KR960001741B1

KR960001741B1 - 세포-없는 t 세포항원 수용체 단백질의 감지방법

Info

Publication number: KR960001741B1
Application number: KR1019870700666A
Authority: KR
Inventors: 패드릭 씨. 쿵; 스티븐 에이취. 입; 미첼 씨. 브라운
Original assignee: 티 셀 사이언시즈, 인코포레이티드; 지오프레이 피. 클레어
Priority date: 1985-12-03
Filing date: 1986-12-02
Publication date: 1996-02-05
Also published as: WO1987003600A1; AU6772587A; DE3650184D1; EP0616811A1; ATE116329T1; EP0248887A1; EP0248887B1; DE3650184T2; KR880700816A; AU617980B2; US5436319A; EP0248887A4

Abstract

내용 없음.

Description

세포-없는 T 세포항원 수용체 단백질의 감지방법

제1도는 T 세포 배양주 배양물의 상청액으로부터 유도된 해방 T 세포 항원 수용체를 HPLC 겔 여과로 측정한 분자크기를 나타내는 크로마토그램.

제2도는 T 세포 백혈병 환자에게 취한 혈청에든 해방된 T 세포 항원 수용체를 HPLC 겔 여과로 측정한 분자크기를 나타내는 크로마토그램.

본 발명은 세포없는 T 세포 항원 수용체 그리고 이들의 진단학 및 치료학에의 용도에 관한 것이다. 여기서 정의하고 기술된 이 세포없는 T 세포 항원 수용체는 T 세포 응답에 관련하는 장해나 질병이 있는 개개인 및 배양물에 들어있는 T 세포 배양주에서 해방된다. 이러한 해방된 수용체는 세포막에 결합된 수용체와는 상이하며 어떤 T 세포 악성종양, 그리고 몇몇 감염성 질병, 암, 충실성 종양, 자기면역 질병, 알레르기 등을 포함하는 T 세포 응답을 유발하거나 관련되는 다른 질병이나 장해에 치료학적 또는 진단학적으로 사용될 수도 있다.

본 발명은 또한 세포배양물 상청액, 세포용해질 및 인체 혈청속에 들어있는 해방된 T 세포 항원 수용체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 속하는 기술분야의 현황을 보다 완전하게 기술하기 위하여 본 출원서속에 참조한 간행물의 개시물을 전부 본 출원서에 참조물로서 여기에 삽입한다.

면역시스템의 원발성 세포는 소의 골수에든 간(幹)세포에서 유도되며 임파구라고 부르는, 작은 백색 혈세포이다. 임파구의 한 종류의 감별은 흉선에서 완비된다. 따라서, 이러한 임파구를 T 세포라고 부른다.

T 세포는 인체의 혈관과 임파관을 따라 순환하고 외부 침입물, 알레르겐, 종양 및 자기항원을 검출하여 이에 대항하여 반응한다. 현미경으로 관찰하면 그들의 형태학이 균일함에도 불구하고, T 세포는 아래의 세가지 주요 부분접합의 이종(異種) 모집단으로 구성된다 : 비루스-감염된 세포를 파괴하는 세포독성의 세포 ; 그리고 B 세포를 생성하는 항체를 조절하는 헬퍼(helper)와 억제인자 세포라고 부르는 두 부분집합.

하나의 T 세포 클롬은 클론 팽창에서 유도되는 동일한 T 세포의 모집단에서 생기는 T 세포이다. T 세포 항원 수용체의 분자 성질은 여러 연구그룹에 의해서 1980년대 초에 보고되었다.(Allison, et al., 1982 J. Immunol. 129 : 2293∼2300 ; Kappler, et al., 1983, Cell 35 : 295∼302 ; Acuto, et al., 1983, J. Exp. Med 158 : 3368∼1373). 이러한 보고서에서 나타낸 것같이 T 세포 항원 수용체는 두가지의 글리코실화한 폴리펩티드로 구성된 헤테로 이량체의 당단백질이며, 두 폴리펩티드중 하나는 α-사슬을 지정하고 다른 하나는 β 사슬을 지칭한다. 하나의 T 세포 항원 수용체는 정상적으로 각 T 세포의 표면에 존재한다. 각 T 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC 단백질)의 단백질과 관련하여 단일의 항원성 결정인자를 인가한다.

T 세포 클론의 T 세포 항원 수용체의 α 및 β 사슬은 각각 변화성(variabie)(V), 다양성(diversity)(D), 결합하는(joining)(J), 일정한(constant)(C)(Siu, et al., 1984, Cell 37 : 393 ; Yanagl, et al., 1985, Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 82 : 3430), 그리고 초변화성(hypervariable)(Patten et al., 1984, Nature 312 : 40 ; Becker et al., 1985, Nature 317 : 430)을 지칭하는 영역의 독특한 결합으로 구성된다. 각 T 세포 클론에서 두 α 와 β 사슬의 V, D 및 J영역의 결합은 T 세포 클론의 독특한 특징이되고 또한 T 세포 클론의 국부적 관계로서 알려진, 독특한 결합위치를 한정하는 방법으로 항원인자에 관여한다. 반대로, C 영역의 항원 결합에 관여하지 않는다.

α 및 β 사슬이외에도, T 세포 수용체 감마 유전자라 지칭하는, 제3의 뚜렷한 유전자가 단리되었다. 이 감마 유전자의 배열순서와 조직화는 T 세포 항원 수용체의 α 및 β 사슬의 유전자와 임뮤노 글로볼린 유전자와 유사하다(Hayday, et al., 1985 Cell 40 : 259∼269). 이 감마 유전자는 오직 T 세포에서만 표현된다. Tonegawa와 이의 공동연구진이 제안한 것은 몇몇 T 세포의 T 세포 항원 수용체의 α 사슬과 β 사슬로 만들어진다는 것이다(S. Tonegawa, The Molecules of the Immune System. Scientific Ameracan, pp. 122∼131, October, 1985).

T 세포 클론의 T 세포 항원 수용체의 α 및 β 사슬로 또한 항원 수용체로 향하는 항체에 의해서 인지될수 있는 다수의 항원성 결정인자를 한정한다. T 세포 클론과만 반응하거나 이것이 역으로 제거되는 T 세포 클론의 항원 수용체에만의 항원결합을 억제하는 항체를 항-클로노티픽(anti-clonotypic)이라 정의한다(Kappler, et al., 1983, Cell 35 : 295∼302 ; Boylston, et al., 1984, Eur. J. Immunol. 14 : 273 ; Acuto, et, al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1326). 만일 α 또는 β 사슬, 또는 이들 모두에 의해서 정의된 항원성 결정인자가 비교적 대다수의 또는 모든 T 세포 클론의 표면에 존재하거나 이들과 관련되면, 이 결정인자는 T 세포 항원 수용체의 주요 골격 결정인자로 지칭된다(Brenner, et al., 1984, J. Exp. Med. 160 : 541 ; Spits et al., 1985, J. Immunol. 135 : 1922).

천연살수(Natural Killer)(NK)세포는 T 세포의 세개의 주요 부분집합의 대부분이 부족하긴 하지만, T 세포 직계의 부분(member)으로서 확인되었다. NK 세포는 분명한 사전 면역없이, 예로 암과같은 특징의 표적세포에 대항해서 세포독성을 직접 중재시키는 능력을 특징으로 한다(Ritz, et al., 1985, Science 228 : 1540 ; Robertson, 1985, Nature 317 : 768). 몇몇 NK 세포는 특징의 MHC 단백질 관련이 없이 항원인지를 할 수 있는 헤테로 이량체 수용체를 그 표면에 가지는 것으로 관찰되었다. 달리 언급하지 않는한, 이러한 적용의 목적으로, 항원 수용체에 대한 모든 참조는 T 세포와 NK 세포의 표면에 유도한 헤테로 이량체 항원을 포함한다.

T 세포 항원 수용체는 막위에서 T3 단백질 복합체와 비-공유로 관련된다고 제안되었다(Borst, et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 5135). 이 T3 단백질 복합체는 T3-감마, T3-델타 및 T3-엡실론으로서 알려진 폴리펩티드 사슬과 관련된 세개의 독특한 막으로 구성된다(Van den Elsen, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 2920). 이 T3 단백질-항원 수용체 관련은 T3단백질 복합체에 대항하는 항체로 연구된 면역침전 그리고 항원 수용체와 T3 단백질 복합체 막위에 동시에 사라지거나 동시에 나타나는 경우의 동시-변조 또는 돌연변이 연구에 의하여 나타날 수 있다.

여기서 T 세포 항원 수용체의 측정은 항원 수용체에 해당하는 단일 클론의 항체를 포함하는 여러가지 면역학 기술에 의해서 T 세포 관련된 항원 수용체를 검출하는데 제한되었다. 이러한 측정은 형광이 공액된 단일 클론의 항체를 T 세포에 결합시키고 그 다음에 형광-활성화한 세포의 더 짧거나 같은 흐름의 혈구계산기의 세포 분석에 의해 통상적으로 수용된다(Acuto, et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1326). 이러한 세포분석으로 주어진 시료에 든 수용체를 표현하는 T 세포의 %에 관한 정보를 제공하지만, 이러한 통상 분석의 정밀도와 신방도는 기존 흐름 혈구계산기를 사용하는 시료속에 든 1∼2% 또는 그 이상의 항성세포에 제한된다. 더욱이 세포분석은 시간이 걸리고 종종 새로운 생세포와 숙련된 헌신적 조작자를 필요로 한다.

T 세포 항원 수용체-항원의 상호 작용의 분자 메카니즘은 집중적인 연구의 제목이 된다(Robertson, 1985, Narure 317 : 768). T 세포 클론이 MHC 단백질과 관련된 막 결합항원을 결합시킬 수 있는 것으로 나타났다(Watts, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5480). 그러나 몇몇 항원은 MHC 단백질에 있는 상태에서 항원 반응성 T 세포 클론에 결합할 수 있다고 Rao, et al. 이 보고하였다.(Rao, et al., 1984, Cell 36 : 879). T 세포 항원 수용체에 결합하는 배위자에 관한 최근의 보고서에서(Davis, 1985, Biotechnology 13 : 858) 제조합 DNA 기술을 임뮤노글로블린 외곽구조내에 포함된 T 세포 항원 수용체 영역으로 잡종분자를 제조하는데 사용하였다. 그러나, 잡종분자에 대항하는 면역학적 반응성에 관하여는 기술되지 않았다.

1975∼1981년 사이, 새앙쥐(mouse)와 쥐(rat)의 시스템에서 "T 세포 항원 수용체"의 특징에 대한 일련의 보고서가 공표되었다(Krawinkel. et al., 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4 : 285 ; Binz and Wigzell, 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4 : 275 ; Binz and Wigzell, 1981, J. Exp. Med. 154 : 1261). 이러한 "T 세포 항원 수용체"는 여기에 기술된 " T 세포 항원 수용체"는 아니다(Allison, et al., 1982, J. Immunol. 129 : 2293∼2300 ; Kappler, et al., 1983, Cell 35 : 295∼302 ; Acuto, et al. 1983, J. Exp. Med 158 : 1368∼1373 ; Hayday, et al., 1985, Cell 40 : 259∼269 ; Kranz, et al., 1985, Science 227 : 941). Krawinkel, et al., 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4 : 285 ; Binz and Wigzell, 1976, Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 4 : 275 and Binz and Wigzell, 1981, J. Exp. Med. 154 : 1261에서 대략 150,000∼180,000 달톤의 분자량을 가지는 "T 세포 항원 수용체"를 지칭하는 단백질을 기술한다. 이 "항원 수용체"는 약 70,000 달톤의 분자량을 가지는 단백질 소단위를 가진 이량체로서 더욱 특징으로 한다. 쥐의 이 "항원 수용체"의 가변성 영역의 염색체의 위치는 염색체 12에 있다(Binz and Wigzell, 1981, J. Exp. Med. 154 : 1261). 본 출원서에 기술된 T 세포 항원 수용체는 약 90,000 달톤의 분자량을 가진다(Allison, et al., 1982, J. Immunol. 129 : 2293∼2300 ; Kappler, et al., 1983, Cell 35 : 295∼302 ; Acuto, et al., 1983, J. Exp. Med 158 : 1368∼1373).

