DE4036288A1

DE4036288A1 - Verfahren und vorrichtung fuer immunologische tests unter nutzung messbarer teilchen

Info

Publication number: DE4036288A1
Application number: DE19904036288
Authority: DE
Inventors: Satoshi Takahashi; Kazunori Okano; Kenji Yasuda; Daizo Tokinaga; Kazumichi Imai
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1989-11-15
Filing date: 1990-11-14
Publication date: 1991-05-23

Description

Die Erfindung betrifft Immunologietechnologie, wie sie hauptsächlich für Bluttests oder klinische Tests verwendet wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung für immunologische Tests unter Nutzung meß barer Teilchen.

Als immunologisches Testverfahren unter Nutzung meßbarer Teilchen ist ein solches bekannt, bei dem man Latexteilchen, an deren Oberfläche ein Antikörper gebunden ist, mit einem Antigen reagieren läßt. Mit Hilfe von Messungen zur Absorp tions- oder Streuintensität wird dann der Agglutinations zustand der Teilchen bestimmt, der durch die Antigen/Anti körper-Reaktion gebildet wurde (KENSA-TO-GIJUTSU (Test and Technique), Vol. 16, Nr. 7, S. 607 (1988), BUNSEKI (Analy sis), Nr. 9, S. 605 (1987)).

Da die Teilchenagglutination nicht gleichförmig ist, ist die Genauigkeit beim Berechnen der Antigenkonzentration beim Nutzen dieser Technik nicht gut, wenn der Mittelwert für die gesamte Reaktionslösung bestimmt werden soll. Demgemäß war es schwierig, die Menge in extrem niedriger Konzentration vorliegendem Antigen quantitativ zu bestimmen.

Es wurde daher ein Verfahren entwickelt, bei dem die Reak tionslösung durch eine Durchflußzelle geschickt wird und die Streu- oder Fluoreszenzintensität von agglutinierten Teil chen gemessen wird, die durch die Durchflußzelle fließen (japanische Patentveröffentlichung 62-81 567; J. Immunol. Methods, Vol. 18, S. 33 (1977)). Bei diesem Verfahren kann jede Größe agglutinierter Teilchen gemessen werden, wodurch die Genauigkeit beim Berechnen der Antigenkonzentration ver bessert werden kann. Es wurde auch ein Verfahren entwickelt, bei dem eine Antigen/Antikörper-Reaktion unter Nutzung fluo reszierender Teilchen herbeigeführt wird und das Agglutina tionsmuster einer Bildverarbeitung unterworfen wird. Es wird dann der Agglutinationszustand untersucht, um die Antigen konzentration zu berechnen (japanische Patentveröffentli chung 64-35 373).

Die vorstehend beschriebenen herkömmlichen Techniken nutzen zum Herbeiführen von Agglutination die Tatsache, daß ein Antikörper (oder ein Antigen) auf der Oberfläche eines La texteilchens mit einem Antigen (bzw. Antikörper) in einem homogenen System reagiert. Da es in Bereichen mit Antigen im Übermaß nicht zu einer Antigen/Antikörper-Reaktion kommt, ist das sogenannte Prozonen-Phänomen unvermeidbar. Es ist auch schwierig, den Einfluß streuender Teilchen, Pigmente und dergleichen voll auszuschließen, die in der Probenlösung vorhanden sind. Darüber hinaus reagiert ein Antigen nicht immer mit einem Antikörper in einem Verhältnis 1 : 1. Bei den herkömmlichen Techniken zum Zählen der Anzahl agglutinierter Teilchen tritt daher ein Problem dahingehend auf, daß es vor allem dann zu Fehlern kommt, wenn Daten in einem Bereich ex trem niedriger Konzentration gemessen werden.

Zum Beseitigen des Einflusses durch das Prozonen-Phänomen oder durch gleichzeitig vorhandene Substanzen sind hetero gene Reaktionen von guter Wirkung, wie sie in der japani schen Patentveröffentlichung 56-1 51 357 beschrieben sind. Bei diesen Verfahren ist jedoch nicht darauf abgehoben, Tests mit hoher Empfindlichkeit zu erzielen; jedoch ermög lichen es die Methoden, mehrere Stoffe auf einfache Weise zu bestimmen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bei der her kömmlichen Technik aufgetretenen und oben beschriebenen Pro bleme zu lösen und ein Verfahren und eine Vorrichtung für immunologische Tests unter Nutzung meßbarer Teilchen anzuge ben.

Charakteristisch für die vorliegende Erfindung ist es, ein Reaktionsgefäß zu verwenden, mit dem Antikörper (oder Anti gene), die spezifisch für ein zu analysierendes Antigen (bzw. einen zu analysierenden Antikörper) sind, unbeweglich verbunden werden, Markierteilchen zu verwenden, an die Anti körper (bzw. Antigene) gebunden sind, die spezifisch für das zu analysierende Antigen (bzw. den zu analysierenden Anti körper) sind, Antigene (oder Antikörper) in einer Probenlö sung an die unbeweglich am Reaktionsgefäß festgehaltenen Antikörper (bzw. Antigene) zu binden und durch eine Anti gen/Antikörper-Reaktion die in der Probenlösung befindlichen Teilchen mit den auf ihnen befindlichen Antikörpern (bzw. Antigenen) an die Antigene (bzw. Antikörper) im Reaktionsge fäß zu binden. Dadurch werden die Teilchen am Reaktionsgefäß festgehalten. Es wird dann die Anzahl der festgehaltenen Teilchen gezählt.

