DE69326770T2

DE69326770T2 - Für einen amnosäauretransporter kodierende dna-sequenzen, plasmide, bakterien,hefen, und pflanzen die einer transporter enthalten sowie ihre verwendung

Info

Publication number: DE69326770T2
Application number: DE69326770T
Authority: DE
Inventors: Wolf-Bernd Frommer
Original assignee: Hoechst Schering Agrevo GmbH
Current assignee: FROMMER, WOLF-BERND, PROF. DR., STANFORD, CALIF.,
Priority date: 1992-07-05
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 2000-09-07
Anticipated expiration: 2013-07-02
Also published as: EP0652955B1; JPH07508419A; AU667942B2; CA2137242A1; WO1994001559A3; HUT68809A; EP0924300A3; HU220252B; DE69326770D1; US6809233B2; ATE185603T1; AU4564293A; KR950702630A; US20030051271A1; DE4222315A1; EP0652955A1; ES2139665T3; RU94046362A; DK0652955T3; GR3032223T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die die codierende Region von Aminosäuretransportern enthalten, durch deren Einschleusung in ein Pflanzengenom der Transfer von Metaboliten in transgene Pflanzen modifiziert wird, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen, die diese DNA-Sequenzen enthalten, sowie ihre Anwendung.
Für viele Pflanzenarten ist bekannt, daß die Abgabe energiereicher Verbindungen an das Phloem durch die Zellwand überall in der Zelle erfolgt. Transportermoleküle, die ermöglichen, daß Aminosäuren die Pflanzenzellwand durchdringen, sind nicht bekannt.
Es wurden zahlreiche Aminosäuretransportsysteme in Bakterien beschrieben. Für aromatische Aminosäuren wurden 5 verschiedene Transporter beschrieben, die eine der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan transportieren können, während die anderen für einzelne Aminosäuren spezifisch sind (siehe Sarsero et al., 1991, J Bacteriol 173: 3231-3234). Die Geschwindigkeitskonstanten des Transportprozesses zeigen, daß der spezifische Transport weniger effizient ist. Für verschiedene Transporterproteine wurden die entsprechenden Gene kloniert. Das wurde durch Verwendung von Mutanten mit ungenügendem Transport, die aufgrund ihrer Transportfähigkeit nach der Transformation mit DNA-Fragmenten als Inserts in Expressionsvektoren gewählt wurden, erreicht (siehe Wallace et al., 1990, J Bacteriol 172: 3214-3220). Die Mutanten wurden in Abhängigkeit von ihrer Fähigkeit gewählt, in Gegenwart toxischer Analoga von Aminosäuren zu wachsen, da sie diese nicht aufnehmen können und daher nicht beeinträchtigt werden können.
Entsprechende Komplementierungsuntersuchungen wurden mit der eukaryotischen Hefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt. Tanaka & Fink (1985, Gene 38: 205- 214) beschreiben einen Histidintransporter, der durch Komplementierung einer Mutation identifiziert wurde. Vandenbol et al. (1989, Gene 83: 153-159) beschreiben einen Prolintransporter für Saccharomyces cerevisiae. Die Hefe weist zwei verschiedene Permeasen für Prolin auf. Eine transportiert mit geringerer Leistung und kann auch für andere Aminosäuren verwendet werden, und die andere ist prolin-spezifisch und wirkt mit hoher Affinität. Letztere wurde aus dem put4-Gen codiert. Dieses weist ein offenes Leseraster für ein Peptid mit einem Molekulargewicht von 69 kDa auf. Das Protein enthält 12 membrandurchdringende Regionen, jedoch keine N-terminale Signalsequenz für die Sekretion. Das ist eine typische Eigenschaft integraler Membranproteine. Die Permeasen sind mit Arginin- und Histidinpermease aus Hefe homolog, jedoch nicht mit Prolinpermease aus Escherichia coli.
Durch Untersuchungen an Tabaksuspensionskulturen wurde für Pflanzenzellen festgestellt, daß der Transport von Arginin, Asparagin, Phenylalanin und Histidin vom pH-Wert und der Energie abhängig ist. Da ein 1000-facher Überschuß von Leucin den Transport der anderen Aminosäuren hemmt, ist anzunehmen, daß alle denselben Transporter benutzen (McDaniel et al., 1982, Plant Physiol 69: 246-249). Li und Bush (1991, Plant Physiol 96: 1338-1344) haben für aliphatische, neutrale Aminosäuren zwei Transportsysteme in den Plasmamembranvesikeln von Beta vulgaris ermittelt. Einerseits verdrängen Alanin, Methionin, Glutamin und Leucin einander am Transporterprotein und andererseits haben Isoleucin, Valin und Threonin gegenseitige kompetitive Wirkung. In kombinierten kompetitionskinetischen Untersuchungen (Li & Bush, 1990, Plant Physiol 94: 268-277) wurden vier verschiedene Transportsysteme unterschieden. Neben einem Transporter für alle neutralen Aminosäuren mit geringer Affinität gibt es einen mit hoher Affinität, der jedoch eine geringe Affinität gegenüber Isoleucin, Threonin, Valin und Prolin aufweist. Weitere Transporter gibt es für Säuren sowie für basische Aminosäuren.