더욱이, 이 항원 수용체의 소단위 구조는 대략 각각 45,000 달톤, 40,000 달톤 및 30,000 달톤의 분자량을 가지는 α, β, γ 사슬을 지칭하는 헤테로 이량체의 글리코실화한 폴리펩티드로 되어 있다(Kranz, et al., 1985, Science 227 : 941). 쥐에서 가변성 영역의 염색체 위치는 알파 : 염색체 14(Krenz, et al., 1985, Science 227 : 941). 베타, 염색체 6(Caccia, et al., 1984, cell 37 : 1092). 감마, 염색체 13(Krenz, et al., 1985, Science 227 : 941).

1982년에, 인체 T 세포 클론에 의한 T3 단백질의 외측 탈피는 배양물속의 이러한 T 세포에 항-T3 단백질 항체를 첨가하여 인공적으로 포함시킬 수 있었다고 보고하였다. 그러나, 생체조직내에서나 실험관에서, 지방적인 탈피나 해방의 관찰은 나타나지 않았다(Roinberz, et al., 1982, Cell 30 : 735).

Fujimoto et al.(Fujimoto, et al., 1983, J. Exp. Med. 159 : 752)는 가용성 형태로된 인체 T 세포 표면항원의 검출을 위해 효소-결합된 면역-흡수검사법(ELISA)을 개발하였다. 각종 세포 배양주에서 취한 혈청 및 배양물의 상청액을 시험했을 때, Leu-2 항원은 발견되었지만, Leu-1이나 Leu-3은 발견되지 않았다. 또한 본 출원인들은 미국정부에 고용된 David Nelson 등의 명의로 1987년 11월 17일자로 미국특허등록된 US 특허 N. 4,707,443호에 대해 알고 있다.

Rubin et al.(Rubin, et al., 1985, J. Immunol. 135 : 3172)의 발견을 근거로한 이 특허출원은 T 세포 생장인자 백혈구사이-2(Interleukin-2)와 상호 작용하는 것으로 믿어지는 가용성 또는 해방된 백혈구사이-2 수용체에 관련된다. 또한 출원자는 T 세포의 "표면인자구조"에 특별히 결합하는 단일 클론의 항체를 기술하며 Reinherz et al.,의 미국특허 제 4,550,086호도 알고 있다. 그러나, Fujimoto 출원, Nelson의 특허출원, Rubin의 발표 또는 Reinherz 특허의 그 어느것도 세포가 없거나 해방된 T 세포 항원 수용체, 생물학적 유체속에서 이를 측정하고 검출하는 방법 또는 이의 진단학적 그리고 치료학적 사용방법을 개시하거나 가르키지 않는다.

본 발명은 세포없는 T 세포 항원 수용체와 이것을 T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 어떤 질병이나 장해를 진단 및 치료하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 일부는 다수의 아래 발견에 기초하고 : (a) 배양물속의 어떤 T 세포 배양주가 그들의 항원 수용체를 배양물 유체속으로 자발적으로 해방시키고(예를 들면, 생장의 로그(log)단계중에) ; (b) 해방된 T 세포 항원 수용체가 막-결합항원 수용체를 결코 표현치 않는 세포에 의해서 제조될 수 있고 ; (c) 생체조직내에서, T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 어떤 질병이나 장해(예로서, 자기면역질병, 기관이식/식접용편기부, 식접용핀 비루스 숙주질병, T 세포 악성종양, 암, 충실성종양, 알레르기 및 어떤 감염성 질병)가 체액속에서 특별히 해방된 T 세포 항원 수용체의 존재의 특징이 있고 ; (d) 이러한 해방된 수용체가 세포결합된 수용체 종과 다르고, T 3 항원과 같은 다른 T 세포 결정인자와 복합체가 될 수 있는 여러가지 형태로 존재하고 ; 그리고 (e) 또한 일부는, 본 발명은 해방된 T 세포 항원 수용체가 해방된 수용체나 해방된 수용체/복합체의 형태로된 변화에도 불구하고 특별한 항-수용체 항체로 정의될 수 있다는 또다른 발견에 근거하고 ; 이렇게 해방된 T 세포 항원 수용체 분자를 확인하는데 사용될 수도 있는 면역검사법을 여기에 기술한다.

본 발명의 세포없는 항원 수용체는 T 세포 항원 수용체의 알파, 베타, 감마 또는 델타 사슬이나 소단위와 관련된 펩티드나 폴리펩티드의 단위체, 단이량체, 또는 헤테로이량체를 포함할 수도 있고 T 세포 결정인자와 같은 또다른 분자에 복합체가 될 수 있거나 될 수 없는 이들의 단편 및/또는 유도체를 포함한다.

본 발명은 또한 환지시료에든 세포없는 수용체 또는 수용체/복합체의 검출 또는 정량분석에 근거하는 진단학적검사에 관한 것이다. T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 질병이나 장해로 이환된 환자에서, T 세포 항원 수용체는 해방 수용체가 체액에 축적되게 하는 정상 조건의 대사율과는 상이한 대사율로 해방된다. 결과적으로, 해방된 수용체의 농도 증가가 어떤 질병과 상호 관련이 된다. 신속하고, 예민하고 값싼 방법이 체액속의 해방된 수용체의 상대농도를 측정하도록 개시되며 ; 이 방법은 환자의 질병을 진단하고 감시하는데 유용하다. 세포없는 수용체를 비교적 비-침입성 기술로 수득할 수 있는 체액에서 검출할 수 있기 때문에, 정상적으로 침입성 생검방법을 필요로 하는(예로서, 거부된 심장 또는 신장이식, 및 그 유사체), 또는 생검할 수 없는(예로, 수술이 불가능하거나 접근이 불가능한 종양과 같은) 질병이나 장해의 진단에서 특별한 잇점을 얻는다.

본 발명은 또한 해방된 T 세포 항원 수용체가 진단학적으로나 약학적으로 허용되는 담체와 혼합된 진단학 및 치료학적 조성물에 관한다.

이러한 방법은 또한 임뮤노글로블린에 용이하게 반응하지 않는 질병과 장해의 진단과 치료에 특별히 유용하다. T 세포와 B 세포의 둘 모두가 특징이 있는 항원을 인지한다는 것은 잘 안려진 것이다(S. Tonegawa, The Molecules of the Immune System, Scientific American, pp. 122∼131, October, 1985 ; Robertson, 1985, Nature 317 : 768). B 세포와는 달리, T 세포는 통상적으로 MHC 단백질과 관련하여 항원을 인지한다는 것이 비록 성립된다 할지라도, T 세포나 B 세포로 인지할 수 있는 항원에 에피토프가 관련되는지의 여부가 불분명하다. 최근의 보고서에서, G. S. Bixler and M. Z. Atassi(Bixler and Atassi, 1985, Biotechnology 3 : 47)이 결론을 내린바는 B 세포(항체 결합하는)에 의해서 인지된 단백질 분자의 영역이 또한 T 세포에 의해서 인지될 수도 있다는 것이다. 그러나, T 세포는 이제까지는 검출할 만한 항체응답이 관찰되지 않았던 분자의 추가적인 면도 인지할 수도 있다. 이러한 데이타로서 제안하게 되는 것은 T 세포 인지의 독특한 특징이 진단학 및 치료학적 적용에서 질병항원을 검출하는데 유용하다는 것이다(Bixler and Atassi, 1985, Biotechnology 3 : 47). 여기서 개시된 세포없는 T 세포 항원 수용체의 존재로 이러한 적용을 위한 시약의 신규 공급원을 제공한다.

[3.1. 정의]

여기서 사용하는 아래의 용어는 다음의 의미를 가진다 :

항-수용체 항체(Anti-receptor Antibody) : T 세포 항원 수용체의 에피로프와 반응하는 항체. T3 항-수용체 항체는 항-클론형태(Anti-clonotypic), 항-부(副) 프레임 구조 또는 항-주요 프레임구조 항체를 포함할 수도 있다.

항-클론형태 항체(Anti-clonotypic Antibody) : T 세포 세포 클론과는 반응하거나 또는 항체가 융기되는 것에 대항하는 T 세포 클론의 항원 수용체에만 결합하는 항원을 억제하는 항체. 1989년 7월 4일자로 미국특허등록된 N. 4,845,026호에서, 항-클론형태 항체를 "항-특발(特發)형" 항체라 정의하였다. 이 용어는 여기서는 임뮤토글로블린의 항원 결합위치를 정의하는 항-특발형(idiotypic) 항체와의 혼돈을 피하기 위하여 변경하였다. 따라서, 여기서 사용하는 이 용어 "항-클론형태 항체"는 특별한 T 세포 항원 수용체의 항원 결합위치를 정의하는 항체를 기술한다.

항-부(副) 프레임구조 항체(Anti-minor Framework Antibody) : 알파 또는 베타 사슬이나 이들 둘 모두를 포함하고, T 세포 클론의 표면에 있거나 이의 비교적 제안된 수와 관련된 T 세포 항원 수용체의 부 프레임구조 결정인자를 정의하는 항체.

일반적으로, 부-프레임구조 결정인자에 대한 항체는 정상피검자의 말초 T 세포의 20% 이하를 인지한다.

T 세포 클론의 비교적 제안된 수에 존재하는 것과 비교적 큰 수 또는 모든 T 세포 클론에 존재하는 것과의 사이에 비록 분계가 항상 분명치 않다 할지라도, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자는 이 분계를 충분히 이해하고 알 수 있으며 부 또는 주요 프레임구조의 결정인자로서 대부분의 주어진 항원성 결정인자를 쉽게 분류할 수 있다. 본 출원의 이 목적으로 본 기술분야에서 통상의 지식의 가진자가 의견을 달리하는 항원성 결정인자는 부 프레임구조 결정인자로 정의한다.

알파 및 베타 소단위 또는 사슬 : T 세포 항원 수용체의 알파 및 베타 소단위는 각각 대략 50,000 및 40,000 달톤의 상대 분자량(M_r)을 가진다. T 세포 기체 발생중에 재배치되고 베타 소던위(Yanagi, et al., 1984, Nature 308 : 145∼149 ; Hedrick et al., 1984 Nature 308 : 153∼158)과 알파 소단위(Chen et al., 1984, Nature 312 : 31∼35 ; Saito et al., 1984, Nature 312 : 36∼40 ; Sim et al., 1984, Neture 312 : 771∼775)를 인코우드하는 유전자는 하부구조적(substractive) 잡음하와 올리고핵산으로 탐침하는 어느것에 의하여 단리하였다.

T 세포 항원 수용체의 인체 알파, 베타 사슬의 독특한 형태는 두 구조가 관련되었다고 제안한 T3 당단백질을 가진 알파 및 베타 분자의 관찰된 동시변조(Meuer et al., 1983, J. Exp. Med. 157 : 705∼719), 동시면역침전(Reinherz et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 : 4104∼4108; Oettgen et al., 1984, J. Biol. Chem. 259 : 12039∼12048) 및 소요의 동시표면(Weiss ＆ Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160 : 1284∼1299)이었다.

