ES2204903T3 - Secuencias de dna que codifican un transportador de oligosacaridos. - Google Patents
Secuencias de dna que codifican un transportador de oligosacaridos.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN SECUENCIAS DE DNA, QUE CONTIENEN LA REGION DE CODIFICACION DE UN PORTADOR DE OLIGOSACARIDOS, CUYA INTRODUCCION EN UN GENOMA DE UNA PLANTA MODIFICA LA FORMACION Y LA TRANSFERENCIA DE MATERIALES DE ALMACENAMIENTO EN PLANTAS TRANSGENICAS, PLASMIDOS, BACTERIAS Y PLANTAS QUE CONTENGAN ESTAS SECUENCIAS DE DNA, ASIMISMO SE DESCRIBE UN PROCESO PARA LA PREPARACION Y TRANSFORMACION DE CADENAS DE LEVADURA, QUE HACE POSIBLE LA IDENTIFICACION DE LAS SECUENCIAS DE DNA DEL PORTADOR DE OLIGOSACARIDO DE LA PLANTA DE LA INVENCION, ASI COMO EL USO DE SECUENCIAS DE DNA DE LA INVENCION.
Description
Secuencias de DNA que codifican un transportador
de oligosacáridos.
La presente invención se refiere a secuencias de
DNA, que contienen la región codificante de un transportador de
oligosacáridos, cuya introducción en un genoma vegetal modifica la
formación y transferencia de materiales de almacenamiento en plantas
transgénicas, plásmidos, bacterias y plantas que contienen estas
secuencias de DNA, un proceso para la preparación y transformación
de cepas de levadura, que hace posible la identificación de las
secuencias de DNA del transportador vegetal de oligosacáridos de la
invención, así como el uso de las secuencias de DNA de la
invención.
El metabolito de transporte más importante para
la energía almacenada en muchas plantas, por ejemplo las patas, es
la sacarosa. En otras especies, otros oligosacáridos pueden atender
a esta función. En las alcachofas japonesas, por ejemplo, es la
estaquiosa.
La posición central del transporte de
oligosacáridos en el contenido de energía de la planta ha sido
demostrada ya en plantas transgénicas, en las cuales por expresión
de una invertasa, la sacarosa se divide en los monosacáridos,
conduciendo a cambios considerables en su hábito (documento EP 442
592). Debido a la importancia de la sacarosa en la formación de
materiales de almacenamiento, se han llevado a cabo numerosos
experimentos en relación con la investigación de la biosíntesis o el
metabolismo de los disacáridos. Por el documento DE 42 13 444, se
sabe que la mejora de las propiedades de almacenamiento de las
partes cosechadas puede conseguirse en las patatas transgénicas, en
las cuales por expresión de una invertasa apoplástica, se inhibe la
transferencia de compuestos ricos en energía a las partes
heterótrofas de los brotes en crecimiento.
A pesar del mucho esfuerzo realizado, el
mecanismo para la distribución de los materiales de almacenamiento,
tales como oligosacáridos en las plantas no se ha esclarecido y,
con objeto de influir en el mismo, no se sabe todavía de qué modo la
sacarosa formada en las hojas después de la fotosíntesis alcanza
los canales de transporte del floema de la planta y de qué modo es
absorbida de los órganos de almacenamiento, v.g. los tubérculos de
las plantas de patata o las semillas. En las membranas plasmáticas
de las células aisladas del tejido de las hojas de la remolacha
azucarera (Beta vulgaris) se ha demostrado que el transporte
de sacarosa a través de la membrana puede ser inducido
proporcionando un gradiente de pH artificial y puede intensificarse
proporcionando un potencial electroquímico (Lemoine & Delrot
(1989) FEBS Letters 249: 129-133). El paso de
sacarosa a través de la membrana sigue una cinética de
Michaelis-Menten, en el cual el valor Km del
transporte de sacarosa es alrededor de 1 mM (Slone & Buckhout,
1991, Planta 183: 484-589). Esta forma de cinética
indica la implicación de una proteína transportadora. Experimentos
sobre membranas plasmáticas de remolacha azucarera, Ricinus
communis y Cyclamen persicum han demostrado que el transporte de
sacarosa está relacionado con un co-transporte de
protones (Buckhout, 1989, Planta 178: 393-399;
Williams et al., 1990, Planta 182: 540-545; Grimm et
al., 1990, Planta 182: 480-485). La estequiometría
del co-transporte es 1:1 (Bush, 1990, Plant Physiol
93: 1590-1596). Sin embargo, se han propuesto
también mecanismos para el transporte de la sacarosa a través del
plasmodium de las células vegetales (Robards & Lucas,
1990, Ann Rev Plant Physiol 41: 369-419). A pesar
del conocimiento de la existencia de un sistema activo de
transporte, que permite que las células suministren sacarosa a los
canales de transporte, no se conoce todavía una proteína con esta
clase de propiedades. En tinción con
N-etilmaleinimida de membrana plasmática de
remolacha azucarera en presencia y ausencia de sacarosa, Gallet et
al. (1989, Biochem Biophys Acta 978: 50-64)
obtuvieron información de que una proteína de tamaño 42 kDa puede
interaccionar con la sacarosa. Los anticuerpos contra una fracción
de proteína de la membrana plasmática de este campo de tamaños
pueden inhibir el transporte de sacarosa a través de las membranas
plasmáticas (Lemoine et al., 1989, Biochem Biophys Acta 978:
65-71). En contraste, se ha obtenido información
(Ripp et al., 1988, Plant Physiol 88: 1435-1445) por
la marcación de fotoafinidad de proteína de soja con el análogo de
sacarosa desoxiazidohidroxibenzamidosacarosa, sobre la participación
de una proteína de 62 kDa en el transporte de sacarosa a través de
las membranas. No se conoce una secuencia de aminoácidos de un
transportador de sacarosa.