Das Transportermolekül oder -gen für pflanzliche Transporterproteine ist nicht bekannt.
Es werden jetzt DNA-Sequenzen beschrieben, die die codierende Region eines pflanzlichen Aminosäuretransporters enthalten und deren in der Nukleotidsequenz enthaltene Information durch Integration in ein Pflanzengenom die Bildung von RNA ermöglicht, durch die eine neue Aminosäuretransportaktivität in die Pflanzenzellen eingeführt oder eine endogene Aminosäuretransporteraktivität exprimiert werden kann.
Unter dem Begriff eines Aminotransporters ist beispielsweise eine cDNA-Sequenz zu verstehen, die einen Aminotransporter von Arabidopsis thaliana codiert.
Die Identifizierung der codierenden Region des Aminosäuretransporters erfolgt durch ein Verfahren, das die Isolierung der Pflanzen-DNA-Sequenzen ermöglicht, die durch Expression in spezifischen Mutanten der Hefe Saccharomyces cerevisiae Transportermoleküle codieren. Dazu sind geeignete Hefemutanten bereitzustellen, die eine Substanz, für die die codierende Region eines Transportermoleküls aus einer Pflanzen-Genbibliothek isoliert werden muß, nicht aufnehmen können.
Eine Mutante, die in einem Medium mit Prolin oder Citrullin als einziger Stickstoffquelle nicht wachsen kann, wird von Jauniaux et al. (1987, Eur J Biochem 164: 601-606) beschrieben.
Für die Herstellung von Hefestämmen, die für die Identifizierung von pflanzlichen Aminosäuretransportern verwendet werden können, wird eine Hefemutante, die in einem Medium mit Prolin und/oder Citrullin als einziger Stickstoffquelle nicht wachsen kann, z. B. mit Plasmid pFL 61 transformiert, das als Insert cDNA- Fragmente aus einer cDNA-Bibliothek von Arabidopsis thallana aufweist.
Des weiteren wird eine Doppelmutante JT 16 (Tanaka & Fink, 1985, Gene 38: 205- 214) mit einer unzureichenden Histidinsynthese (his4) und Histidinaufnahme (hip1) mit dem beschriebenen Plasmid pFL 61 transformiert und in einem Medium mit Histidinzusatz kultiviert.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß bei der Transformation von Hefezellen bestimmte pflanzliche cDNA-Fragmente die Hefemutation komplementieren können. Anhand einer Analyse der Eigenschaften der von der cDNA codierten Proteine kann gezeigt werden, daß für die Komplementierung der Mutation eine codierende Region verantwortlich ist, die einen pflanzlichen Aminosäuretransporter mit einem breiten Spezifitätsspektrum codiert (siehe Beispiel 3).
Eine solche codierende Region eines Aminosäuretransporters wird beispielsweise in einer der folgenden Nukleotidsequenzen gezeigt: 1. Sequenz (Seq. ID Nr. 1): 2. Sequenz (Seq. ID Nr. 2):
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die mit Hilfe der transformierten Hefestämme identifiziert wurden, z. B. die Sequenzen Seq. Nr. 1 und Nr. 2, können in Plasmide eingeschleust werden und dabei mit Steuerelementen für die Expression in eukaryotischen Zellen kombiniert werden (siehe Beispiel 4). Diese Steuerelemente sind einerseits Transkriptionspromotoren und andererseits Transkriptionsterminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryotische Zellen mit dem Ziel transformiert werden, eine translatierbare mRNA zu exprimieren, wodurch die Synthese eines Aminosäuretransporters in den Zellen ermöglicht wird, oder mit dem Ziel, eine nichttranslatierbare RNA zu exprimieren, wodurch die Synthese eines endogenen Aminosäuretransporters in den Zellen verhindert wird. Durch Expression einer RNA, die den Sequenzen der pflanzlichen Aminosäuretransporter der Erfindung entspricht, ist eine Modifikation des pflanzlichen Säurestoffwechsels sowie des gesamten Stickstoffstoffwechsels möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung offensichtlich ist. Stickstoff ist der Nährstoff, der hauptverantwortlich für die Wachstumsbegrenzung ist. Die Lebensfähigkeit der Keimlinien sowie die Keimfähigkeit der Samen ist direkt vom Stickstoffgehalt des Speichergewebes abhängig. Die Bildung von hochwertigen