DE4220759A1 - DNA-Sequenzen für Oligosaccharid-Transporter, Plasmide, Bakterien und Pflanzen enthaltend einen Transporter sowie Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen zur Identifikation des Transporteers - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Oligosaccharid-Transporters enthalten, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Speicherstoffen in transgenen Pflanzen verändern, Plasmide, Bakterien und Pflanzen enthaltend diese DNA-Sequenzen sowie ein Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen, die der Identifikation der erfindungsgemäßen DNA Sequenzen pflanzlicher Oligosaccharid-Transporters ermöglichen.

Der wichtigste Transportmetabolit für gespeicherte Energie ist bei vielen Pflanzen, beispielsweise der Kartoffel, die Saccharose, ein Disaccharid aus Glukose und Fruktose. Bei anderen Spezies können andere Oligosaccharide diese Rolle einnehmen. Bei der japanischen Artischocke ist dies beispielsweise die Stachiose.

Die zentrale Stellung der Transport-Oligosaccharide im Energiehaushalt der Pflanze wurde bereits an transgenen Pflanzen gezeigt, bei denen durch Expression einer Invertase, die Saccharose in die Monosaccharide spaltet, erhebliche Veränderungen im Habitus herbei geführt wurden (EP 442 592). Wegen der Bedeutung der Saccharose bei der Bildung von Speicherstoffen sind zahlreiche Versuche unternommen worden, in die Biosynthese oder den Metabolismus des Disaccharids einzugreifen. Aus der DE 42 13 444 ist die Verbesserung der Lagereigenschaften von Ernteteilen transgener Kartoffeln, bei denen durch Expression einer apoplastischen Invertase die Weiterleitung von energiereichen Verbindungen an die heterotrophen Orte des Sproßwachstums unterbunden ist, bekannt. Trotz der vielfältigen Bemühungen, den Mechanismus der Verteilung von Speicherstoffen wie Oligosaccharide in Pflanzen aufzuklären und zu beeinflussen, ist bisher nicht bekannt, wie die in den Blättern in der Folge der Photosyntheseprozesse gebildete Saccharose in die Leitungsbahnen des Phloems der Pflanze gelangt und wie sie von den Speicherorganen, z. B. den Knollen von Kartoffelpflanzen oder den Samen, aufgenommen wird. An isolierten Plasmalemma-Membranen von Zellen des Blattgewebes der Zuckerrübe Beta vulgaris wurde demonstriert, daß der Transport von Saccharose durch die Membran bei Erzeugen eines künstlichen pH-Gradienten induziert und durch Erzeugen eines elektrochemischen Potentials intensiviert werden kann (Lemoine & Delrot (1989) FEBS letters 249: 129-133). Der Membrandurchtritt der Saccharose folgt einer Michaelis-Menten-Kinetik, der km Wert des Saccharose-Transports beträgt etwa 1 mM (Slone & Buckhout, 1991, Planta 183 : 484-589). Diese Art der Kinetik läßt auf die Beteiligung eines Transporter- Proteins schließen. Untersuchungen an Plasmalemma-Membranen von Zuckerrübe, Ricinus communis und Cyclamen persicum weisen darauf hin, daß es sich beim Saccharosetransport um einen Kotransport mit Protonen handelt (Buckhout, 1989, Planta 178 : 393-399; Williams et al., 1990, Planta 182 : 540-545; Grimm et al., 1990, Planta 182: 480-485). Die Stöchiometrie des Kotransports beträgt 1 : 1 (Bush, 1990, Plant Physiol 93: 1590-1596). Es werden jedoch auch Mechanismen diskutiert, die von einen Transport der Saccharose durch die Plasmodesmen der Pflanzenzellen ausgehen (Robards & Lucas, 1990, Ann Rev Plant Physiol 41: 369-419). Trotz der Hinweise auf die Existenz eines aktiven Transportsystems, das den Zellen erlaubt, Saccharose an die Leitungsbahnen abzugeben, ist ein Protein mit derartigen Eigenschaften bisher nicht bekannt. Bei N-Ethylmaleinimid-Markierung von Plasmalemma-Proteinen der Zuckerrübe in Gegenwart und Abwesenheit von Saccharose erhielten Gallet et al. (1989, Biochem Biophys Acta 978: 56-64) Hinweise darauf, daß ein Protein der Größe 42 kDa mit Saccharose interagieren kann. Antikörper gegen eine Fraktion von Plasmalemma- Proteinen dieses Größenbereichs können den Saccharose-Transport durch Plasmalemma-Membranen inhibieren (Lemoine et al., 1989, Bichem Biophys Acta 978: 65-71). Im Gegensatz hierzu erhielten Ripp et al., 1988, Plant Physiol 88: 1435-1445) bei Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen aus Sojabohne mit dem Saccharoseanalogon Desoxy-azido-hydroxy-benzamido-Saccharose Hinweise auf die Beteiligung eines 62 kDa Proteins am Transport der Saccharose durch Membranen. Eine Aminosäuresequenz eines Saccharose-Transporters ist nicht bekannt.