Se describen ahora secuencias de DNA de acuerdo
con la reivindicación 1 que contienen la región codificante de un
transportador de oligosacáridos, y cuya información contenida en la
secuencia nucleotídica permite, por integración de la secuencia en
un genoma vegetal, la formación de RNA, por la cual puede
introducirse una nueva actividad de transporte de oligosacáridos en
las células vegetales o puede expresarse una actividad
transportadora de oligosacáridos endógenos. Por el término
transportador de oligosacáridos debe entenderse por ejemplo un
transportador de sacarosa procedente de plantas tales como
espinacas o patatas.
La identificación de la región codificante del
transportador de oligosacáridos es realizada por un proceso que
permite el aislamiento de secuencias de DNA vegetal que codifican
las moléculas transportadoras por medios de expresión en mutantes
específicos de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Para
esto, tienen que proporcionarse mutantes de levadura adecuados que
no puedan absorber una sustancia para la cual la región codificante
de una molécula transportadora tiene que ser aislada a partir de una
genoteca de genes vegetales. Se conoce ya un proceso para
complementación de una deficiencia en el transporte de potasio en
mutantes de levadura (Anderson et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA
89: 3736-3740). En ésta, se expresan secuencias de
cDNA de levadura para mRNA vegetal en mutantes de levadura por el
uso de vectores de expresión. Aquellas levaduras que no pueden
absorber ahora las sustancias a transportar en las células,
contienen la región codificante para una molécula transportadora en
el vector de expresión. El proceso conocido, sin embargo, no es
útil para la identificación de la región codificante para un
transportador de sacarosa, dado que las levaduras no contienen
ningún transportador endógeno de sacarosa que pudiera ser
desconectado por mutación. Las levaduras codifican una invertasa de
escisión, que escinde la sacarosa extracelular de tal manera que
las hexosas pueden ser absorbidas por las células por la vía de un
transportador de hexosa.
Para la preparación y transformación de cepas de
levadura que sirvan para identificar un transportador vegetal de
oligosacáridos:
- a)
- en primer lugar, se prepara una cepa de levadura con un gen suc2 defectuoso por recombinación homóloga, y luego, a partir de ésta,
- b)
- por transformación con un gen para una actividad de sacarosa-sintasa a partir de células vegetales, se extrae una cepa de levadura que puede escindir la sacarosa intracelular, y
- c)
- por transformación de esta cepa con una genoteca de genes vegetales en un vector de expresión para células de levadura, se identifica la secuencia de DNA que codifica un transportador vegetal de oligosacáridos.
Las cepas de levadura obtenidas por este proceso,
para identificación de transportadores de oligosacáridos vegetales
son por ejemplo las cepas de levadura YSH
2.64-1A-SUSY (DSM 7106) e YSH
2.64-1A-INV (DSM 7105).
Con la cepa de levadura YSH
2.64-1A-SUSY, se identifica una
secuencia de DNA para un transportador de sacarosa vegetal que tiene
las secuencias siguientes.
Transportador de sacarosa de espinacas (Seq.ID
No.1):
Las secuencias de DNA identificadas pueden
introducirse en plásmidos y combinarse de este modo con elementos
directores para la expresión en células eucariotas (véase Ejemplo
5). Estos elementos directores son, por una parte, promotores de la
transcripción, y por otra parte terminadores de la transcripción.
Con las secuencias de DNA de la invención contenidas en los
plásmidos, pueden transformarse células eucariotas, con la
finalidad de expresión de un mRNA traducible, lo cual hace posible
la síntesis de un transportador de sacarosa en las células, o con
la finalidad de expresión de un RNA no traducible, que impide la
síntesis de un transportador de sacarosa endógeno en las células.
Por la expresión de un RNA correspondiente a las secuencias del
transportador de oligosacáridos de la invención, es posible una
modificación del metabolismo de los carbohidratos de la planta, lo
cual puede ser importante en el sentido de que una mejora en el
suministro de sustancias de almacenamiento en las partes cosechadas
da como resultado un aumento del rendimiento de las plantas útiles
en agricultura. La posibilidad de forzar la absorción de materiales
de almacenamiento en órganos individuales permite la modificación de
la planta entera por la cual el crecimiento de los tejidos
individuales, por ejemplo las hojas, se ralentiza, en tanto que el
crecimiento de las partes cosechadas se incrementa. Para esto,
puede imaginarse un alargamiento de la fase vegetativa de las
cosechas, que conduce a una formación incrementada de sustancias de
almacenamiento.