Nährstoffen mit einem hohen Proteingehalt hängt von einer ausreichenden Stickstoffzufuhr ab. Stickstoff wird im wesentlichen in Form von Aminosäuren transportiert. Ein verbesserter Transport der Aminosäuren in die geernteten Pflanzenteile kann daher zu einer höheren Ausbeute bei landwirtschaftlichen Kulturpflanzen führen. Die Möglichkeit, die Aufnahme von Aminosäure in einzelnen Organen zu forcieren, gestattet eine qualitative Verbesserung dieser Organe, die aufgrund der Nutzungsanforderungen wenig Stickstoff enthalten, z. B. Kartoffeln, die für die Stärkeproduktion angebaut werden. Darüber hinaus werden Modifikationen der gesamten Pflanze möglich, wodurch das Wachstum der einzelnen Gewebe, z. B. der Blätter, verlangsamt wird, während das Wachstum der geernteten Teile zunimmt. In diesem Zusammenhang ist eine Verlängerung der Vegetationsphase von Kulturpflanzen vorstellbar, was zu einer verstärkten Bildung von Speichersubstanzen führt.
Verfahren für die genetische Modifikation zweikeimblättriger und einkeimblättriger Pflanzen sind bereits bekannt (siehe z. B. Gasser, C. S., Fraley, R. T., 1989, Science 244: 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42: 205-225). Für die Expression in Pflanzen müssen die codierenden Sequenzen mit den transkriptionalen Regulatorelementen gekoppelt werden. Diese Elemente werden als Promotoren bezeichnet und sind bekannt (EP 375091).
Des weiteren müssen die codierenden Regionen Terminationssignale für die Transkription erhalten, mit denen sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elemente werden ebenfalls beschrieben (siehe Gielen et al., 1989, EMBO J 8: 23- 29). Die Startregion der Transkription kann sowohl nativ und/oder homolog als auch fremd und/oder heterolog für die Wirtspflanze sein. Wenn es gewünscht wird, können Terminationsregionen untereinander ausgetauscht werden. Die DNA- Sequenz der Start- und Terminationsregionen der Transkription kann synthetisch erzeugt oder natürlich erhalten oder aus einem Gemisch von synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen erhalten werden. Für das Einschleusen fremder Gene in höhere Pflanzen steht eine große Zahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, dia ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker enthalten, der eine Selektion der transformierten Zellen ermöglicht. Beispiele für diese Vektoren sind pBR 322, pUC-Serie, M13 mp-Serie, pACYC 184 usw. In Abhängigkeit von der Methode des Einschleusens des gewünschten Gens in die Pflanzen können auch andere DNA-Sequenzen geeignet sein. Sollten Ti- oder Ri-Plasmide verwendet werden, z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle, so wird zumindest die rechte Begrenzung, häufig jedoch sowohl die rechte als auch die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Region an das einzuschleusende Gen angelagert. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv untersucht und ist in EP 120 516, Hoekama, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B. V. Alblasserdam, (1985), Kapitel V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 gut beschrieben. Sobald die eingeschleuste DNA in das Genom integriert ist, ist sie in der Regel dort stabil und verbleibt auch in Abkömmlingen der ursprünglich transformierten Zelle. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der in den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegen ein Biozid oder Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin usw. erzeugt. Der verwendete individuelle Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen aus Zellen ermöglichen, denen die eingeschleuste DNA fehlt.
Für das Einschleusen von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation unter Verwendung von Agrobacteria viele andere Verfahren zur Verfügung. Diese Verfahren umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA und die Elektroporation sowie ballistische Methoden und die Virusinfektion. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können ganze Pflanzen in einem geeigneten Medium, das Antibiotika oder Biozide für die Selektion enthält, regeneriert werden. Die so entstehenden Pflanzen können auf das Vorhandensein der eingeschleusten DNA hin untersucht werden. Bei der Injektion und Elektroporation werden keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derviate verwendet werden. Sollen jedoch aus diesen transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, so ist das Vorhandensein eines selektierbaren Markergens notwendig. Die transformierten Zellen wachsen in den Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5: 81-84). Diese Pflanzen können normal wachsen und mit Pflanzen gekreuzt werden, die die gleichen transformierten Gene oder andere aufweisen. Die resultierenden Hybriden weisen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften auf.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Plasmide eingeschleust und dadurch mit Steuerelementen für eine Expression in prokaryotischen Zellen kombiniert werden. Die Bildung einer translatierbaren RNA-Sequenz eines eukaryotischen Aminosäuretransporters aus Bakterien bedeutet trotz der beträchtlichen Unterschiede in den Membranstrukturen von Prokaryoten und Eukaryotischen außerdem überraschenderweise, daß Prokaryonten jetzt einen eukaryotischen Aminosäuretransporter mit einer Spezifität für bestimmte Substrate verwenden können. Das ermöglicht die Erzeugung von Bakterienstämmen, die für Untersuchungen der Eigenschaften des Transporters sowie seines Substrates verwendet werden könnten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Bakterien, die die erfindungsgemäßen Plasmide enthalten.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Plasmide eingeschleust werden, die durch Rekombination der DNA-Sequenzen in prokaryotischen oder eukaryotischen Systemen eine Mutagenese oder eine Sequenzmodifikation ermöglichen. Auf diese Weise kann die Spezifität des Aminosäuretransporters modifiziert werden. Somit kann die Transporterspezifität verändert werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Derivate oder Teile von Plasmiden, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten und für die Transformation der prokaryotischen und eukaryotischen Zellen verwendet werden können.
Durch Anwendung von Standardverfahren (siehe Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) kann ein Basenaustausch vorgenommen werden, oder natürliche oder synthetische Sequenzen können eingebracht werden. Für die Bindung von DNA- Fragmenten untereinander können Adapter oder Linker an die Fragmente angelagert werden. Des weiteren können Manipulationen zur Vorbreitung entsprechender Restriktionsschnittstellen oder zur Beseitigung überschüssiger DNA- oder Restriktionsschnittstellen vorgenommen werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen vorzunehmen sind, können in vitro Mutagenese, Primerreparatur, Restriktionen oder Ligationen angewendet werden. Als Analysenmethoden können im allgemeinen die Sequenzanalyse, die Restriktionsanalyse und andere biochemisch molekularbiologische Methoden angewendet werden. Nach der jeweiligen Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz abgespalten und an eine andere DNA-Sequenz gebunden werden. Jede Plasmidsequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Derivate oder Teile der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und Plasmide können auch für die Transformation prokaryotischer und eukaryotischer Zellen verwendet werden. Des weiteren können die DNA-Sequenzen der Erfindung nach Standardverfahren für die Isolation ähnlicher Sequenzen im Genom verschiedener Pflanzenarten verwendet werden, die auch für Aminosäure- oder andere Oligosaccharid-Transportermoleküle codieren. Mit diesen Sequenzen können Konstrukte für die Transformation von Pflanzenzellen hergestellt werden, die den Transportprozeß in transgenen Pflanzen modifizieren.
Um verwandte DNA-Sequenzen spezifizieren zu können, müssen zunächst Genbibliotheken erstellt werden, die für den Gengehalt einer Pflanzenart oder für die Genexpression in einer Pflanzenart repräsentativ sind. Erstere sind Genombibliotheken, während letztere cDNA-Bibliotheken sind. Aus diesen können die verwandten Sequenzen unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen als Sonden isoliert werden. Sobald das verwandte Gen identifiziert und isoliert wurde, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine möglich.
Um die Beispiele zu verstehen, die die Grundlage für diese Erfindung bilden, werden zunächst alle Verfahren, die für diese Tests erforderlich und an sich bekannt sind, aufgeführt:

