DE3855280T2

DE3855280T2 - Von mca 16-88 erkanntes antigen

Info

Publication number: DE3855280T2
Application number: DE3855280T
Authority: DE
Inventors: Michael Berman; Ebo Bos; Michael Hanna; Martin Haspel; Nicholas Pomato
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1987-07-02
Filing date: 1988-07-01
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2008-07-02
Also published as: DE3855280D1; IE72186B1; NZ225280A; EP0328578A4; AU2070688A; DK102589D0; EP0328578A1; ATE137674T1; JP3081208B2; ZA884777B; IL86958A; IE882034L; HU213222B; JPH01503755A; EP0328578B1; AU618209B2; WO1989000050A1; IL86958A0; DK102589A

Description

Kolonkrebs ist der am zweithäufigsten verbreitete Krebs in den vereinigten Staaten, der sowohl Männer als auch Frauen betrifft. Bis vor kurzem war Chirurgie die einzige lebenserhaltende Massnahme gegen diese Krankheit, was eine schlechte Prognose hat für Patienten mit transmuralen Ausdehnungen des Tumors und Metastasen in regionalen Lymphknoten. Hinweise auf eine stark verbesserte Prognose gab es in einem kürzlich berichteten randomisierten Phase II-aktiven spezifischen Immunotherapieversuch, der gezeigt hat, dass eine Immunisierung von Patienten mit autologen Tumorzellen, gemischt mit Tice BCG (Bacillus Calmette Guerin) (Institut für Tuberkuloseforschung, Chicago IL), die verzögerte cutane Hypersensitivität in signifikanter Weise erhöhte und Rückfälle und Sterblichkeit während eines Zeitraums von vier Jahren signifikant verringerte (3).
Es hat zahlreiche Publikationen gegeben, die die Identifizierung von Kolonkarzinom-assoziierten Antigenen beschreiben (4-9). Die Mehrheit dieser Antigene wurden mittels monoklonalen Antikörpern identifiziert, die durch Immunisierung von Mäusen mit einer Form des Kolontumors (Extrakte, aufgelöste Zellen, Membranpräparationen etc.) oder mit Kolontumorzelllinien erzeugt wurden. Diese Maus- Antikörper identifizieren eine Auswahl von Antigenen, die in der Maus antigen sind. Zusätzlich zu diesen Untersuchungen gibt es mehrere Berichte über menschliche monoklonale Antikörper, die eine spezifische Reaktionsfähigkeit mit Tumormaterial zeigen (19).
Durch die Verwendung von peripheren B-Zellen von Kolonpatienten, die mit autologen Tumorzellen und BCG in Immunotherapieprotokollen aktiv immunisiert worden sind, haben wir erfolgreich eine Strategie entwickelt, um menschliche monoklonale Anti-Tumor-Antikörper zu erzeugen (1 sowie EP 151030). Nicht wie gegen menschlichen Kolonkrebs erzeugte monoklonale Mausantikörper, die oft Gewebekomponenten, wie CEA, die auch in gesunden Individuen vorhanden sind, erkennen, zeigt unser menschlicher monoklonale Antikörper keine Reaktion mit CEA, Blutgruppendeterminanten oder Histokompatibilitätsantigenen, was ein Hinweis darauf ist, dass diese Antikörper durch eine auf jene Epitope beschränkte Spezifität gekennzeichnet sind, die im autologen Wirt als antigen erkannt werden.
Wir haben diese menschlichen monoklonalen Antikörper als Sonden verwendet, um Tumorantigene zu identifizieren. Wir haben ein spezielles Antigen in Kolontumoren, Extrakten von Kolontumorzeillinien und heterologen Implantaten, die aus nackten Mäusen gewonnen wurden, identifiziert. Das entsprechende Antigen ist dadurch gekennzeichnet, dass es ein Epitop enthält, das vom menschlichen monoklonalen Antikörper (MCA) 16-88 erkannt wird und das in ungefähr 60 % aller Kolontumoren nachgewiesen werden kann. Wir haben nachgewiesen, dass das mit dem menschlichen MCA 16-88 identifizierte Epitop vom monoklonalen Antikörper der Maus nicht erkannt wird, noch nicht einmal von jenen, die durch Immunisierung von Mäusen mit dem dieses Epitop enthaltenden menschlichen Antigen erzeugt wurden.
In EP200464 wird ein MAb-definiertes Tumorantigen offenbart, das neben anderen mit der SW403-Zelllinie reagiert. Dieses Antigen existiert jedoch im Gegensatz zu dem das Epitop des MCA-16-88 enthaltende Antigen auch in normalem Gewebe.