\newpage
Se conocen ya procesos para la modificación
genética de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas (véase por
ejemplo Gasser, C.S., Fraley, R.T., 1989, Science 244:
1293-1299; Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol
Plant Physiol 42: 205-225). Para expresión en
plantas - las secuencias codificantes tienen que acoplarse con los
elementos reguladores de la transcripción. Tales elementos,
denominados promotores, son conocidos (EP 375091).
Adicionalmente, las regiones codificantes tienen
que proveerse de señales de terminación de la transcripción con las
cuales puedan transcribirse aquéllas correctamente. Tales elementos
han sido descritos también (véase Gielen et al., 1989, EMBO J 8:
23-29). La región de comienzo de la transcripción
puede ser natural y/o homóloga así como extraña y/o heteróloga para
la planta huésped. Si se desea, las regiones de terminación son
intercambiables unas con otras. La secuencia de DNA de las regiones
de comienzo y de terminación de la transcripción puede prepararse
sintéticamente u obtenerse naturalmente, o bien obtenerse a partir
de una mezcla de constituyentes de DNA sintéticos y naturales. Para
introducción de genes extraños en plantas superiores, se dispone de
un gran número de vectores de clonación que incluyen una señal de
replicación para E. coli y un marcador que permite una
selección de las células transformadas. Ejemplos de tales vectores
son pBR 322, la serie pUC, la serie mp de M13, pACYC 184, etc.
Dependiendo del método de introducción del gen deseado en las
plantas, pueden ser adecuadas otras secuencias de DNA. En caso de
utilizarse el plásmido Ti o Ri, v.g. para la transformación de la
célula vegetal, entonces al menos el límite derecho pero a menudo
tanto el límite derecho como el límite izquierdo del
T-DNA del plásmido Ti y Ri, se une, como una región
flanqueante, al gen que se introduce. El uso de
T-DNA para la transformación de células vegetales ha
sido investigado intensivamente y está bien descrito en el
documento EP 120 516; Hoekama, en: The Binary Plant Vector System,
Offset-drukkerij Kanters B.V. Alblasserdam, (1985),
Capítulo V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:
1-46 y An et al. (1985) EMBO J. 4:
277-287. Una vez que el DNA introducido se integra
en el genoma, es por regla general estable en el mismo y se
mantiene también en la progenie de las células originales
transformadas. Dicho DNA contiene normalmente un marcador de
selección, que induce resistencia en las células vegetales
transformadas contra un biocida o antibiótico tal como kanamicina, G
418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, etc. El marcador
individual empleado debería, por tanto, permitir la selección de
células transformadas a partir de células que carecen del DNA
introducido.
Para la introducción de DNA en una célula vegetal
huésped, además de la transformación utilizando Agrobacteria,
existen muchas otras técnicas disponibles. Estas técnicas incluyen
la fusión de protoplastos, microinyección de DNA y electroporación,
así como métodos balísticos con virus. A partir del material vegetal
transformado, pueden regenerarse plantas enteras en un medio
adecuado, que contiene antibióticos o biocidas para la selección.
Las plantas resultantes pueden ensayarse luego en cuanto a la
presencia del DNA introducido. No se exige ningún requisito especial
en cuanto a los plásmidos en inyección y electroporación. Pueden
utilizarse plásmidos simples, tales como v.g. derivados de pUC. Sin
embargo, en caso de que se regeneren plantas enteras a partir de
tales células transformadas, es necesaria la presencia de un gen
marcador seleccionable. Las células transformadas crecen dentro de
las plantas de la manera usual (véase también McCormick et al.
(1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Estas plantas
pueden cultivarse normalmente y cruzarse con plantas que posean los
mismos genes transformados o diferentes. Los individuos híbridos
resultantes tienen las propiedades fenotípicas
correspondientes.
Las secuencias de DNA de la invención pueden
introducirse también en plásmidos y combinarse de este modo con
elementos directores para una expresión en células procariotas. La
formación de una secuencia de RNA traducible de un transportador
eucariota de sacarosa a partir de bacterias conduce además,
sorprendentemente, a pesar de las considerables diferencias en las
estructuras de membrana de procariotas y eucariotas, a procariotas
que son ahora capaces de absorber sacarosa. Esto hace posible la
producción de cepas bacterianas industrialmente interesantes, que
podrían cultivarse en el sustrato relativamente económico sacarosa
(véase Ejemplo 5). Por ejemplo, la producción de ácido
polihidroxibutírico en la bacteria Alkaligenes eutrophus ha
sido descrita (Steinbüchel & Schubert, 1989, Arch Microbiol
153: 101-104). La bacteria utiliza solamente, sin
embargo, una selección muy limitada de sustratos. La expresión de un
gen para un transportador de sacarosa, entre otros, en
Alkaligenes eutrophus sería por consiguiente de gran
interés.
Las secuencias de DNA de la invención pueden
introducirse también en plásmidos que permiten la mutagénesis o una
modificación de la secuencia por recombinación de secuencias de DNA
en sistemas procariotas o eucariotas. De este modo puede
modificarse la especificidad del transportador de sacarosa.