1. Klonierungsverfahren

Für die Klonierung in E. coli wurde der Vektor pBluescriptSK (Short et al., 1988, Nucl Acids Res 16: 7583-7600) verwendet.
Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291) verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstrukte in den binären Vektor pBIN-Hyg kloniert.

2. Bakterien- und Hefestämme

Für den Vektor pBluescriptSK sowie für die PBinAR-Konstrukte wurde der E. coli- Stamm XL1blue verwendet (Bullock et al., 1987, Biotechniques, 5, 376-378).
Als Ausgangsstamm für die Expression der cDNA-Bibliothek in Hefe wurde der Hefestamm 22574d (Jauniaux et al., 1987, Eur J Biochem 164: 601-606) verwendet.
Die Transformation der Plasmide in Kartoffelpflanzen wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 durchgeführt (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12: 8711-8720).

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer von DNA in die Agrobacteria erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res 16: 9877). Die Plasmid-DNA des transformierten Agrobacterium wurde nach der Methode von Birnboim und Doly isoliert (1979, Nucl Acids Res 7: 1513-1523) und mittels Gelelektrophorese nach einer entsprechenden Restriktionsspaltung analysiert.

4. Pflanzentransformation

Zehn kleine mit einem Skalpell verletzte Blätter einer sterilen Kartoffelkultur wurden in 10 ml eines MS-Mediums mit 2% Aminosäure eingebracht, das 30-50 ul einer unter Selektionsbedingungen durchgeführten Übernachtkultur von Agrobacterium unter Selektionsbedingungen durchgeführten Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens enthält. Nach 3-5-minütigem leichten Schütteln wurden die Blätter auf ein MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l, Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Gibberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bactoagar gelegt. Nach einer einwöchigen Inkubation bei 25ºC und 3000 Lux war die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.

5. Hinterlegung

Die folgenden Plasmide und Hefestämme wurden in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Deutschland, am 12.6.1992 hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid pPPP1-20 (DSM 7129)
Plasmid pBinPPP1-20 (DSM 7130)