Es ist charakteristisch für die erfindungsgemäße Vorrich tung, ein Mikroskop zu verwenden, um ein vergrößertes Bild des Reaktionsgefäßes zu erhalten, in dem die Antigen/Anti körper-Reaktion ausgeführt wurde, und eine Fernseh(TV)-Kame ra zum Fotografieren des durch das Mikroskop vergrößerten Bildes und einen Bildprozessor zu verwenden, mit dem das von der TV-Kamera fotografierte Bild einer Bildverarbeitung unterzogen wird, und die Anzahl der im Bild vorhandenen Mar kierteilchen zu zählen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von durch Figuren veranschaulichten Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Blockdiagramm einer Vorrichtung zum Ausführen immunologischer Tests unter Nutzung meßbarer Teilchen;

Fig. 2 ein Diagramm, bei dem die Anzahl festgehaltener Teilchen über der Konzentration eines Antigens in einer Pro benlösung dargestellt ist;

Fig. 3 schematischer stark vergrößerter Teilquerschnitt durch die Wand eines Reaktionsgefäßes mit Antikörpern, Anti genen und Markierteilchen;

Fig. 4 ein Blockdiagramm gemäß Fig. 1, jedoch für eine Vorrichtung mit einem austauschbaren Filter zum Messen bei unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen;

Fig. 5 ein Histogramm zum Veranschaulichen von Messungen, wie sie mit der Vorrichtung gemäß Fig. 4 erzielbar sind;

Fig. 6 eine schematische Seitenansicht entsprechend der von Fig. 3, jedoch zum Erläutern eines anderen Ausführungs beispiels;

Fig. 7 ein schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung, die mit einem Laser arbeitet;

Fig. 8 ein Diagramm, wie es mit der Vorrichtung gemäß Fig. 7 aufgenommen werden kann, bei dem die Streuintensität von Laserlicht über der Konzentration von Antigen in einer Probenlösung dargestellt ist.

Markierteilchen, wie oben erwähnt, können aus einem Polymer bestehen, das einen fluoreszierenden Stoff aufweist. Die spezifische Dichte liegt etwa im Bereich 1 bis 1,4. Der Teilchendurchmesser ist im wesentlichen 3 µm oder weniger, vorzugsweise im Bereich zwischen 0,1 bis 1 µm. Um mehrere Antigene oder Antikörper analysieren zu können, werden meh rere voneinander verschiedene Markierteilchen verwendet, die Antikörper oder Antigene binden, die für ein jeweiliges An tigen bzw. einen jeweiligen Antikörper spezifisch sind. Wenn Teilchen mit unterschiedlichen Durchmessern oder/und unter schiedlicher Fluoreszenzwellenlänge des fluoreszierenden Stoffes als unterschiedliche Markierteilchen verwendet wer den, können die Antigene oder Antikörper unabhängig vonein ander gezählt werden.

Um einen Analysefehler auszuschließen, wie er aufgrund nichtspezifischer Adsorption von Teilchen am Reaktionsgefäß erfolgt, d. h. Adsorption, die nicht durch eine Antigen/An tikörper-Reaktion bedingt ist, werden Bezugsteilchen, an die die spezifischen Antikörper (bzw. Antigene) nicht gebunden sind, in Kontakt mit dem Reaktionsgefäß gebracht, zusätzlich zu den Markierteilchen, an die die Antikörper (bzw. Antige ne) gebunden sind, die spezifisch für die zu analysierenden Antigene (bzw. Antikörper) sind. Die vom Reaktionsgefäß festgehaltenen Markierteilchen und Bezugsteilchen werden un abhängig voneinander gezählt. Zähldaten für die Bezugsteil chen werden als Schätzwert für nichtspezifische Adsorption der Markierteilchen verwendet. Das heißt, daß diejenigen Daten, die durch Abziehen des Schätzwertes vom Zählwert für die Markierteilchen erhalten werden, als genaue analytische Daten für die zu analysierenden Antigene (bzw. Antikörper) verwendet werden. Es ist erforderlich, daß die Markierteil chen unabhängig von den Bezugsteilchen gezählt werden. Daher müssen die einen Teilchen fluoreszierend sein oder, wenn beide Teilchen fluoreszieren, müssen die Fluoreszenzwellen längen voneinander unterschiedlich sein. Die beiden Teilchen können auch voneinander unterschiedliche Durchmesser aufwei sen. In diesem Fall ist das Verhältnis der Teilchendurchmes ser vorzugsweise nicht größer als Zwei.

Anschließend wird die Erfindung anhand verschiedener Ausfüh rungsbeispiele beschrieben, bei denen α-Fetoprotein (AFP) als zu analysierendes Antigen verwendet wird.

Beispiel 1 Herstellen festgehaltener Antikörper

Es wird eine Mikrotiterplatte als Reaktionsgefäß verwendet, und ein Antikörper für AFP wird auf der inneren Oberfläche der Platte festgehalten. 50 µl einer Lösung von antihuman- α-Fetoprotein-Antikörper (Antihuman AFP-Antikörper) mit einer Konzentration von 10 µg/ml werden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben. Es läuft dann für 2 Stunden eine Reaktion zum Festhalten der Anti hum AFP-Antikörper ab.

Herstellen von Markierteilchen

Acrylteilchen mit 0,76 µm Durchmesser mit Carboxylgruppen an ihrer Oberfläche werden als Markierung verwendet. Anti human AFP-Antikörper werden auf der Oberfläche der Teilchen festgehalten (festgehaltene Menge: 0,76 mg/g). Genauer ge sprochen, werden antihuman AFP-Antikörper mit 2-Mercaptol ethanol behandelt. Die vorstehend beschriebenen Teilchen werden mit 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid hydrochlorid, dann mit 1,8-Diamino-3,6-Dioxaoctan und schließlich mit n-(τ-Maleimidobutyryloxi)-Succinimid behan delt. Wenn die behandelten antihuman AFP-Antikörper mit den so behandelten Teilchen zur Reaktion gebracht werden, ist es möglich, die Antikörper an den Teilchen festzuhalten.