후속적으로, 두 단백질 복합체의 직접적인 물리적 관련이 T3 당단백질에 알파, 베타분자를 화학적으로 가교 결합시키고 베타 소단위와 T3 당단백질(M_r28,000) 소단위(Brennre et al., 1985, Cell 40 : 183∼190)로서 가교결합된 복합체의 성분을 확인하여 나타내었다. 하나의 T3 상대물은 쥐의 알파, 베타 T 세포 항원 수용체와 유사하게 관련되었다.(Allision et al., 1985, Nature 314 : 107∼109 ; Samelson ＆ Schwartz, 1984, Immunol. Rev. 81 : 131∼144).

감마 및 델타 소단위 또는 사슬 : 감마를 지칭하는 T 세포에서 재배치하는 제3유전자가 쥐(Saito et al., 1984, Nature, 309 : 757∼762 ; Krunz et al., 1985, Nature 313 : 752∼755 ; Hayday et al., 1985, Cell 40 : 259∼269)와 인체(Lefranc et al., 1985, Nature 316 : 464∼466; Murre, et al., 1985, Nature 316 : 549∼552)에서 확인되었다. 그러나 유전자구조의 견지에서 인체와 쥐의 감마 유전자 사이에는 주요한 차이가 있는데 ; 이를테면 인체 감마유전자의 cDNA 는 감마 유전자 생성물에서 N-연결된 글리코실화를 위해 다섯 개의 포텐셜 위치로 나타내며, 이것은 쥐의 감마 유전자에서는 이러한 위치가 뚜렷하게 없다는 사실과는 반대된다. 이와 같이, 인체 감마 유전자 생성물은 그의 유전자 배열순서로부터 예측할 수 없는 높은 분자량을 가지게 된다.

이 감마 유전자 재배치는 억제인자-세포특성은 물론 조력자(helper) 표현형을 가진 임파구에서 발생하고 다수의 감마 사슬을 생성시킬 수도 있다. 그러나, 감마 유전자의 기능은 알려져 있지 않다. 더욱이, 감마 유전자로 인코우드된 단백질이나 그의 가능한 다른 구조(알파, 베타 및 T3 당단백질로 발생하는)와의 관련의 어느것도 정의되지 않았다. 인체에서, 다중 클리코실화 위치는 감마 폴리펩티드구조의 성질과 위치를 정밀하게 예측하지 못한다. 최근에는 55kd 폴리펩티드가 추정적으로 감마 소단위로서 확인되었다.

델타 T 세포 수용체 폴리펩티드는 약 40,000달톤의 분자량을 가지고 감마 소단위를 가진 T3 관련된 헤테로이량체를 형성할 수도 있다. 감마 및 델타 소단위는 모두가 여기서 참고로 삽입되어 있는, 1984년 7월 3일 출원된 동시계류중인 출원 제882,100호 및 제881,825호 그리고 아래의 발표물 : Brenner et al., 1986, Nature 322 : 145∼149에 더욱 완벽하게 기술되어 있다. 또한 이러한 참고물은 이러한 신규의 T3 관련된 폴리펩티드를 정의하는 항-프레임 구조 항체를 기술한다.

T3 단백질 복합체 : 이 T3 단백질 복합체는 T3-감마, T3-델타 및 T3-엡실론으로서 알려진 세 개의 분명한 막 관련된 폴리펩티드 사슬로 구성된다(Van den Elsen, etal., 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 2920). 이 T3 단백질-항원 수용체 관련된 T3 단백질 복합체에 대항하는 항원으로의 면역 침전의 연구와 항원 수용체와 T3 단백질 복합체가 막위에서 동시에 사라지거나 동시에 나타나는 경우의 동시변조 또는 돌연변이 연구로서 나타낼 수 있다.(Ohashi, et al., 1985, Nature 316 : 606).

여기서 사용한, "T 세포"는 흉선에서 유도된 세포를 정의하고 이것은 T 세포 항원 수용체 분자를 표현한다.

본 발명은 세포가 없거나 해방된 T 세포 항원 수용체, 세포배양물 상청액 세포용해질 및 생물학적 유체속의 해방된 T 세포 항원 수용체의 검출을 허용하는 면역검사법은 물론 진단학적 및 치료학적 구성물, T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 어떤 질병이나 장해를 탐지하고 처리하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 부분적으로 배양물속의 어떤T 세포 배양주가 배양물 유체(예를 들면, 생장의 로그단계중에)속으로 특별한 항원 수용체를 자발적으로 해방시키고, 세포없는 항원 수용체가 막결합형태를 결코 표현하지 않는 세포로부터 해방될 수 있다는 최초의 발견에 근거한다. 여기에 기술된 이 해방된 T 세포 항원 수용체는 세포막 결합된 항원 수용체와는 상이하고 몇몇은 T3 항원과 같은 다른 T 세포 결정인자와 복합체가 될 수도 있는 여러 가지 형태로 존재하는 것으로 나타난다.

본 발명은 또한 부분적으로 해방된 T 세포 항원 수용체나 수용체/복합체의 크기의 이질성에도 불구하고 이것이 해방된 T 세포 수용체나 수용체/복합체를 정의하는 항-주요 프레임 구조, 항-부(副) 프레임구조 및 항-클론형태의 항체를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 항-수용체 항체를 사용하여 신빙성 있게 확인할 수 있다는 또다른 발견에 근거한다. 이 항-수용체 항체는 세포없는 T 세포 항원 수용체의 확인, 단리 또는 정제에 사용할 수 있다. 이러한 항체 분자의 조합은 본 발명의 세포없는 T 세포 항원 수용체의 특별한 류를 검출하고 확인하기 위하여 아래에 상세히 기술된 면역검사법에 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 부분적으로 생체내의 어떤 조건에서 특정한 T 세포 항원 수용체가 T 세포로부터 해방되어 둘러싼 체액속으로 들어간다는 또다른 발견에 근거한 것이다. 생체조직에서 T 세포 항원 수용체를 해방시키는 이러한 조건은 이를테면 자기면역질병, 기관이식/식접용편거부, 식접용편 베르스 숙주질병, T 세포 악성종양, 암, 충실성 종양, 어떤 감염성 질병, 알레르기 및 그 유사물과 같은, T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 질병 또는 장해를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

여기서 기술한 면역검사법은 생물학적 시료속의 해방된 수용체 또는 수용체/복합체의 존재를 시험하는데 사용할 수도 있고 수용체나 수용체/복합체의 증가된 혈청수준을 나타내며 T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 장해나 질병이 있는 환자를 진단하거나 감시하는데 사용할 수도 있다. 또한, 세포없는 T 세포 항원 수용체 그들 자신도 임뮤노 글로블린을 사용하여 쉽게 전해지지(adderss) 않는 질병이나 상태용으로 진단학적 및/또는 치료학적으로 사용할 수 있다.

분명히 하려는 목적으로, 본 발명은 다음의 견지에서 아래의 작은 항에서 기술한다. (a) 세포없는 T 세포 항원 수용체의 성질 ; (b) 세포없는 T 세포 항원 수용체의 검출 ; 및 (c) T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 질병이나 장해의 진단, 감시 및 치료를 위한 세포없는 T 세포 항원 수용체의 사용.

[5.1. 세포없는 T 세포 항원 수용체의 성질]

본 발명의 세포없는 T 세포 항원 수용체는 약 180kd 내지 약 20kd의 분명한 분자량 범위로 크기에서 상당한 이질성을 나타내는 분자의 모집단을 포함한다. 본 발명의 이 세포없는 T 세포 항원 수용체는 T 세포 결정인자와 같은 다른 분자에 복합체가 되거나 될 수 없는 수용체의 단편 및/또는 유도체를 포함하는 T 세포 항원 수용체(3.1항 정의편 참조)의 알파, 베타, 감마 또는 베타 사슬과 관련되는 펩티드나 단백질의 단위체, 단이량체, 헤테로 이량체를 포함할 수도 있다. 수용체 분자의 단편이나 유도체는 이를테면 항원에 결합할 수 있는 항원에 결합시킬 수 있는 MHC 단백질이나 NK 항원 수용체와 관련된 항원에 결합할 수 있는 관능기일 수도 있다. 세포없는 항원 수용체의 이러한 단편은 주 또는 부 프레임구조 결정인자의 에피토프, 클론형태의 분자 또는 일정한, 변화되는, 또는 과변하는(hypervariable) 영역을 포함하는 단편을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

분자크기와 형태의 이러한 다양성에도 불구하고, 본 발명의 세포없는 항원 수용체는 충분히 안정되어서 세포없는 수용체에서 에피토프를 한정하는 항-수용체 항체를 사용하여 이들을 결정적으로 확인할 수가 있다. 세포없는 항원 수용체를 확인하는데 사용될 수 있는 단일 클론의 항체와 면역검사법의 실예는 아래의 5.2항과 실시예에서 더욱 완전하게 기술한다.

본 발명의 세포없는 항원 수용체는 고농도에서 세포없는 수용체를 해방시키는 세포에서 정제하고, DNA 기술로 재조합하거나 또는 화학적 합성기술로서 생성할 수도 있다. 예를들면, 세포없는 수용체는 해방된 수용체를 만들기 위해 유전조작된 T 세포, T 세포 배양주, NK 세포, T 세포-T 세포 하이브리도마 및 숙주세포를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 수용체를 해방시키는 다수의 세포로부터 정제할 수도 있다. 본인들이 발견한 것은 T 세포 항원 수용체의 세포없는 형태를 세포형질의 T 세포 항원 수용체를 포함하고 세포없는 형태를 해방시키지만 수용체의 막결합된 형태를 표현하지 않는 세포의 배양물로부터 정제할 수도 있다는 것이다. 이러한 T 세포 항원의 세포없는 형태를 해방하는 세포형질-양성이고, 막-음성인 세포 배양주의 한 예는 T 세포 배양주 Molt 4가 된다.

또한 본 발명의 세포없는 T 세포 항원 수용체는 T 세포 항원 수용체를 표현하고 해방하는 T 세포 - T 세포 하이브리도마 세포배양주로 부터 정제할 수도 있다. 이러한 T 세포 하이브리도마 기술은 본 기술분야에 공지되어 있으며 본 발명의 이 구체예에 따라서 사용될 수도 있다.(예를 들면 see, Gallagher et al., 1986, J. Immunol. Methods 90 : 57 ; see also Imai, et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8708). 또한 재조합 DNA 기술을 해방된 수용체를 생산하는 유전공학적으로 조작된 세포 형질전환에 사용할 수 있다. 이 끝에는, T 세포 항원 수용체나 이들의 부위의 알파, 베타, 감마 또는 델타 사슬을 인코우드하는 뉴클레오티드 배열순서를 적절한 표현요소(촉진유전자, 증대제등)의 제어하에 두어서 적절한 숙주세포를 형질변경시키는데 사용할 때 T 세포 항원 수용체나 이들의 적절한 단편을 표현하고 해방시키는 지시를 하게 될 재조합 DNA 분자를 생산하게 된다. DNA 코우드의 변성 때문에, 이러한 뉴클레오티드 배열순서는 유도체와 치환물을 포함하고 이들이 번역된 아미노산 사슬에 조용한 변화를 가져온다.