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt Plasmid pPPP1-20, das die Sequenz Seq-ID Nr. 1 enthält. Die dünne Linie entspricht der Sequenz von pBluescriptSK. Die dickere Linie stellt das cDNA-Insert dar. Die Schnittstellen der Inserts werden gezeigt.
Fig. 2 zeigt die Aufnahme von ¹&sup4;C-Prolin aus dem Medium.
no = Aufnahmezeitraum ohne Kompetitor
proline = Zeitraum mit vierfachem Überschuß an nichtmarkiertem Prolin
citrulline = Zeitraum mit vierfachem Überschuß an nichtmarkiertem Citrullin
GABA = Zeitraum mit dem vierfachen Überschuß an Gammaaminobuttersäure
time = Zeit in Sekunden
cpm = Zerfall pro Minute
Fig. 3 zeigt Plasmid pAAP2, das die Sequenz Seq-ID Nr. 2 enthält. Die dünne Linie entspricht der Sequenz von pBluescriptSK. Die dickere Linie stellt das cDNA-Insert dar. Die Schnittstellen der Inserts werden gezeigt.
Fig. 4 zeigt einen Kompetitionsversuch mit der Hefelinie 22574d: :AAP2, wobei die Aufnahme von ¹&sup4;C-markiertem L-Prolin aus dem Medium in Gegenwart eines vierfachen Überschusses anderer Aminosäuren oder ihrer Analoga gemessen wird. Neben den Standardabkürzungen für Aminosäuren als Dreibuchstabencode werden auch folgende verwendet:
Cit = Citrullin; D-Pro = D-Prolin; OH-Pro = Hydroxyprolin und A2C = Azetidin-2-Carbonsäure.
Fig. 5 zeigt einen Kompetitionsversuch mit der Hefelinie JT16: :AAP2, wobei die Aufnahme von ¹&sup4;C-markiertem L-Histidin aus dem Medium bei Vorliegen eines zehnfachen Überschusses anderer Aminosäuren oder ihrer Analoga gemessen wird. Neben den Standardabkürzungen für Aminosäuren als Dreibuchstabencode werden auch folgende verwendet:
Cit = Citrullin; Orn = Ornithin; Can = Canavanin und NH&sub4; = Ammonium.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Klonierung und die Identifizierung sowie die Wirkungsweise und die Anwendung eines pflanzlichen Aminosäuretransporters.

Beispiel 1

Klonierung der cDNA eines pflanzlichen Aminosäuretransporters

Für die Komplementierung der Prolintransportmutation des Hefestammes 22574d (Jauniaux et al., 1987, Eur J Biochem 164: 601-606) und/oder der Histidinsynthese und der Transportmutation des Stammes JT16 (Tanaka & Fink, 1985, Gene 38: 205-214) wurde eine cDNA junger Keimlinien von Arabidopsis thallana (Zweiblattstadium) im Hefeexpressionsvektor pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291) verwendet, der von Minet bereitgestellt wurde (Minet et al., 1992, Plant J 2: 417-422). Etwa 1 ug des Vektors mit dem cDNA-Insert wurden in den Hefestamm 22574d und/oder JT16 nach der Methode von Dohmen et al. transformiert (1991, Yeast 7: 691-692). Hefetransformanten, die in Medien mit 4 mM Prolin als einziger Stickstoffquelle oder in Medien mit 6 mM Histidin wachsen konnten, wurden vermehrt. Aus den Linien wurde Plasmid-DNA nach Standardmethoden hergestellt. Klone, die diese spezifische Mutation komplementieren konnten, enthielten Plasmide mit einer ähnlichen Restriktionsform des cDNA-Inserts. Ihre Größe schwankte zwischen 1,6 und 1,7 kb.

Beispiel 2

Sequenzanalysen des cDNA-Inserts des Plasmids pFL61-ppp1-20

Aus einer Hefelinie PPP1-20, die in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 gewonnen wurde, die, trotz der 22574d-Mutation mit Prolin als einziger Stickstoffquelle wachsen konnte, wurde das Plasmid pFL61-ppp1-20 isoliert und sein cDNA-Insert als NotI-Fragment hergestellt und in den Vektor pBluescriptSK kloniert. Auf diese Weise erhielt man das Plasmid pPPP1-20 (siehe Fig. 1). Unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide wurde das Insert nach der Methode von Sanger et al. (1977, Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467) sequenziert. Diese Sequenz wird oben angeführt.
In ähnlicher Weise wurde aus einer Hefelinie, die trotz der Doppelmutation his4/hip1 in einem Medium mit Histidinzusatz gezüchtet werden konnte, das Plasmid pFL61- aap2 isoliert, dessen Insert ebenfalls als NotI-Fragment in pBluescriptSK kloniert wurde. Das resultierende Plasmid pAAP2 wurde sequenziert und die Sequenz (Seq ID-Nr. 2) wird oben angeführt. Das Plasmid pAAP2 hat eine ähnliche Struktur wie pPPP1-20 (siehe Fig. 1), weist jedoch anstelle des Inserts Seq-ID Nr. 1 das Insert Seq-ID Nr. 2 (siehe Fig. 3) auf.