Weiterer Reaktionsablauf

Es werden 20 µl eines Probenserums in das Reaktionsgefäß mit festgehaltenen antihuman AFP-Antikörpern gebracht. Dann läuft für 2 Stunden eine Reaktion zum Einfangen des zu ana lysierenden Antigens im Reaktionsgefäß ab. Anschließend wird das Reaktionsgefäß mit einem Phosphatpuffer mit 0,5% BSA (0,5% BSA-PBS) gewaschen, um Antigene usw. auszuwaschen, die nicht reagiert haben. Anschließend werden 100 µl einer Suspension von Markierteilchen mit einer Teilchenkonzentra tion von 0,1% in das Reaktionsgefäß gegeben, in dem die Suspension für 5 Stunden in Ruhe verbleibt, um eine Reaktion herbeizuführen. Bei der Reaktion werden die Teilchen an das Human-AFP gebunden, das im Reaktionsgefäß festgehalten wird. anschließend wird das Reaktionsgefäß sacht mit 0,5% BSA-PBS gewaschen, um überschüssige Teilchen zu entfernen.

Es ist empfehlenswert, eine Teilchenkonzentration im Bereich von 0,01% bis 1% der Markierteilchen in der Suspension zu verwenden. Wenn Polystyrolteilchen mit relativ kleiner spe zifischer Dichte verwendet werden, liegt die Teilchenkonzen tration geeigneterweise im Bereich von 0,05% bis 5%. Auch für andere Teilchen wird die Teilchenkonzentration abhängig vom spezifischen Gewicht der Teilchen, dem Teilchendurchmes ser usw. bestimmt.

Zählen von Teilchen

Eine Vorrichtung zum Zählen der Anzahl von Teilchen, die in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte mit flachem Boden festgehalten werden, ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Die Vorrichtung weist ein umgekehrtes Mikroskop 1, eine TV-Kamera 2, einen Bildprozessor 3, einen Fernsehmonitor 4 und eine Ausgabeeinrichtung 5 auf. Jede Vertiefung 6 der Mikro titerplatte, in der Teilchen festgehalten werden, wird auf den Tisch des Mikroskops 1 gebracht und mikroskopische Bil der von Teilchen 7 in der Vertiefung 6 werden mit der TV-Kamera 2 erzeugt. Als Mikroskopbilder können außer gewöhnli chen Durchleuchtungsbildern auch Phasenkontrast- oder Diffe renzinterferenzbilder verwendet werden. Beim Ausführungsbei spiel erfolgt die Beobachtung mit Hilfe von Phasenkontrast bildern. Das Ausgangssignal von der TV-Kamera 2 wird durch den Bildprozessor 3 verarbeitet. Zunächst werden die Bilder in 8-Bit-Digitaldaten umgewandelt und in einem Bildspeicher angesammelt. Dieser Ablauf erfolgt für 64 Rahmen, um das Signal/Rausch-Verhältnis des Bildes zu verbessern. Auf Grundlage der erhaltenen Bilddaten wird die Anzahl von Teil chen ausgezählt. Im Beispielsfall wird zum Ausschließen eines Zählfehlers aufgrund von Staubteilchen und dergleichen die Größe jedes Teilchens gemessen und nur diejenigen Teil chen mit einem Durchmesser von 0,6 µm bis 0,9 µm werden ge zählt. Der Teilchendurchmesserbereich für die zu zählenden Teilchen wird bestimmt, indem Unebenheit der benutzten Teil chen und Aberration zwischen dem Ort des Brennpunkts des Mikroskops und dem Ort der vorhandenen Teilchen berücksich tigt wird.

Die Beziehung zwischen der Konzentration von Human-AFP und der Anzahl festgehaltener Teilchen gemäß dem Ausführungsbei spiel ist in Fig. 2 dargestellt. Wenn das dortige Diagramm als Kalibrierkurve verwendet wird, läßt sich eine unbekannte Konzentration von Human-AFP in einer Serumprobe quantitativ bestimmen.

Beispiel 2

Das folgende Ausführungsbeispiel zeigt gleichzeitiges Messen mehrerer Arten von Antigenen.

Herstellen festgehaltener Antikörper

Es wird eine Mikrotiterplatte als Reaktionsgefäß verwendet, und Antikörper, die spezifisch für AFP und CEA sind, werden an der inneren Oberfläche der Mikrotiterplatte festgehalten. Es werden 50 µl einer Lösung von antihuman AFP-Antikörper mit einer Konzentration von 10 µg/ml und 25 µl einer Lösung von Anti-CEA-Antikörper mit einer Konzentration von 10 µg/ml in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben. Dann wird unter zwischenzeitlichem Rühren für 2 Stunden eine Reaktion ausgeführt, um die antihuman AFP-Anti körper und die Anti-CEA-Antikörper an der Oberfläche jeder Vertiefung in gemischtem Zustand festzuhalten.

Herstellen von Markierteilchen

Feine fluoreszente Latexteilchen mit Carboxylgruppen an ih ren Oberflächen werden als Markierung verwendet. Antihuman AFP-Antikörper werden dazu gebracht, daß sie auf der Ober fläche feiner Teilchen mit einem Durchmesser von 0,5 µm und einer Fluoreszenzpeakwellenlänge von 540 nm festhalten, was auf ähnliche Weise erfolgt wie bei Beispiel 1 (festgehaltene Menge: etwa 0,7 mg/g). Diese Teilchen sind erste Markier teilchen. Darüber hinaus werden Anti-CEA-Antikörper dazu ge bracht, an der Oberfläche feiner Teilchen mit einem Durch messer von 0,5 µm und einer Fluoreszenzpeakwellenlänge von 850 nm festzuhalten, was wiederum ähnlich wie bei Beispiel 1 erfolgt (festgehaltene Menge: etwa 0,7 mg/g). Diese Teilchen sind zweite Markierteilchen.