Utilizando procesos estándar (véase Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, EE.UU.). Pueden
realizarse cambios de bases o bien se pueden añadir secuencias
naturales o sintéticas. Para la fijación de fragmentos de DNA unos
con otros pueden introducirse en los fragmentos adaptadores o
enlazadores. Adicionalmente, pueden efectuarse manipulaciones que
preparan sitios de escisión por restricción adecuados o eliminan el
exceso de DNA o los sitios de escisión por restricción. En los casos
en los que deban realizarse inserciones, deleciones o sustituciones
tales como por ejemplo transiciones y transversiones, pueden
utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de iniciadores,
restricciones o ligaciones. Para los métodos de análisis, en general
se puede utilizar un análisis de secuencia, análisis de restricción
y otros métodos bioquímicos de biología molecular. Después de cada
manipulación, la secuencia de DNA utilizada puede escindirse y
enlazarse con otra secuencia de DNA. Cada secuencia plasmídica puede
clonarse en los mismos o diferentes plásmidos.
Derivados o partes de las secuencias de DNA y
plásmidos de la invención pueden utilizarse también para la
transformación de células procariotas y eucariotas. Adicionalmente,
las secuencias de DNA de la invención pueden utilizarse de acuerdo
con procesos estándar para el aislamiento de secuencias similares en
el genoma de las plantas de diversas especies, que codifican
también sacarosa u otras moléculas transportadoras de
oligosacáridos. Con estas secuencias, pueden prepararse constructos
para la transformación de células vegetales que modifican el
proceso de transporte en plantas transgénicas.
A fin de especificar secuencias de DNA afines,
tienen que prepararse primeramente genotecas de genes, que son
representativas del contenido en genes de un tipo de plantas o de
la expresión de genes en un tipo de planta. Las primeras son
genotecas genómicas, mientras que las últimas son genotecas de
cDNA. A partir de éstas, pueden aislarse secuencias afines
utilizando las secuencias de DNA de la invención como sondas. Una
vez que el gen en cuestión ha sido identificado y aislado, es
posible una determinación de la secuencia y un análisis de las
propiedades de las proteínas codificadas a partir de esta
secuencia.
Con objeto de comprender los ejemplos que
constituyen la base de esta invención, se enumerarán antes que nada
todos los procesos necesarios para estos ensayos y que son
conocidos per se:
Para la clonación, se utilizó el fago Lambda ZAP
II, así como el vector pBluescriptSK (Short et al., 1988, Nucl Acids
Res 16: 7583-7600).
Para la transformación de levaduras, se
utilizaron los vectores YIplac 128 y YEplac 112 (Gietz &
Sugino, 1988, Gene 74: 527-534).
Para la transformación de plantas, se clonaron
los constructos génicos en el vector binario pBinAR (Höfgen &
Willmitzer, 1990, Plant Sci 66: 221-230).
Para el vector pBluescriptSK, así como para los
constructos pBinAR, se utilizó la cepa de E. coli XL1blue
(Bullock et al., 1987, Biotechniques, 5,
376-378).
Como cepa de partida para la producción de la
cepa de levadura YSH 2.64-1A-susy de
la invención, se utilizó la cepa YSH 2.64-1A
(Gozalbo & Hohmann, 1990, Curr. Genet, 17:
77-79).
La transformación del plásmido en planta de
patata se llevó a cabo utilizando la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12:
8711-8720).
La transferencia del DNA en la
Agrobacteria se llevó a cabo mediante transformación directa
por el método de Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res
16: 9877). El DNA plasmídico del Agrobacterium transformado
se aisló de acuerdo con el método de Birnboin y Doly (1979) (Nucl.
Acids Res 7: 1513-1523) y se analizó por
electroforesis en gel después de escisión adecuada por
restricción.
Diez hojas pequeñas, heridas con un escalpelo, de
un cultivo estéril de patata se pusieron en 10 ml de medio MS con
2% de sacarosa que contenía 30-50 \mul de un
cultivo nocturno de Agrobacterium tumefaciens desarrollado
bajo selección. Después de 3-5 minutos de agitación
suave mediante sacudidas, las hojas se extendieron sobre medio MS
de 1,6% de glucosa, 2 mg/l de zeatina-ribosa, 0,02
mg/l de ácido naftilacético, 0,02 mg/l de ácido gibberélico, 500
mg/l de claforán, 50 mg/l de kanamicina y 0,8% de agar bacto.
Después de incubación durante una semana a 25ºC y 3000 lux, la
concentración de claforán en el medio se redujo a la mitad.
Los plásmidos y cepas de levadura siguientes se
depositaron en el Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) en
Braunschweig, Alemania, en fecha 12.06.1992 (número de
depósito):
| Plásmido | pSK-S21 | (DSM 7115) | |
| Cepa de levadura | YSH | 2.64-1A-SUSY | (DSM 7106) |
| Cepa de levadura | YSH | 2.64-1A-INV | (DSM 7105) |
Fig.1:
Patrón de tiempos de la absorción de sacarosa en
células de levadura.