Beispiel 3

Untersuchungen der Aufnahme in die Hefelinien PPP1-20 und AAP2 mit ¹&sup4;C- markiertem Protein

Die Hefelinien 22574d: :PPP1-20 und 22574d: :AAP2, die in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 gewonnen wurden, wurden in flüssigem Medium gezüchtet, bis die Kultur die logarithmische Phase erreichte. Nach dem Zentrifugieren der Kultur werden die Zellen gewaschen und in 100 mm Tris/HCl, pH 4,5, 2 mM MgCl&sub2; und 0,6 M Sorbit aufgenommen. Etwa 100 ul der Suspension wurden einer Lösung aus 0,5 mM L- Prolin plus 1 uCi ¹&sup4;Cmarkiertem L-Prolin in 100 ul des gleichen Puffers zugesetzt. Die Aufnahme der markierten Aminosäure wurde nach dem Verfahren gemessen, das von Cirillo (1989, Meth Enzymol 174: 617-622) beschrieben wurde. Die Aufnahme der markierten Aminosäure wurde, einerseits in Coinkubation mit der Protein-modifizierenden Substanz Diethylpyrocarbonat verglichen, die ein Inhibitor des Aminosäuretransportes in den Membransvesikeln von Beta vulgaris ist- und andererseits in Coinkubation mit anderen Protein-modifizierenden Substanzen. Der berechnete Rückgang wird in Tabelle I und/oder III gezeigt. Ein Kompetitionsversuch mit verschiedenen Aminosäuren und Analoga, bei dem die Spezifität des Transporters abgelesen werden konnte, wird in Tabelle II für PPP1-20 und in Fig. 4 für AAP2 gezeigt. Ein analoger Versuch, bei dem eine Kompetition für die Histidinaufnahme in der Linie JT16: :AAP2 untersucht wurde, wird im Beispiel 5 beschrieben. Der Zeitraum für PPP1-20 wird in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 4

Transformation von Pflanzen mit einem Konstrukt für die Überexpression der codierenden Region von Aminosäuretransportern

Aus dem Plasmid pPPP1-20, das als Insert die cDNA für den Aminosäuretransporter aus Arabidopsis enthält, wurde ein inneres Fragment des Inserts nach BamHI- Spaltung isoliert und in die BamHI-Schnittstelle aus pAJ, das zunächst mit dem BamHI-Enzym linearisiert wurde, kloniert. Dann wurde die cDNA als EcoRI/HindIII- Fragment aus pA7 hergestellt und in den Vektor pBIN-HYG kloniert. Nach der Transformation durch Agrobacteria wurde sie zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffeln eingefügt.
Zehn unabhängig erhaltene Transformanten, bei denen das Vorhandensein des intakten, nicht umgelagerten chimären Gens nach der Southern-Blot-Analyse nachgewiesen wurde, wurden auf Modifikationen des Aminosäure- und Stickstoffgehalts hin untersucht. Außerdem wurden die Aminosäuresynthese, die Geschwindigkeit der Photosynthese und der Transport untersucht.

Beispiel 5

Untersuchungen der Aufnahme von ¹&sup4;C-markiertem Histidin in die Hefelinie AAP2

Die Hefelinie JT16: :AAP2, die in ähnlicher Wiese wie im Beispiel 1 gewonnen wurde, wurde im flüssigen Medium gezüchtet, bis die Kultur die logarithmische Phase erreichte. Nach dem Zentrifugieren der Kultur wurden die Zellen gewaschen und in 10 mm Tris/HCl, pH 4,5, 2 mm MgCl&sub2; und 0,6M Sorbit aufgenommen. Etwa 100 ml der Suspension wurden einer Lösung von 0,5 mm L-Histidin plus 1 uCi ¹&sup4;C- markiertem L-Histidin in 100 ul des gleichen Puffers zugesetzt. Die Aufnahme der markierten Aminosäure wurde nach der von Cirillo (1989, Meth Enzymol 174: 617- 622) beschriebenen Methode gemessen. Die Aufnahme der markierten Aminosäure wurde in einem Kompetitionsversuch mit der verschiedener Aminosäuren und Analoga in 10-fachem Überschuß verglichen. Die Verhältnisse werden in Fig. 5 gezeigt.