Weiterer Reaktionsablauf

Nachdem 50 µl Serumprobe mit AFP und CEA in jede Vertiefung des Reaktionsgefäßes für unbeweglich festzuhaltende anti human AFP- und Anti-CEA-Antikörper gebracht sind, läuft für 2 Stunden eine Reaktion ab, um die zu analysierenden Anti gene (AFP und CEA) in jeder Vertiefung des Reaktionsgefäßes festzuhalten. Dann wird das Reaktionsgefäß mit einem Phos phatpuffer mit 0,5% BSA (0,5% BSA-PBS) gewaschen, um Anti gene usw. zu entfernen, die nicht reagiert haben.

Anschließend wird eine Mischung von 60 µl einer Suspension der ersten Markierteilchen mit einer Teilchenkonzentration von 0,5% und 60 µl einer Suspension von zweiten Markier teilchen mit einer Teilchenkonzentration von 0,5% in jede Vertiefung gegeben. Sie verbleibt dort für 5 Stunden, um zur Reaktion zu führen. Bei der Reaktion werden die ersten und zweiten Markierteilchen an das Human-AFP bzw. das CEA gebun den, wie sie in jeder Vertiefung des Reaktionsgefäßes fest gehalten werden. Anschließend wird das Reaktionsgefäß sacht mit 0,5% BSA-BPS gewaschen, um überschüssige Teilchen zu entfernen.

Der Bindungszustand zwischen den Antigenen und den Markier teilchen ist in Fig. 3 veranschaulicht. Human-AFP 24 und CEA 25, wie sie in der Serumprobe vorhanden sind, binden an an tihuman AFP-Antikörper 22 bzw. Anti-CEA-Antikörper 23, wie sie in jeder Vertiefung 6 des Reaktionsgefäßes festgehalten werden. Darüber hinaus binden erste Markierteilchen 8 mit einem Durchmesser von 0,5 µm und einer Fluoreszenzpeakwel lenlänge von 540 nm an Human-AFP 24 über antihuman AFP-Anti körper 26. Zweite Markierteilchen 9 mit einem Durchmesser von 0,5 µm und einer Fluoreszenzpeakwellenlänge von 580 nm binden an CEA 25 über Anti-CEA-Antikörper 28.

Zählen von Teilchen

Fig. 4 zeigt schematisch eine Einrichtung zum Zählen von Teilchen, wie sie in jeder Vertiefung 6′ einer Mikrotiter platte mit flachem Boden festgehalten werden. Die Einrich tung verfügt über ein umgekehrtes Mikroskop 1′, eine TV-Kamera 2 zum Aufnehmen des Mikroskopbildes, einen Bildpro zessor 3 zum Analysieren von Bildern, eine Filterwechselein richtung 13 zum Wechseln eines Filters zum Messen von Fluo reszenzlicht vom Fluoreszenzmikroskop, abhängig vom zu ana lysierenden Stoff, eine Steuereinrichtung 14 zum Steuern des Bildprozessors 3 und der Filterwechseleinrichtung 13, einen TV-Monitor 4 und eine Ausgabeeinrichtung 5 zum Ausgeben der Ergebnisse der Verarbeitung.

Die Mikrotiterplatte mit den Vertiefungen 6′, in denen Teil chen festgehalten werden, wird auf den Tisch des Mikroskops 1′ gestellt, und Mikroskopbilder von Teilchen 8 und 9 in den Vertiefungen 6′ werden mit der TV-Kamera 2 aufgenommen. Die Bilder werden einer Bildverarbeitung unterzogen, in der die verschiedenen Teilchenarten unterschieden werden.

Zunächst werden die Mikroskopbilder für die Fluoreszenz bei 540 nm ausgewertet. Dazu wird mit der Filterwechseleinrich tung 13 ein Interferenzfilter am Mikroskop angeordnet, das Licht von 540 nm durchläßt, aber Licht anderer Wellenlängen sperrt. Mit Hilfe der Filterwechseleinrichtung 13 dabei er zielte Bilder werden mit der TV-Kamera 2 aufgenommen, die Bildintensität wird in 8-Bit-Digitaldaten umgewandelt, und die Daten werden in einem Bildspeicher des Bildprozessors 3 angesammelt. Dieser Ablauf wird für 64 Rahmen ausgeführt, um das Signal/Rausch-Verhältnis der Fluoreszenzbilder zu ver bessern. Auf Grundlage der Bilder wird für jedes Pixel der Ort gemessen, an dem der Fluoreszenzwellenlängenpeak auf tritt, und es wir die Intensität des Bereichs gemessen. Der Ort des Pixels mit dem Fluoreszenzwellenlängenpeak ent spricht einer Position, an der ein Teilchen vorhanden ist. Die Intensität ist ein Maß dafür, zu beurteilen, zu welcher Gruppe feiner Teilchen ein jeweiliges Teilchen gehört.