Es werden nun DNA-Sequenzen beschrieben, die die Kodierregion eines Oligosaccharid-Transporters enthalten, und deren in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Sequenzintegration in ein pflanzliches Genom die Bildung von Ribonukleinsäuren erlaubt, mit deren Hilfe eine neue Oligosaccharid-Transporter-Aktivität in Pflanzenzellen eingeführt werden oder eine endogene Oligosaccharid-Transporter-Aktivität unterdrückt werden kann. Unter einem Oligosaccharid-Transporter ist z. B. ein Saccharose- Transporter aus Pflanzen wie Spinat oder Kartoffel zu verstehen. Die Identifikation der Kodierregion der Oligosaccharid-Transporter wird über ein Verfahren durchgeführt, das die Isolation von pflanzlichen DNA-Sequenzen, die Transporter-Moleküle kodieren, mittels Expression in spezifischen Mutanten der Hefe Saccharomyces cerevisiae erlaubt. Hierzu müssen geeignete Hefe-Mutanten verfügbar sein, die nicht in der Lage sind, eine Substanz aufzunehmen, für die aus einer pflanzlichen Genbank die Kodierregion eines Transporter-Moleküls isoliert werden soll. Es ist bereits ein Verfahren zur Komplementation einer Kalium- Transport Defizienz in Hefe-Mutanten bekannt (Anderson et al., 1992, Proc NStl Acad Sci USA 89 : 3736-3740). Hierbei werden mit Hilfe von Expressionsvektoren für Hefen cDNA Sequenzen zu pflanzlicher mRNA in den Hefe-Mutanten exprimiert. Diejenigen Hefen, die nun in der Lage sind, die zu transportierende Substanz in die Zellen aufzunehmen, enthalten die Kodierregionen für ein Transporter-Molekül im Expressionsvektor. Das bekannte Verfahren ist zur Identifikation von Kodierregionen für Saccharose- Transporter jedoch nicht anwendbar, da Hefen keinen endogenen Saccharose-Transporter besitzen, der durch Mutation ausgeschaltet werden könnte. Hefen kodieren eine sezernierbare Invertase, die extrazellulär Saccharose spaltet, so daß von der Zelle Hexosen über einen Hexosetransporter aufgenommen werden können.

Für die Herstellung und Transformation von Hefestämmen, die der Identifikation pflanzlicher Oligosaccharid-Transporter dienen, wird nun

• a) zunächst ein Hefestamm mit einem defekten suc2 Gen, der keine Invertase sezernieren kann, durch homologe Rekombination hergestellt und daraus anschließend
• b) durch Transformation mit einem Gen für eine Saccharose- Synthase-Aktivität aus pflanzlichen Zellen ein Hefestamm, der intrazellulär Saccharose spalten kann, gewonnen und
• c) durch Transformation dieses Stammes mit einer pflanzlichen cDNA Bibliothek in einen Expressionsvektor für Hefezellen die DNA- Sequenz identifiziert, die für einen pflanzlichen Oligosaccharid- Transporter kodiert.

