DE3853588T2 - Monoklonaler antikörper, spezifisch gegen den funktionellen adhäsionsbereich des oberflächenproteins einer phagocyten-zelle. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft eine Hybridzellinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert, welcher sich an eine bestimmte Stelle des Antigens bindet, die sich auf der Phagozytenzelloberfläche befindet. Im besonderen lagert sich dieser monoklonale Antikörper an einen spezifischen Bereich des CD11b Glykoproteins an und inaktiviert diesen, wodurch adhäsionsabhängige Funktionen der Phagozytenzelle gehemmt werden, wobei jedoch die anderen Phagozytenfunktionen nicht beeinträchtigt werden.
• Peripheres Blut im Blutkreislauf eines Menschen besteht in erster Linie aus roten Blutkörperchen, Blutplättchen und weißen Blutkörperchen oder Leukozyten. Zur Familie der weißen Blutkörperchen gehören Lymphozyten, Neutrophile, Monozyten, Eosinophile und Basophile. Lymphozyten werden in erster Linie in die Untergruppen der T-Zellen und der B-Zellen eingeteilt; weitere Untergruppen von Lymphozyten sind ebenfalls bekannt. Die Vielfalt der Funktionen von Leukozyten und ihre klinische Relevanz haben bei Wissenschaftlern großes Interesse hervorgerufen.
• Neutrophile, Eosinophile und Basophile werden als "granulozyten" identifizert, da sie zytoplasmatische Granula enthalten. Granulozyten und Monozyten werden wegen ihrer Fähigkeit zur Phagozytose bzw. zur Einverleibung von Bakterien, anderen Mikroorganismen und anderer Fremdmaterialien, welche im allgemeinen als "Antigene" bezeichnet werden, als "Phagozyten" identifiziert. Diese Phagozytenfunktion ist wichtig, um eine Vielzahl von Infektionen vom Körper abzuwehren, und spielt darüberhinaus bei vielen verschiedenen Arten von entzündlichen Krankheiten eine wichtige Rolle. Phagozyten werden von gewöhnlichen Vorläuferzellen im Knochenmark produziert, zirkulieren im peripheren Blut und dringen schließlich je nach Bedarf zur Kontrolle einer Infektion oder zur Teilnahme an einer Entzündungsreaktion in das Gewebe ein. Derartige Antwortfunktionen sind bei menschlichen und tierischen Phagozyten zu finden, d.h. bei Primaten und Hunden.
• Neutrophile sind die Leukozyten, die in menschlichem und tierischem peripheren Blut am häufigsten vorkommen. Ein Mikroliter normalen menschlichen Vollblutes enthält durchschnittlich 5 x 10³ Leukozyten, wovon 3.975 Neutrophile, 150 Eosinophile, 25 Basophile, 250 Monozyten und 1.500 Lymphozyten sind.
• Bei der Immunantwort von Granulozyten oder Monozyten auf Infektionen oder Entzündungen jeglicher Art werden als erste Reaktion auf "chemische Anziehungsfaktoren", wie z.B. bestimmte bakterielle Produkte, Komplement-Komponenten, etc., diese Zellen zur Migration in die entsprechenden Areale aktiviert. Dieser Anziehungsprozeß wird "Chemotaxis" genannt. Sobald die Granulozyten oder Monozyten an einem Entzündungs- oder Infektionsherd angekommen sind, beginnen sie, sich fest an ihre Zielzellen anzulagern. Zu diesem Zweck besitzen diese Zellen eine Reihe spezifischer Zelloberflächen-Rezeptor-Glykoproteine, die diese Wechselwirkung unterstützen, also beispielsweise Komplement-, Fc- und Fibronektinrezeptoren.