또한, 이 수용체를 화학적합성방법으로 생산할 수도 있다. 이 끝에는 세포없는 T 세포 항원 수용체를 형성하는 단위체나 이량체를 보충하는 소단위를 본 기술분야에서 공지된 기술에 의해서 합성할 수가 있다.(Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85 ; 2149). 이러한 소단위는 조용한 변화를 가져오는 아미노산 배열순서내에서의 변경과 치환을 포함하지만 이에 국한되지는 않는, T 세포 항원 수용체의 알파, 베타, 감마 및 델타 사슬을 위해 수득된 배열순서의 전부 또는 일부와 꼭 같거나 실질적으로 같은 아미노산 배열순서를 포함할 수도 있다. 이러한 변경에는 실질적으로 동등한 산/염기 성질 및/또는 친수성/소수성 성질을 가지는 아미노산 잔기의 치환물을 포함한다.

세포없는 항원 수용체는 크로마토그래피기술, 전기영동기술 및 면역학적 방법을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 본 기술분야에서 공지된 방법을 써서 정제할 수도 있다. HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 포함하는 면역친화력기술과 크로마토그래피방법은 세포없는 항원 수용체의 정제에 특별히 유용하다 ; 이러한 면역정제계획에 사용할 수 있는 항체를 기술하는 아래의 5. 2항 참조 ; 제 1 도 및 제 2 도는 물론 이러한 정제방법의 실예인 Siliciano et al., 1986, Cell 47 : 161∼171 참조.

정제되고 세포가 없는 항원 수용체의 그의 안정도를 보지하고 그의 특정항원에 그 수용체를 결합되게 하는 원자가를 보지하는 능력은 여기의 실시예로 나타내고 또한 세포용해질로부터 유도된 T 세포 항원 수용체를 항원에 결합시키는 능력을 나타내는 최근의 데이타(Siliciano et al., 1986, Cell 47 : 161∼171 참조)로 지지된다.

[5.2. 세포없는 T 세포 항원 수용체의 검출 및 확인]

예로서 항-주요-프레임구조, 항-부 프레임구조 및 항-클론형태와 같은 다수의 항-수용체 항체는 해방되었거나 세포없는 T 세포 항원 수용체 분자와는 반응하지만, 부적절한 세포나 분자와는 교차반응하지 않는다. 이러한 반-수용체 항체는 5.1항에서 정의된 본 발명의 세포없는 T 세포 항원 수용체 뿐만 아니라 이들의 단련과 유도체를 확인, 정제 또는 단리하는데 사용할 수가 있다. 이러한 면역검사 및/또는 면역친화력 정제계획은 세포없는 T 세포 항원 수용체에 복합체가 될 수도 있는 분자의 에피토프를 정의하는 추가항체의 사용을 포함하거나 포함치 않을 수도 있다.

일반적으로 항-주요 프레임구조 항체는 아마도 세포없는 T 세포 항원 수용체의 일정한 영역의 일부 또는 전부를 한정하고 그리하여 항-주요 프레임구조 항체에 의해서 한정된 특별하고 일정한 영역을 가지는 세포없는 T 세포 항원 수용체의 류를 검출, 단리 또는 정제하는데 사용할 수가 있다. 비록 항-부 프레임구조 항체가 수용체 분자의 일정한 영역의 일부를 한정한다 할지라도, 모든 가능성에서 또한 가변성 영역이 관련될 수도 있다. 결과적으로, 항-부 프레임구조 항체를 세포없는 T 세포 항원 수용체의 더 작은 부분집합을 확인, 단리 또는 정제하는데 사용할 수도 있다. 세포없는 T 세포 항원 수용체의 일정한 영역이 이 분자의 주효체 기능이나 생물학적 활성도를 결정한다고 가정할 때, 항-프레임구조 항체를 소요의 주효체 기능을 나타내는 특별한 류의 세포없는 T 세포 수용체를 확인, 단리 또는 정제하는데 사용할 수 있다는 것을 정사하게 된다.

항-프레임구조 항체에 반대로, 세포없는 T 세포 항원 수용체의 항원 결합위치를 한정하는 항-클론형태항체는 어쩌면 수용체 분자의 가변성 및 과변하는 영역에 결합하고 그들의 주효체 기능에 관계없이 특별한 항원에 특정한 세포없는 T 세포 항원 수용체를 확인, 단리 또는 정제하는데 사용할 수도 있다.

항-수용체 항체의 조합물을 특별한 항원을 한정하고 특별한 소요의 주효체 기능을 가지거나 나타내는 세포없는 T 세포 항원 수용체를 확인, 단리 또는 정제하는데 사용할 수도 있다. 예를들면, 문제의 항원 결합위치를 한정하는 항-클론형태 항체와 소요의 주효체 기능으로 특징이 있는 세포없는 수용체의 부분집합을 한정하는 항-프레임구조 항체와의 조합물을 소요의 세포없는 수용체를 확인, 단리 또는 정제하는데 사용할 수도 있다.

본 발명의 세포없는 T 세포 항원 수용체를 확인 또는 검출하기 위하여, 항-수용체 항체를 방사성 동위원소, 형광물, 효소-기질 반응, 비색염료, 면역침전, agglutination complement fixation. 및 그 유사체와 같은 어떤 적절한 라벨을 사용하여 검출할 수도 있는 경쟁적, 비경쟁적 및 "샌드위치" 면역반응을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 어떤 형태의 면역검사에 사용할 수도 있다. 이러한 면역검사는 방사성면역검사, 면역방사성 메터검사, 형광면역검사, 효소-결합된 면역검사, 단백질 A 면역검사, 면역확산법, 면역침전법, 면역전기영동, 완전고정, 응집반응검사 및 그 유사품을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

세포없는 수용체의 검출을 위한 면역검사는 세포없는 수용체(T3 항원과 같은)와 복합체를 이루는 T 세포 결정인자를 한정하는 다른 항체를 가지거나 가지지 않은 항-수용체 항체와의 상이한 조합물을 사용하는 실시예에 기술되어 있다. 하나의 특별한 구체예에서, 같은 결합위치에는 경쟁하지 않는 두개의 항-수용체 분자의 어떤 조합물을 세포없는 T 세포 항원 수용체를 검출하는데 사용할 수 있는 샌드위치 면역검사법이 기술되어 있다. 또한, 세포없는 수용체/복합체의 검출은 수용체(예로 T3 항원)에 복합체가 된 분자를 한정하는 제2항체와의 조합으로 항-수용체 항체를 사용하는 샌드위치 면역검사에서 성취될 수도 있다. 샌드위치 면역검사에서, 시험할 시로는 비가동화한 하나의 항체와 반응시킨다. 이 비가동화한 항체에의 이 시료의 결합은 여기서 검출항체라 부르고 세포없는 수용체 분자의 제2에피토프에 또는 세포없는 수용체의 반복 에피토프의 같은 에피토프에 목적을 두는 제2의 라벨이된 항체를 첨가하여 평가된다. 결합된 라벨이나 신호의 발생으로 시료속에 세포없는 T 세포 수용체가 존재하는 것을 나타낸다.

또다른 구체예에서, 항-수용체 항체와 한-T 세포 결정인자(예로 항-T3)를 해방된 수용체 복합체를 검출하기 위한 비가동화하고 검출항체로서 사용할 수 있다. 사용되는 완충액등의 형태인, 세제의 존재와 같은 다른 검사조건도 여기의 실시예를 검토한 후에 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 분명해질 것이다.

본 발명의 한 형태의 한 특별한 구체예에서 본인들이 발견한 것은 두개의 항-주요 프레임구조의 단일 클론의 항체가 해방된 T 세포 항원 수용체 ; 단일 클론의 항체 W4 및 베타-F1(이후로는 BF1으로 칭하고 이것을 1989년 7월 4일자 미국특허 등록된 N.4,845,026호에서는 BA3로서 참조한다)의 확인 및 검출하기 위하여 어떤 형태(비가동화하든가 또는 검출항체로서)로든 사용할 수 있지만 ; 그러나, 혈청내의 세포없는 수용체의 검출은 이러한 두 항체의 특별한 형태 : W4 검출 항체를 가진 비가동화한 BF1 항체를 사용해야 하는 것이 요망된다.

이러한 면역검사는 세포배양물, 세포용출물과 같은 각종 시료와 환자의 시료에든 해방된 T 세포 항원 수용체를 검출하는데 사용할 수도 있다. 또한, 이러한 같은 항체분자를 해방된 T 세포 수용체의 면역친화력 정제 및/또는 농축에 사용할 수 있다.

[5.3. 진단 및 치료용으로 세포없는 T 세포 항원 수용체 및/또는 수용체 복합체의 사용]

진단학 분야에 세포없는 T 세포 항원 수용체의 사용에는 최소한 두가지 시도가 있다 ; (a) 세포없는 T 세포 항원 수용체를 체액속에 세포없는 수용체의 축적을 초래하는 T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 장해나 질병에 대한 검출용 표시기로서 사용할 수 있고 ; 그리고 (b) 세포없는 T 세포 항원 수용체 그 자체는 수용체에 의하여 인지된 특정 질병 항원에 지향하는 탐침으로서 사용할 수도 있다. 각 시도는 그 자체의 특별한 잇점을 제시한다.

표시기로서 세포없는 T 세포 항원 수용체 또는 수용체/복합체의 사용은 어떤 장해나 질병을 가진 환자, 특히 T 세포 응답을 유발하거나 관련시키는 환자에서 세포없는 수용체가 상승된 수준으로 발견된다는 본인들의 발견에 근거한다. 결과적으로, 이 해방된 T 세포 항원 수용체를 이 장해나 질병을 진단하고 감시하기 위한 표시기로서 사용할 수도 있다. 이러한 장해나 질병은 T 세포 악성종양, 자기면역질병, 이식/식접용편거부, 숙주 베르수스 식접용편 질병, 암, 충실성 종양, 알레르기 및 비루스, fungus, parasite 또는 박테리아에 의해서 유발되는 어떤 감염성 질병을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

더욱이, 개개인에 있는 다수의 T 세포 클론은 하나 이상의 병원체에 자발적으로 응답할 수 있다(Emmrich and Meuer, 1985, Immunology Today 6 : 197). 이와 같이 개개인에서 취한 혈청이 해방된 T 세포 항원 수용체의 분명한 형태의 혼합물은 포함한다는 것을 정사된다. 해방된 수용체의 각 형태의 정량적 측정으로 다수의 병원체를 포함하는 다중 감염이나 질병을 가진 환자를 진단하고 감시하게 허용한다.

따라서, 환자시료를 진단과 질병감시를 돕기 위하여 해방된 T 세포 항원 수용체나 수용체 복합체의 존재 및/또는 양을 알기 위해 시험할 수 있다. 시험할 환자시료는 혈액, 플라스마, 혈청, 뇨, 수액, 활액, 양수 및 뇌액 뇌유를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 생물학적 유체를 포함할 수도 있다. 해방된 수용체 또는 수용체/복합체의 양은 특별한 수용체 또는 수용체/복합체의 알고 있는 농도를 포함하는 병행의 표준을 실시하여 정량 측정할 수도 있다. 여기에 기술된 항-수용체 및 다른 항체를 사용하는 면역검사는 이 시도에 특별히 유용하다. 표시물로서 세포없거나 해방된 T 세포 항원 수용체를 사용하는 진단학적 검사는 환자에 대해 침입성이 덜한 잇점을 제공하는데, 그 이유는 체액이 침입성 생검기술을 피하도록 시험될 수 있기 때문이다.