Schon Hollmann et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 128(1), 34-39, 1985) beschreiben ein durch einen Mab definiertes Tumorantigen, das jedoch mit Vimentin reagiert.
Die vorliegende Erfindung umfasst das vom menschlichen monoklonalen Antikörper 16-88 erkannte Epitop, das dieses Epitop enthaltende menschliche Tumorantigen, das wir identifiziert, isoliert und charakterisiert haben, und dieses gleiche Epitop enthaltende, antiidiotypische Antikörper des menschlichen MCA 16-88. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des dieses Epitop enthaltenden Antikörpers zur Diagnose und Überwachung der Krebsbehandlung.
Figur 1 zeigt ein Flussdiagramm, das das Reinigungsschema des vom menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigens zusammenfassend darstellt. Figur 2 zeigt eine HPLC-Gelfiltrationsisolation dieses Antigens. Figuren 3 und 4 zeigen die Reinigung des Antigens mittels SDS-PAGE und Western Blot. Figuren 5, 6 und 7 stellen die Charakterisierung des Antigens durch eine native Gradienten-PAGE, Saccharosedichtegradientzentrifugation beziehungsweise SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese dar.
Wir haben das Antigen, das das vom menschlichen MCA 16-88 erkannte Epitop enthält, in ungefähr 60 % der untersuchten Kolontumoren nachweisen können (10). Wir haben auch nachgewiesen, dass die Kolonkrebszelllinien HT-29, SW1463, SW948, SW403, LS174, LoVo und WiDr (ATCC, Rockville, MD) das gleiche Antigen enthalten. Wegen der niedrigen Reaktionsfähigkeit des menschlichen MCA 16-88 mit passendem normalen Kolongewebe ist es klar, dass dieses Antigen bevorzugt in Kolontumorzellen exprimiert wird.
Weiter haben wir dieses Antigen in Seren von Kolonkrebs- Patienten nachgewiesen, während in Seren von gesunden Individuen kein nachweisbarer Anteil des Antigens auftritt. Interessanterweise verfügten einige Patienten mit nachweisbarer Tumorbelastung über tiefe CEA-Werte, jedoch über hohe Werte des vom menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigens, während andere Patienten über zwar feststellbare, aber tiefe Antigen-Werte und erhebliche CEA-Werte verfügten. Das Antigen, das das vom menschlichen MCA 16-88 erkannte Epitop enthält, ist in seiner Eignung als Tumormarker komplementär zum CEA, da es in Seren von gesunden Individuen oder in normalem Gewebe nicht in nachweisbaren Werten nachgewiesen werden kann. Deshalb wird das Antigen als Immunreagenz bei der Diagnose und der Überwachung, ob allein oder in Kombination mit anderen Tumorantigenen, ein unschätzbares Werkzeug sein. Das Antigen kann auch in Impfstoffen verwendet werden, uin humorale Wirt-Antworten hervorzurufen (12, 13).
Menschliches MCA 16-88 ist erwiesenermassen eine nützliche Sonde bei der Isolierung und biochemischen Charakterisierung des Antigens. Jedoch war es in gewissen Fällen nötig, die von uns hergestellten monoklonalen Maus-Antikörper 575- 20 und 810-12 zu verwenden, die andere Epitope auf dem gleichen Antigen erkennen.
Die Reinigung des Antigens wurde erreicht durch Salzausfällung, Gelfiltrationschromatographie und Affinitätschromatographie. Das gereinigte Antigen wanderte als einzelnes Protein auf nativer Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese (natives PAGE) und als eine Serie von nahe beieinander wandernden Proteinen in der denaturierende Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen.
Das Molekulargewicht des nativen Proteins betrug bei Gelfutration ungefähr 900K und bei nativem PAGE ungefähr 100 - 140K. Die unterschiedlichen Molekulargewichte lassen darauf schliessen, dass entweder die Form des Moleküls nicht der eines globulären Proteins entspricht, oder aber, dass sich das Protein mit einem Nichteiweissstoff (z.B. Lipide) verbindet. Saccharosedichtezentrifugation Diese Schlüsse wurden dadurch noch gestützt, dass bei der Saccharosedichtezentrifugation des nativen Antigens die Grösse als leicht höher als 43K angezeigt wurde. Auch die Bestimmung der offensichtlichen Grösse des nativen Moleküls nach der Dichte lässt also auf ein nicht-globuläres Protein oder auf eine Verbindung des Proteins mit einem Nichteiweisskomponente schliessen.