Die über dieses Verfahren erhältlichen Hefestämme zur Identifikation von pflanzlichen Oligosaccharid-Transportern sind z. B. die Hefestämme YSH 2.64-1A-SUSY (DSM 7106) und YSH 2.64-1A- INV (DSM 7105).

Mit dem Hefestamm YSH 2.64-1A-SUSY kann eine DNA-Sequenz für einen pflanzlichen Saccharose-Transporter identifiziert werden, die die folgende Sequenz aufweist:

Die identifizierten DNA-Sequenzen können in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für Expression in eukaryontischen Zellen kombiniert werden. Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions- Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Saccharose- Transporters in den Zellen ermöglicht, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht translatierbaren RNA, die die Synthese eines endogenen Saccharose-Transporters verhindert. Durch Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Oligosaccharid-Transporters ist eine Veränderung des pflanzlichen Kohlenhydratmetabolismus möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß die Verbesserung der Weiterleitung von Speicherstoffen an Ernteteile zu einer Ertragssteigerung von Nutzpflanzen führt. Die Möglichkeit der Unterdrückung von Speicherstoffaufnahme in einzelne Organe erlaubt die Veränderung der Gestalt einer Pflanze, indem das Wachstum einzelner Gewebe verlangsamt wird - beispielsweise von Blüten, während das Wachstum von Ernteteilen begünstigt wird. Hierbei ist an eine Verlängerung der Vegetationsphase von Kulturpflanzen zu denken, die zu einer vermehrten Bildung von Speicherstoffen führt.

Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (vgl. u. a. Gasser, C.S., Fraley, R.T., 1989, Sience 244 : 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42: 205-225). Zur Expression der kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind bekannt (u. a. EP 375 091). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Derartige Elemente sind ebenfalls beschrieben (vgl. Gielen et al., 1989, EMBO J 8 : 23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und -terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vektor System, Offset-drukkerÿ Kanters B.V. Alblasserdam, (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4 : 277-287 beschrieben worden. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden und Virusinfektion. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für eine Expression in prokaryontischen Zellen kombiniert werden. Die Bildung einer von Bakterien translatierbaren RNA Sequenz eines eukaryontischen Saccharose-Transporters führt trotz der erheblichen Unterschiede in den Membranstrukturen von Pro- und Eukaryonten überraschend dazu, daß Prokaryonten nun Saccharose aufnehmen können. ,Dies ermöglicht die Produktion von technisch interessanten Bakterienstämmen, die auf dem sehr preisgünstigen Substrat Saccharose wachsen können (s. Ausführungsbeispiel 5). Beispielsweise ist die Produktion von Poly-Hydroxy-Buttersäure im Bakterienstamm Alkaligenes eutrophus beschrieben (Steinbüchel & Schubert, 1989, Arch Microbiol 153 : 101-104). Das Bakterium nutzt jedoch nur eine sehr begrenzte Auswahl von Substraten. Die Expression eines Gens für einen Saccharose-Transporter u. a. in Alkaligenes eutrophus wäre daher von großem Interesse.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Saccharose-Transporters verändert werden. Durch Veränderung der Spezifität des Saccharose-Transport-Systems ist der Transport neuer Verbindungen in eukaryontische oder aber in prokaryontische Zellen möglich, die weitere interessante Möglichkeiten erschließt. Beispielsweise kann im Falle von pflanzlichen Zellen ebenso an den Transport von Pestiziden wie auch von Substraten für Stoffwechselreaktionen der Pflanze gedacht werden. Mit Hilfe von Standard-Verfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit einer anderen DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Ferner können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen dazu genutzt werden, nach Standard-Verfahren aus dem Genom von Pflanzen verschiedener Spezies ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Saccharose- oder andere Oligosaccarid- Transportermoleküle kodieren. Mit diesen Sequenzen können Konstruktionen zur Transformation von Pflanzenzellen hergestellt werden, die Transportvorgänge in den transgenen Pflanzen verändern.

Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen, muß man zunächst Genbanken anlegen, die für den Gehalt von Genen einer Pflanzenart oder für die Expression von Genen in einer Pflanzenart repräsentativ sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNA- Banken. Aus diesen können mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen als Sonde verwandte Sequenzen isoliert werden. Hat man die dazugehörigen Gene identifiziert und isoliert, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine erforderlich.

Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele werden die wichtigsten, eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung wurden der Phage Lamba ZAP II sowie der Vektor pBluescriptSK (Short et al., 1988, Nucl Acids Res 16 : 7583-7600) verwendet.

Für die Transformation von Hefen wurden die Vektoren YIplac 128 und YEplac 112 verwendet (Gietz & Sugino, 1988, Gene 74 : 527-534).

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen & Willmitzer, 1990, Plant Sci 66 : 221-230) kloniert.

2. Bakterien- und Hefestämme

Für den pBluescriptSK Vektor sowie für pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm XL1blue (Bullock et al., 1987, Biotechniques, 5, 376-378) verwendet.

Als Ausgangsstamm für die Erzeugung des erfindungsgemäßen Hefestammes YSH 2.64-1A-susy wurde der Stamm YSH 2.64-1A (Gozalbo & Hohmann, 1990, Curr Genet 17 : 77-79) verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12 : 8711-8720) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobakterium tumefaciens

Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgt durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucl Acids Res 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Pflanzentransformation

Zehn kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.

Hinterlegungen

Am 12.06.1992 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganis­ men (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide und Hefestämme hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid pSK-S21 (DSM 7115)
Hefestamm YSH 2.64-1A-SUSY (DSM 7106)
Hefestamm YSH 2.64-1A-INV (DSM 7105).

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 Zeitverlauf der Aufnahme von Saccharose in Hefe-Zellen. "pmol/mg Zellen"=Menge der aufgenommenen ¹⁴C-markierten Saccharose in pmol, bezogen auf das Naßgewicht der Hefezellen in mg; "112"=Ausgangsstamm (ohne Transporter); "+Glukose"= Vorinkubation der Zellen in Medium mit 10 mM Glukose; "-Glukose" =keine Vorinkubation der Zellen; "2,5 µMCCCP"=Koinkubation mit dem Inhibitor Carbonyl-cyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP) in der Konzentration 2,5 µM; "500 µMPCMBS"=Koinkubation mit dem Inhibitor Parachlormercuribenzolsulfonsäure (PCMBS) in der Konzentration 500 µM; "10 µM Antimycin"=Koinkubation mit dem Inhibitor Antimycin in der Konzentration 10 µM.

Fig. 2 Klonierung des Plasmids pMA5-INV. Darstellung der Insertion des 2,4 kb großen HindIII Fragments aus pSEYC 306-1 in pMA5-10.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschreiben die Herstellung der Hefestämme, die Identifikation sowie die Funktion und Verwendung eines pflanzlichen Saccharose-Transporters.

Ausführungsbeispiel 1 Herstellung der Hefestämme YSH 2.64-1A-SUSY und YSH 2.64-1A-INV