Anschließend wird das Mikroskopbild für die Fluoreszenzwel lenlänge von 580 nm ausgewertet. Mit Hilfe der Filterwech seleinrichtung 13 wird ein Interferenzfilter im Mikroskop angeordnet, das Licht von 580 nm durchläßt, aber Licht an derer Wellenlängen sperrt. Hierbei erhaltene Bilder werden von der TV-Kamera 2 aufgenommen, die Bildintensität wird in 8-Bit-Digitaldaten gewandelt und diese werden im Bildspei cher des Bildprozessors 3 angesammelt. Dieser Ablauf wird für 64 Rahmen auf ähnliche Weise wiederholt, wie oben ange geben, um das Signal/Rausch-Verhältnis der Fluoreszenzbilder zu verbessern. Mit Hilfe der Bilder werden der Ort eines Pixels mit dem Fluoreszenzwellenlängenpeak und die Intensi tät in diesem Bereich berechnet.

Durch Vergleichen der Fluoreszenzintensität bei 540 nm mit derjenigen bei 580 nm kann, wenn feine Teilchen vorhanden sind, entschieden werden, ob die Teilchen zur Gruppe der er sten oder der zweiten Teilchen gehören. Wenn die Fluores zenzintensität bei 580 nm stärker ist, sind die feinen Teil chen zweite Markierteilchen, was bedeutet, daß Antigen CEA gemessen wird. Durch Ausführen des Vergleichs für alle fei nen Teilchen im Bild lassen sich die Zahlen der ersten und zweiten Markierteilchen zählen, die Human-AFP bzw. CEA ent sprechen.

Zum quantitativen Bestimmen der Konzentration von Human-AFP oder CEA wird gemäß der Vorgehensweise des Ausführungsbei spiels eine Kalibrierkurve mit Hilfe einer Probenlösung be kannter Konzentration aufgenommen, und aus der Anzahl jewei liger Teilchen wird die Konzentration bestimmt.

Zum unterscheidbaren Zählen mehrerer der vorstehend genann ten Antigene können verschiedene Abänderungen neben dem Ver fahren ausgeführt werden, das unterschiedliche Fluoreszenz wellenlängen für die Markierteilchen verwendet, wie im vor stehend beschriebenen Beispiel 2 erläutert. Zunächst ist es möglich, Teilchen mit verschiedenen Durchmessern zu verwen den, auf denen Antikörper, die für das jeweils zu analysie rende Antigen spezifisch sind, festgehalten werden. Mit Hil fe der Teilchen werden mehrere Markierteilchen hergestellt. Zum Beispiel werden Teilchen von 0,5 µm Durchmesser und sol che von 0,75 µm Durchmesser hergestellt. An die erste Art von Teilchen wird ein Antikörper gebunden, der für das erste zu analysierende Antigen spezifisch ist. An die zweite Art von Teilchen wird ein Antikörper gebunden, der für das zwei te zu analysierende Antigen spezifisch ist. So werden die ersten und zweiten Markierteilchen hergestellt. In jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte werden nach Ablauf der Reaktion mit Teilchen dieser ersten und zweiten Markierteil chengruppe die zwei Arten von Markierteilchen getrennt von einander gezählt. Eine Technik besteht darin, die Teilchen aufgrund ihrer Größe voneinander zu unterscheiden und zu zählen. Eine andere Technik geht dahin, die Teilchen zu zäh len, nachdem ein Bild mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops aufgenommen wurde, wie in Fig. 4 dargestellt, wobei jedoch fluoreszierende Markierteilchen mit gleicher Fluoreszenzwel lenlänge verwendet werden. In diesem Fall unterscheiden sich die zwei Arten von Markierteilchen durch unterschiedliche Fluoreszenzintensität, was durch den Unterschied der Teil chendurchmesser bedingt ist. Der Bildprozessor berechnet die jeweiligen Emissionsintensitäten an Emissionspunkten in den Bildern, erzeugt Histogramme für die Emissionspunkte, bezo gen auf die Emissionsintensitäten, und stellt die Histogram me auf dem Schirm dar. Dies ist in Fig. 5 gezeigt. Flächen der zwei Peaks im Histogramm bezeichnen die Anzahl der zwei Arten von Markierteilchen, so daß Konzentrationen für zwei Arten zu analysierender Antigene getrennt voneinander erhal ten werden können.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung werden zwei Arten von Teilchen, nämlich fluoreszierende und nichtfluoreszierende Teilchen, hergestellt und mit verschiedenen Antikörpern ver bunden, um erste bzw. zweite Markierteilchen zu erzeugen. In diesem Fall wird nach der Reaktion die Anzahl fluoreszieren der Teilchen in den Bildern für jede Vertiefung der Mikro titerplatte ausgezählt, wobei ein Filter verwendet wird, das nur für Licht der Fluoreszenzwellenlänge der fluoreszieren den Teilchen durchlässig ist, jedoch Licht anderer Wellen längen abschneidet. Dadurch wird die Anzahl der ersten Mar kierteilchen erhalten. Darüber hinaus wird aus Durchlicht bildern für denselben Bereich, für den die obigen Bilder hergestellt wurden, die Zahl aller Teilchen in der Fläche gezählt. Durch Abziehen der Zahl der ersten Markierteilchen von der Zahl aller Teilchen kann die Zahl der zweiten Mar kierteilchen erhalten werden.

Wenn die vorstehend angegebenen verschiedenen Techniken zum Unterscheiden von Teilchen miteinander kombiniert werden, lassen sich viele Arten von Antigenen analysieren, wie sie in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte vorhanden sind.