Die Bestimmung des Molekulargewichts des Antigens mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen resultierte in einer Serie von nahe beieinander wandernden Proteinen der Grössenordnung zwischen 43K und 35 K.
Experimente, bei denen das Antigen mit ³H-Glucosamin gekennzeichnet wurde, zeigen, dass dieses Protein nur wenige oder gar keine Kohlenhydrate aufweist. Desweitern scheint das Protein nicht sulfatiert zu sein, da es nicht gelang, ³&sup4;SO&sub4; in das Protein einzubauen. Hingegen wurde ³²PO&sub4; eingebaut, was bedeutet, dass das Protein phosphoryliert ist.
Wir haben dieses Tumor-assozuerte Antigen durch seine Reaktionsfähigkeit mit dem menschlichen monoklonalen Antikörper 16-88 isoliert. Aufgrund der Anwesenheit dieses Antigens in verschiedenen Kolonkarzinoma und in Seren verschiedener Kolonkrebspatienten, ist es ein signifikantes Antigen für Diagnosezwecke und für Impfstoffentwicklung. Das Antigen ist definiert und klar identifiziert durch seine Immunoreaktionsfähigkeit mit dem menschlichen MCA 16-88, seiner Molekulargewichtscharakterisierung und seinem isoelektrischen Fokussierungspunkt.
Unter Verwendung des menschlichen monoklonalen Antikörpers 16-88 haben wir eine E-coli-Expressions-Bibliothek untersucht für die Herstellung rekombinanter Proteine, die das Epitop MCA 16-88 aufweisen. Fünf positive Klonen wurden genau analysiert. Eine Serie von Klonen (Fig. 8A) stammt von der komplementären DNA des menschlichen Cytokeratins Nr. 18. Diese Tatsache wird durch die DNA-Sequenzanalyse und durch den Vergleich mit der veröffentlichten Sequenz (21) bestätigt. Die wichtige Schlussfolgerung aus dieser Studie besteht darin, dass das menschliche MCA 16-88 Epitop in der Region um das von Romano et al. sequenzierte und in den Klonen rCTA 10.2 und rCTA 12. exprimierte Cytokeratin Nr. 18 nicht enthalten ist. Dieses Epitop ist Bestandteil des N-terminalen Aminosäureanteils von Cytokeratin Nr. 18 wie durch rCTA 56.1 definiert.
Neben seiner Reaktionsfähigkeit mit Cytokeratin Nr. 18 wird das Epitop MC 16-88 auch von anderen Mitgliedern der Cytokeratin-Famihe exprimiert. Dies wird in Figur 88 dargestellt. Die Analyse von rCTA 45.1 und rCTA 52.1 mit spezifischen Antiseren hat den Stoff als rekombinantes Cytokeratin Nr. 19 identifiziert. Es wurde gezeigt, dass zwei der das Epitop MCA 16-88 tragenden Genprodukte der Familie der Cytrokeratine angehören. Diese stellen jedoch nur zwei der vielen dicht beieinander wandernden von der biochemischen Analyse definierten Proteine dar. Genauer gesagt, unterscheidet sich das wichtige durch MCA 16-88 definierte Epitop von anderen, eingeschränkteren Epitopen der weiter gefassten Filamentfamilie der Proteine (Tabelle 3).
Das von MCA 16-88 erkannte Tumor-assozuerte Antigen wurde aus den Zelllinien HT-29 gereinigt. Das Antigen scheint mit den Cytokeratinen 8, 18 und 19 in verwandt zu sein, da das vom menschlichen monoklonalen Antikörper 16-88 erkannte Epitop in diesen Molekülen vorkommt, und da von monoklonalen Maus-Antikörpern erkannte, für die Cytokeratine 8, 18 und 19 typischen Epitope mit diesem Antigen reaktionsfähig sind. Das Antigen unterscheidet sich von den Cytokeratinen 8, 18 und 19 (die einzigen in HT-29 Zellen vorhandenen Cytokeratine) durch seine Löslichkeit in wässriger Lösung (im Gegensatz zu den nativen Cytokeratinen 8, 18 und 19) und durch seinen geringeren Molukulargrssenbereich. Ausserdem zeigen N-terminale Proteinsequenzdaten zwei der Polypeptide im Antigenkomplex für dieses Antigen eine andere Aminosäuresequenz an als für die Cytokeratine 8, 18 und 19.
Neben der Reinigung des Antigens haben wir die Reaktionsfähigkeit des MCA 16-88 mit der Isolierung von antiidiotypischen, monoklonalen Maus-Antikörpern noch weitergehend charakterisiert (Tabelle 2).