• Eine der wichtigsten Familien der Zelloberflächen-Rezeptor-Glykoproteine, die an der Phagozytenadhäsion beteiligt sind, ist die Familie der Leukozytenzelladhäsionsmoleküle, die als "CAM" oder Cd11/CD18 bekannt ist. Diese Familie besteht aus mindestens drei (3) Zelloberflächenproteinen, die jeweils zwei (2) Untereinheiten aufweisen. Sie haben eine gemeinsame beta-Untereinheit, CD1B, mit einem Molekulargewicht von 94.000 Dalton und weisen unterschiedliche alpha-Untereinheiten auf. Die bekannten Mitglieder dieser Familie werden mit LFA-1 (CD11a/CD18), Mo1 (Cd11b/CD1B) und P150,94 (CD11c/CD18) bezeichnet. Diese Glykoproteine weisen jeweils alpha-Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 180.000, 155.000 und 150.000 Dalton auf. Jedes dieser Zelloberflächenproteine wurde durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern genau identifiziert. Die biologische Bedeutung dieser Familie von Oberflächen-Glykoproteinen wurde durch die Identifizierung einer menschlichen Krankheit erkannt, bei der ein genetisch bedingter Mangel an Leukozyten besteht, die die Gruppe von Antigenen tragen. Diese Krankheit ist gekennzeichnet durch wiederkehrende bakterielle Infektionen und durch Mängel bei adhäsionsabhängigen Funktionen wie Phagozytose, Chemotaxis, Leukoaggregation, sowie durch Ausbreiten von Neutrophilen auf Kunststoff.
• Mo1 ist ein Zelloberflächen-Glykoprotein, das auf Granulozyten, mononukleären Phagozyten und Null-Zellen zu finden ist (Todd, R.F. III, Nadler, L.M., und Schlossman, S.F., Antigens on human monocytes, Journal of Immunology, 126: 1435-1442, 1981). Beim Menschen besteht dieses Molekül aus zwei Proteinen von 155.000 bzw. 94.000 Dalton, welche eine nicht-kovalente Bindung eingehen (Todd, R.F. III, van Agthoven, A., Schlossman, S.F. und Terhorst, D., Structure analysis of differentiation antigens Mo1 and Mo2 on human monocytes, Hybridoma 1: 329-337, 1982). Es wurde gezeigt, daß dieser Komplex die Adhäsion an einer Vielzahl von Oberflächen, wie z.B. anderen Granulozyten, Endothelium und reaktionsträgen Substraten, vermittelt. Genetisch bedingte Mängel an diesen Molekülen führen aufgrund der Unfähigkeit von Granulozyten, eine antimikrobielle Entzündungsantwort zu vermitteln, zu wiederkehrenden bakteriellen Infektionen. Patienten, die einen Mangel an diesen Molekülen haben, sind gekennzeichnet durch eine erhöhte Leukozytenzahl ("Leukozytose" genannt), sowie durch funktionelle Defekte bei der phagozytischen Aktivität, wie sie in vitro durch verminderte oder nicht stattfindende Aggregationsadhäsion an Substraten, Chemotaxis und Phagozytose von opsonisierten Partikeln gemessen wurden. Die Aktivierung von Granulozyten und Monozyten durch lösliche Entzündungsmediatoren erhöht den funktionsfähigen Anteil dieser Moleküle (Todd. R.F. III, Arnaout, M.A., Rosin, R.E., Crowley, C.A., Peters, W.A., und Babior, B.M. The subcellular localization of Mo1 (Mo1 alpha; formerly gp¹¹&sup0;), a surface of glycoprotein associated with neutrophil adhesion, J. Clin. Invest., 74: 1280-1290, 1984; Arnaout, M.A., Hakim, R.M. Todd, R.F., Dana, N. und Colten, H.R. Increased expression of an adhesion-promotion surface glycoprotein in the granulocytopenia of hemodialysis. New Engl. J. Med., 312: 457-462, 1985.) Monoklonale Antikörper, die gegen das Mo1 Glykoprotein gerichtet werden, verhindern in vitro wirksam eine Neutrophilenaggregation und verhindern außerdem die Phagozytose.