Der Hefestamm YSH 2.64-1A hat die Eigenschaften suc2-, ma10, leu2, trp1 (Gozalbo & Hohmann, 1990, Curr Genet 17 : 77-79). Um in diesen Stamm eine enzymatische Aktivität zur Spaltung von Saccharose einzuführen, wurde er mit dem integrativen Plasmid YIplac128A2- SUSY transformiert, das die Kodierregion der Saccharose-Synthase von Kartoffel als Fusion an den Promotor des Gens für Alkoholdehydrogenase aus Hefe enthält. Das Plasmid YIplac 128A2- SUSY wurde wie folgt hergestellt. Das Plasmid YIplac128 (Gietz & Sugino, 1988, Gene 74: 527-534) wurde durch Schnitte mit PstI und EcoRI, Abbau bzw. Auffüllen überhängender Einzelstränge und Ligation im Bereich des polylinkers verkürzt. In die verbliebene SphI Schnittstelle wurde eine 728 bp Kassette mit dem Promotor der Alkoholdehydrogenase aus dem Plasmid pVT102U (Vernet et al., 1987, Gene 52: 225-233) insertiert. Dabei wurde YIplac128A2 erhalten. Die Kodierregion der Saccharose-Synthase wurde durch Polymerase- Kettenreaktion mit den Oligonukleotiden SUSY1 und SUSY2 (GAGAGAGGATCCTGCAATGGCTGAACGTGTTTTGACTCGTG bzw. GAGAGAGGATCCTTCAT TCACTCAGCAGCCAATGGAACAGCT) an einem Lambda-Klon der Saccharose- Synthase aus Kartoffel (Salanoubat & Belliard, 1987, Gene 60: 47- 56) amplifiziert. Aus dem Produkt wurde die Kodierregion als BamHI Fragment präpariert und in die BamHI Schnittstelle des polylinkers der Kassette insertiert. Mit dem so hergestellten Plasmid YIplac128A2-SUSY wurde der Hefestamm YSH 2.64-1A transformiert. Da das Plasmid nicht die 2µ Region trägt, kann es in Hefe nicht autonom replizieren. Deshalb erhalten nur solche Transformanden die Leucin-Auxotrophie, die die Plasmid-DNA zumindest teilweise chromosomal integrieren.

Leucin autotrophe Kolonien wurden auf Expression des Saccharose- Synthase Gens hin analysiert. Hierzu wurden Zellen einer 5 ml Flüssigkultur unter Zusatz von Glasperlen durch starkes Schütteln aufgeschlossen, anschließend wurde nach Zentrifugation Gesamtprotein aus dem Überstand für eine Enzymaktivitätsmessung eingesetzt. Die Aktivität der exprimierten Saccharose-Synthase beträgt 25 mU/mg Protein.

Analog wurde eine Invertase-Aktivität in den Hefestamm YSH 2.64-1A eingeführt, indem mit Hilfe des Plasmids YIplac128A1-INV ein Gen für eine cytosolische, nicht sezernierbare Invertase chromosomal ins Hefegenom integriert wurde. YIplac128A1-INV enthält anstelle der Kodierregion für Saccharose-Synthase ein Invertase-Gen, dem die Signalsequenz für Export des Genprodukts fehlt. Der Vorläufer des Plasmids ist das Plasmid YIplac128A1, das sich von YIplac128A2 in der Orientierung des polylinkers in der Kassette mit dem Promotor des Alkoholdehydrogenase-Gens unterscheidet. Die Kassette für dieses Plasmid stammt aus dem Plasmid pVT100U (Vernet et al., 1987, Gene 52 : 225-233). Mit den Oligonukleotiden INV3 und INV4 (GAGCTGCAGATGGCAAACGAAACTAGCGATAGACCTTTGGTCACA bzw. GAGACTAGTTTATAACCTCTATTTTACTTCCCTTACTTGGAA) wurde die Kodierregion der Invertase durch eine Polymerase-Kettenreaktion an DNA des suc2 Gens gewonnen. Die Kodierregion wurde als PstI/SpeI Fragment in den mit Hilfe von PstI und XbaI linearisierten Vektor YIplac128A1 ligiert. Ein Test der enzymatischen Aktivität der in der Hefezelle exprimierten Invertaseaktivität ergab eine Enzymaktivität von 68 mU/mg Gesamtprotein aus Hefezellen.