진단학적 탐침으로서 세포없는 T 세포 항원 수용체나 수용체/복합체의 사용은 어떤 질병에 대해서 특징이 있는 특별한 항원을 특별히 인지하고 이것에 결합하는 세포없는 수용체의 능력에 근거하며; 이것을 질병-관련된 항원으로서 참조한다. 본 발명의 이 구체예는 인공조건에서 환자시료에든 질병-관련된 항원을 검출하고 생체조직내에서 질병-관련된 항원의 위치를 확인하는 탐침으로서 세포없는 수용체를 사용하는 것을 포함한다. 세포없는 수용체로 한정되는 질병-관련된 항원이 생체조직내에서 해방되는 경우 환자의 체액은 탐침으로서 세포없는 수용체를 사용하여 해방된 질병 관련 항원의 존재 및/또는 양에 대해 시험할 수가 있다. 이 끝에 세포없는 수용체를 환자시료에서 세포없는 수용체와 질병-관련 항원 사이에 형성된 반응 복합체를 검출하기 위하여 적절히 라벨을 할 수도 있다. 질병-관련된 항원이 해방되지 않는 경우, 라벨이된 세포없는 수용체를 질병항원에 극소화하기 위해 생체조직내에서 사용할 수가 있다. 어느 구체예에서든, 세포없는 수용체는 임뮤노 글로블린으로 인지되지 않는 항원으로 특징이 되는 질병이나 장해를 진단할 때 엄청난 잇점을 제공한다(Kradin et al., 1986, "T Cell Involvement in Tumors", 6th Intl. Congr. Immunol. Abst No. 4.23.29, Toronto, Canada, July 1986 ; Rosenberg et all, 1985, N. Engl. J. Med. 313 ; and Rosenberg et al., 1986, Science 233 : 1318). 더우기, 질병-관련된 항원이 발산되거나 해방되는 경우에는, 비 침입식 기술을 환자체액을 검사하는데 사용할 수가 있다. 질병-관련 항원이 발산되지 않는 경우에는, 진단학적 탐침으로서 해방된 T 세포 항원 수용체의 사용은 생검할 수 없는 위치에 종양이나 악성종양이 있는 경우에 특별한 잇점이 있다.

또한 본 발명의 세포없는 T 세포 항원 수용체를 약학적으로 적합한 담체와의 혼합된 치료학적 조성물로서 사용할 수도 있다. 이 끝에, 특별한 항원을 한정하고 특별한 주효체 기능(예로 면역억제 또는 면역잠재력 효과)을 가지는 세포없는 T 세포 항원 수용체를 특정한 장해나 질병의 치료에 치료학적 유효 투여량으로서 사용할 수도 있다. 예를들면 면역억제 주효체 기능을 나타내고 자기면역질병에 포함된 항원을 한정하는 세포없는 항원 수용체는 특별한 항원에 대항하도록 지시된 자기면역응답을 충분히 억제하는데 사용할 수 있다. 반대로, 면역잠재력 주효체 기능을 나타내고 감염된 세포 암세포 또는 종양세포에서 표적항원을 한정하는 항원 수용체는 특별한 암이나 종양항원에 대항하도록 지시된 면역응답을 특별히 일으켜서 효력을 더하게 하는데 사용할 수 있다. 그러므로 세포없는 항원 수용체를 표적 특정의 방실에서 면역응답을 변조하는데 사용할 수 있어서, 면역시스템을 비-특정적으로 자극하거나 억제하는 치료에서 큰 잇점을 제공한다.

또한 세포를 줄이거나 생장을 억제하는 독성 및 대사저지 화합물을 죽일 표적세포에 특이한 세포없는 T 세포 항원 수용체 또는 단편 또는 이들의 유도체에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 치료학적 유효 사용량으로 이러한 화합물을 투여하면 목표의 치료를 얻을 수 있었다.

본 발명의 다른 구체예는 아래의 실시예를 참조하면 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진자는 더욱 이해하게 될 것이다.

해방된 T 세포 항원 수용체와 수용체 복합체의 검출

아래의 실시예는 T 세포 배양물, T 세포 용해질의 세포없는 상청액과 인체 혈청에 든 해방된 T 세포 항원의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 각종 면역 검사법을 기술한다. 이러한 시료의 HPLC 겔여과에 의해서 수득된 분설을 특징으로 하는 검사로서, 세포 배양물과 인체혈청에 든 해방된 T 세포 항원의 분자성질을 또한 기술한다. 이 결과는 T 세포 항원 수용체가 각종 형태로 해방될 수도 있고, 해방된 형태가 막-결합된 수용체와는 다를 수도 있다는 것을 나타낸다. 어떤 T 세포 악성종양이나 감염성 질병을 가진 환자에서 취한 혈청에 있는 해방된 T 세포 항원 수용체의 증가된 수준의 검출도 또한 기술한다. 이러한 결과는 해방된 T 세포 항원의 혈청수준을 측정하는 검사가 어떤 T 세포 악성종양이나 감염성 질병을 감시함에 있어서 진단학적 가치를 가진다는 것을 나타낸다.

아래의 모든 실시예에서, ATCC나 많은 대학연구소로부터 수득할 수 있는 T 세포 배양주 및 B 세포 배양주를 10% 태아 송아지 혈청으로 37℃ 및 5% CO₂로 RPMI 1640(Gibco Laboratories, Grand Island, N. Y.에서 연구한 배양유체)에서 생장시키고 유지하였다. 배양상청액을 ml당 1백만 세포의 세포 농도에서 이러한 세포 배양주의 로그생장 단계 배양물로부터 수거하였다. 모든 경우에서 생존성은 99% 이상이었다.

상청액은 1시간동안 50,000×g로 원심분리하여 막단편을 없앴다. 몇몇 경우에는 0.22μm 여과기(Arco LC13, Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan)를 통과하는 여과를 추과단계를 사용하였다.

아래의 항에서 사용한 HPB-ALL T 세포 배양주는 널리 분포된 세포 배양주이다(예를 들면, Borst et al., 1986, J. Immunol. 136 : 601∼607 ; Lanier et al., 1986, J. Immunol. 137 ; 2286∼2292 ; and Weiss et al., 1986, Proc. Natl. acad. Sci. U. S. A. 83 : 6998∼7002 참조).

[6.1. 세포 항원 수용체를 한정하는 항체의 세포(cellular specificity)]

앞서 기론한 것같이, T 세포 항원 수용체에 대항하는 최소한 세가지의 분명한 항체, 즉, 항-주요 프레임구조, 항-부 프레임구조가 있다(앞의 3. 1항의 정의란 참조). 면역형광 또는 면역침전으로 측정한 각 형태의 대표적인 항체의 세포반응성은 표 1에 표시한다.

[표 1]

[분명한 형태의 항-T 세포의 수용체 단일크론의 항체를 가진 세포배양주의 반응성]

* 반응성은 세포 면역형광 또는 면역침전으로 연구하였다. 항체의 실시예는 아래의 것을 사용하였다 :

Anti-clonotypic : Kappler, et al., 1983, Cell 35 : 295∼302 ; Boylston, et al., 1984, Eur. J. Immunol. 14 : 273 ; Acuto, et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1326 ;

Anti-minor framework : Acuto, et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1326 ; Bigler, et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1450 ;

Anti-major framework : Bigler, et al., 1985, J. Exp. Med. 161 : 1450 ; Brenner, et al., 1984, J. Exp. Med. 160 : 541 ; Spits et al., 1985, J. Immunol. 135 : 1922.

이 실시예에서, 한-주요 프레임구조 항체는 모든 T 세포와는 반응하였고 B 세포와는 반응하지 않았다. 항-부 프레임구조 항체는 백혈병(HPB-ALL) T 세포 배양주와 몇몇 말초 T 세포와는 반응하였지만, 또 다른 임파종(Jurkat) T 세포 배양주, 백혈병의(CEM) T 세포 배양주, 또는 임파종(Daudi) B 세포 배양주와는 반응하지 않았다. 항-클론형태 항체는 이것에 대항하여 증가된 예로 HPB-ALL 세포 배양주와 같은 특정의 T 세포 배양주와만 반응하였다.

세개의 항-주요 프레임구조 항체를 사용하여 몇개의 형성된 인체 세포배양주를 면역세포 화학적으로 염색하는 또다른 실험도 실시하였다.

세 항체, BFI, W4 및 W12는 흐름 혈구계산에 의해서 표면 T3/수용체 복합체에 대하여 음성으로 밝혀진 인체 T 세포 배양주인, Molt4의 표면에서 취한 T 세포 항원 수용체를 면역침전할 수가 없었다. 그러나, Molt4의 면역 cyto 화학적 염색은 두 항-주요 프레임구조 항체와 항-T3 항체 모두를 가진 세포형질에서는 강한 반응성을 나타내었다. 이 결과가 나타내는 것은 Molt4가 세포형질 형태의 T 세포 항원 수용체를 표현하지만 막 결합된 형태는 표현하지 않는다는 것이다.

[6.2. 배양한 T 세포에서 해방된 T 세포 항원 수용체]

아래의 실험은 가용성 T 세포 항원 수용체가 배양된 T 세포에 의해서 자발적으로 해방되는지의 여부를 시험하는 것으로 지칭하고 그렇게 수행하였다. 배양한 T 세포의 세포없는 상청액은 세포없는 한 형태의 항-수용체 항체(예로 항-클론형태, 항-부 프레임구조 또는 항-주요 프레임구조중 어느 하나)를 비가동화한 항체에서 샌드위치 면역검사법을 써서 해방된 T 세포 수용체의 존재여부에 대해 검사하였다. 비가동화한 항체에 배양한 상청액에 존재하는 해방된 T 세포 수용체의 결합이 해방된 T 세포 항원 수용체의 상이한 에피토프를 한정하는 라벨이 된 한-수용체 항체(여기서는 검출항체라 한다)를 첨가하여 검출하였다.

시험할 세포-없는 상청액은 로그단계 배양물로부터 상청액을 수거하여 재조하였다. 세포는 50,000×g에서 1시간동안 원심분리하여 펠릿으로 만들었다. 막 단편은 0.22μm 구멍크기의 여과기를 통해 정제한 상청액을 여과하여 제거하였다.

항-수용체 항체를 비가동화하기 위하여, 미량 적정판(Dynatech, Alexandria, Virginia에서 구입한, Immulon Ⅰ을 인산염 완충된 식염수(PBS)에서 2.5μg/ml의 농도의 항-수용체 항체를 로서 4℃에서 밤새껏 피복하엿다. 다음날 이 판을 1% 소의 혈청 알부민(BSA)을 처리하여 단백질이 비-특징적으로 흡수되어 있을 수도 있는 판의 나머지 위치를 차단하였다. 그리고 판을 0.05% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우릴레이트(Sigma Chemical compamy, St. Louis, Mo.에서 구입한 Tween 20)에든 10mM 트리스 pH 8.0로 세척하였다.

시험할(100μl 분취량) 세포-없고 막-없는 배양물 상청액을 적합한 완충액으로 희석하였다 : 예로, 0.01M 트리스, 0.15M NaCl, 1mM MgCl₂, 1mM 페닐메틸설포닐-불화를(PMSF), 10mM 요오드아세토아미드, 1μg/ml 펩스타린 10μg/ml N-톱실-L-페닐아민 클로로페닐 케톤(TCPK), 1% 노니데트 P-40을 포함하며 pH는 8.0(NP₄O 폴리옥시에틸렌(9)

옥틸페놀, 몰당 평균 9몰의 산화에틸렌을 포함하는 옥틸페놀 산화에틸렌 응축물을 포함하는 하나의 이온성 세제, Sigma Chemical Co.에서 구입함)이 희석한 시료를 피복한 미량적정 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 시료는 씻어내고 100μl의 적절히 적정한 말의 또다른 T 세포 항원 수용체의 에피토프를 한정한 비오타닐화한 검출항체를 검가하였다. 37℃에서 2시간 동안의 제2배양후에, 결합하지 않은 비오티닐화한 검출항체를 씻어내고 100μl의 적절히 적정한 양의 스트렙타 비딘 고추냉이 과산화효소의 공액(Zymed Laboratories, San Francisco, California에서 구입함)을 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 결합하지 않은 공액을 씻어내고 새로 만든 기질을 첨가하였다(0.2% OPD, 0.015% 과산화수소, 65mM 인산이나트륨, 17mM 구연산 pH 5.5로 된 완충액에 든 디히드로 클로라이드 오르토페닐렌디아민). 37℃에서 20분간 배양후, 50μl의 2N 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 미량적정기에 나타나는 색깔을 ELISA 판독기(MR 600, Dynatech에서 구입)로 490nm(OD490)으로 판독하였다.