• Das Mol-Glykoprotein war besonders interessant, da diese spezielle molekulare Struktur die Fähigkeit zur Bindung an eine Komponente mit der Bezeichnung "iC3b" besitzt, welche ein Teil der dritten Komplement-Komponente ist (Arnaout, M.A., Todd, R.F. III, Dana N., Melamed, J., Schlossman, S.F., und Colten, H.R. lnhibition of phagocytosis of complement C3 or IgG-coated particles and of iC3b binding by monoclonal antibodies to a monocytegranulocyte membrane glycoprotein (Mol), J. Clin. Invest., 72: 171- 179, 1983.) Darüberhinaus ist das Mol-Glykoprotein sehr wichtig bei allen adhäsionsabhängigen Phagozytenfunktionen. Es wurde gezeigt, daß andere monoklonale Antikörper die Funktionen des Mol-Glykoproteins hemmen.
• Der von der neuen erfindungsgemäßen Hybridzellinie erhaltene monoklonale Antikörper ist in der Lage, die adhäsionsabhängige Funktion von Neutrophilen zu hemmen, bindet sich jedoch nicht an den iC3b-Teil der dritten Komplement-Komponente. Dieser monoklonale Antikörper trägt die Kennzeichnung "MY904". Er bindet sich spezifisch an Neutrophile, d.h. an den antigenen Ort auf dem CD11B/CD Phagozyten-Oberflächen-Protein, der für die Granulozytenadhäsion verantwortlich ist. Durch die Zugabe des monoklonalen Antikörpers MY904 zu Phagozyten werden adhäsionsabhängige Phagozytenfunktionen gehemmt, jedoch werden andere Funktionen nicht gehemmt, und zwar weder die des Cd11b/CD18-Moleküls, wie z.B. die Bindung der Komplement-Komponente iC3b, noch andere Arten von Neutrophilen- oder Monozytenfunktionen, wie z.B. die Fc-Rezeptor-Aktivierung, die Aktivierung des Atmungsschubs durch chemotaktische Peptide oder Phorboldiester und andere.
• Der Nutzen eines solchen spezifischen monoklonalen Antikörpers ist unterschiedlicher Natur. Die Bindung des monoklonalen Antikörpers MY904 an Neutrophile könnte speziell die Migration der Neutrophilen zu Entzündungs- oder Infektionsherden hemmen. Eine solche Bindung an Neutrophile könnte die Adhäsion und Ausbreitung von aktivierten, bereits an Entzündungs- oder Infektionsherden befindlichen Neutrophilen verhindern und dann die Freigabe toxischer Substanzen durch Neutrophile hemmen. Der monoklonale Antikörper MY904 könnte zum Zweck eines Immunassays des CD11b/CD18-Moleküls mit einer geeigneten Markierungssubstanz gekennzeichnet werden oder mit einem geeigneten Substrat konjugiert werden, um gebundene Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Magnetkugeltrennung anzureichern. Die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers MY904, bestimmte Phagozytenfunktionen zu hemmen, hätte speziellen Nutzen für eingehende Studien von Phagozytenfunktionen, insbesondere, wenn an klinischen Störungen überschießende oder schädliche Phagozytenfunktionen beteiligt sind. Außerdem ist dieser monoklonale Antikörper nützlich für die quantitative Bestimmung des funktionellen Anteils des Oberflächenantigens CD11b/CD18 und kann dadurch zur Diagnose der hier beschriebenen Mol-Mangel-Krankheit herangezogen werden.
