Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Ungebundenes Probenmaterial wurde weggewaschen und 100 ul einer sauber titrierten Menge eines biotinylierten Nachweis-Antikörpers, der ein anderes Epitop auf dem T-Zell-Antigenrezeptor definiert, wurden zugegeben. Nach einer zweiten Inkubation für 2 Stunden bei 37ºC wurde ungebundenes biotinyliertes Nachweis- Antikörpermaterial weggewaschen und 100 ul einer genau titrierten Menge eines Konjugats von Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (bezogen von Zymed Laboratories, San Francisco, Kalifornien) wurden zugegeben und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Ungebundenes Konjugat wurde weggewaschen und frisch hergestelltes Substrat (0,2% OPD, Dihydrochloridorthophenylendiamin in gepuffertem Peroxid bestehend aus 0,015% Wasserstoffperoxid, 65 mM Dinatriumphosphat, 17 mM Citronensäure, pH-Wert 5,5) wurde zugegeben. Nach einer 20 Minuten langen Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 N Schwefelsäure gestoppt, und es wurde die sich in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte entwickelnde Färbung mit einem ELISA-Lesegerät (MR 600, bezogen von Dynatech) bei 490 nm (OD 490) gemessen.
Geeignete Kontrollen bestanden aus: (a) Mikrotiter-Vertiefungen ohne immobilisierte Antikörper zur Ermittlung der nicht-spezifischen Bindung der Probe an die Platte; (b) Proben aus einer B- Zell-Linie oder aus Serum eines gesunden Individuums zur Ermittlung der nicht-spezifischen Bindung des immobilisierten Antikörpers an die Probe; und (c) nicht-relevante Antikörper desselben Immunglobulin-Isotyps der immobilisierten und Nachweis-Antikörper zur Kontrolle der nicht-spezifischen Bindung von sowohl der Probe an den immobilisierten Antikörper als auch des Nachweis- Antikörpers an die Platte oder Probe.

6.2.1. Nachweis von aus kultivierten T-Zellen freigesetztem T- Zell-Antigenrezeptor

Der oben beschriebene Sandwich-Immunoassay wurde durchgeführt unter Verwendung eines Anti-minor Framework-Antikörpers als immobilisierter Antikörper und entweder eines Anti-major Framework- oder eines HPB-ALL-anti-klontypischen Antikörpers als Nachweis-Antikörper. Die zellfreien Überstände kultivierter T- Zell-Linien (HPB-ALL, CEM, und Jurkat) sowie von der Daudi B- Zell-Linie wurden sowohl in Anwesenheit von 0,1% NP40 als auch in Abwesenheit eines Detergenz analysiert.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der folgenden Tabelle II dargestellt. Tabelle II Nachweis von freigesetztem T-Zell-Antigenrezeptor Herkunft des Kulturüberstands OD490 unter Verwendung eines immobilisierten Anti-minor Framework-Antikörpers und des angegebenen Nachweis-Antikörpers: * Detergenz-Behandlung Anti-major Framework HPB-ALL Anti-Klontyp HPB-ALL T-Zell-Linie (Leukämie) Jurkat T-Zell-Linie (Lymphom) CEM T-Zell-Linie Daudi B-Zell-Linie
* Die Kulturüberstände wurden aus Kulturen der Log-Phase geerntet und mittels Zentrifugation (50.000·g für 1 Stunde) und Filtration (Filter einer Porengröße von 0,22 um) von Membranfragmenten befreit. 100 ul eines jeden Kulturüberstandes wurden analysiert mit und ohne Detergenz unter Verwendung eines Anti-minor Framework-Region-Antikörpers als immobilisierter Antikörper und eines Anti-major Framework- oder anti-klontypischen Antikörpers als Nachweis-Antikörper.
Aus der Tabelle II können mehrere Schlüsse gezogen werden. Erstens kann die Anwesenheit des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in dem Kulturüberstand der HPB-ALL T-Zellen lediglich unter geeigneten Assaybedingungen gezeigt werden, z. B. im Falle der Analyse der zellfreien Überstände in Anwesenheit von mindestens 0,1% NP40, einem nicht-ionischen Detergenz. Zweitens ist der immobilisierte Anti-minor Framework-Antikörper lediglich reaktiv gegenüber der HPB-ALL T-Zell-Linie, nicht jedoch gegenüber den CEM- und Jurkat T-Zell-Linien oder den Daudi B-Zell- Linien. Die Daten der Tabelle II stimmen überein mit den unter Anwendung des in Tabelle I dargestellten Immunfluoreszenzassays erhaltenen Ergebnissen und bestätigen die Spezifität von Antiminor Framework-Antikörpern für HPB-ALL T-Zellen, da unter Verwendung von Nachweis-Antikörpern wie einem Anti-major Framework- Antikörper oder einem anti-klontypischen Antikörper in Verbindung mit immobilisiertem Anti-minor Framework-Antikörper lediglich freigesetzte Rezeptoren von den leukämischen HPB-ALL T- Zellen quantifizierbar waren. Diese Daten zeigen, daß der freigesetzte Antigenrezeptor mit dem membranständigen Antigenrezeptor verwandt ist.
Um festzustellen, ob andere T-Zell-Linien ebenfalls den T-Zell- Antigenrezeptor freisetzen, wurde ein Assay geschaffen, bei dem der immobilisierte Antikörper ein Anti-major Framework-Antikörper und der Nachweis-Antikörper ein zweiter Anti-major Framework-Antikörper war, wobei die zuvor beschriebenen Assaybedingungen angewendet wurden. Die in Tabelle III dargestellten Daten zeigen, daß der freigesetzte T-Zell-Antigenrezeptor unter Anwendung zweier unterschiedlicher Anti-major Framework-Antikörper im Sandwich-Immunoassay unter der Voraussetzung nachgewiesen werden kann, daß der immobilisierte und der Nachweis-Antikörper nicht um dieselbe Bindungsstelle kompetieren.