Reinigung des durch MCA 16-88 erkannten Antigens

Ein Flussdiagramm fasst den Reinigungsablauf des vom menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigens in Figur 1 zusammenfassend dar. Nach der Extraktion der Tumorzelllinie HT- 29, in einer das Detergenz NP-40 (Sigma Chemical Co.) enthaltenden Pufferlösung resultierte in einer wässrigen Lösung, die nach der Klärung ein von dem menschlichen MCA 16- 88 erkanntes Antigen enthielt. Dieses Protein wurde nach der Dialyse durch Zugabe von 20%igem Ammoniumsulfat (A.S.) ausgefällt. Nach der Zentrifugation wurde der gelöste Niederschlag auf einer TSK 4000SW-Gelfiltrationssäule fraktioniert.
Der Antigenpool aus der Gelfiltrationssäule wurde direkt auf eine Thiopropyl-Seraphose 6B-Säule aufgetragen und mit 10 mM Dithiothreitol eluiert. Figuren 3 und 4 zeigen die SDS-PAGE- und die Westernblot-Analyse des Antigenpools während der Reinigungsphase. Die Bahnen A-E zeigen Coomassie-blaue Anfärbung nach SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese; F-I, Westernblot-Analyse mit MCA 16-88 als Sonde; Bahn A, SDS-Molekular-gewichtstandards; Bahnen B und F, rohes Extrakt; Bahnen C und G, 20%iger Ammoniumsulfatniederschlag; Bahnen D und H, TSK 400-Gelfiltrationschromatographie; und Bahnen E und I, Thiopropylsepharose - Chromatographie.

Antigencharakterisierung

Reinheit des nativen Antigens

Die Reinheit des nicht-denaturierten Antigens wurde durch Grössenausschluss-Hochleistungsflüssigchromatographie, Anionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie und Agaroseionenaustauschchromatographie bewertet. Aus den Resultaten geht hervor, dass durch Anwendung der Analysenhochleistungsflüssigchromatographie einzelne Peaks erhalten wurden, während eine einzige Bande bei einem isoelektrischen pH-Wert von 5.3 ± 0.3 durch analytische Ionenaustauschchromatographie erhalten wurde (Figur 2). Basierend auf diesen Kriterien verfügt das native Antigen also über die Charakteristiken eines nahezu homogenen Proteins. Figur 2 zeigt die Analyse des gereinigten Antigens durch Hochleistungsflüssigchromatographie-Gelfiltration, Anionenaustausch-Hochleistungs-flüssigchromatographie und isoelektrische Fokussierung.
A. Eine Zorbax-GF-450-Säule (9,4 mm x 25 cm) (DuPont) wurde in PBS ausbalanciert/equilibriert, auf Molekulargewichtsstandards geeicht und dann für die Auflösung des gereinigten Antigens verwendet.
-A280 nm
B. Eine Pharmacia Mono Q-Säule (5 mm x 5 cm, Anionenaustausch) wurde in 20 mM Tris, pH 8,0 (Puffer A) equilibriert. Anschliessend wurde eine Probe des gereinigten Antigens eingefüllt. Die Säule wurde mittels eines linearen Gradienten aus Puffer A bis Puffer A + 1.0 NaCl entwickelt.
-A 280 nm
----NaCl-Konzentration

