CN112014369B - 超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种超灵敏数字层析快速检测系统及方法，检测系统主要包括：层析反应系统、光学成像系统和图像处理系统。其中层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集的待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；其中光学成像系统能分辨反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；其中图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系。本发明的检测系统和方法可以显著提高荧光或者胶体金层析分析方法的检测灵敏度。

Description

超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测系统，尤其涉及一种超灵敏快速检测分析物的系统，具体涉及到一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统。此外，本发明还涉及超灵敏数字层析快速检测分析物的方法。

背景

超灵敏检测分析的方法在临床疾病检测、食品安全、微生物检验检疫、兽医等领域都具有广阔的应用前景。数字检测分析技术是指通过对特异性反应进行绝对计数，从而提高检测分析的灵敏度。

目前，常见的数字分析技术包括数字PCR、数字ELISA等，其基本原理是将一个样本分成几千到几万份，分配到不同反应单元的待测目标分子，在每个反应单元中进行反应，反应结束后计数发生阳性反应的微分单元数量，实现对目标分析物的超灵敏检测。例如美国Quanterix公司推出的数字ELISA技术，与传统的免疫检测的主要区别在于能够在飞升大小的微孔内捕获单分子，允许单个磁珠的信号的数字化读取，该技术的检测灵敏度比传统的ELISA方法提高1000倍。

此外，通过对发生特异性结合反应的单纳米颗粒计数，也可以实现对目标分析物的超微量检测，例如Nongjian Tao等报道（ACS Sens. 2020, 5, 4, 1126–1131），在玻璃载玻片表面固定抗体，与金纳米颗粒修饰的标记抗体结合，采用暗场显微镜观察单个金纳米颗粒，对特异性结合的金纳米颗粒计数，可实现对肌钙蛋白的超灵敏检测。但上述检测方法步骤繁琐、耗时长、检测系统难于标准化，不适于开发现场、快速检测试剂盒。

中国发明专利申请CN201811282815.8公开了一种基于数字免疫分析技术的低丰度蛋白质绝对定量方法，该方法将捕获磁珠、目标抗原和检测颗粒进行免疫反应后，将免疫复合物重点检测颗粒洗脱，用微流控颗粒计数芯片分析检测颗粒数量。但上述数字免疫分析方法也存在检测步骤复杂，试剂难于标准化的问题。

中国发明专利申请CN202010449078.7公开了一种多光谱调制的便携式免疫层析试纸条定量检测装置，该发明中光学检测模块将调制过的光入射到待检测的试纸条上，在45度接收角将C线和T线反射光或者荧光引导至多光谱检测模块，由于上述检测方法采集检测颗粒的宏观整体信号，对超微量，尤其单个检测颗粒的信号无法检测识别，因而限制了该分析方法的检测灵敏度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，克服了现有数字检测方法步骤繁琐、耗时长、检测系统难于标准化的缺陷，简化了检测步骤，缩短了检测时间，检测系统易于标准化，实现对目标分析物的超灵敏、现场快速检测，提高现有层析检测技术的分析灵敏度。为此，本发明还提供一种超灵敏数字层析快速检测分析物的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，包括：层析反应系统，光学成像系统和图像处理系统；

所述的层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，其中侧向层析反应系统包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；纵向层析反应系统包括反应膜、吸水纸和组装卡壳；所述层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集的待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；

所述光学成像系统为荧光显微放大或者暗场显微放大光学系统，能分辨所述层析反应系统的反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；

所述图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系。

作为本发明优选的技术方案，所述层析反应系统为侧向或者纵向层析反应系统，层析反应时间小于20分钟。

作为本发明优选的技术方案，所述层析反应系统的检测区域，除了固定特异性捕获生物配体外，还固定了检测区域标示性微粒。所述检测区域标示性微粒，可以为荧光波长区别于示踪颗粒的荧光纳米颗粒，或者是在显微成像系统下可分辨的各种形状微粒。