Ausführungsbeispiel 2

Klonierung der cDNA eines pflanzlichen Saccharose-Transporters Von polyadenylierter RNA aus Blattgewebe erwachsener Spinatpflanzen wurde eine cDNA Bibliothek im Phagen Lambda ZAP 11 angelegt. Von 500 000 Pfu wurde die Phagen-DNA präpariert und über einen Cäsiumchlorid-Sarcosyl-Gradienten gereinigt. Nach Schneiden der Phagen-DNA mit dem Enzym NotI wurden Insertionen aus den Größenbereichen über und unter 1,5 kbp aus einem 1%igen Agarosegel präpariert und in die NotI Schnittstelle des Expressionsvektors YEplac112A1NE ligiert. Der Vektor ist ein Derivat des Vektors YEplac 112 (Gozalbo & Hohmann, 1990, Curr Genet 17 : 77-79), bei dem wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben der polylinker gegen eine Kassette mit dem Promotor des Alkoholdehydrogenasegens ausgetauscht wurde. Der polylinker der Kassette wurde durch Schneiden mit den Enzymen PstI und XbaI wiederum entfernt und gegen ein doppelsträngiges Oligonukleotid ersetzt, das eine NotI und eine EcoRI Schnittstelle einführt (Sequenz: GATCCGCGGCCGCCCGGAATTCTCTAGACTGCA). Etwa 90 000 Klone für den Größenbereich unter 1,5 kbp und etwa 40 000 Klone für den Größenbereich über 1,5 kbp wurden bei Transformation in E.coli erhalten. Von diesen wurde Plasmid-DNA präpariert. Vierzehn mal wurden 2 µg DNA in den Hefestamm YSH2.64-1A suc-.susy transformiert. Transformanden wurden auf Medium mit 2% Glukose angezogen, und jeweils fünf- bis zehntausend wurden mit Flüssigmedium von Agarplatten abgespült und auf Saccharose haltiges Medium ausplattiert. Solche Kolonien, die schneller wachsen konnten, wurden weiter analysiert. Die Insertion in den Vektor YEplac112A1NE des Transformanden S21 (YEplac112A1NE-S21) wurde sequenziert. Die Sequenz ist oben wiedergegeben.

Ausführungsbeispiel 3 Analyse von Saccharose metabolisierenden Hefe-Transformanden

Der Hefe-Transformand YEplac112A1NE-S21, der entsprechend Ausführungsbeispiel 2 erhalten wurde, wurde in Flüssigmedium angezogen, bis die Kultur die logarithmische Phase erreicht hatte. Nach Zentrifugation der Kultur wurden die Zellen in Medium mit Glukose einer Vorinkubation für 5 Minuten unterzogen und dann in Medium mit ¹⁴C-markierter Saccharose aufgenommen. Die Aufnahme der markierten Saccharose wurde nach dem von Cirillo (1989, Meth Enzymol 174: 617-622) beschriebenen Verfahren gemesssen. Die Aufnahme der markierten Saccharose wurde derjenigen ohne Vorinkubation mit Glukose sowie denjenigen bei Koinkubation mit den Inhibitoren Carbonyl-cyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP), Parachlormercuribenzolsulfonsäure (PCMBS) und Antimycin verglichen. Der Zeitverlauf ist in Fig. 1 wiedergegeben. Die berechnete Reduktion der Saccharoseaufnahme durch Inhibitoren ist in der Tabelle I aufgeführt. Ein Kompetitionsexperiment mit verschiedenen Zuckern als Kompetitor der markierten Saccharose, aus dem die Spezifität des Transporters abgelesen werden kann, zeigt Tabelle II.

Ausführungsbeispiel 4 Transformation von Bakterienstämmen mit DNA-Sequenzen zur Expression einer Saccharose-Transporter-Aktivität