Molekulargewichtscharakteristiken

Mittels Grössenausschlusssäulenchromatographie konnte das durch Gelfiltrationssäulenchromatographie ermittelte Molekulargewicht des nativen Antigens auf ungefähr 900K festgelegt werden. Untersuchungen auf anderen Gelfiltrationsmatrixen wie Fratogel HW55F-65F und Sephacryl S-400 bestätigten dieses Molekulargewicht. Figur 5 zeigt ein durch native Gradienten-PAGE ermitteltes Molekulargewicht von ungefähr 100-140K an. Diese aus den verschiedenen Messmethoden resultierenden Unterschiede bei den Molekulargewichten blieb auch dann bestehen, wenn beim Gelfiltrationssystem der Puffer der nativen Gradienten-PAGE (0,1M Tris, 0,1M Borsäure, pH 8,3) verwendet wurde und wenn im nativen PAGE- System ein nichtborathaltiger Puffer (0,05M Tris 0,5M Glycm, pH 8,3) ersetzt wurde.
Die unterschiedlichen Molekulargewichte zwischen der Gelfiltration und der Gelelektrophorese zeigen auf, dass die Form des vom MCA 16-88 erkannten Antigens nicht globulär ist, wie bei der Molekulargewichtsbestimmung durch Gelfiltration angenommen. Um informationen über die Form dieses Moleküls zu erhalten wurde eine Saccharosedichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Figur 6 zeigt, dass das Antigen hinsichtlich der Dichte in seiner nativen Form über die Charakteristiken eines Proteins verfügte, das leicht grösser als 43K ist.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

In Figur 7 erscheint das Antigen als eine Serie von Polypeptidbanden mit einem Molekulargewicht zwischen 43K und 35K, wie es durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen ermittelt worden ist. Die Proteinbanden waren immunoreaktionsfähig und konnten nach SDS-PAGE durch Elektro-Eluierung voneinander getrennt werden. Muster, Anordnung sowie die Immunoreaktionsfähigkeit dieser Bänder blieben auch unter reduzier&nden Bedingungen unverändert.
Die Bahnen 1 bis 9 zeigen Coomassie-blaue Anfärbung nach Anwendung der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese; Bahnen 10 bis 18 Westernblot-Analyse unter Verwendung von MCA 16-99 nach SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese; Bahnen 1 und 10, 20 % Ammoniumsulfat-Niederschlag; Bahnen 2 und 11 elektroeluiertes Proteinband A; Bahnen 3 und 12 elektroeluierte Proteinbande B; Bahnen 4 und 13 elektroeluierte Proteinbande C, Bahnen 5 und 14 elektroeluierte Proteinbande D; Bahnen 6 und 15 elektroeluierte Proteinbande E; Bahnen 7 und 16 elektroeluierte Proteinbande F; Bahnen 8 und 17 elektroeluierte Proteinbande G; und Bahnen 9 und 18 elektroeluierte Proteinbande H.

Biosynthetische Markierung

Wie in den Beispielen gezeigt, wurde die In-vivo-Markierung der HT-29-Zellen mittels ³H-Glucosamin, ³&sup5;SO&sub4; und ³²SO&sub4; vorgenommen. Zur Immunopräzipitierung wurde ein gegen das Antigen gerichteter monoklonaler Mausantikörper verwendet, weil das Antigen nicht mit dem menschlichen MCA 16-88 präzipitiert werden konnte, da es sich um ein IgM Molekül handelt. Bei diesen Experimenten wurde nur geringfügige oder gar keine Inkorporation von ³H-Glucosamin oder ³&sup5;SO&sub4; beobachtet. Dagegen wurde das Antigen bei der Verwendung von ³²PO&sub4; markiert, was darauf hinweist, dass dieses Protein phosphoryliert ist.