Tabelle III

Freigesetzter T-Zell-Antigenrezeptor in Kulturüberständen

Herkunft des Kulturüberstands OD490 unter Verwendung zweier unterschiedlicher Anti-major Framework-Antikörper sowohl als immobilisierter als auch als Nachweis-Antikörper
HPB-ALL 0,401
Jurkat 0,243
CEM 0,225
Molt 4 0,968
HSB2 0,100
Daudi (B-Zelle) 0,111
Medium alleine 0,106
Assay-Hintergrund 0,076
Die Ergebnisse der Tabelle III zeigen ebenfalls, daß viele T- Zell-Linien einen Anti-major Framework-reaktiven Antigenrezeptor in ihren Überstand freisetzen. Es sollte beachtet werden, daß die Zellinien Molt 4 und CEM über ein minimal nachweisbares T3- Oberflächenprotein verfügen. Da davon ausgegangen wird, daß T3- und T-Zell-Antigenrezeptor coexprimiert werden (Weiss und Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160 : 1285), würde man erwarten, daß ein minimaler Oberflächen-Antigenrezeptor in diesen beiden Zellinien nachgewiesen würde. Überraschenderweise wurden in dem Kulturüberstand dieser Zellinien erhebliche Mengen des T-Zell-Antigenrezeptors nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, daß der freigesetzte T-Zell-Antigenrezeptor unabhängig von anderen T-Zell- Determinanten, die mit dem zellgebundenen Rezeptor coexprimiert werden, exprimiert werden kann. Die für Molt 4 erhaltenen Ergebnisse sind besonders überraschend, da, wie zuvor im Abschnitt 6.1. ausgeführt, sich die Zellinie Molt 4 als Membran-negativ, jedoch Zytoplasma-positiv für T-Zell-Rezeptoren erwies. Mit anderen Worten exprimiert die Zellinie Molt 4 T-Zell-Antigenrezeptoren, die auf das Zytoplasma beschränkt sind. Diese Befunde legen nahe, daß die Anwesenheit oder Abwesenheit der Membranform des T-Zell-Antigenrezeptors nichts darüber aussagt, ob eine Zellinie einen zellfreien oder freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptor produziert.
Andere Konfigurationen des Immunassays sind möglich. Beispielsweise kann eine gewisse Menge des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors nachgewiesen werden, indem derselbe Anti-Rezeptor- Antikörper sowohl als immobilisierter als auch als Nachweis- Antikörper unter bestimmten Bedingungen eingesetzt wird, z. B. bei Existenz einer Multiplizität derselben antigenen Determinante in der Rezeptorpräparation. Desweiteren könnten zwei Antimajor Framework-Antikörper zum Nachweis der Rezeptoren unter der Voraussetzung verwendet werden, daß sie verschiedene oder sich wiederholende Epitope definieren. Es wird ferner davon ausgegangen, daß der Typ und die Konzentration eines Detergenz in diesen Assays wichtig sein kann in Abhängigkeit der Beschaffenheit der antigenen Determinante auf dem Rezeptor.

6.2.2. Nachweis von aus kultivierten T-Zellen freigesetztem T-Zell-Antigenrezeptor/T3-Protein-Komplex

Um festzustellen, ob zumindest eine gewisse Menge des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors mit dem T3-Protein-Komplex assoziiert ist - schließlich wurde der membrangebundene Rezeptor auf der T-Zell-Membran nachgewiesen (Borst et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 5135; Ohashi et al., 1985, Nature 316 : 606) - wurden Überstände analysiert unter Verwendung eines immobilisierten Anti-T3-Antikörpers (wie der von Ortho Diagnostic Systems, Raritan, N.J., erhältliche OKT3 oder der von Becton Dickinson Monoclonal Center, Mountainview, Kalifornien, erhältliche Leu4) und eines Anti-Rezeptor-Nachweis-Antikörpers. Die Überstände wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit der Detergenzien NP40 oder Digitonin (bezogen von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin) in einer Endkonzentration von 0,2% analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV Nachweis von freigesetztem T-Zell-Antigenrezeptor/T3-Komplex Herkunft des Kulturüberstands OD490 unter Verwendung eines immobilisierten Anti-T3-Antikörpers und der angegebenen Nachweis-Antikörpers: Detergenz-Behandlung* Anti-major Framework HPB-ALL Anti-Klontyp HPB-ALL T-Zell-Linie (Leukämie) Jurkat T-Zell-Linie (Lymphom) Daudi B-Zell-Linie
* Detergenz-behandelte Überstände enthielten eine Endkonzentration von 0,2% NP40 oder Digitonin wie angegeben.
Aus diesen Daten lassen sich eine Reihe signifikanter Beobachtungen ableiten. Zum einen wurde der Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptor-Komplexes in dem Kulturüberstand von der Anwesenheit von Detergenzien im Assay beeinflußt. Bei Abwesenheit eines Detergenz und unter Verwendung des HPB-ALL Anti-Klontyp-Nachweis-Antikörpers konnten signifikante Mengen des freigesetzten Rezeptor-Komplexes im HPB-ALL-Überstand gemessen werden. Die Anwesenheit des Detergenz Digitonin erhöhte die nachweisbare Menge des freigesetzten Rezeptor-Komplexes in HPB-ALL T-Zell- Überstanden, wie durch Messung des Anti-major Framework- oder des HPB-ALL Anti-Klontyp-Nachweis-Antikörpers festgestellt wurde. Ferner ermöglichte die Anwesenheit von Digitonin den Nachweis des freigesetzten Rezeptor-Komplexes in beiden analysierten T-Zell-Linien (d. h. HPB-ALL- und Jurkat-Überstände), wie durch Messung des Anti-major Framework-Nachweis-Antikörpers ermittelt wurde. Demgegenüber wurde bei Verwendung einer der beiden Nachweis-Antikörper in Gegenwart von NP40 kein Komplex nachgewiesen. Zum anderen wurde gezeigt, daß die Überstände der HPB-ALL- und Jurkat-T-Zell-Linien den freigesetzten Rezeptor-Komplex enthielten, wenn ein Anti-major Framework-Antikörper als Nachweis-Antikörper eingesetzt wurde. Demgegenüber enthielt lediglich der von der HPB-ALL T-Zell-Linie abgeleitete Kulturüberstand eine signifikante Menge des freigesetzten Rezeptor-Komplexes, wenn der für die HPB-ALL T-Zell-Linie spezifische Anti-Klontyp-Nachweis-Antikörper als Nachweis-Antikörper eingesetzt wurde. Die zur Kontrolle eingesetzte Daudi B-Lymphom-Zell-Linie zeigte in keinem der Nachweisverfahren ein positives Ergebnis.