Tabelle I

Die Hemmung des Aminosäuretransportes in den Hefestämmen 22574d: :PPP1-20 durch Protein-modifizierende Substanzen

% des Transport ohne Inhibitor

0,1 mM DEPC (Diethylpyrocarbonat) 65
10 uM CCCP (Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon) < 3
10 uM 2,4 DNP (Dinitrophenol) < 3
1 mM Natriumarsenat 35
10 uM Antimycin A 29
500 uM PCMBS (p-Chlormercuribenzolsulfonsäure) 78 Tabelle II Kompetition durch den ein-, vier- und zehnfachen Überschuß von Aminosäuren und Analoga in den Hefestämmen 22574d: :PPP1-20

Tabelle III

Hemmung des Aminosäuretransports im Hefestamm JT16: :AAP2 durch Protein- modifizierende Substanzen
% des Transports ohne Inhibitor (%)
1 mM DEPC (Diethylpyrocarbonat) 3,1 ± 1,6
10uM CCCP (Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon) 15,6 ± 2,1
10 uM 2,4 DNP (Dinitrophenol) 7,6 ± 1,6

Claims

1. Aus Pflanzen abgeleitete DNA-Sequenzen, die die codierende Region eines Aminosäuretransporters für den Membrantransport oder Teile oder Derivate davon enthalten, die durch Integration in ein Pflanzengenom die Bildung von RNA und durch Translation dieser RNA oder durch einen von dieser RNA ausgehenden Antisense-Effekt die Expression einer neuen Aminosäuretransporter-Aktivität in den Pflanzenzellen oder die Unterdrückung einer endogenen Aminosäuretransporter-Aktivität ermöglichen.

2. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotid-Sequenz gemäß Seq. ID Nr. 1 enthält.

3. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotid-Sequenz gemäß Seq. ID Nr. 2 enthält.

4. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.

5. Plasmid pPPP1-20 (DSM 7129).

6. Plasmid pAAP2 mit der Struktur eines Plasmids pPPP1-20, das als Insert Seq. ID Nr. 2 anstelle von Seq. ID Nr. 1 enthält.

7. Plasmid pBin PPP1-20 (DSM 7130).

8. Verwendung des Plasmids gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 oder von Derivaten oder Teilen davon, die Integration in ein Pflanzengenom die Bildung von RNA und durch Translation dieser RNA oder durch einen von dieser RNA ausgehenden Antisense-Effekt die Expression einer neuen Aminosäuretransporter-Aktivität in den Pflanzenzellen oder die Unterdrückung einer endogenen Aminosäuretransporter-Aktivität ermöglichen, zur Transformation prokaryotischer und eukaryotischer Zellen.

9. Pflanzenwirtszelle, in welche eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Derivate davon mit pflanzlicher Aminosäurentransporter-Aktivität eingeschleust wurden.

10. Bakterien, welche eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthalten.

11. Verwendung der DNA-Sequenz des Aminosäuretransporters gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung von Plasmiden mit veränderter Transporterspezifität.

12. Verwendung der DNA-Sequenz des Aminosäuretransporters gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Isolierung ähnlicher Sequenzen aus dem Genom der Pflanze, die ebenfalls Aminosäuretransporter-Moleküle codieren.

13. Verwendung der DNA-Sequenz des Aminosäuretransporters gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Expression translatierbarer mRNA, die die Synthese eines Aminosäuretransporters in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ermöglicht.

14. Verwendung der DNA-Sequenz des Aminosäuretransporters gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Expression einer nicht-translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Aminosäuretransporters in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen behindert.

15. Verwendung der DNA-Sequenz des Aminosäuretransporters gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in Kombination mit Steuerelementen für eine Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen.

16. Hefestämme, die DNA-Sequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthalten.

17. Verwendung von Hefestämmen ohne ein Aminosäure-Aufnahmesystem zur Identifizierung eines pflanzlichen Aminosäuretransporters durch Komplementierung der Hefemutation.