Isoelektrische Fokussierung

Das durch menschliches MCA 16-85 erkannte gereinigte Antigen wurde in 1 %-igen Agarosegels einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen. Das Antigen erschien bei einem isoelektrischen Punkt von ungefähr pH 5.5 als ein einzige Bande (Figur 2C).

Klonierung des rekombinanten durch den MCA 16-88 erkannten Antigens

Eine Bibliothek von ORF8 Lambda-Phagen, die aus der Zelllinie HT29 hergestellte komplementäre DNA trägt, wurde mit dem MCA 16-88 und Maus-MCA 575-20 untersucht. Dabei wurden 160'000 rekombinante Phagen (mit 74 % CDNA-Insertionen) gefunden. Es wurden zwei mit MCA 575-20 reaktiosfähige Klone isoliert und charakterisiert, z.B. rCTA 10.0 (Figuren 8A und Tabelle 3). Weiter wurden auch drei mit MCA 16-88 reaktionsfähige Klone isoliert. Figur 8 und Tabelle 3 beinhalten die Charakterisierung der Klone rCTA 56.1, 45.1 und 52.1.

Nachweis des Antigens im Serum von Patienten

Eine Anzahl von Patientenseren wurde nach dem durch den menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigen sowie nach CEA- und FHAP-Werten untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Antigen-werte in den untersuchten Seren standen zwar nicht in Wechselbeziehung mit hohen CEA- und FHAP-Werten, schienen sich jedoch komplementär zu diesen zu verhalten.

Erkennung des Antigens durch monoklonale Mausantikörper

Mehrere abgeleitete, monoklonale Mausantikörper verfügten über Immunoreaktionsfähigkeit mit dem durch den MCA 16-88 erkannten Antigen. Die Mausmonoklonalen 575-20 und 810-12 erkannten das Antigen, und kompetitive Assays zeigten, dass keiner der beiden Mausmonoklonalen mit dem spezifischen durch den menschlichen MCA 16-88 erkannten Epitop reagierte (Tabelle 4).

Reaktionsfähigkeit des durch den MCA 16-88 erkannten Antigens mit Antikörpern gegen intermediäre Filamentproteine

Der Antigen-Komplex besteht aus eng miteinander verbundenen Polypeptiden mit Molekulargewichtsgrössen zwischen 43K und 35K, die kleiner als alle vorgängig beschriebenen Cytokeratine sind, mit Ausnahme von Cytokeratin 19, dessen Molekulargewicht bei 40K liegt. Acht Banden des mit A-H markierten Antigen-Komplexes wurden elektroeluiert und einer Westernblot- sowie einer EIA-Analyse unterzogen. Wie in Tabelle 5 ersichtlich, konnte das MCA 16-88 die Banden B-H erkennen. Das Anti-Cytokeratin 8 erkannte die Banden A-H, während das Anti-Cytokeratin nur die Banden B-F und das Anti-Cytokeratin 19 sogar nur die Banden E-H erkannte. Der Maus-MCA (MCA 575-20), das durch die Immunisierung einer Maus mit dem gereinigten Antigen hergestellt wurde, reagiert mit den Banden A-G. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass der Maus-MCA mit einem anderen Epitop des MCA 16-88 reagiert. Diese Vermutung wurde durch einen kompetitiven Radioimmunoassay, bei dem mit ¹²&sup5;I markierter MCA 16-88 verwendet wurde bestätigt. Die Ergebnisse der Westernblot- Analyse wurden für alle Polypeptide durch EIA bestätigt. Diese Daten zeigen, dass die durch monoklonale, für die Cytokeratine 8, 18 und 19 spezifischen Antikörper erkannten Epitope auf dem Antigen existieren.