Beim vorstehend beschriebenen Feststellen der Konzentration eines spezifischen Antigens in einer Probenlösung durch Zäh len der Anzahl von Markierteilchen, die in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte festgehalten werden, führen unspezi fisch in der Vertiefung adsorbierte Teilchen zu Problemen, insbesondere im Bereich niedriger Konzentration. Wenn näm lich die Teilchen in Berührung mit der Vertiefung gebracht werden, werden sie mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit an der Oberfläche der Vertiefung adsorbiert, ohne daß dabei eine Antigen/Antikörper-Reaktion im Spiel ist. Ein Teil der adsorbierten Teilchen bleibt selbst beim Waschen zurück. Daher muß die Anzahl dieser unspezifisch adsorbierten Teil chen geschätzt werden und von der gezählten Anzahl von Teil chen abgezogen werden, um ein genaues Analyseergebnis zu er halten. Eine Technik für zuverlässiges Schätzen wird nun als Beispiel 3 erläutert.

Beispiel 3 Herstellen festgehaltener Antikörper

Antihuman AFP-Antikörper werden in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden auf eine Art und Weise festgehalten, wie sie der von Beispiel 1 ähnlich ist.

Herstellen feiner Teilchen

Fluoreszierende Latexteilchen (mit 0,5 µm Durchmesser) mit Carboxylgruppen an ihren Oberflächen werden hergestellt, und antihuman AFP-Antikörper werden an ihnen festgehalten, um so Markierteilchen zu bilden. Teilchen vom selben Material und vom selben Durchmesser wie die Markierteilchen werden her gestellt, jedoch werden diese nicht dazu veranlaßt, Antikör per festzuhalten. Diese Teilchen sind Bezugsteilchen.

Weiterer Verfahrensablauf

Nachdem Serumproben in jede Vertiefung einer Mikrotiterplat te gegeben sind, läuft für 2 Stunden eine Reaktion zum Fest halten der zu analysierenden Antigene (AFP) in den Vertie fungen ab. Die Vertiefungen werden dann mit einem Phosphat puffer mit 0,5% BSA (0,5% BSA-PBS) ausgewaschen. Anschlie ßend wird eine Mischung von 60 µl einer 0,3%igen Suspension der oben angegebenen Markierteilchen und von 60 µl einer 0,3%igen Suspension der Bezugsteilchen in jede Vertiefung gegeben und dort für 5 Stunden stehengelassen, um eine Reak tion herbeizuführen. Dann werden die Vertiefungen sacht mit 0,5% BSA-PBS gewaschen, um überschüssige Teilchen zu ent fernen.

Der Bindungszustand an der Vertiefungsoberfläche ist in Fig. 6 dargestellt. Human-AFP 24, das in der Serumprobe vor handen ist, bindet über eine Antigen-Antikörper-Reaktion an die Antihuman-AFP-Antikörper 22, wie sie in der Vertiefung 6 festgehalten werden. Markierteilchen 70 binden über die An tihuman-AFP-Antikörper 26 an das Human-AFP 24. Ein Teil der Teilchen verbleibt an der Oberfläche der Vertiefung 6 ohne Vermittlung eines Antigens, d. h. durch unspezifische Ad sorption, wie an einer Stelle gezeigt, die mit dem Bezugs zeichen 71 versehen ist. Darüber hinaus bindet auch ein Teil von Bezugsteilchen 18, die keine Antikörper aufweisen, an die Oberfläche der Vertiefung 6.

Zählen von Teilchen

Es wird eine Vorrichtung mit dem in Fig. 4 dargestellten Aufbau verwendet. Eine Mikrotiterplatte mit Vertiefungen 6′, in denen Teilchen aufgrund der oben beschriebenen Reaktion festgehalten werden, wird auf den Tisch des Fluoreszenz mikroskops 1′ gestellt. Zunächst wird das Fluoreszenzmikro skop 1′ so eingestellt, daß Teilchenbilder im Durchlicht be obachtet werden können. Die Bilder werden von der TV-Kamera 2 aufgenommen, was Daten für erste Bilder liefert. Anschlie ßend wird ein Filter, das Licht von 540 nm durchläßt, aber Licht anderer Wellenlängen abschirmt, mit Hilfe der Filter wechseleinrichtung 13 im Mikroskop angeordnet, um Daten für zweite Bilder in derselben Fläche zu liefern, in der die Daten für das erste Bild aufgenommen wurden. Im Bildprozes sor 3 wird die Anzahl von Teilchen aus den Daten für das er ste und das zweite Bild gezählt, was Zählwerte N₁ bzw. N₂ ergibt. Details der Technik, wie das wiederholte Aufnehmen von Bildern, das Erzeugen von Teilchenbildern usw. entspre chen denen der Beispiele 1 und 2. N₁ bezeichnet die Anzahl aller Teilchen innerhalb der oben beschriebenen Fläche, d. h. die Gesamtanzahl von Markierteilchen 70 und 71 und Be zugsteilchen 80. N₂ bezeichnet dagegen die Anzahl fluores zierender Teilchen, also die Gesamtanzahl von Markierteilchen 70 und 71. Die Anzahl von Bezugsteilchen 80 in der oben beschriebenen Fläche wird demgemäß (N₁-N₂). Aus diesem Wert läßt sich die Anzahl unspezifisch in der Vertiefung adsor bierter Teilchen 71 innerhalb der Markierteilchen in der oben beschriebenen Fläche zu k(N₁-N₂) bestimmen. Hierbei ist k eine Konstante, die durch die Adsorptionseigenschaften der Bezugsteilchen bzw. der Markierteilchen in bezug auf die Vertiefungsoberfläche bestimmt ist. Dieser Wert kann vorab dadurch bestimmt werden, daß die zwei Teilchenarten mit einer Vertiefung in Kontakt gebracht werden, ohne daß eine Serumprobe in die Vertiefung gegeben wird. Mit Hilfe des k- Wertes und der Zählwerte N₁ und N₂ läßt sich die Anzahl N₃ von an das zu analysierende Antigen gebundener Teilchen 70 wie folgt berechnen:

N₃ = N₂-k(N₁-N₂).