6.2.3. Effekte der Detergenzbehandlung auf den Immunnachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors und Rezeptor/T3-Protein-Komplexes

Eine Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um die Auswirkungen einer Detergenzbehandlung auf den Nachweis des freigesetzten T- Zell-Antigenrezeptors und die Auswirkungen der Anwendung unterschiedlicher Kombinationen von Antikörpern als immobilisierter oder Nachweis-Antikörper im Immunoassay zum freigesetzten T- Zell-Antigenrezeptor zu untersuchen. Für diese Reihe von Experimenten wurden unterschiedliche Konfigurationen von Anti-Rezeptor- und Anti-T3-Antikörpern eingesetzt, um HPB-ALL T-Zell-Überstände zu analysieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt. Tabelle V Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors oder Rezeptor-Komplexes in Überständen von HPB-ALL T-Zell-Kulturen OD490 unter Verwendung von Nachweis-Antikörpern: Immobilisierter Antikörper Detergenz*-Behandlung HPB-All Anti-Klontyp Anti-minor Framework Anti-major Framework HPB-ALL Anti-Klontyp Digitonin keine
* Detergenz-behandelte Überstände enthielten eine Endkonzentration von 0,2% NP40 oder Digitonin wie angegeben.
Nicht-spezifische Hintergrundwerte wurden von den angegebenen Werten abgezogen n.u. bedeutet "nicht untersucht".
Wie in Tabelle V dargestellt, verstärkte NP40 (und nicht Digitonin) den Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors bei Anwendung von Kombinationen von Anti-Rezeptor-Antikörpern als immobilisierte und Nachweis-Antikörper im Assay. Demgegenüber verstärkte Digitonin (und nicht NP40) den Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptor-Komplexes im Falle der Anwendung einer Kombination von Anti-T3- und Anti-Rezeptor-Antikörpern als immobilisierte und Nachweis-Antikörper. Insbesondere wurde in den mit NP40 behandelten Proben der Überstände von HPB-ALL eine gegenüber dem mit Digitonin behandelten Proben des Überstandes von HPB-ALL höhere Menge des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors registriert, wenn als immobilisierter Antikörper ein Antiminor Framework oder ein HPB-ALL-Anti-Klontyp verwendet wurde.
Demgegenüber wurde bei den mit Digitonin behandelten HPB-ALL- Überständen eine verglichen mit den NP40-behandelten Proben höhere Menge des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptor-Komplexes registriert, wenn als immobilisierter Antikörper ein Anti-T3- Antikörper eingesetzt wurde. Es konnten ebenfalls signifikante Mengen des freigesetzten Rezeptor-Komplexes in Abwesenheit eines jeglichen Detergenz nachgewiesen werden, wenn der immobilisierte Anti-T3 in Verbindung mit einem HPB-ALL-Anti-Klontyp oder einem Anti-minor Framework-Nachweis-Antikörper eingesetzt wurde.

6.2.4. Beschaffenheit des T-Zell-Antigenrezeptors in Kulturüberständen

Um zu zeigen, daß der in den Kulturüberständen gemessene T-Zell- Antigenrezeptor nicht Membran-assoziiert ist, wurden Gelfiltrationen unter nicht-denaturierenden Bedingungen ohne Detergenz durchgeführt. Kulturüberstände von HPB- und Molt 4-Zellkulturen von mindestens 10&sup6; Zellen pro Milliliter und einer Lebensfähigkeit von mehr als 98% wurden geerntet. Die Zellen wurden mit 50.000·g für 1 Stunde pelletiert, und die geklärten Überstände wurden durch ein 0,22 um Filter filtriert. Die filtrierten Überstände wurden mittels HPLC-Gelfiltration wie folgt fraktioniert: Die Proben wurden unter Verwendung einer 250 ul Öse in die Säule aus 7,5·300 mm BioSil TSK-250 mit 7,5·100 mm BioSil guard column (BioRad Laboratories, Richmond, Kalif.) injiziert, die mit 0,1 M Phosphat und 0,1 M NaCl (pH-Wert 6,8) equilibriert war und mit 0,5 ml pro Minute gefahren wurde. Die Absorption bei 280 nm wurde aufgezeichnet und 0,25 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Säulen wurden kalibriert mit Molekulargewichtsstandards, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt wurden.
Aliquots von 150 ul einer jeden Fraktion wurden hinsichtlich der major Framework-Determinanten des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors analysiert durch eine Veränderung des zuvor beschriebenen Sandwich-Immunoassays, bei dem anstelle der zweistündigen Inkubationen bei 37ºC zwei Stunden lange Inkubationen bei Raumtemperatur (20-25ºC) auf einer Schüttelplattform (180 UpM) durchgeführt wurden.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Fig. 1 dargestellt, aus der hervorgeht, daß beide Molt 4- und HPB-T-Zell-Überstände eine Spezies enthielten, die durch ein Molekulargewicht von ungefähr 40 kD charakterisiert ist. Der HPB-T-Zell-Überstand enthielt jedoch andere Spezies mit einer erheblichen Heterogenität in der Größe, die zwischen Molekulargewichten von 180 kD und 20 kD lag, wobei die größeren Formen vorherrschten. Demgegenüber zeigte Molt 4 lediglich einen Antigenrezeptor mit einem durchschnittlichen Gewicht von 35 kD, wodurch die Anwesenheit entweder einer einzelnen Kette oder eines Fragments des T-Zell-Antigenrezeptors nahegelegt wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß der T-Zell-Antigenrezeptor in vielfältigen Formen freigesetzt werden kann und nicht Membran-assoziiert ist.