• Die Erfindung schafft eine Hybridzellinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der gegen den adhäsionsabhängigen Bereich des Mol-Antigens gerichtet ist, welches sich auf der Oberfläche von menschlichen und tierischen Phagozyten befindet. Der monoklonale Antikörper ist spezifisch gegen den Teil des CD11B/CD18 Phagozytenzellen-Oberflächenproteins gerichtet, der bei der Adhäsion von Neutrophilen und Monozyten involviert ist, und hemmt daher adhäsionsabhängige Phagozytenfunktionen, wie z.B. die Chemotaxis und die Phagozytose zu bzw. an einem Entzündungs- oder Infektionsherd, ohne bestimmte andere Phagozytenfunktionen zu beeinflussen.
• Der monoklonale Antikörper wird durch eine Hybridzellinie hergestellt, bei der ein Bindungspartner mit menschlichen Zellen chronisch granulozytärer Leukämie immunisiert wurde.
• Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper trägt die Kennzeichnung MY904. Er wurde mit einem von Kohler und Milstein beschriebenen Standardverfahren entwickelt (Nature 256: 495-497 (1975)), d.h. durch die Verschmelzung von Mäusemilzzellen, die mit gereinigten Zellen chronisch granulozytärer Leukämie (CGL) immunisiert worden waren, und Mausmyelomzellen.
• Die bei dem Immunisierungsvorgang verwendeten menschlichen CGL- Zellen waren einzigartig und wurden speziell präpariert. Durch Venenpunktion wurde von einem einzigen Patienten mit CGL in der Blastenphase Blut für routinemäßige diagnostische Untersuchungen abgenommen. Mononukleäre Zellen wurden präpariert durch Ficoll- Hypaque-Dichtegradientensedimentation, 1,077 g/cm³. Die mononukleären Zellen wurden dann bis zu Ihrer Verwendung in 10% Dimethylsulfoxid in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Zum Zweck der Immunisierung wurden bestimmte Mengen der CGL-Zellen aufgetaut und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert, und 10 x 10&sup6; Zellen wurden in die Bauchhöhle und in subkutane Bereiche einer Balb/c-Maus injiziert. Dieser Vorgang wurde einen (1) Monat lang jeweils in wöchentlichen Abständen wiederholt. Nach einem weiteren Zeitraum von einem (1) Monat, wurden der Maus zur Erzeugung des "Booster-Effekts" 10 x 10&sup6; Zellen des gleichen Patienten intravenös in die Schwanzvene der Maus injiziert. Drei (3) Tage später wurde die Milz der Maus entfernt und die Milzzellen durch herkömmliche Techniken gesammelt.
• Anschließend folgte die Verschmelzung zur Bildung von Hybridomen. Die Milzzellen wurden gewaschen und mit der NS-1 Plasmazytom-Zellinie in einem Verhältnis von acht (8) Milzzellen zu der NS-1-Zelle in serumfreiem Medium vermischt. Die Zellen wurden zu Pellet-Form zentrifugiert und acht (8) Minuten lang bei 25ºC in 0,5 ml von 30% Polyethylenglykol (PEG) suspendiert. Das PEG wurde dekantiert und die Zellen wurden in Hypoxanthineaminopterin-Thymidin-Medien verdünnt und schließlich auf Mikrotiterplatten verteilt. Tests bezüglich des Reaktionsvermögens des monoklonalen Antikörpers MY904 wurden durch indirekte Immunofluoreszenz und Durchflußzytometrie durchgeführt, wobei das Screening sich auf das Reaktionsvermögen mit CGL-Zellen des ursprünglichen Patienten bezog. Der monoklonale Antikörper MY904 wurde wegen seines Reaktionsvermögens mit den immunisierenden CGL- Zellen und wegen seines fehlenden Reaktionsvermögens mit normalen menschlichen T-Lymphozyten und B-Lymphozyten ausgewählt.