"pmol/mg células" = cantidad de la sacarosa
marcada con ^{14}C en pmol, absorbida en relación con el peso
húmedo de las células de levadura, mg; "112" = cepa de partida
(sin transportador); "+Glucosa" =
pre-incubación de las células en un medio de
glucosa 10 mM; "-Glucosa" = ausencia de
pre-incubación de las células; "2,5 \muMCCCP"
= coincubación con el inhibidor,
carbonil-cianuro-m-cloro-fenilhidrazona
(CCCP) en una concentración de 2,5 \muM; "500 \muMPCMBS" =
coincubación con el inhibidor ácido
p-cloromercuribencenosulfónico (PCMBS) en una
concentración de 500 \muM; "10 \muM Antimicina" =
coincubación con el inhibidor antimicina en una concentración de 10
\muM.
Fig. 2:
Clonación del plásmido pMA5-INV.
Muestra la inserción del fragmento HindIII de 2,4 kb de tamaño
procedente de pSEYC 306-1 en
pMA5-10.
Fig. 3:
Muestra el plásmido
pBinAR-S21.
En ésta:
| Promotor CaMV 35S: | Promotor del gen para el RNA 35S del virus del mosaico de la coliflor |
| A: | Región codificante del transportador de sacarosa en las espinacas, orientación |
| en la dirección de lectura | |
| OCS: | Terminador del gen de la octopina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens |
| SMAI, NotI, BamHI: | Posiciones de escisión de las enzimas de restricción |
Fig. 4:
Muestra el plásmido
pBinAR-P62-anti.
En éste:
| Promotor CaMV 35S: | Promotor del gen para el RNA 35S del virus del mosaico de la coliflor |
| OCS: | Terminador del gen de octopina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens |
| SmaI, SacI, BamHI, XbaI: | Posiciones de escisión de las enzimas de restricción |
Fig. 5:
Contenido de diversos carbohidratos en las hojas
de transformantes
BinAR-P62-anti.
En ésta:
| fru: | fructosa |
| suc: | sacarosa |
| sta: | almidón |
| Control: | plantas de partida sin transformar |
| sp-5 a sp-43: | transformantes con números individuales |
Fig. 6:
El flujo de carbohidratos de los pecíolos de
transformantes BinAR-p62-anti.
| wt: | tipo salvaje |
| sp-5 a sp-43: | transformantes con números individuales |
Los ejemplos siguientes describen la preparación
de las cepas de levadura, su identificación así como la función y
el uso de un transportador de sacarosa en las plantas.
La cepa de levadura YSH 2.64-1A
tiene las características suc2-, mal0, leu2, trp1 (Gozalbo &
Hohmann, 1990, Curr. Genet. 17: 77-79). Con objeto
de introducir una actividad enzimática de escisión de sacarosa en
esta cepa, se transformó la misma con el plásmido integrador
YIplac128A2-SUSY, que contiene la región codificante
de la sacarosa-sintasa de patata como una fusión con
el promotor del gen para la alcohol-deshidrogenasa
de levadura. El plásmido YIplac 128A2-SUSY se
preparó como sigue. Se acortó el plásmido YIplac128 (Gietz &
Sugino, 1988, Gene 74: 527-534) por escisión con
PstI y EcoRI, degradación y/o rellenado de las cadenas simples
colgantes y ligación en la región del polienlazador. En la posición
de escisión SphI restante, se insertó una casete de 728 pb con el
promotor de alcohol-deshidrogenasa del plásmido
pVT102U (Vernet et al., 1987, Gene 52: 225-233). De
este modo se obtuvo YIplac128A2. La región codificante de la
sacarosa-sintasa se multiplicó por la reacción en
cadena de la polimerasa con los oligonucleótidos
a un clon lambda de
sacarosa-sintasa de patata (Salanoubat &
Belliard, 1987 Gene 60: 47-56). A partir del
producto, se preparó la región codificante como fragmento BamHI y
se insertó en el sitio de escisión BamHI del polienlazador de la
casete. La cepa de levadura YSH 2.64-1A se
transformó con el plásmido YIplac128A2-SUSY, así
preparado. Dado que el plásmido no lleva la región 2\mu, el mismo
no puede replicarse autónomamente en levadura. Por esta razón,
dichos transformantes adquieren únicamente auxotrofía de leucina,
que integran al menos en parte cromosómicamente el DNA
plasmídico.
Las colonias de leucina autótrofas se analizaron
en cuanto a la expresión del gen de
sacarosa-sintasa. Para esto, se descompusieron
células de un cultivo líquido de 5 ml por adición de perlas de
vidrio con agitación enérgica mediante sacudidas, y luego, después
de centrifugar, se añadió la proteína total del sobrenadante para
una medida de la actividad enzimática. La actividad de la
sacarosa-sintasa expresada contiene 25 mU/mg de
proteína.