Wie oben beschrieben kann die Anzahl feiner Teilchen, die nur von der Antigenmenge abhängt, bestimmt werden, ohne von unspezifischer Adsorption beeinflußt zu sein. Daher kann auch eine Antigenmenge mit extrem geringer Konzentration ge nau bestimmt werden.

Beim Ausführungsbeispiel 3 sind die Markierteilchen fluores zierend und die Bezugsteilchen nichtfluoreszierend, um sie voneinander unterscheiden und getrennt zählen zu können. Selbst wenn beide Teilchenarten fluoreszierend sind, können sie jedoch unterschieden werden, wenn nämlich entweder un terschiedliche Fluoreszenzwellenlängen oder unterschiedli che Teilchendurchmesser verwendet werden. Wenn unterschied liche Teilchendurchmesser verwendet werden, ist es von Vor teil, wenn das Verhältnis der Teilchendurchmesser nicht grö ßer als zwei ist, um übermäßig große Unterschiede in den Adsorptionseigenschaften der beiden Teilchen zu vermeiden.

Es ist zweckmäßig, als Teilchen, die mit den oben beschrie benen verschiedenen Techniken gezählt werden, solche mit einer spezifischen Dichte von etwa 1 bis etwa 1,4 zu verwen den wie Polystyrol, Acryl, Styrol-Butadien-Copolymere, Sty rol-Acrylsäure-Copolymere usw. Wenn Teilchen mit einer spe zifischen Dichte von etwa 1 bis etwa 1,4 verwendet werden, läuft der Reaktionsprozeß mit gutem Wirkungsgrad ab. Der Teilchendurchmesser beträgt vorzugsweise 3 µm oder weniger und liegt insbesondere im Bereich zwischen 0,1 bis 1 µm.

Zum Binden von Antikörpern (oder Antigenen) an die Oberflä che der Teilchen können bekannte Verfahren genutzt werden, wie physikalische Adsorption, chemisches Binden usw.

Insbesondere wenn Teilchen mit etwa 0,1 µm Durchmesser zur Markierung verwendet werden, können andere Teilchen an die sen agglutinieren, wobei bereits von der Oberfläche der Ver tiefung festgehaltene Teilchen als Keim wirken. Dadurch wird das Aufnehmen von Bildern vereinfacht. Wenn z. B. Human-AFP das zu analysierende Antigen ist, wird ein Reaktionsgefäß verwendet, in dem Antihuman-AFP-Antikörper (Ziege) festge halten werden und festgehaltene Antihum-AFP-Antikörper (Ka ninchen) als Markierteilchen verwendet werden. Die Markier teilchen werden auf ähnliche Weise wie bei Beispiel 1 zum Anhaften an der Oberfläche der Vertiefung gebracht. Wenn darüber hinaus festgehaltene Anti-Kaninchen IgG-Antikörper (Maus)-Teilchen als agglutinierbare Teilchen verwendet wer den, erfolgt Agglutination auf den von der Oberfläche der Vertiefung festgehaltenen Teilchen, die demgemäß Agglutina tionskeime sind. Bilder der agglutinierten Teilchen werden aufgenommen, und ihre Zahl wird gezählt, wodurch die Konzen tration an Human-AFP berechnet werden kann.

Andere Ausführungsbeispiele

Auch mit anderen Vorrichtungen als denen der Fig. 1 und 4 kann die Anzahl in der Vertiefung festgehaltener Teilchen, also die Anzahl von Markierteilchen gezählt werden. Bei dem durch Fig. 7 veranschaulichten Ausführungsbeispiel wird die Vertiefung nach Abschluß der Reaktion mit Laserlicht be leuchtet, und gestreutes Licht wird gemessen, um die Anzahl in der Vertiefung festgehaltener Teilchen zu ermitteln. Laserlicht von einem He-Ne-Laser 30 wird auf eine Vertiefung 6 einer Mikrotiterplatte gestrahlt, die als Reaktionsgefäß dient. Von den Teilchen 7 in der Vertiefung 6 gestreutes Licht wird mit Hilfe einer Linse 34 fokussiert und durch einen Lichtdetektor 36 gemessen. Der Lichtanteil, der unmit telbar durch die Vertiefung 6 hindurchtritt, wird durch eine Blende 38 ausgeblendet, so daß dieser Anteil nicht den Lichtdetektor 36 erreicht. Um darüber hinaus den Einfluß von Intensitätsänderungen des He-Ne-Lasers auszuschließen, wird die Intensität des He-Ne-Lasers durch einen Strahlteiler 32 und einen Lichtdetektor 40 überwacht, um damit die Intensi tät zu korrigieren, wie sie vom Lichtdetektor 36 ermittelt wird. Die Korrektur erfolgt in einer Datenverarbeitungsein richtung 42.

Die Beziehung zwischen der Konzentration von Human-AFP und der Intensität gestreuten Lichts, wie sie von der Zahl fest gehaltener Teilchen abhängt, ist für dieses Ausführungsbei spiel in Fig. 8 dargestellt. Wenn diese Abhängigkeit als Kalibrierkurve verwendet wird, kann eine unbekannte Konzen tration von Human-AFP in einer Serumprobe quantitativ be stimmt werden.

Anstatt den in Fig. 7 dargestellten Aufbau zu verwenden, kann zum Erfassen der Teilchenanzahl auch die Menge durch gehenden Lichts verwendet werden, also desjenigen Lichts, das gerade durch die Vertiefung 6 hindurchtritt. Es ist auch möglich, die Vorrichtung so auszubilden, daß aufeinanderfol gendes Abtasten mit einem Laserstrahl erfolgt, dessen Fleck durchmesser so klein ist wie der Durchmesser der Teilchen. In diesem Fall zeigen Änderungen im erfaßten Licht (entweder Streulicht oder durchgehendes Licht) beim Abtasten die An wesenheit von Teilchen. Die Anzahl von Markierteilchen kann durch eine Verarbeitung erfolgen, die der Bildverarbeitung von TV-Bildern ähnlich ist.