Um aufgenommene Saccharose metabolisieren zu können, benötigen Bakterienzellen eine enzymatische Aktivität zur Spaltung in die Monosaccharide. Zur Einführung einer solchen Aktivität wurden Bakterien mit dem Plasmid pMA5-INV transformiert und bezüglich der Invertase-Aktivität untersucht. Das Plasmid pMA5-INV wurde wie folgt hergestellt. Das Plasmid pMA5-10 (Stanssens et al., 1989, Nucl Acids Res 17 : 4441-4454) wurde an der HindIII Schnittstelle des polylinkers linearisiert. In die HindIII Schnittstelle wurde das 2,4 kb HindIII Fragment des Plasmids pSEYC306-1 (Taussig & Carlson, 1983, Nucl Acids Res 11: 1943-1954) kloniert. Den entsprechenden Ausschnitt des Plasmids zeigt Fig. 2. Die enzymatische Aktivität der Invertase in Bakterienzellen, die mit dem Plasmid pMA5-INV transformiert wurden, wurde nach bekannten Methoden in einem gelelektrophoretischen Aktivitätstest bestimmt. Die Möglichkeit der Bildung eines funktionalen Saccharose- Transporters durch Expression einer pflanzlichen cDNA in Bakterienzellen wurde durch Transformation von E. coli mit dem Plasmid pSK-521 untersucht. Das Plasmid ist in Ausführungsbeispiel 3 beschrieben. Nach Transformation von Bakterienzellen mit pSK-S21 wurden Untersuchungen der Saccharose-Aufnahme durchgeführt.

Tabelle I

Tabelle II

Claims (18)

1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Oligosaccharid- Transporters enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Nukleotidabfolge enthaltende Information bei Integration in ein pflanzliches Genom die Bildung von Ribonukleinsäure erlaubt und über diese Ribonukleinsäure eine neue Oligosaccharid-Transporter- Aktivität in Pflanzenzellen eingeführt werden kann oder eine endogene Oligosaccharid-Transporter-Aktivität unterdrückt werden kann, womit die Bildung und Weiterleitung von Speicherstoffen verändert wird.

2. Eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Nukleotidabfolge (Seq-ID No 1) enthält:

3. Ein Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1-2 enthält.

4. Plasmid pSK-S21 (DSM 7115).

5. Verwendung der Plasmide gemäß den Ansprüchen 3-4 oder Derivate oder Teile davon zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen.

6. Pflanzen, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 und 2.

7. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 und 2.

8. Verwendung, der DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Herstellung von Bakterien, die Saccharose aufnehmen können.

9. Verwendung der DNA-Sequenz des Oligosaccharid-Transporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Herstellung von Plasmiden mit veränderter Spezifität des Transporters.

10. Verwendung der DNA-Sequenz des Oligo-Saccharid-Transporters gemäß dem Ansprüchen 1 und 2 zur Isolierung ähnlicher Sequenzen aus den Genom der Pflanze.

11. Verwendung der DNA-Sequenz des Oligo-Saccharid-Transporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Expression einer translatierbaren m-RNA, die die Synthese eines Saccharose-Transporters in den Zellen ermöglicht.

12. Verwendung der DNA-Sequenz des Oligosaccharid-Transporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Expression einer nicht translatierbaren RNA, die die Synthese eines endogenen Saccharose- Transporters in den Zellen verhindert.

13. Verwendung der DNA-Sequenz des Oligosaccharid-Transporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 in Kombination mit Steuerelementen für eine Expression in prokaryontischen Zellen.

14. Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen, für die Identifikation pflanzlicher Oligosaccharid-Transporter, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) zunächst einen Hefestamm mit einem defekten suc2 Gen, der keine Invertase sezernieren kann, durch homologe Rekombination herstellt und daraus anschließend
• b) durch Transformation mit einem Gen für eine Saccharose- Synthese-Aktivität aus pflanzlichen Zellen einen Hefestamm, der intrazellulär Saccharose spalten kann, gewinnt und
• c) durch Transformation dieses Stammes mit einer pflanzlichen cDNA Bibliothek in einem Expressionsvektor für Hefezellen die DNA- Sequenz indentifiziert, die für einen pflanzlichen Oligosaccharid- Transporter kodiert.

15. Hefestämme zur Identifikation von pflanzlichen Oligosaccharid- Transportern, erhältlich über das Verfahren gemäß Anspruch 15.

16. Hefestamm YSH 2.64-1A-SUSY (DSM 7106).

17. Hefestamm YSH 2.64-1A-INV (DSM 7105).

18. Verwendung der Hefestämme gemäß den Ansprüchen 17 und 18 zur Identifikation pflanzlicher Oligosaccharid-Transporter.