6.3. Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Zelllysaten

Zu analysierende Zelllysate wurden hergestellt aus solubilisierten normalen mononukleären oder leukämischen T-Zell-Linien und B-Zell-Kontrollen in einem isotonen Puffer (vorzugsweise 0,15 M NaCl, 0,01 M Tris, pH-Wert 7,4, 1 mM MgCl&sub2;) enthaltend Proteaseinhibitoren (vorzugsweise PMSF, TCPK, Aprotinin, Pepstatin oder Iodacetamid) und ein Detergenz (vorzugsweise NP40 oder Digitonin von 0,1 bis 5%, bevorzugter mit 1%, obgleich andere chemisch verwandte Detergenzien gleichermaßen wirken). Nach der Solubilisierung wurden Nuklei und andere Trümmer mittels Zentrifugation pelletiert (10 Minuten mit 400·g, gefolgt durch erneute Zentrifugation mit 50.000·g für 20 Minuten). Die Lysate (Aliquots von 100 ul) wurden unmittelbar anschließend analysiert mit dem in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen ELISA Sandwich- Immunoassay, oder sie wurden zur späteren Analyse bei 4ºC aufbewahrt oder eingefroren. Für den Durchschnittsfachmann ist es offensichtlich, daß Gewebe im Fall von Lymphgewebe oder anderen mit Lymphozyten infiltrierten Geweben auf ähnliche Weise behandelt werden könnten (z. B. Mayer et al., 1985, J. Immunol. 134: 258).
Wie in Tabelle VI dargestellt, wurde der solubilisierte T-Zell- Antigenrezeptor in den Zelllysaten der T-Zell-Linien und den peripheren mononuklearen Zellen, nicht aber in dem B-Lymphom- Zell-(Daudi)-Lysat nachgewiesen. Tabelle VI Nachweis des T-Zell-Antigenrezeptors in Zelllysaten Zelllysat Zell-Äquivalente im Assay* OD490 unter Verwendung von immobilisiertem Anti-minor Framework-Antikörper und Anti-major Framework-Nachweis-Antikörper HPB-ALL T-Zell-Linie (Leukämie) Jurkat T-Zell-Linie (Lymphom) periphere mononukleare Zellen (gesundes Individuum) Daudi B-Zell-Linie
* Die in Klammern angegebenen Werte beziffern die tatsächliche Anzahl von Zellen, die die Reaktivität des Anti-minor Framework-Antikörpers aufweisen. Es wird darauf hingewiesen, daß die peripheren mononukleären Zellen etwa 2% Zellen enthielten, die eine Reaktivität gegenüber dem immobilisierten Anti-minor Framework-Antikörper zeigten. Daher ist es notwendig, die tatsächliche positive Zellzahl zu normalisieren, um sie mit der HPB-ALL T-Zell-Linie zu vergleichen (vgl. Tabelle I).
Eine Matrix von immobilisierten Antikörpern und Nachweis-Antikörpern wurde hergestellt, um den Effekt unterschiedlicher Kombinationen von Antikörpern bei der Messung der freigesetzten T- Zell-Antigenrezeptoren in mit NP40 behandelten HPB-ALL-Lysaten zu untersuchen. Wie in Tabelle VII dargestellt, konnte eine niedrigere aber signifikante Menge des freigesetzten T-Zell- Antigenrezeptors gemessen werden, wenn derselbe Anti-major Framework-Antikörper sowohl als immobilisierter als auch als Nachweis-Antikörper verwendet wurde. In ähnlicher Weise konnte eine geringere aber signifikante Menge des freigesetzten T- Zell- Antigenrezeptors gemessen werden, wenn derselbe Anti-minor Framework-Antikörper sowohl als immobilisierter als auch aus Nachweis-Antikörper eingesetzt wurde. Demgegenüber konnte der freigesetzte T-Zell-Antigenrezeptor nicht nachgewiesen werden, wenn derselbe HPB-ALL-Anti-Klontyp-Antikörper sowohl als immobilisierter als auch als Nachweis-Antikörper eingesetzt wurde. Tabelle VII Nachweis des T-Zell-Antigenrezeptors im Zelllysat von HPB-ALL T-Zellen Immobilisierter Antikörper OD490 unter Verwendung von Nachweis-Antikörpern*: HPB-ALL Anti-Klontyp Anti-minor Framework Anti-major Framework
* Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben mit NP40 lysiert; pro Vertiefung wurden im Assay 2,5·10&sup6; Zelläquivalente eingesetzt.
Die Werte des nicht-spezifischen Hintergrundes wurden von den angegebenen Werten abgezogen.
+ bedeutet größer als.
Der freigesetzte, T-Zell-Antigenrezeptor konnte auch aus einer Anzahl unterschiedlicher Zellen unter Verwendung zweier unterschiedlicher Anti-major Framework-Antikörper als immobilisierte und Nachweis-Antikörper nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Tabelle VIII zeigen, daß bei Verwendung eines Anti-major Framework-Antikörpers als immobilisierter Antikörper und eines zweiten Anti-major Framework-Nachweis-Antikörpers, der ein abweichendes Epitop auf der major Framework-Determinante definiert, der T-Zell-Antigenrezeptor in Lysaten einer Vielzahl von T-Zell- Linien und peripheren Blutlymphozyten von gesunden Spendern, nicht aber von B-Zell-Linien gemessen werden konnte. Tabelle VIII T-Zell-Antigenrezeptor im Detergenz-Lysat von T-Zell-Linien und peripheren Blut-Lymphozyten Anzahl der Zellen pro Vertiefung OD490 des Zelllysats unter Verwendung zweier unterschiedlicher Anti-major Framework-Antikörper als immobilisierte und Nachweis-Antikörper* HPB-ALL T-Zelle Jurkat Molt 4 Daudi-B-Zelle
* Der monoklonale Antikörper W4 war der immobilisierte Antikörper und BF1 war der Nachweis-Antikörper. Jeder monoklonale Antikörper definiert ein unterschiedliches Epitop der major Framework-Determinante des T-Zell-Rezeptors.
n.u. bedeutet nicht untersucht.
+ bedeutet größer als.
Der T-Zell-Antigenrezeptor-Komplex kann in Zelllysaten aus einer Vielzahl von T-Zell-Linien unter Anwendung eines Anti-T3-Antikörpers als immobilisierter Antikörper und eines Anti-major Framework-Antikörpers als Nachweis-Antikörper unter Bedingungen gemessen werden, die für den T-Zell-Antigenrezeptor-T3-Komplex in Überständen beschrieben wurden.