优选地，所述示踪纳米颗粒的粒径为10-500nm，粒径分布均一，示踪纳米颗粒是荧光纳米颗粒或者等离子体纳米颗粒，荧光纳米颗粒为时间分辨荧光、有机荧光染料、荧光量子点、聚集诱导荧光中的一种或者几种组合，等离子体纳米颗粒为金、铂、银、钯纳米颗粒中的一种或者几种组合。

优选地，所述生物配体为抗原、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、生物素中的一种或几种组合。

优选地，所述光学成像系统的放大倍数为100-1000倍，能分辨单个示踪纳米颗粒。

优选地，所述检测区域识别模块能识别光学成像系统采集到的反应膜上的图像，通过检测区域标示性微粒识别反应膜上的检测区域。

优选地，所述特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块能统计检测区域中特异性结合的示踪纳米颗粒的数目。

此外，本发明还提供一种采用上述系统的超灵敏数字层析快速检测分析物的方法，包括如下步骤：

步骤1，一定体积的样本滴加到层析反应系统上，层析反应后，在光学成像系统上获取层析反应系统的反应膜上检测区域的显微图像，通过图像处理系统对检测区的示踪纳米颗粒进行计数；

步骤2，通过校准品浓度与示踪纳米颗粒数量间的拟合关系曲线，计算得到样本中待测分析物的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过显微信号放大和单纳米颗粒计数相结合的方式，可显著提高免疫层析检测方法的检测分析灵敏度，在试剂的检测区域除了固定捕获配体外，还固定标识性纳米微粒对检测区域进行标记，便于显微定位检测区域，并降低反应膜与标记颗粒间非特异性结合的信号干扰，通过显微光学信号放大，实现对检测区域特异性结合的示踪颗粒的单颗粒计数，建立检测区域中特异性示踪颗粒数量与待测标志物浓度的关系曲线，与传统的肉眼判读或者基于宏观信号收集的免疫层析分析仪相比较，该检测系统和方法可以明显提高荧光或者胶体金免疫层析分析方法的检测灵敏度，且克服了现有数字检测方法步骤繁琐、耗时长、检测系统难于标准化的缺陷，简化了检测步骤，缩短了检测时间，检测系统易于标准化，且具有层析试纸的快速、便捷、低成本、易于工业化生产等优点。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步的描述。

图1为本发明的超灵敏数字层析快速检测系统的组成结构示意图。

图2为本发明实施例一中标准荧光膜条在荧光成像仪和荧光显微镜的检测结果比较示意图，是不同浓度的标准荧光条带的荧光成像仪照片和低浓度标准荧光条带的荧光显微照片的比较。图2中，标准荧光膜条1-8的划膜荧光颗粒浓度依次为：1.2，4.8，19.2，76.8，307.2，1228，4915，19661（百个每厘米）。

图3为本发明实施例一中标准荧光膜条的显微颗粒计数与荧光免疫分析仪对标准荧光膜条的检测结果比较示意图。

图4为本发明实施例二中侧向层析反应系统的结构示意图。图4中，9-样品垫，10-结合垫，11-反应膜，12-检测区，13-质控区，14-吸水垫，15-PVC不干胶背板。

图5为本发明实施例二中量子点荧光侧向免疫层析检测HIV p24 不同检测浓度，检测区的荧光显微照片。

图6为本发明实施例二中量子点荧光侧向免疫层析检测HIV p24 不同检测浓度，分别采用荧光显微计数和荧光免疫层析分析仪的检测结果比较示意图。

图7为本发明实施例三中纵向层析反应系统（斑点免疫渗滤）检测卡的结构示意图。图7中，16-塑料卡壳，17-检测区，18-反应膜，19-吸水垫。

图8为本发明实施例三中胶体金纳米颗粒（40纳米）的暗场显微镜照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，包括：层析反应系统，光学成像系统和图像处理系统；