De una manera similar, se introdujo una actividad
de invertasa en la cepa de levadura YSH 2.64-1A,
en la cual, con la ayuda del plásmido
YIplac128A1-INV, un gen para una invertasa
citosólica no escindible se integró cromosómicamente en el genoma
de la levadura. YIplac128A1-INV contiene, en lugar
de la región codificante para sacarosa-sintasa, un
gen de invertasa, que carece de la secuencia de señal para
exportación del producto génico. El percusor del plásmido es el
plásmido YIplac128A1, que difiere de YIplac128A2 en la orientación
del polienlazador en la casete con el promotor del gen de
alcohol-deshidrogenasa. La casete para este plásmido
deriva del plásmido pVT100U (Vernet et al., 1987, Gene 52:
225-233). La región codificante de la invertasa se
obtuvo en el DNA del gen suc2 por la reacción en cadena de la
polimerasa con los oligonucleótidos
La región codificante se ligó como fragmento
PstI/SpeI en el vector linealizado YIplac128A1den utilizando PstI y
XbaI. Un ensayo de la actividad enzimática de la actividad de
invertasa expresada en las células de levadura, dio como resultado
una actividad enzimática de 68 mU/mg de proteína total procedente de
células de levadura.
A partir de RNA poliadenilado procedente del
tejido de las hojas de plantas de espinaca y patata en crecimiento,
se preparó una genoteca del cDNA en la genoteca del fago Lambda ZAP
II. A partir de 500.000 Pfu, se preparó el DNA de fago y se purificó
utilizando un gradiente de sarcosil-cloruro de
cesio. Después de escindir el DNA de fago con la enzima NotI, se
prepararon inserciones a partir de las regiones de tamaño superior
e inferior a 1,5 kpb en un gel de agarosa al 1% y se ligaron en los
sitios de escisión NotI del vector de expresión YEplac112A1NE. El
vector es un derivado del vector YEplac 112 (Gozalbo & Hohmann,
1990, Curr Genet 17: 77-79), con el cual, como se
describe en el Ejemplo 1, se intercambió el polienlazador con una
casete que tenía el promotor del gen de
alcohol-deshidrogenasa. El polienlazador de la
casete se eliminó nuevamente por escisión con las enzimas PstI y
XbaI y se reemplazó por un oligonucleótido bicatenario que
introduce un sitio de escisión NotI y EcoRI
(Secuencia: GATCCGCGGCCGCCCGGAATTCTCTAGACTGCA).
Se obtuvieron aproximadamente 90.000 clones para la región de tamaño
inferior a 1,5 kpb y aproximadamente 40.000 clones para la región de
tamaño superior a 1,5 kpb por transformación en E. coli. A
partir de éstos, se preparó DNA plasmídico. Se transformaron 2
\mug de DNA catorce veces en la cepa de levadura
YHS2.64-1Asuc-.SUSY. los transformantes se
cultivaron en un medio que contenía 2% de glucosa, y cinco a diez
mil de cada uno se separaron por lavado con medio líquido de placas
de agar y se extendieron sobre un medio que contenía sacarosa.
Aquellas colonias que pudieron desarrollarse más rápidamente, se
analizaron después. Se secuenciaron las inserciones en el vector
YE-plac112A1NE de los transformantes S21 o P62
(YEplac112-A1NE-S21). Las secuencias
se han dado anteriormente.
El transformante de levadura
YEplac112A1NE-S21, correspondiente al obtenido en
el Ejemplo 2, se cultivó en medio líquido hasta que el cultivo hubo
alcanzado la fase logarítmica. Después de centrifugar el cultivo,
las células se sometieron a una pre-incubación
durante 5 minutos en un medio que contenía glucosa y se recogieron
luego en un medio que contenía sacarosa marcada con ^{14}C. La
absorción de la sacarosa marcada se midió por el proceso descrito
por Cirillo (1989, Meth Enzymol 174: 617-622). La
absorción de la sacarosa marcada sin preincubación con glucosa se
comparó con la correspondiente a la co-incubación
con los inhibidores
carbonil-cianuro-m-clorofenilhidrazona
(CCCP), ácido
p-cloromercuribenceno-sulfónico
(PCMBS) y antimicina. El patrón de tiempos se muestra en Fig. 1. La
reducción calculada de la absorción de sacarosa por los inhibidores
se muestra en la Tabla I. Un experimento de competición con diversos
azúcares como competidores para la sacarosa marcada, a partir del
cual puede interpretarse la especificidad del transportador, se
muestra en la Tabla II.
Se llevaron a cabo experimentos análogos con la
cepa de levadura YEplac112A1NE-P62. Éstos dieron
resultados similares.
Con objeto de poder metabolizar la sacarosa
absorbida, se precisan células bacterianas que tengan una actividad
enzimática para la escisión del monosacárido. Para introducir dicha
actividad, se transformaron bacterias mediante el plásmido
pMA5-INV y se ensayaron en cuanto a actividad de
invertasa. El plásmido pMA5-INV se preparó como
sigue. Se linealizó el plásmido pMA5-10 (Stanssens
et al., 1989, Nucl Acids Res 17: 4441-4454) en el
sitio de escisión HindIII del polienlazador. El fragmento HindIII
de 2,4 kb del plásmido pSEYC306-1 (Taussig &
Carlson, 1983, Nucl Acids Res 11: 1943-1954) se
clonó en el sitio de escisión HindIII. El punto de corte
correspondiente del plásmido se muestra en Fig. 2. La actividad
enzimática de la invertasa en las células bacterianas,
transformadas con el plásmido pMA5-INV se determinó
en un ensayo de actividad en electroforesis en gel, de manera
conocida. La posibilidad de la formación de un transportador
funcional de sacarosa por expresión de un cDNA vegetal en células
bacterianas se ensayó por transformación de E. coli con el
plásmido pSK-S21. El plásmido se describe en el
Ejemplo 3. Después de la transformación de las células bacterianas
con pSK-S21, se realizaron ensayos para la absorción
de sacarosa.