6.4. Freigesetzter T-Zell-Antigenrezeptor oder Rezeptor-Komplex in Seren

Die Anwesenheit des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptor-Komplexes in Kulturüberständen von leukämischen T-Zell-Linien führte zur Untersuchung, ob der freigesetzte Antigenrezeptor-Komplex in Seren von Patienten mit T-Zell-Malignitäten oder infektiösen Krankheiten nachgewiesen werden kann. Die nachfolgend beschriebenen Experimente wurden zur Bestätigung dieser Theorie auf gestellt und durchgeführt.

6.4.1. Nachweis des freigesetzten Rezeptor-Komplexes in Seren von leukämischen Patienten

Die nachfolgenden Assays wurden durchgeführt unter Verwendung von immobilisiertem Anti-T3-Antikörper und Anti-major Framework- Nachweis-Antikörper, um festzustellen, ob der freigesetzte Rezeptor-Komplex in Serumproben von leukämischen Patienten nachgewiesen werden kann.
Die Vertiefungen einer Immulon I Mikrotiterplatte wurden über Nacht bei 4ºC mit einem monoklonalen Anti-T3- oder Kontroll- Antikörper bei 2,5 ug/ml in PBS beschichtet. Die Vertiefungen wurden anschließend ausgiebig gewaschen, mit 1% BSA in einem Puffer enthaltend 0,025 M Tris, pH-Wert 7,4, 0,15 M NaCl und 0,05% Tween 20 über Nacht bei 4ºC beschichtet und erneut intensiv gewaschen, bevor die Serumprobe und das T-Zell-Lysat zugegeben wurden. Serumaliquots (50 ul) von leukämischen Patienten oder gesunden Individuen wurden den beschichteten Vertiefungen zugegeben, mit 10 ul 2% Digitonin und 40 ul fötalem Kälberserum vermischt, und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Die restlichen Schritte des Assays erfolgten wie zuvor beschrieben. Wie in der folgenden Tabelle IX angezeigt, wiesen die Serumproben von 6 Patienten mit T-Zell-Leukämie oder T-Zell-Lymphom verglichen mit gesunden Individuen signifikant erhöhte Werte für den freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptor-Komplex auf.

Tabelle IX

Freigesetzter T-Zell-Antigenrezeptor-Komplex in Seren

Serumprobe 0D490 unter Verwendung von immobilisierten Anti-T3-Antikörper und Anti-major Framework-Nachweis-Antikörper
* Patient A 0,043
Patient B 0,506
Patient C 0,049
Patient D 0,102
Patient E 0,053
Patient F 0,070
** gesundes Individuum 0,015 ± 0,0072
* Die Patienten A und B waren seropositiv hinsichtlich des humanen T-Zell-Leukämie-Virus I und zeigten Symptome der T- Zell-Leukämie; Patient C zeigte in der Diagnose eine T-Zell- Leukämie; die Patienten D, E und F wiesen nach Diagnose ein T-Zell-Lymphom auf.
** Der durchschnittliche Assaywert für Seren aus 16 gesunden Individuen (Bereich des Wertes bei OD&sub4;&sub9;&sub0;: 0,01 bis 0,031).

6.4.2. Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren leukämischer Patienten

Die folgenden Assays wurden durchgeführt unter Verwendung zweier unterschiedlicher Anti-major Framework-Antikörper, nämlich W4 und BF1 als immobilisierter und Nachweis-Antikörper. Eine besondere Konfiguration dieser Antikörper schien den Nachweis des T- Zell-Antigenrezeptors in den Serumproben zu begünstigen.
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Flow Laboratories, McLean, Virginia) wurden über Nacht bei 4ºC mit einem monoklonalen Anti-Framewerk- oder Kontroll-Antikörper mit 4 ug/ml in PBS beschichtet. Die Vertiefungen wurden anschließend intensiv gewaschen, mit 1% BSA in 0,025 M Tris (pH-Wert 7,4), 0,15 M NaCl und 0,05% Tween-20 bei 37ºC für 2 Stunden beschichtet. Den Vertiefungen wurden Serumaliquots (50 ul) von Patienten und gesunden Individuen (negative Kontrollen) oder 50 ul von Standards bestehend aus Verdünnungen eines NP40-Lysats von HPB T (positive Kontrollen)-Zellen zugegeben, gefolgt von 100 ul eines Puffers bestehend aus 50% fötalem Kälberserum, 0,0125 M Tris (pH-Wert 7,4), 0,075 M NaCl, 0,375% NP40 und 100 ug/ml eines irrelevanten gereinigten Mäuse-IgGs. Die Proben wurden 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, wonach ungebundenes Probenmaterial weggewaschen wurde. Jeder Vertiefung wurden 100 ul eines genau titrierten HRP-Konjugats des zweiten Anti-major Framework-Nachweis-Antikörpers zugegeben, und es wurde für zusätzliche 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS 0,05% Tween gewaschen. 100 ul des zuvor beschriebenen OPD-Substrats wurden zugegeben, und es wurde inkubiert und abgelesen in Gegenwart von H&sub2;SO&sub4; wie zuvor beschrieben.
Mit den ersten Ergebnissen dieses Assays konnte der Nachweis des T-Zell-Antigenrezeptors im Serum erwachsener Patienten mit T- Zell-Leukämie (ATL) nicht erfolgen. Ferner war die rückgewonnene Menge von HPB-Lysat im Falle der Einführung in das Serum relativ gering. Eine Umwandlung der Konfiguration der Antikörper führte jedoch tatsächlich zu einer vollständigen Rückgewinnung. Unter Verwendung der umgekehrten Konfiguration der Anti-major Framework-Antikörper, d. h. des immobilisierten BF1 gefolgt vom W4 Nachweis-Antikörper, konnte der T-Zell-Antigenrezeptor in diesen Seren nachgewiesen werden (Tabelle X). Dieses Ergebnis ist überraschend, da beide Konfigurationen dieser Antikörper erfolgreich zum Nachweis des von kultivierten Zellen freigesetzten T-Zell- Antigens eingesetzt werden können. Obgleich dieses Phänomen bei der Untersuchung von Seren ungeklärt bleibt, ist davon auszugehen, daß die korrekte Auswahl und Konfiguration von Antikörpern für den Assay wichtig sind. Tabelle X Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren Serum-Probe Nr. OD490 von Serum, das unter Verwendung zweier unterschiedlicher Anti-major Framework-Antikörper wie angegeben analysiert wurde: * Immobilisierter Antikörper: Nachweis-Antikörper: T-Zell-Leukämie Rückgewinnung des in normales Serum gegebenen Zelllysat-Rezeptors
* Die Werte für den nicht-spezifischen Hintergrund wurden von den angegebenen Werten abgezogen.