• Es zeigte sich, daß der monoklonale Antikörper MY904 mit gereinigten Monozyten von 10/10 normalen getesteten Spendern reagiert, mit 10/10 normalen getesteten Granulozyten und mit 10/10 Proben normaler mononukleärer Knochenmarkszellen. Er reagierte nicht mit gereinigten B-Lymphozyten. Eine niedrige Antigendichte wurde auf einer Untergruppe von großen granularen Lymphozyten peripheren Blutes entdeckt, von der gezeigt worden war, daß sie die natürlichen Killerzellen einschließt. Die in einer Gewebekultur aufbewahrte Zellinie KG-1 wurde getestet und lieferte für das Epitop MY904 ein positives Testergebnis. Die Myeloidzellinien HL-60 und U937 wurden getestet und lieferten ein negatives Testergebnis, jedoch drücken beide Zellinien, wenn sie in vitro durch die Zugabe von Phorboldiester zur Differenzierung gebracht werden, das MV904-Epitop aus. Folgende Zelllinien wurden getestet und lieferten ebenfalls ein negatives Testergebnis: K562, Daudi, Nalm-1, Nalm-6, JB, Raji, CEM, HSB, sowie 5 Epstein-Barrtransformierte B-Lymphozyten-Zellinien (Laz-221, -388, -156, -471, -509). Bei normalen Erythrozyten und Blutplättchen fehlt der Antigenabschnitt von MY904, ebenso wie bei Phytohämagglutinin-aktivierten T-Lymphozyten.
• Die Funktion des MY904-Epitops auf menschlichen leukämischen Zellen wurde ebenfalls untersucht. Der Antikörper reagiert mit Granulozyten aller Patienten mit chronischer granulozytärer Leukämie (CGL) in der stabilen Phase. Dreißig Patienten mit chronischer granulozytärer Leukämie in der Blastenphase wurden ebenfalls getestet. In neun Fällen waren die Blast-Zellen positiv. Außerdem wurden 193 Fälle von akuter Myeloblastenleukämie untersucht; der monoklonale Antikörper MY904 reagierte mit leukämischen Zellen von 56% dieser Patienten.
• Der monoklonale Antikörper gehört zur Unterklasse Iggl und bildet ein Immunpräzipitat eines Glykoproteins, das aus zwei (2) Untereinheiten mit je 155.000 Dalton und 94.000 Dalton von oberflächenmarkierten, normalen, menschlichen Granulozyten besteht (Dana, N., et al. Two functional domains in the phagocyte membrane glycoprotein Mol identified with monoclonal antibodies. J. Immunol. 137: 3259-3263, 1986). Die Verteilung des Reaktionsvermögens des monoklonalen Antikörpers MY904 verhindert nicht die iC3b-Bindung, hemmt jedoch wirksam die adhäsionsabhängigen Vorgänge, die Ausbreitung von Granulozyten auf Kunststoff und die Chemotaxis. (Dana et al., ibd.). Verglichen mit anderen anti-Mol monoklonalen Antikörpern war der monoklonale Antikörper MY904 deshalb einzigartig, weil er nur die adhäsionsabhängigen Funktionen, aber nicht die iC3b-Bindung hemmte. Zu anderen getesteten Antikörpern zählten die monoklonalen Antikörper 44, 903, 94, 17, OKM10 und Leu-15. (Dana et al., ibd).
• Der monoklonale Antikörper MY904 identifiziert also das Mol Granulozyten-Monozyten-Zelloberflächen-Glykoprotein und bindet sich außerdem spezifisch an ein Epitop auf diesem Glykoprotein, das an adhäsionsabhängigen Vorgängen von Granulozyten-/Monozytenaktivitäten beteiligt ist.
• Eine Probe der Hybridzellinie, die in der Lage ist, monoklonale Antikörper MY904 zu produzieren, ist bei der American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, mit Wirkung vom 19. August 1987 unter der A.T.C.C.-Nummer HB9510 hinterlegt.