Bei den verschiedenen oben beschriebenen Ausführungsbeispie len ist der zu analysierende Stoff ein Antigen in einer Se rumprobe. Die Ausführungsbeispiele lassen sich jedoch auch auf Fälle anwenden, bei denen der zu analysierende Stoff ein Antikörper ist. In diesem Fall werden Antigene, die spezi fisch für den zu analysierenden Antikörper sind, fest mit der Vertiefung und den Markierteilchen verbunden. Darüber hinaus können ähnliche Reaktionen nicht nur mit Kombinatio nen solcher Antigene und Antikörper ausgeführt werden, son dern auch mit Kombinationen anderer spezifisch bindender Substanzen, wie z. B. Hormonen und ihren Rezeptoren, Zucker und Lecithin usw.

Claims

1. Immunologisches Testverfahren, gekennzeichnet durch fol gende Schritte:

- Herstellen von Markierteilchen mit mindestens einer Art, mit deren Oberfläche Antikörper oder Antigene, die spezi fisch für ein Antigen bzw. einen Antikörper sind, unbeweg lich verbunden werden, wobei die Anzahl der Arten von Mar kierteilchen der Anzahl von Arten zu analysierender Anti gene oder Antikörper entspricht,
- unbewegliches Verbinden von Antikörpern oder Antigenen, die spezifisch für die mindestens eine Art von Antigen bzw. Antikörper sind, mit der Oberfläche eines Reaktionsgefä ßes,
- Herstellen eines Kontakts zwischen der Probenlösung und dem Reaktionsgefäß zum Festhalten der in der Probenlösung vorhandenen Antigene bzw. Antikörper an der Oberfläche des Reaktionsgefäßes mit Hilfe der dort unbeweglich festgehal tenen Antikörper bzw. Antigene,
- Herstellen eines Kontakts zwischen einer Markierteilchen suspension und dem Reaktionsgefäß nach Abschluß des vori gen Schritts, um dadurch die Markierteilchen an die Anti gene bzw. Antikörper zu binden, die an der Oberfläche des Reaktionsgefäßes festgehalten werden,
- und Auszählen der Markierteilchen getrennt nach den ver schiedenen Arten, um aus der Anzahl jeder Art die Konzen tration der mindestens einen Art zu analysierender Anti gene oder Antikörper zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Auszählen der Teilchen ein vergrößertes Bild des Reak tionsgefäßes mit einer TV-Kamera aufgenommen wird und in diesem Bild die Teilchen gezählt werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich die mehreren Markierteilchenarten durch ihre Durchmesser voneinander unterscheiden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Markierteilchen fluoreszierend sind und unterschiedliche Arten von Markierteilchen unterschiedliche Fluoreszenzwellenlängen aufweisen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Arten von Markierteilchen fluoreszierend und andere Arten nichtfluoreszierend sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß unterschiedliche Filter verwendet wer den, von denen jedes bei der Fluoreszenzwellenlänge des Lichts von einer Art von Markierteilchen durchläßt, aber das von den Markierteilchen anderer Arten emittierte Licht sperrt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß

- der Suspension von Markierteilchen Bezugsteilchen zuge setzt werden, an deren Oberfläche sich keine Antikörper oder Antigene befinden,
- beim Auszählen von Teilchen die Anzahl von Bezugsteilchen zusätzlich ausgezählt wird,
- und die Anzahl gezählter Markierteilchen auf Grundlage der Anzahl gezählter Bezugsteilchen korrigiert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß vor dem Zählen von Teilchen das Reaktions gefäß sacht gewaschen wird, um überschüssige Teilchen zu entfernen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch ge kennzeichnet, daß die Markierteilchen und die Bezugsteilchen unterschiedliche Durchmesser aufweisen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Durchmesser der Markierteilchen und der Bezugsteilchen nicht größer als Zwei ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierteilchen und die Bezugsteil chen fluoreszieren, aber unterschiedliche Fluoreszenzwellen längen aufweisen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß entweder die Markierteilchen oder die Bezugsteilchen fluoreszierend und die anderen Teilchen nichtfluoreszierend sind.

13. Immunologische Testvorrichtung, gekennzeichnet durch:

- ein Reaktionsgefäß (6, 6′) mit einer flachen Bodenfläche, an der Antikörper oder Antigene, die spezifisch für eine zu analysierende Art von Antigenen oder Antikörpern sind, festgehalten werden, und in dem die in einer Probenlösung enthaltenen Antigene oder Antikörper zunächst einer Anti gen/Antikörper-Reaktion mit den festgehaltenen Antikörpern bzw. Antigenen und dann einer Antigen/Antikörper-Reaktion mit Antikörpern bzw. Antigenen unterworfen werden, die an der Oberfläche von Markierteilchen festgehalten werden;
- ein umgedrehtes Mikroskop (1, 1′), auf dem das Reaktions gefäß angebracht ist,
- eine TV-Kamera (2) zum Aufnehmen von Mikroskopbildern von der Bodenfläche des Reaktionsgefäßes,
- und einen Bildprozessor (3) zum Aufzeichnen der von der TV-Kamera aufgenommenen Bilder, zum Ermitteln von Markier teilchen innerhalb der Bilder und zum Zählen von deren An zahl.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch eine Filterwechseleinrichtung (13) am Mikroskop (1′).