6.4.3. Natur des T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten

Um die Beschaffenheit bzw. Natur des T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten mit dem in den Zellkultur-Überständen analysierten Material zu vergleichen, wurde erneut eine HPLC-Gelfiltration durchgeführt. Die Seren wurden 1 : 1 mit 0,1 M Phosphat und 0,1 M NaCl (pH-Wert 6,8) verdünnt und durch eine Membran von 0,22 um filtriert. 250 ul einer jeden Probe wurden in die Säule unter den zuvor beschriebenen Bedingungen injiziert. Die Assays wurden entsprechend der für die Kulturüberstand-Fraktionen beschriebenen Vorgehensweise (obiger Abschnitt 6.2.4.) durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der Fig. 2 dargestellt, in der A und C die von Patienten mit akuter adulter T- Zell-Leukämie erhaltenen Chromatogramme und B das Chromatogramm für einen Patienten mit einer chronischen lymphozytären T4-Leukämie repräsentieren. Die Daten zeigen, daß in Seren zumindest verschiedene Formen des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors vorhanden sein können, und daß ein unterschiedliches Profil für unterschiedliche Patienten nachgewiesen werden kann. Das Material des freien Volumens kann den mit Membranen oder anderen Molekülen oder Aggregaten assoziierten T-Zell-Antigenrezeptor repräsentieren, während das in dem Fraktionierungsbereich der Säule eingeschlossene Material auf Material hinweist, das dem von der leukämischen Molt 4-Zellinie nachgewiesenem ähnlich ist. Diese Ergebnisse unterstützen die Ansicht, daß der T-Zell-Antigenrezeptor sowohl in vivo als auch in vitro in einer Vielzahl von Formen freigesetzt werden kann.

6.4.4. Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten mit T-Zell-Malignitäten

Die Ergebnisse aus der Analyse von 51 leukämischen und 8 gesunden Laborspendern hinsichtlich des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Serumproben unter Verwendung der optimierten Konfiguration von Anti-major Framework-Antikörpern sind in der Tabelle XI dargestellt. Die Werte sind in Relation zu einem Standardlysat der HPB T-Zell-Linie ausgewiesen. Von den gesunden Laborspendern wurde mit diesem Assay kein nachweisbares Material gemessen. 8 von 10 akuten ATL-Patienten zeigten signifikante Mengen des Antigenrezeptors. Während 2 von 16 chronischen ATL- Patienten erhöhte Werte des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors aufwiesen, zeigen diese Daten, daß die Menge an zellfreiem T-Zell-Antigenrezeptor in Seren mit der Krankheits-Aktivität dieser ATL-Patienten korreliert ist. Unter den nicht-ATL-leukämischen Patienten zeigte eine T4-positive Leukämie in diesem Assay eine starke Reaktivität. Tabelle XI Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten mit T-Zell-Malignitäten Diagnose Anzahl der Patienten * Serumwerte des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors (Einheiten/ml) ** akute adulte T-Zell-Leukämie Patient chronische adulte T-Zell-Leukämie schwelende adulte T-Zell-Leukämie nicht-adulte T-Zell-Leukämie gesund
* Die Patienten A, B und C entsprechen A, B und C der Fig. 2.
** Die Serumwerte wurden analysiert durch den optimierten Sandwich-Immunoassay, bei dem immobilisierter BF1 und W4 Nachweis-Antikörper eingesetzt wurden. Die Einheiten sind im Verhältnis zu den Werten dargestellt, die von einem standardisierten HAB T-Zell-Lysat erhalten wurden, welches als positive Kontrolle diente.
*** Diese Probe wurde einem Patienten mit chronischer lymphozytärer T4-Leukämie entnommen.
- bedeutet weniger als.
Es wird davon ausgegangen, daß die Menge an freigesetztem T- Zell-Antigenrezeptor eine diagnostische Bedeutung bei der Überwachung T-Zell-abhängiger Malignitäten haben kann.