적할한 기준은 아래를 포함한다. (a) 판에 시료의 비-특징적 결합을 계수하기 위한 비가동화한 항체를 가진 미량적정 웰 : (b) 시료에 비가동화한 항체의 비특징적 결합을 계수하기 위해 정상 피검물에서 취한 혈청과 또는 B 세포에서 취한 시료 : 그리고 (c) 판이나 시료에의 비가동화한 항체 또는 검출항에 두 시료중 어느것의 비특징적 결합을 조절하는 비가동화한 그리고 검출항체의 같은 임뮤노글로블린의 비관련성 항체.

[6.2.1. 배양된 T 세포에서 해방된 T 세포 항원 수용체의 검출]

위에서-기술한 샌드위치 면역검사는 비가동화한 항체로서 항-부 프레임구조 항체를 사용하고 검출항체로서 항-주요 프레임구조나 HPB-ALL 항-클론형태 항체중 어느것을 사용하여 실시하였다.

배양한 T 세포 배양주(HPB-ALL, CEM 및 Jurkat)는 물론 Daudi B 세포 배양주의 세포없는 상청액을 0.1% NP₄O의 존재하에서나 또는 세제가 없는 상태에서 검사하였다. 이들 검사의 결과는 아래의 표 2에 표시한다.

[표 2]

[해방된 T 세포 항원 수용체의 검출]

* 배양물 상청액은 로그단계 배양물에서 수거하고 원심분리(50,000×g로 1시간) 및 여과(0.22μm 크기의 여과기)로 막단편을 분리하였다.

100μl의 각 배양물 상청액을 비가동화한 항체로서 항-부 프레임구조 영역 또는 검출항체로서 항-유전형 항체를 사용하는 세제가 있거나 또는 없이 분석하였다.

표 2로부터, 여러가지 결론을 도출할 수 있다. 첫째, HPB-ALL T 세포 배양물 상청액 속에 해방된 T 세포 항원 수용체의 존재는 예로서 세포없는 상청액을 비이온성 세제인 NP₄O의 최소한 0.1%의 존재하에 검사할때와 같이 적합한 검사 조건하에서만 나타난다. 둘째, 비가동화한 항-부 프레임구조 항체는 HPB-ALL T 세포 배양주 하고만 반응성이 있고 CEM 및 Jurkat T 세포 배양주 또는 Daudi B 세포 배양주 하고는 반응성이 없다. 표 2의 데이타는 위의 표 1에 표시된 것과 같은 면역형광을 사용하여 수득한 결과와는 일치하고 HPB-ALL 세포용 항-부 프레임구조 항체의 특성을 확인하는데 그 이유는 HPB-ALL 백혈병 T 세포에서 취한 해방된 수용체만이 비가동화한 항-부 프레임구조 항체와 함께 항-주요 프레임구조 항체나 항-클론형태 항체나 같은 검출항체를 사용하여 정량할 수 있었다. 이러한 데이타는 해방된 항원 수용체가 막항원 수용체에 관련된다는 것을 나타낸다.

다른 T 세포는 또한 T 세포 항원 수용체를 해방시키는지의 여부를 결정하기 위하여, 상기한 검사조건을 사용하여, 비가동화한 항체가 항-주요 프레임구조 항체이고 검출항체가 제2 항-주요 프레임구조 항체가 되게 검사를 실시하였다. 표 3에 표시된 데이타는 해방된 T 세포 항원 수용체를 비가동화한 및 검출항체가 같은 결합위치에 경쟁하지 않는다는 조건하에, 샌드위치 면역검사에서 두개의 분명한 항-주요 프레임구조 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

[표 3]

[배양물 상청액에 든 해방된 T 세포 항원 수용체]

표 3의 결과는 또한 많은 T 세포 배양주가 그들의 상청액속으로 항-주요 프레임구조 반응성 항원 수용체를 해방한다는 것을 나타낸다. 숙지해야 할 것은 Molt4 및 CEM 세포 배양주가 최소의 표면 검출 가능한 T3 단백질을 가진다. T3 및 T 세포 항원 수용체가 동시 표현되는 것으로 생각되기 때문에(Weiss and Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160 : 1285) 기대되는 것은 최소 표면 항원 수용체가 이러한 두 개의 세포 배양주에서 검출될 것이라는 것이다. 놀라웁게도, 상당한양의 T 세포 항원 수용체가 이러한 세포 배양주의 배양물 상청액에서 검출되었다. 이것이 제시하는 것은 해방된 T 세포 항원 수용체가 세포 결합 수용체로 동시 표현되는 다른 T 세포 결정인자와는 독립적으로 표현될 수도 있다. Moil4에 대해서 수득된 결과는 특별히 놀라운데, 그 이유는 6.1.항에서 이미 설명한 것같이, Molt4 세포 배양주가 T 세포 수용체에 대해서 막음성이고 그 위에 세포형질 양성인 것으로 판명되었기 때문이다. 환언하면, Molt4 세포 배양주는 세포형질에 국한되는 T 세포 항원 수용체를 표현한다. 이러한 데이터가 제시하는 것은 T 세포 항원 막형태의 존재와 없음이 세포 배양주가 세포없거나 해방된 T 세포 항원 수용체를 생산하는지의 여부의 전조가 안된다는 것이다.

면역검사법의 다른 형태로 가능하다 : 예를 들면, 몇몇 해방된 T 세포 항원 수용체는 예로서 수용체 제조에 있어서 같은 항원 결정인자의 중복성의 존재와 같은, 몇몇 조건하에서 비가동화 한 항체는 물론 검출항체용으로 같은 항-수용체 항체를 사용하여 검출할 수도 있다. 더우기, 두 항-부 프레임구조 항체를 이들이 분명한 또한 반복되는 에피토프를 한정한다는 조건하에 수용체를 검출하는데 사용할 수 있었다. 추가로 정사되는 것은, 수용체에 있는 항원 결정인자의 성질에 따라서, 결정인자의 형태와 농도가 이 검사에서 중요할 수도 있다는 것이다.

[6.2.2. 배양된 T 세포에서 해방된 T 세포 항원 수용체/T3 단백질 복합체의 검출]

막-결합된 수용체가 T 세포 막에 존재하는 것으로 표시될 때(Borst, et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 5135 ; Ohashi, et al., 1985, Nature 316 : 606) 최소한 몇몇의 해방된 T 세포 항원 수용체가 T3 단백질 복합체와 관련되는지의 여부를 결정하기 위하여, 비가동화한 항-T3 항체(Ortho Diagnostic Ststems, Raritan, N.J.에서 수득되는 OKT3 또는 Becton Dickinson Monoclonal Center, Mountainview, California에서 수득되는 Leu4와 같은), 그리고 항-수용체 검출항체를 사용하여 검사하였다. 상청액을 0.1%의 최종농도로, 세제 NP4O 또는 digitonin(purchased from Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin에서 구입)의 없거나 존재하에서 검사하였다. 이 결과는 아래의 표 4에 표시한다.

[표 4]

[해방된 T 세포 항원 수용체/T3 복합체의 검출]

* 세제처리한 상청액은 표시된 것같이 0.2% NP₄O 또는 디기토닌의 최종농도를 함유함

이러한 데이터로부터 몇가지 중요한 관찰이 이루어졌다. 첫째는, 배양물 상청액에 든 해방된 T 세포 항원 수용체의 검출이 검사에서 세제의 존재에 의해서 영향을 받았다. 세제가 없는 상태에서는, 상당한 양의 해방된 수용체 복합체가 HPB-ALL 항-클론형태 검출항체를 사용하여 HPB-ALL 상청액에서 측정될 수 있었다. 세제 digitonin의 존재로서 항-주요 프레임구조 또는 HPB-ALL항-클른형태 검출항체중 어느 것으로 측정하여 HPB-ALL T세포 상청액에든 해방된 수용체 복합체의 검출가능한 수준을 증대하였다.

더욱이, 디기토닌의 존재로 항-주요 프레임구조의 검출항체로 측정하여 검사한 두 T세포 배양주(예로, HPB-ALL 및 Jurkat 상청액)속에서 해방된 수용체 복합체의 검출을 가능케 하였다. 반대로 NP₄O의 존재하에서 둘중 어느 검출항체든 사용하여도 복합체가 검출되지 않았다. 둘째로, 항-주요 프레임 구조 항체를 검출항체로서 사용한때에는, 두 HPB-All 및 Jurkat 세포 배양주에서 취한 상청액은 해방된 수용체 복합체를 포함하는 것으로 나타났다. 반대로, HPB-All 세포배양주에 특정한 항-클론형태의 검출항체를 검출항체로서 사용하면 단지 HPB-ALL T세포배양주에서 유도된 배양물 상청액만이 해방된 수용체 복합체의 중요한 양을 포함하는 것으로 나타났다. 어떤 검출방식에서도, 기준 DaudiB 임파종 세포 배양주는 양성결고를 나타내지 않았다.

[6.2.3. 해방된 T 세포 항원 수용체와 수용체/T3 단백질 불합체의 면역-검출에 대한 세제처리의 영향]

해방된 T 세포 항원수용체에 대한 세제처리의 영향과 해방된 T세포 항원수용체 검사에서 비가등화 하거나 또는 검출항체로서의 항체의 상이한 조합을 사용하는 영향을 더욱 조사하기 위한 한벌의 실험을 실시하였다. 이 한벌의 실험에서 상이한 배치를 HPB-ALL T세포 상청액을 검사하는데 사용하였다. 결과는 표5에 표시한다.

[표 5]

[HPB-ALL 세포 배양물의 상청액에서의 해방된 T 세포 항원수용체나 수용체 복합체의 검출]

* 세제처리한 상청액은 표시된 것같이 0.2% NP₄O 또는 디기토닌의 최종농도를 함유하였다.

비특정의 배경판독은 표시한 값에 뺀다.

N.D.는 "실시않음"을 나타낸다.

표 5에서 나타낸 것같이, NP-40( 및 디기토닌은 아님)은 항-수용체 항체의 조합물을 검사에서 비가등화 및 검출항체로서 사용하였을 때 해방된 T 세포 항원수용체의 검출을 증대시켰다. 반대로, 디기토닌(NP-40은 아님)은 항-T3와 항-수용체 항체를 비가등화 및 검출항체로서 사용했을때 해방된 T세포 항원 수용체 복합체의 검출을 증대시켰다. 보다 특별히는, 항-부 프레임구조 또는 HPB-ALL항-클롬형태를 비가동화 한 항체로서 사용했을 때, NP-40으로 처리한 HPB-ALL 상청액 시료는 디기토닌으로 처리한 HPB-ALL 상청액 시료보다 더 높은 수준의 해방된 T 세포 항원 수용체를 나타내었다.