所述的层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，层析反应时间小于20分钟，其中侧向层析反应系统包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；纵向层析反应系统包括反应膜、吸水纸和组装卡壳；所述层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集的待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；所述示踪纳米颗粒的粒径为10-500nm，粒径分布均一，示踪纳米颗粒是荧光纳米颗粒或者等离子体纳米颗粒，荧光纳米颗粒为时间分辨荧光、有机荧光染料、荧光量子点、聚集诱导荧光中的一种或者几种组合，等离子体纳米颗粒为金、铂、银、钯纳米颗粒中的一种或者几种组合。所述生物配体为抗原、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、生物素中的一种或几种组合。所述层析反应系统的检测区域，除了固定特异性捕获生物配体外，还固定了检测区域标示性微粒。所述检测区域标示性微粒，可以为荧光波长区别于示踪颗粒的荧光纳米颗粒，或者是在显微成像系统下可分辨的各种形状微粒。

所述光学成像系统为荧光显微放大或者暗场显微放大光学系统，能分辨所述层析反应系统的反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；所述光学成像系统的放大倍数为100-1000倍，能分辨单个示踪纳米颗粒。

所述图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系。所述检测区域识别模块能识别光学成像系统采集到的反应膜上的图像，通过检测区域标示性微粒识别反应膜上的检测区域。所述特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块能统计检测区域中特异性结合的示踪纳米颗粒的数目。

本发明还提供一种采用上述系统的超灵敏数字层析快速检测分析物的方法，包括如下步骤：

步骤1，一定体积的样本滴加到层析反应系统上，层析反应后，在光学成像系统上获取层析反应系统的反应膜上检测区域的显微图像，通过图像处理系统对检测区的示踪纳米颗粒进行计数；

步骤2，通过校准品浓度与示踪纳米颗粒数量间的拟合关系曲线，计算得到样本中待测分析物的浓度。

实施例一：

荧光层析分析仪和荧光显微拍照颗粒计数的检测灵敏度比较

1. 标准荧光膜条的制备

量子点纳米球微球溶液依次4倍稀释后，硝酸纤维素膜（NC膜）固定在PVC不干胶背板上，1微升每厘米的速度划膜，得到不同荧光强度的标准荧光条带。

2. 不同读取方法对标准荧光条带的检测结果比较

分别选择荧光凝胶成像仪（复日FR200多功能成像仪）、荧光免疫层析分析仪（苏州和迈FIC-H1）和荧光显微镜（奥林巴斯BX51）对标准荧光膜条进行荧光信号分析，荧光成像仪与荧光显微拍照的检测结果比较如图2所示，荧光免疫层析分析仪与荧光显微计数的检测结果比较如图3所示，其中荧光成像仪和免疫荧光分析仪的分析灵敏度比较接近，而采用荧光显微镜拍照后，对荧光颗粒进行计数的检测灵敏度可以提高100倍左右。

实施例二：

基于量子点荧光标记的快速免疫层析试纸条对HIV p24的超灵敏检测

1. 量子点纳米球标记HIV p24抗体的标记

1.1）去表面带羧基的量子点纳米球（发射波长620纳米，红色）100微升，用pH 6.0的磷酸缓冲液稀释至300微升，加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）0.3 mg，置于旋转混匀器，室温反应0.5小时。

1.2）羧基量子点微球活化后，12000 转每分钟离心10分钟，去除上清后，将活化后的量子点纳米球分散于300微升的磷酸缓冲液中，加入HIV p24标记抗体约100微克，置于旋转混匀器，室温反应1小时

1.3）抗体与量子点纳米球偶联反应后，12000转每分钟离心10分钟，去上清后，将抗体-量子点纳米球分散于300微升磷酸缓冲液中，加入BSA 10毫克，置于旋转混匀器，室温封闭反应2小时，即得到HIV p24-量子点纳米球偶联物。

2. 数字免疫层析试纸的组装

2.1）选择量子点纳米球（发射波长520纳米，绿色）作为检测带指示颗粒，100微升的绿色量子点纳米球，与10毫克的BSA混合，加入EDC 0.3 毫克，置于旋转混匀器，室温反应2小时，得到检测区域示踪颗粒。

2.2）层析反应膜选用赛多利斯公司的CN 140 硝酸纤维素膜（NC膜），HIV p24 捕获抗体浓度1毫克每毫升，与1微升的示踪微粒混匀，作为检测区域；羊抗鼠IgG多克隆抗体1毫克每毫升，作为质控区域；然后以1微升每厘米的喷量，在NC膜上均匀划膜，形成相隔4毫米的检测区域和质控区域。