• Tests in vitro haben gezeigt, daß Lekozyten sowohl vom Menschen als auch von Hunden und von subhumanen Primaten das Mol-Glykoprotein aufweisen. Gemäß Letvin, N.L, Todd, R.F. III, Palley, L.S., und Griff in, J.D. wurde die Konservierung des MY904-Myeloid-Oberflächenantigens auf Granulozyten von Primaten und Hunden gezeigt (Blood 61: 408-410, 1983). Außerdem wurde gezeigt, daß die Bindung des monoklonalen Antikörpers MY904 normale Neutrophile von Hunden die Neutrophilenaggregation in vitro wirksam verhindert, wenn eine Stimulierung mit Phorbolester PMA erfolgt ist (Giger, U., Boxer, L.A., Simpson, P.A., Lucchesi, B.R. und Todd, R.F. III. Deficiency of leukocyte surface glycoproteins Mol, LFA-1 and Leu-MS in a dog with recurrent bacterial infection: an animal model. Blood 69: 1622-1630, 1987).
• Der monoklonale Antikörper MY904 ist einzigartig wegen seiner außergewöhnlichen Spezifität für den Adhäsionsbereich des CD11b/CD18 Phagozyten-Oberflächenproteins. Außerdem hat dieser Antikörper die Fähigkeit, Phagozytenfunktionen, bei denen das funktionelle Vorhandensein dieser kritischen Zelloberflächenstruktur erforderlich ist, vollständig zu verhindern.

Claims (9)

1. Durch Hybridom-Technik produzierte Hybridzellinie, die alle Eigenschaften der bei der American Type Culture Collection unter Nummer HB9510 hinterlegten Hybridom-Probe aufweist, welche den monoklonalen Antikörper MY904 produziert, wobei die Hybridzellinie einen monoklonalen Antikörper produziert, der sich spezifisch mit dem Adhasionsbereich des CD11b/CD18 Phagozyten-Oberflächen-Proteins verbindet.

2. Zellinie nach Anspruch 1, wobei sich der von der Zellinie produzierte monoklonale Antikörper spezifisch mit Granulozyten aus Proben peripheren Blutes mit Granulozytenleukämie verbindet.

3. Zellinie nach Anspruch 1, wobei sich der von der Zellinie produzierte monoklonale Antikörper spezifisch mit normalen Monozyten, normalen Granulozyten und normalen mononukleären Zellen verbindet, nicht jedoch mit normalen Erythrozyten und Blutplättchen.

4. Hybridom-Zellinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der sich mit dem Epitop verbindet, das durch den monoklonalen Antikörper MY904 definiert ist, welcher von der bei der American Type Culture Collection hinterlegten Probe Nummer HB9510 produziert wird.

5. Hybridom-Zellinie, die bei der American Type Culture Collection unter der Nummer HB9510 hinterlegt ist.

6. Monoklonaler Antikörper, der sich nicht spezifisch mit der iC3b-Komplement-Komponente verbindet und der sich spezifisch mit einem Epitop auf dem Cd11b-Teil des CD11b/CD18 Phagozyten-Membran-Proteins Mol verbindet, um nur die adhäsionsabhängigen Funktionen von Granulozyten und Monozyten zu hemmen und dabei bestimmte Phagozytenfunktionen auf einen Entzündungs- oder Infektionsherd zu blockieren, wobei ein solches Epitop durch den monoklonalen Antikörper definiert wird, der von der bei der American Type Culture Collection unter der Nummer HB9510 hinterlegten Probe produziert wird.

7. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 6, der sich spezifisch mit normalen Monozyten, normalen Granulozyten und normalen mononukleären Knochenmarkszellen verbindet, jedoch nicht mit normalen Erythrozyten und Blutplättchen.

8. Monoklonaler Antikörper, der durch Hybridom-Technik produziert wird und der alle Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers aufweist, welcher von der bei der American Type Culture Collection unter Nummer H89510 hinterlegten Hybridom- Probe produziert wird.

9. Monoklonaler Antikörper, der von der bei der American Type Culture Collection unter der Nummer HB9510 hinterlegten Hybridom-Probe produziert wird.