반대로, 항-T3 항체를 비가동화한 항체로서 사용했을 때, HPB-ALL 상청액으로 처리한 디기토닌은 ND₄O으로 처리한 시료보다 더 높은 수준의 해방된 T 세포 항원 수용체 복합체를 나타내었다. 또한 해방된 수용체 복합체의 중요한 양이 비가동화 한 항-T3을 HPB-ALL항-클론형태 또는 항-부 프레임구조 검출항체와 함께 사용했을때 어떤 세제가 없는 상태에서도 검출될 수 있었다.

[6.2.4. 배양물 상청액에서의 T 세포 항원 수용체의 성질]

배양물 상청액에서 측정된 T 세포 항원 수용체가 막과 관련되지 않았다는 것을 나타내기 위하여, 세제없이 변성시키지 않는 조건하에서 겔여과 실험을 실시하였다. ml당 최소한 10⁶세포를 가지며 90% 이상의 생존력을 가지는 HPB 및 Molt₄세포배양물에서 취한 배양물 상청액을 수거하였다. 세포를 1시간동안 50,000×g로 펠릿으로 만들고 정제한 상청액은 0.22um 여과기를 통하여 여과하였다. 여과한 상청액을 아래와 같이 HPLC겔여과하여 분류하였다 : 0.1M 인산염, 0.1M NaCl(pH 6.8)로 평형화 되고 분당 0.5ml로 가동되는 7.5×100mm BioSil 보호칼럼(BioRad Laboratories, Richmond, Calif.)이 있는 7.5×300mm BioSil TSK-250 속으로 250μl 루프를 사용하는 칼럼속으로 주입한다. 280nm에서의 흡수를 감시하고 0.25ml 분설을 수거하였다. 칼럼을 제조자가 공급하는 분자량 표준을 사용하여 보정하였다.

각 분설의 150μl 분취량을 앞에서 기술한 샌드위치 면역검사의 변경으로 해방된 세포 항원 수용체의 주요 프레임구조 결정인자에 대해서 분석하였으며, 이 면역검사에서는 기진기 플랫폼에서(180rpm) 실은(20∼25℃)의 2시간 배양을 37℃에서의 2시간 배양대신에 실시하였다.

이 분석의 결과는 제1도에 표시하며, 여기서는 대략 40kd의 분자량을 특징으로 하는 종(種)을 두 Molt-4 및 HPB T 세포 상청액이 포함한다는 것을 나타낸다. 그러나, HPB T 세포 상청액은 지배적으로 더 큰 형태를 가진 180kd 내지 20kd의 분명한 분자량 범위의 상당한 다성분을 가진 다른 종을 포함하였다.

반대로 Molt4는 35kd의 분명한 평균 분자량을 가진 항원 수용체만을 나타내어서, T 세포 항원 수용체의 단일 사슬이나 단편중 어느 것이 존재하면 제외한다. 이러한 결과로 T 세포 항원 수용체가 여러가지 형태로 해방될 수도 있과 막과는 관련이 없다는 것을 나타낸다.

[6.3. 세포 용해질 속에서의 해방된 T 세포 항원 수용체의 검출]

분석할 세포용해질을 단백효소 억제제(바람직하게는 PMSF, TCPK, 아프로티닌(aprotinin), 펩스타틴(pepstatin) 또는 요오드 아세트아미드)와 세제(비록 다른 화학적으로 관련된 세제로 또한 작용하지만 바람직하게는 0.1 내지 5%, 더욱 바람직하는1%, NP₄O 또는 디기토닌)을 포함하는 등장성 완충액(바람직하게는 0.15M NaCl, 0.01M 트리스 pH 7.4, 1mM MgCl₄)에 든 용해된 정상의 단일크론의 또는 백혈병의 T 세포 배양주 또는 B 세포기준으로부터 제조하였다.

용해후에, 핵과 다른 부스러기를 원심분리(10분간 400×g 후에 20분간 50,000×g로 재원심분리)로서 펠릿으로 만들었다. 용해질(100μl 분취량)을 앞의 실시예에서 기술한 ELISA샌드위치 면역검사법으로 즉시 분석하거나 또는 4℃로 보관하거나 또는 분석을 위하여 냉동하였다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 분명한 것은 인파구(예로 Mayer, et al., 1985, J. Immunol. 134 : 258) 침윤된 임파의 조직이나 다른 조직의 경우 유사한 방법으로 조절을 처리할 수 있었다는 것이다.

표 6에서 표시한 것같이, 용해된 T 세포 항원 수용체가 T 세포 배양주와 말초의 단일 클론의 세포의 세포용해질에서 검출되었지만 B임파종세포(Daudi)용해질에서는 검출되지 않았다.

[표 6]

[세포용해질에서의 T 세포 항원 수용체의 검출]

* 괄호내의 숫자는 항-부 프레임 구조 항체 반응성을 가지는 실제 세포수를 나타낸다. 말초의 단핵세포는 약 2% 세포를 포함하고 이것은 비가등화한 함-부 프레임구조 항체에 반응성이 있다는 것을 알아야 한다. 그러므로 실제 양성세포 계산을 정상화하여 이것을 HPB-ALL T 세포 배양주와 비교할 필요가 있다(표 1 참조).

비가등화한 항체와 검출항체의 기질을 NP₄O으로 처리한 HPB-ALL 용해질에서의 해방된 T세포 항원수용체의 측정에서 항체의 상이한 조합의 영향을 조사하기 위해 실시하였다. 표 7에서 나타내는 것같이 같은 항-주요 프레임구조 항체를 비가동화한 및 검출항체로서 사용할때, 낮지만 중요한 수준의 해방된 T 세포 항원 수용체를 측정할 수가 있었다.

유사하게 같은 항-부 프레임구조 항체를 두 비가동화한 그리고 검출 항체로서 사용할때, 낮지만 중요한 수준의 해방된 T 세포 항원 수용체를 측정할 수 있었다. 반대로, 같은 HPB-ALL 항-클론형태 항체를 두 비가등화한 그리고 검출항체로서 사용했을때, 해방된 T 세포 항원 수용체를 검출할 수가 없었다.

[표 7]

[HPB-ALL T세포의 세포 용해질에서의 T 세포 항원 수용체의 검출]

* 이 세포는 앞에서 기술한 것같이 NP₄O으로 용해시키고 ; 2.5×10⁶세포 등가물을 검사 웰다 사용하였다.

비특정 배경판독은 표시된 값에서 감하였다.

+는 보다 큼을 나타낸다.

또한 해방된 T 세포 항원 수용체로 비가등화한 그리고 검출항체로서 두 개의 분명한 항-주요 프레임구조 항체를 사용하여 상이한 세포의 수로부터 검출할 수 있었다. 표 8의 결과는 비가등화한 항체로서의 항-주요 프레임구조 항체와 주요 프레임구조 결정인자의 상이한 에피토프를 한정하는 제2항-주요 프레임구조 검출 항체를 사용하여, T 세포 항원 수용체를 T 세포배양주의 여러가지로부터의 용해질과 정상수체로부터의 말초 혈액 임파구에서 측정할 수 있지만 B세포 배양주로부터는 측정할 수 없었다.

[표 8]

[T 세포배양주와 말초 혈액 임파구로부터의 세제 용해질 속에 든 T 세포 항원 수용체]

* 단일클론의 항체 W4는 비가등화한 항체이고 BF1는 검출항체이었다.

각 단일클론의 항체는 T 세포 수용체의 주요 프레임구조 결정인자의 상이한 에피로프를 한정한다.

ND는 실시않음을 나타낸다.

+는 그 이상을 나타낸다.

T 세포 항원 수용체 복합체를 상청액에 든 T 세포 항원 수용체-T 복합체용으로 기술된 조건하에서 비가등화 한 항체로서 항-T항체와 검출항체로서 항-주요 프레임구조 항체를 사용하여 여러가지의 T 세포 배양주로부터에 세포용해질에서 측정할 수도 있다.

[6.4. 혈청에든 해방된 T 세포 항원 수용체 또는 수용체/복합체]

T 세포 백혈병 배양주의 배양물 상청액에 해방된 T 세포 항원 수용체의 존재로서 우리로 하여금 해방된 항원 수용체 복합체가 T 세포 악성종양이나 감염성 질병을 가진 환자의 혈청속에서 검출될 수 있는지의 여부를 조사하게 한다. 아래에 기술된 이 실험은 이 이론을 확인하기 위해 실시한 것이다.

[6.4.1. 백혈병환자의 형청속의 해방된 수용체/복합체의 검출]

아래의 검사는 해방된 수용체/복합체가 백혈병 환자의 혈청시료에서 검출될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 비가등화 한 항-T3 항체와 항-주요 프레임구조 검출항체를 사용하여 실시하였다.

임뮤론(Immulon) Ⅰ판으로부터의 미량적정 웰을 PBS에 든 2.5μg/ml의 항-T3 단일 클론의 또는 기준항체로서 4℃에서 밤새껏 피복하였다. 그리고 이 웰을 철저히 세척하고, 0.025M 트리스 pH 7.4, 0.15M NaCl 및 0.05% Tween 20을 포함하는 완충액에 든 1% BSA로서 4℃에서 바새껏 피복하고, 혈청시료와 T 세포 용해질을 첨가하기 전에 다시 철저히 세척하였다. 백혈병 환자 또는 정상 피검물에서 취한 혈청의 분취량(50μl)을 피복한 웰에 첨가하고 10μl의 2% 디기토닌과 40μl의 태아 송아지 혈청으로 혼합시키고, 실온에서 15분간 배양하였다. 검사방법의 나머지는 앞에서 기술한 것같이 실시하였다. 아래의 표 9에서 나타내는 것같이, T 세포 백혈병이나 T 세포 임파종을 가진 6명의 환자에서 취한 혈청시료는 정상 피검물과 비교하여 현저히 증가된 수준의 해방된 세포 항원 수용체 복합체를 가졌다.

[표 9]

[혈청속의 해방된 T 세포 항원 수용체 복합체]

* 환자 A 및 B는 인체 T 세포 백혈병 비루스Ⅰ에 대해 혈청양성이고 T 세포 백혈병의 증상을 나타내었고 ; 환자 C는 T 세포 백혈병으로서 진단되었고 ; 환자 D, E 및 F는 모두 T 세포 임파종으로서 진단되었다.

* * 16명의 정상 피검물에 취한 혈청의 평균검사치(OD490 값의 범위 : 0.01 내지 0.031).

[6.4.2. 백혈병 환자의 혈청에서의 해방된 T 세포 항원 수용체의 검출]

아래의 검사는 비가등화한 그리고 검출항체로서 두개의 분명한 항-주요 프레임구조 항체, W₄와 BF1을 사용하여 실시하였다. 이러한 항체의 특별한 배치는 혈청시료에서의 T 세포 항원 수용체의 검출을 확증하는 것으로 나타냈다.

미량 적정웰(Flow Laboratories, MeLean, Virginia)를 항-프레임 구조의 단일클론 또는 기준항체로 4μg/ml의 PBS로서 4℃에서 밤새껏 피복하였다. 그리고 이 웰을 철저히 세척하고, 0.025M 트리스(pH 7.4), 0.15M NaCl 및 0.05% Tween-20에 든 1% BSA로서 37℃에서 2시간 동안 피복하였다. 환자와 정상인의 피검물(음성기준)에서 취한 혈청(50μl)의 분취량과 HPB T(양성기준)세포에서 취한 NP₄₀용해질의 희석물을 포함하는 50μl의 표준물을 웰에 첨가하고 다음에 50% 태아 송아지 혈청, 0.125M 트리스(pH 7.4), 0.075M NaCl, 0.375% NP4O, 및 100μg/ml의 무관계한 정제된 쥐의 IgG를 포함하는 완충액 100μl를 첨가하였다. 시료를 37℃에서 2시간동안 배양하고, 그 다음에 결합되지 않은 시료를 씻어내었다.