2.3）结合垫材质为亲水的玻璃纤维，HIV p24标记抗体-量子点纳米球偶联物，分散在结合垫处理液中，然后使用喷膜仪均匀喷涂在玻璃纤维膜上，30度烘干，待用。

2.4）如图4所示，将样品垫9、结合垫10、反应膜11和吸水垫14，依次如图4所示叠放在PVC不干胶背板15上，组装成大板后，用裁纸刀将其剪切成4毫米宽的试纸条。

3. 样品测试和结果判读

将待测的标准品或血清样本用缓冲液稀释后，加100微升至样品垫，反应10分钟后，荧光免疫层析仪检测试纸检测带和质控带的荧光信号强度；同时采用荧光显微镜进行拍照，通过绿色荧光量子点显微定位检测区域，获取检测带的荧光显微图像，荧光显微照片如图5所示，并采用ImageJ软件对检测区域的红色量子点纳米微球进行计数。其中荧光免疫层析分析仪的检测结果与显微计数检测结果的比较，如图6所示。通过系列已知浓度的HIVp24校准品与示踪颗粒显微计数间的拟合方程，计算得到待测样本中HIV p24的浓度。

实施例三：

基于胶体金的免疫渗滤对C反应蛋白（CRP）的超灵敏快速检测

商品化CRP胶体金免疫渗滤检测试剂盒购自上海奥普生物，检测结构如图7所示，不同梯度的校准品溶液倍比稀释后，取100微升滴加到试纸条样品垫，层析反应15分钟后，对胶体金检测板白光下拍照并进行灰度分析；暗场显微镜拍照，其中40纳米胶体金颗粒的典型暗场显微镜照片如图8所示，对检测斑点单位区域的胶体金颗粒进行计数，绘制校准曲线，计数待测样本中CRP的浓度。

Claims (6)

1.一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，包括：层析反应系统，光学成像系统和图像处理系统；

所述的层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，其中侧向层析反应系统包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；纵向层析反应系统包括反应膜、吸水纸和组装卡壳；所述层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；所述层析反应系统的检测区域，除了固定了特异性捕获生物配体外，还固定了检测区域标示性微粒；所述检测区域标示性微粒，为荧光发射波长区别于示踪颗粒的荧光纳米颗粒，或者是在显微成像系统下可分辨的各种形状微粒；

所述光学成像系统为荧光显微放大或者暗场显微放大光学系统，能分辨所述层析反应系统的反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；

所述图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系；所述检测区域识别模块能识别光学成像系统采集到的反应膜上的图像，通过检测区域标示性微粒识别反应膜上的检测区域；所述特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块能统计检测区域中特异性结合的示踪纳米颗粒的数目。

2.根据权利要求1所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述层析反应系统为侧向或者纵向层析反应系统，层析反应时间小于20分钟。

3.根据权利要求1所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述示踪纳米颗粒的粒径为10-500nm，粒径分布均一，示踪纳米颗粒是荧光纳米颗粒或者等离子体纳米颗粒，荧光纳米颗粒为时间分辨荧光、有机荧光染料、荧光量子点、聚集诱导荧光中的一种或者几种组合，等离子体纳米颗粒为金、铂、银、钯纳米颗粒中的一种或者几种组合。

4.根据权利要求1所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述生物配体为抗原、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、生物素中的一种或几种组合。

5.根据权利要求1所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述光学成像系统的放大倍数为100-1000倍，能分辨单个示踪纳米颗粒。

6.一种采用如权利要求1-5任一项所述系统的超灵敏数字层析快速检测分析物的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，一定体积的样本滴加到层析反应系统上，层析反应后，在光学成像系统上获取层析反应系统的反应膜上检测区域的显微图像，通过图像处理系统对检测区的示踪纳米颗粒进行计数；

步骤2，通过校准品浓度与示踪纳米颗粒数量间的拟合关系曲线，计算得到样本中待测分析物的浓度。