A partir de los vectores YEplac
112A1NE-S21 y YEplac 112A1NE-P62 que
contienen, como inserciones el cDNA para el transportador de
sacarosa de espinaca y/o patata (véanse Ejemplos 2 y 3), se
aislaron las inserciones después de escisión con NotI y se ligaron
en el sitio de escisión NotI de los plásmidos
pBluescript-SK (pSK-S21 y/o
pSK-P62). Para pSK-S21, la inserción
se preparó como un fragmento SacI/XbaI y se clonó, después de
rellenado en el DNA monocatenario colgante, en la orientación "de
sentido" en pBinAR (Höfgen & Willmitzer, 1990, Plant Sci 66:
221-230) que se escindió previamente con las enzimas
SmaI y XbaI. El plásmido resultante pBinAR-S21
(véase Fig. 3) puede insertarse para transformación de plantas a fin
de sobre-expresar el transportador de sacarosa.
Para pSK-P62, la inserción se aisló como un
fragmento NotI de 1,7 kpb y se clonó en una orientación
"antisentido" en el sitio de escisión SmaI del vector binario
pBinAR, dando como resultado
pBinAR-P62-anti (véase fig. 4). Este
plásmido es adecuado para transformación de plantas con la finalidad
de inhibición "antisentido" de la expresión del transportador
de sacarosa.
Las Agrobacterias de transformación se
utilizaron luego para infección de segmentos de hojas de tabaco y
patata.
Diez transformantes obtenidos independientemente,
en los cuales se demostró la presencia del gen quimérico intacto no
reordenado por análisis mediante transferencia Southern, cambios en
el contenido de sacarosa, hexosa y almidón se ensayaron
respectivamente.
Los transformantes, que contienen el
T-DNA de
pBinAR-P62-anti, demostraron una
concentración fuertemente incrementada de almidones, hexosas y
sacarosa en las hojas (véase fig. 5). El eflujo de carbohidrato a
partir de los peciolos recogidos de las plantas se reduce
notablemente en medio acuoso (véase fig. 6). A partir de estos
datos, se aprecia claramente la significación del transportador de
sacarosa para el transporte alejado del fotoasimilado de los
órganos fotosintéticamente activos. Dado que una inhibición de la
actividad del transportador limita el transporte de los
carbohidratos a distancia, esto da como resultado una disminución de
la transferencia de fotoasimilados a los órganos de almacenamiento
en el caso de una sobre-expresión, por ejemplo
utilizando el plásmido pBin-AR-S21.
Las plantas de tabaco, en las cuales se ha integrado el
T-DNA de pBinAR-S21, exhiben
adicionalmente una dominancia apical reducida, es decir que muestran
un crecimiento arbustivo. Un cambio fenotípico de este tipo es muy
deseable, por ejemplo, en las plantas de tomate. El plásmido
pBinAR-S21 con la secuencia de DNA (Seq.ID No. 1) de
la invención es adecuado por consiguiente para la modificación de
plantas con el propósito de mejorar características de reproducción
importantes tales como el crecimiento arbustivo.
| Inhibidor | Transporte de sacarosa* |
| (%) | |
| Control | 100 |
| CCCP 0,5\muM | 65 |
| CCCP 2,5\muM | 21 |
| PCMBS 25\muM | 73 |
| PCMBS 100\muM | 21 |
| 2,4-DNP 25\muM | 61 |
| 2,4-DNP 100\muM | 9 |
| Arseniato de sodio 1mM | 34 |
| Antimicina A 10\muM | 59 |
| CAMP 1m | 102 |
| CCCP = carbonil-cianuro-m-clorofenilhidrazona | |
| PCMBS = ácido p-cloromercuribencenosulfónico | |
| 2,4-DNP = 2,4-dinitrofenol | |
| * = en relación con Y Eplac 112 A1NE-S21 (control) |
| Competidor | Transporte de sacarosa* |
| (%) | |
| Control | 100 |
| Sacarosa 2 mM | 28 |
| Maltosa 2 mM | 58 |
| Maltosa 10 mM | 37 |
| Fenilglucosido 2 mM | 7 |
| Floridzina 2 mM | 16 |
| Lactosa 2 mM | 91 |
| Palatinosa 10 mM | 102 |
| Trehalosa 10 mM | 103 |
| * = en relación con Yeplac 112 A1NE - S21 (control) |
Claims (24)
1. Una secuencia de DNA que contiene la región
codificante de un transportador de oligosacáridos,
caracterizada porque la introducción de dicha secuencia de
DNA en un genoma vegetal modifica la formación y transferencia de
materiales de almacenamiento en plantas transgénicas, que puede
obtenerse por un proceso que comprende los pasos siguientes:
- a)
- en primer lugar, se prepara una cepa de levadura con un gen suc2 defectuoso por recombinación homóloga, y luego, a partir de ésta,
- b)
- por transformación con un gen para una actividad de sacarosa-sintasa a partir de células vegetales, se extrae una cepa de levadura que puede escindir la sacarosa intracelular, y
- c)
- por transformación de esta cepa con una genoteca de genes vegetales en un vector de expresión para células de levadura, se identifica la secuencia de DNA que codifica un transportador vegetal de oligosacáridos.