6.4.5. Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten mit infektiöser Krankheit

Die Ergebnisse der Analyse des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten mit infektiösen Krankheiten sind in der Tabelle XII dargestellt. Signifikante Mengen des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors werden auch bei Patienten mit einer viralen Herpes-Infektion beobachtet. Es ist möglich, daß dieses Material aufgrund der Krankheit oder aufgrund der Immunreaktion auf die Krankheit direkt freigesetzt werden kann. In jedem Fall wird davon ausgegangen, daß die Menge an freigesetztem T-Zell-Antigenrezeptor bei der Überwachung infektiöser Krankheiten eine diagnostische Bedeutung haben kann. Tabelle XII Nachweis des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors in Seren von Patienten mit infektiösen Krankheiten Diagnose Anzahl von Patienten Serumwerte des freigesetzten T-Zell-Antigenrezeptors (Einheiten/ml) * Infektion mit Epstein-Barr-Virus Infektion mit Cytomegalovirus gesunde Blutspender gesundes Laborpersonal
* Die Serumwerte wurden analysiert mit dem optimierten Sandwich-Immunoassay, bei dem immobilisierter BF1 und W4 Nachweis-Antikörper eingesetzt wurden. Die Einheiten sind im Verhältnis zu den Werten dargestellt, die von einem standardisierten HPB T-Zell-Lysat erhalten wurden, welches als positive Kontrolle diente.
- bedeutet weniger als.

7. Hinterlegung von Mikroorganismen

Die folgenden Hybridome sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter den folgenden Hinterlegungs-Nummern hinterlegt worden: Hybridom Antikörper-Typ Hinterlegungs-Nr. Anti-major Framework
Die vorliegende Erfindung wird in ihrem Umfang durch die in den zur Veranschaulichung einiger Aspekte der Erfindung dienenden Beispielen offenbarten Ausführungsformen nicht beschränkt, und jedwede funktionell äquivalenten Verfahren liegen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Tatsächlich ergeben sich für den Durchschnittsfachmann vielfältige Veränderungen der Erfindung zusätzlich zu den vorliegend beschriebenen und fallen in den Schutzbereich der anhängenden Patentansprüche.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis eines löslichen, zellfreien T-Zell- Antigenrezeptors oder eines Fragments, Derivats oder Komplexes davon in einer zellfreien Probe, bei dem man:

(a) die Probe mit einem für den T-Zell-Antigenrezeptor, das Fragment, Derivat oder den Komplex spezifischen Antikörper unter Bedingungen kontaktiert, die das Eintreten einer immunspezifischen Bindung erlauben, und

(b) feststellt, ob eine immunspezifische Bindung erfolgt,

wobei die immunspezifische Bindung das Vorhandensein des zellfreien T-Zell-Antigenrezeptors, des Fragments, Derivats oder des Komplexes in der Probe anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Antikörper ein Antimajor Framework-Antikörper, ein Anti-minor Framework-Antikörper oder ein anti-klontypischer Antikörper ist.

3. Verfahren zum Nachweis eines löslichen, zellfreien T-Zell- Antigenrezeptors oder eines Fragments, Derivats oder Komplexes davon in einer zellfreien Probe, bei dem man:

(a) die Probe mit einem ersten Antikörper und einem zweiten Antikörper, wobei beide Antikörper spezifisch für einen T-Zell-Antigenrezeptor sind, und wobei der erste und der zweite Antikörper nicht um dieselbe Bindungsstelle konkurrieren, unter Bedingungen kontaktiert, die eine immunspezifische Bindung beider Antikörper an eine Komponente der Probe erlauben, und

(b) feststellt, ob die immunspezifische Bindung erfolgt, wobei die immunspezifische Bindung der Komponente der Probe an beide Antikörper das Vorhandensein des zellfreien T- Zell-Antigenrezeptors, des Fragments, Derivats oder des Komplexes in der Probe anzeigt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der erste Antikörper immobilisiert und der zweite Antikörper nachweisbar markiert ist, damit die immunspezifische Bindung beider Antikörper durch den Nachweis des nachweisbaren Markers in immobilisierter Form angezeigt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der erste Antikörper ein Anti-major Framework-Antikörper, ein Anti-minor Framework- Antikörper oder ein anti-klontyischer Antikörper ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der zweite Antikörper ein Anti-major Framework-Antikörper, ein Anti-minor Framework- Antikörper oder ein anti-klontypischer Antikörper ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Probe eine biologische Flüssigkeit umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Probe eine biologische Probe umfaßt, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Zellkulturmedium, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Urin, Spinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Amnionflüssigkeit und Kranialflüssigkeit.

9. Verfahren zum Nachweis eines löslichen, zellfreien, mit einem zweiten Protein oder Peptid komplexierten T-Zell-Antigenrezeptors oder eines Fragments oder Derivats davon in einer zellfreien Probe, bei dem man:

(a) die Probe mit einem ersten für einen T-Zell-Antigenrezeptor spezifischen Antikörper und mit einem zweiten für ein Epitop des zweiten Proteins oder Peptids spezifischen Antikörper unter Bedingungen kontaktiert, die eine immunspezifische Bindung beider Antikörper an eine Komponente der Probe erlauben, und

(b) feststellt, ob die immunspezifische Bindung erfolgt,

wobei der Nachweis der immunspezifischen Bindung das Vorhandensein des löslichen, zellfreien, mit dem zweiten Protein oder Peptid komplexierten T-Zell-Antigenrezeptors, Fragments oder Derivats anzeigt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der erste Antikörper immobilisiert und der zweite Antikörper nachweisbar markiert ist, damit die immunspezifische Bindung beider Antikörper durch den Nachweis des nachweisbaren Markers in immobilisierter Form angezeigt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der zweite Antikörper immobilisiert und der erste Antikörper nachweisbar markiert ist, damit die immunspezifische Bindung beider Antikörper durch den Nachweis des nachweisbaren Markers in immobilisierter Form angezeigt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem der erste Antikörper ein Anti-major Framework-Antikörper, ein Anti-minor Framework-Antikörper oder ein anti-klontypischer Antikörper ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem der zweite Antikörper ein Anti-T3-Antikörper ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem die Probe eine biologische Flüssigkeit umfaßt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem die Probe eine biologische Flüssigkeit umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellkulturmedium, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Urin, Spinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Amnionflüssigkeit und Kranialflüssigkeit.

16. Anwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Diagnose eines Krankheitszustandes eines menschlichen oder tierischen Körpers, wobei das Verfahren auf eine von dem menschlichen oder tierischen Körper entnommene Körperflüssigkeitsprobe angewendet wird.

17. Anwendung nach Anspruch 16, bei der der Krankheitszustand durch Leukämie, ein Lymphom oder eine virale Infektion verursacht ist.

18. Eine in vitro oder in vivo diagnostische Zusammensetzung umfassend ein lösliches, zellfreies Molekül, das eine antigene Determinante eines T-Zell-Antigenrezeptors trägt, und einen diagnostisch verträglichen Träger.

19. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der das lösliche, zellfreie Molekül ein α-, β-, γ- oder δ-Monomer umfaßt.

20. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der das lösliche, zellfreie Molekül ein Homodimer der α-, β-, γ- oder δ-Monomere umfaßt.

21. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der das lösliche, zellfreie Molekül ein Heterodimer der α-, β-, γ- oder δ-Monomere umfaßt.

22. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der das lösliche, zellfreie Molekül von einer rekombinanten Zelle produziert wird.

23. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der das lösliche, zellfreie Molekül mittels chemischer Synthese hergestellt ist.

24. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der die antigene Determinante ein Epitop enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer major Framework-Determinate, einer minor Framework-Determinante, einer antigenbindenden Region oder Klontyp, einer konstanten Region, einer variablen Region und einer hypervariablen Region.

25. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der das zellfreie Molekül mit einem zweiten Peptid oder Protein komplexiert ist.

26. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der das zellfreie Molekül mit dem T3-Protein komplexiert ist.

27. Diagnostische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 bis 26, bei der das zellfreie Molekül markiert ist.

28. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Störung eines Individuums, umfassend das Nachweisen oder Messen der Menge eines Antigens in einer Probe aus dem Individuum, wobei der Nachweis oder die Messung mittels eines Verfahrens erfolgt, das das Kontaktieren des Antigens mit der diagnostischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 26 in der Weise, daß eine Bindung des Antigens mit dem zellfreien Molekül erfolgt, und das Nachweisen oder Messen der Bindung umfaßt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem das zellfreie Molekül markiert ist.

30. Lösliches, zellfreies Molekül, das eine antigene Determinante eines T-Zell-Antigenrezeptors trägt, zur therapeutischen Verwendung.

31. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, das ein α-, β-, γ- oder δ-Monomer umfaßt.

32. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, das ein Homodimer der α-, β-, γ- oder δ-Monomere umfaßt.

33. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, das ein Heterodimer der α-, β-, γ- oder δ-Monomere umfaßt.

34. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, das von einer rekombinanten Zelle produziert wird.

35. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, das mittels chemischer Synthese hergestellt ist.

36. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, bei dem die antigene Determinante ein Epitop einer major Framework-Determinate enthält.

37. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, bei dem die antigene Determinante ein Epitop einer minor Framework-Determinante enthält.

38. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, bei dem die antigene Determinante ein Epitop einer antigenbindenden Region oder Klontyp enthält.

39. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, bei dem die antigene Determinante ein Epitop einer konstanten Region enthält.

40. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, bei dem die antigene Determinante ein Epitop einer variablen Region enthält.

41. Lösliches, zollfreies Molekül nach Anspruch 30, bei dem die antigene Determinante ein Epitop einer hypervariablen Region enthält.

42. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, das mit einem zweiten Peptid oder Protein komplexiert ist.

43. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, das mit dem T3-Protein komplexiert ist.

44. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, definiert durch seine Reaktivität gegenüber dem von einem bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer HB 9282 hinterlegten Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper W4.

45. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, definiert durch seine Reaktivität gegenüber dem von einem bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer HB 9283 hinterlegten Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper βF1.

46. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 30, definiert durch seine Reaktivität sowohl gegenüber dem von einem bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer HB 9282 hinterlegten Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper W4 als auch gegenüber dem bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer HB 9283 hinterlegten Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper βF1.

47. Lösliches, zellfreies Molekül, das eine antigene Determinante eines T-Zell-Antigenrezeptors trägt, zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit, bei der eine T-Zell-Antwort ausgelöst wird oder beteiligt ist.

48. Lösliches, zellfreies Molekül nach Anspruch 47 gemäß Definition in einem der Ansprüche 31 bis 46.

49. Lösliches, zellfreies Molekül nach einem der Ansprüche 47 oder 48, wobei die Krankheit, bei der eine Immunantwort ausgelöst wird oder beteiligt ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunkrankheit, Organtransplantat / Transplantatabstoßung, Transplantat gegen Empfänger-Reaktion, T-Zell-Malignität, Krebs, solidem Tumor, Allergie und infektiöser Krankheit.

50. Verwendung eines löslichen, zellfreien Moleküls, das eine antigene Determinante eines T-Zell-Antigenrezeptors trägt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, bei der eine T-Zell-Antwort hervorgerufen wird oder beteiligt ist.

51. Verwendung nach Anspruch 50 zur Herstellung des Medikaments, wobei das lösliche, zellfreie Molekül wie in einem der Ansprüche 31 bis 46 definiert beschaffen ist.

52. Verwendung nach Anspruch 50 oder 51 zur Herstellung des Medikaments, wobei die Krankheit, bei der eine Immunantwort hervorgerufen wird oder beteiligt ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunkrankheit, Organtransplantat/Transplantatabstoßung, Transplantat gegen Empfänger- Reaktion, T-Zell-Malignität, Krebs, solidem Tumor, Allergie und infektiöser Krankheit.

53. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines löslichen, zellfreien Moleküls, das eine antigene Determinante eines T-Zell-Antigenrezeptors trägt, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

54. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 53, bei der das lösliche, zellfreie Molekül wie in einem der Ansprüche 31 bis 46 definiert beschaffen ist.