제2항-주요 프레임구조 검출항체의 적절히 적정한 HRP 공역 100μl를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 또다시 2시간 동안 배양하였다.

웰을 PBS 0.05% Tween으로 세척하였다. 앞서 기술한 100μ1의 OPD 기질을 배양하고 앞서 기술한 것같이 H₂SO₄의 존재하에서 판독하였다.

이 검사의 최초의 결과는 성인의 세포 백혈병(ATL)환자의 혈청에 들어 있는 T세포 항원 수용체의 검출에서는 실패하였다.

더우기, 혈청속으로 탔을 때에는 HPB 용해질의 회수는 비교적 낮았다. 그러나, 항체의 배치를 거꾸로 하면 실제로 완전히 회수가 되었다. 예로서, 비가동화한 BF1 다음에 W₄검출항체를 배치하는 것같이, 항-주요 프레임구조 항체의 배치를 역으로 사용하면, 이 T세포 항원 수용체는 이러한 혈청속에서 검출될 수 있었다(표 10). 이것은 놀라웁게도 이러한 항체의 어떤 배치든 배양한 세포에서 해방된 T세포 항원을 검출하는데 성공적으로 사용할 수 있기 때문이다. 혈청의 시험에서 이러한 현상의 성질이 불분명하게 남아 있는 한편, 항체의 정확한 선택과 배치가 이 검사에서 중요한 것으로 정사된다.

[표 10]

[혈청속의 해방된 T세포 항원 수용체의 검출]

* 비특정 배경판독은 표시한 값에서 뺀다.

[6.4.3. 환자혈청의 T세포 항원 수용체의 성질]

환자혈청의 T세포 항원 수용체의 성질을 세포 배양물을 상청액에서 분석된 물질과 비교하기 위하여 HPLC 겔 여과를 다시 사용하였다.

혈청을 0.1M 인산염과 01M NaCl(pH6.8)로서 1대 1로 희석하고 0.2um 막으로 여과하였다. 250μl의 각 시료를 앞에서 기술한 조건을 써서 칼럼속으로 주입하였다. 검사는 배양물 상청액분설(위의 6.2.4항 참조)에 대해서 기술한 것과 동일하게 실시하였다.

이 실험의 결과는 제2도에 표시되어 있으며, 여기서 A와 C는 급성 성체 T세포 백혈병이 있는 환자에 대해서 수득한 크로마토그램을 나타내고 B는 T₄만성 임파구 백혈병이 있는 환자에 대한 크로마토그램을 나타낸다. 이 데이터가 가르키는 것은 해방된 T세포 항원 수용체의 최소한 몇몇 형태가 혈청속에 존재하고 상이한 프로파일이 상이한 환자에 대해서 검출될수도 있다는 것이다. 빈 공간에 있는 물질은 막이나 다른 분자 또는 접합체와 관련된 T세포 항원 수용체를 나타낼 수도 있는 한편에 칼럼의 분별범위내에 포함되는 물질은 Molt 4 백혈병 세포배양주에서 볼 수 있는 것과 유사한 물질이라고 시사한다.

이러한 결과는 생체조직내에서는 물론 시험관내에서 T세포 항원 수용체가 다양한 형태로 해방될 수도 있다는 관념을 뒷받침한다.

[6.4.4. T세포 악성종양을 가진 환자의 혈청의 해방된 T세포 항원 수용체 검출]

항-주요 프레임 구조 항체의 최적화 한 배치를 사용하여 혈청시료에든 해방된 T세포 항원수용체에 대한 51명의 백혈병 및 8명의 정상 실험실 급혈자의 검사결과를 표 11에 나타내었다. 값은 HPB T세포 배양주에서 취한 표준 용해질에 관련하여 표현하였다. 정상의 실험실 급혈자는 이 검사로 측정하여 검출되는 물질을 가지지 않았다. 8명의 급성 ATL 환자는 항원 수용체의 중요한 수준을 나타내었다. 16명의 만성 ATL 환자중에서 2명이 해방된 T세포 항원 수용체의 증가된 수준을 나타낸 한편, 이러한 데이터는 혈청속의 세포없는 T세포 항원 수용체의 수준이 이러한 ATL 환자에서 질병활성도와 상호 관련된다는 것을 나타낸다. ATL가 아닌 백혈병 환자중에서 T4양성 백혈병은 이 검사에서 강한 반응성을 나타내었다.

[표 11]

[T세포 악성 종양을 가진 환자의 혈청에서의 해방된 T세포 항원 수용체의 검출]

* 환자 A, B 및 C는 제2도의 A, B 및 C에 상응한다.

* * 비가동화한 BF1 및 W₄검출항체를 사용하는 최적화한 샌드위치 면역 검사에 의해서 혈청수준을 검사하였다. 단위는 양성기준으로 작용하는 표준 HPB T세포 용해질에서 수득한 판독과 관련하여 표현하였다.

* * * 이 시료는 T₄만성 임파구 백혈병 환자로부터 취하였다.

-그 이하를 나타냄.

해방된 T세포 항원 수용체의 수준이 T세포와 관련된 악성 종양을 감시에서 진단학적 가치를 가질 수도 있다는 것을 정사된다.

[6.4.5. 감염성 질병이 있는 환자의 혈청에 든 해방된 T세포 항원 수용체의 검출]

감염성 질병이 있는 환자의 혈청에 든 해방된 T세포 항원 수용체의 검사결과는 표 12에 나타낸다. 또한 해방된 T세포 항원 수용체의 중요한 수준도 허페스비루스(herpesvirus)로 감염된 환자에서 나타난다. 이 물질이 질병이나 이 질병에 대한 면역 반응에 기인하여 직접 해방될 수도 있다. 어느 경우에든, 해방된 T세포 항원 수용체의 수준이 감염성 질병을 감시함에 있어서 진단학적 가치를 가지는 것으로 정사된다.

[표 12]

[감염성 질병이 있는 환자의 혈청에 든 해방된 T세포 항원 수용체의 검출]

* 비가동화한 BF1 및 W₄검출 항체를 사용하는 최적화한 샌드위치 면역검사에 의해서 혈청수준을 검사하였다. 단위의 양성기준으로 작용하는 표준 HPB T세포 용해질에서 수득한 판독과 관련하여 표현하였다.

-그 이하를 의미함.

[7. 미생물의 기탁]

아래의 하이브리도마를 미국 Rockville, MD의 ATCC에 기탁하고 아래의 기탁번호를 받았다.

본 발명의 몇 형태를 설명하려는 의도로 제시한 실시예에 기술된 구체예에 의하여 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니며 동등한 기능을 하는 어떤 방법도 본 발명의 범위내에 포함된다. 진실로, 여기에 나타내고 기술한 것 이외에도 본 발명에 여러가지 변경이 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 분명해지고 청부된 청구범위내에 포함되는 것을 의도한다.

Claims

무세포(cell free) 샘플에서 세포없는 T세포 항원 수용체의 감지방법에 있어서, (a) 면역특이적 결합이 일어날 수 있는 조건하에서 세포없는 T세포 항원 수용체 또는 이의 복합체 특이적인 항체와 샘플을 접촉시키고 ; 그리고 (b) 샘플내에서 면역특이적 결합이 일어났는지를 확인하고, 면역특이적 결합이 형성될 경우 세포없는 T세포 항원 수용체 또는 이의 복합체가 샘플안에 존재함을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포없는 T세포 항원 수용체 단백질의 감지방법.
제1항에 있어서, 항체는 항-주프레임구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제1항에 있어서, 항체는 항-부프레임구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제1항에 있어서, 항체는 항-클로노타입 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제1항에 있어서, 샘플은 생물학적 유체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제5항에 있어서, 생물학적 유체는 세포배양물로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제5항에 있어서, 생물학적 유체는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨, 척수, 활액, 양수 또는 두개골액으로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
무세포 샘플에서 세포없는 T세포 항원 수용체의 감지 방법에 있어서, (a) 면역특이적 결합이 일어날 수 있는 조건하에서 세포없는 T세포 항원 수용체 또는 이의 복합체에 특이적인 제1항체와 제2항체를 샘플과 접촉시키고 이때 제1항체와 제2항체는 동일한 항원 결정부위에 결합되지 않으며 ; 그리고 (b) 샘플내에서 면역특이적 결합이 일어났는지를 확인하고, 제1과 제2항체에 대해 샘플안의 성분이 면역특이적 결합이 형성한 경우 세포없는 T세포 항원 수용체 또는 이의 복합체가 샘플안에 세포없는 T 세포 항원 수용체 또는 이의 복합체가 샘플안에 존재함을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포없는 T세포 항원 수용체 단백질의 감지방법.
제8항에 있어서, 제1항체는 고정시키고, 제2항체는 방사능 동위원소로 라벨링시켜 면역특이적 결합의 확인은 고정된 라벨링을 감지하는 것으로 실시되는 것을 특징으로 하는 감지방법.
제9항에 있어서, 고정된 제1항체는 항-주프레임 구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제9항에 있어서, 고정된 제1항체는 항-부프레임 구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제9항에 있어서, 고정된 제1항체는 항-클로노타입 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제9항에 있어서, 라벨링된 제2항체는 항-주프레임 구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제9항에 있어서, 라벨링된 제2항체는 항-부프레임 구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제9항에 있어서, 라벨링된 제2항체는 항-클로노타입 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제8항에 있어서, 샘플은 생물학적 유체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제16항에 있어서, 생물학적 유체는 세포배양물로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제16항에 있어서, 생물학적 유체는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨, 척수, 활액, 양수 또는 두개골액으로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
무세포 샘플에서 제2의 단백질 또는 펩티드가 복합된 세포없는 T세포 항원 수용체 복합체의 감지방법에 있어서, (a) 면역특이적 결합이 일어날 수 있는 조건하에서 샘플과 제1과 제2항체를 접촉시키고, 이때 제1항체는 세포없는 T세포 항원 수용체에 특이적인 항체이고, 제2항체는 제2단백질 또는 펩티드의 에피토프에 특이적인 항체로 구성되며 ; 그리고 (b) 샘플내에 성분이 제1과 제2항체와 면역특이적 결합이 이루어졌는지를 확인하고, 면역특이적 결합이 형성된 경우 샘플내에 세포없는 T세포 항원 수용체 또는 제2단백질 또는 펩티드가 복합된 세포없는 T세포 항원 수용체의 복합체가 존재함을 나타내는 것을 특징으로 하는 새포없는 T세포 항원 수용체의 감지방법.
제19항에 있어서, 제1항체는 고정시키고 제2항체는 방사능 동위원소로 라벨링시켜 면역특이적 결합의 확인은 고정된 방사능 라벨링의 감지에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 감지방법.
제19항에 있어서, 제2항체는 고정시키고 제1항체는 방사능 동위원소로 라벨링시켜 면역특이적 결합의 확인은 고정된 방사능 라벨링의 감지에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 감지방법.
제19항에 있어서, 제1항체는 항-주프레임구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제19항에 있어서, 제1항체는 항-부프레임구조 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제19항에 있어서, 제1항체는 항-클로노타입 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제19항에 있어서, 제2항체는 항-T3로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제19항에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨, 척수, 활액, 양수 또는 두개골액으로서 선택된 생물학적 유체로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.
제26항에 있어서, 생물학적 유체는 세포배양물로 구성된 것을 특징으로 하는 감지방법.