2. Una secuencia de DNA de acuerdo con la
reivindicación 1, en la cual la genoteca de genes vegetales es una
genoteca genómica.
3. Una secuencia de DNA de acuerdo con la
reivindicación 1, en la cual la genoteca genómica vegetal es una
genoteca de cDNA.
4. Una secuencia de DNA que contiene la región
codificante de un transportador de oligosacáridos de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 derivado de una
planta.
5. Una secuencia de DNA que contiene la región
codificante de un transportador de oligosacáridos de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada
porque se deriva de espinaca.
6. Una secuencia de DNA que contiene la región
codificante de un transportador de oligosacáridos de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada
porque se deriva de patata.
7. Una secuencia de DNA de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque contiene una secuencia
de nucleótidos definida por SEQ.ID No. 1.
8. Una secuencia de DNA de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual la secuencia de
DNA está alterada por mutagénesis o modificación de la secuencia
que incluye inserciones, deleciones o sustituciones, de tal manera
que se modifica el proceso de transporte de oligosacáridos en las
plantas transgénicas.
9. Un plásmido, caracterizado porque
contiene una secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
10. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación
9, designado pSK-S21 (DSM 7115).
11. Un plásmido de acuerdo con las
reivindicaciones 9 ó 10, que contiene una secuencia de DNA de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una
parte o derivado de la misma que permite la expresión de un mRNA
traducible que hace posible la síntesis de un transportador de
sacarosa en las células o la expresión de un RNA no traducible, que
impide la síntesis de un transportador endógeno de sacarosa en las
células.
12. Una célula transformada con un plásmido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 o una
secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 derivada de una genoteca de cDNA
vegetal.
13. Una célula de acuerdo con la reivindicación
12, que es un célula procariota.
14. Una célula de acuerdo con la reivindicación
12, que es una célula eucariota, en particular una célula
vegetal.
15. Una planta transgénica que contiene una
célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 14.
16. Uso de una secuencia de DNA de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8
- a)
- para la preparación de bacterias que pueden absorber sacarosa,
- b)
- para la preparación de secuencias de DNA del transportador con especificidad cambiada,
- c)
- para aislamiento de secuencias similares a partir del genoma de las plantas,
- d)
- para la expresión de mRNA traducible que hace posible la síntesis de un transportador de sacarosa en las células,
- e)
- para la expresión de mRNA no traducible, que impide un transportador endógeno de sacarosa en las células,
- f)
- en combinación con elementos directores para una expresión en células procariotas,
- g)
- para la modificación de plantas con la finalidad de mejorar características de reproducción importantes tales como aumento en el rendimiento de las plantas de explotación agrícola, modificación de la planta entera por la cual el crecimiento de tejidos individuales tales como las hojas se ralentiza, en tanto que se incrementa el crecimiento de las plantas de cosecha, mientras que es posible un alargamiento de la fase vegetativa, que conduce a una formación incrementada de sustancias de almacenamiento, o
- h)
- para la transformación de células vegetales.
17. Un proceso para la preparación y
transformación de cepas de levadura que sirven para identificar un
transportador vegetal de oligosacáridos, caracterizado
porque
- a)
- en primer lugar, se prepara una cepa de levadura con un gen suc2 defectuoso por recombinación homóloga, y luego, a partir de ésta,
- b)
- por transformación con un gen para una actividad de sacarosa-sintasa a partir de células vegetales, se extrae una cepa de levadura que puede escindir la sacarosa intracelular, y
- c)
- por transformación de esta cepa con una genoteca de cDNA vegetal en un vector de expresión para células de levadura, se identifica la secuencia de DNA que codifica un transportador vegetal de oligosacáridos.
18. Cepas de levadura para identificación de
transportadores de oligosacáridos vegetales, obtenidas por un
proceso de acuerdo con la reivindicación 17 a) y b).
19. Una cepa de levadura de acuerdo con la
reivindicación 18, que es la cepa de levadura YSH
2.64-1A-SUSY (DSM 7106).
20. Una cepa de levadura de acuerdo con la
reivindicación 18, que es la cepa de levadura YSH
2.64-1A-INV (DSM 7105).
21. Uso de las cepas de levadura de acuerdo con
las reivindicaciones 18 a 20 para la identificación de un
transportador de oligosacáridos en las plantas.
22. Uso de un plásmido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para la transformación de
plantas para una sobre-expresión del transportador
de sacarosa.
23. Proceso para la producción de una célula de
planta transgénica que comprende el paso de introducir una secuencia
de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8
o un plásmido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
9 a 11 en una célula huésped vegetal.
24. Proceso para la producción de una planta
transgénica que comprende el paso de introducir una secuencia de DNA
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un
plásmido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a
11 en una célula huésped vegetal y regenerar plantas enteras a
partir de ella.
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