EIA-Charakterisierung des durch den MCA erkannten Antigens

Tabelle 6 stellt in zusammenfassender Weise die Charakterisierung des Antigens mit mehreren monoklonalen, für diverse intermediäre Filamentproteine spezifischen Antikörpern dar sowie die Reaktionsfähigkeit des MCA 16-88 mit mehreren gereinigten intermediäre Filamentproteine.
Die für die Cytokeratine 8, 18 und 19 und den murinen monoklonalen Antikörper MCA 575-20 spezifischen Antikörper waren die einzigen Antikörper, die mit dem Antigen reaktionsfähig waren. Der MCA 575-20 reagierte mit dem Antigen und dem Cytokeratin 18 auf die gleiche Weise, zeigte jedoch keine Reaktionsfähigkeit mit den anderen intermediären Filamentproteinen. Die Reaktionsfähigkeiten der Anti- Cytokeratine 8 und 18 sind mit dem Antigen höher als mit den gereinigten Cytokeratinen. Dies könnte an den Epitopen auf dem Antigen liegen, die auf dem intakten Cytokeratin nicht so leicht zugänglich sind. Das Antigen verfügt also über Epitope, die in den Cytokeratinen 8, 18 und 19 auch vorhanden sind. Ausserdem erkennt das menschliche MCA 16-88 Epitope auf dem Antigen, den Cytokeratinen 8 und 18 und möglicherweise auch auf Desmin, jedoch nicht auf Vimentin.

Erkennung des Antigens durch anti-idiotypische monoklonale Mausantikörper

Es wurden verschiedene monoklonale Mausantikörper abgeleitet, die bezüglich der Bindung an den MCA 16-88 mit dem Antigen direkt kompetitierten. Tabelle 2 stellt die Reaktionsfähigkeit dieser anti-idiotypischen Antikörper dar.

Anordnung der Epitope 16-88

Der menschliche monoklonale Antikörper 16-88 erkennt im Westernblot, bei dem gereinigte Proteine verwendet werden, in intermediären Filamentproteinen und Cytokeratin 18 enthaltene Epitope, sowie Epitope in Desmin. Der Monoklonale 16- 88 verfärbt auch durch Ficoll-Hypaque aus peripherem Blut isolierte und mit Ethanol fixierte Lymphzellen. Diese Zellen enthalten zwar kein Keratin, dafür aber andere intermediäre Filamentproteine, und es wird so indirekt bewiesen, dass 16-88 ein Epitop erkennt, das in mindestens 3 bis 4 Genprodukten vorkommt. Diese Genprodukte gehören zur Familie des cytoskeletalen Prote,ins das als intermediäre Filamente bekannt ist und die Cytokeratine 8 und 18 und Desmin enthält, jedoch nicht darauf beschränkt ist.

Sequenzanalyse des durch den MCA 16-88 erkannten Antigens

Es wurde eine N-terminale Proteinsequenzanalyse der Banden G und H (Bahnen 8 und 17, bzw. Bahnen 9 und 18 in Figur 7) durchgeführt, welche nach der SDS-PAGE-Analyse elektroeluiert wurden. Die Proteinsequenzierung wurde unter Verwendung eines automatisierten Gasphasen-Proteinsequenzierers (Applied Biosystems, Inc.) vorgenommen. Aus den Resultaten geht hervor, dass die Bänder G und H trotz ihrer unterschiedlichen Grösse über die gleiche N-terminale Proteinsequenz verfügen. Anhand von Vergleichen mit bekannten Proteinsequenzen konnte herausgefunden werden, dass die Polypeptide des durch den MCA 16-88 erkannten Antigens eine gewisse Ähnlichkeit mit den Cytokeratinen 8 und 19 (ungefähr 20%) aufweisen. Sie sind jedoch nicht mit diesen Cytokeratinen identisch und es konnte im Grunde genommen keine Ähnlichkeit zum Cytokeratin 18 gefunden werden. Obwohl also das Antigen über Epitope verfügt, die auch in den Cytokeratinen 8, 18 und 19 vorhanden sind, handelt es sich dabei deutlich um ein anderes Protein.
Die acht nahe beieinander wandernden Banden A-H (Bahnen 1-9 und 11-18 in Figur 7) sind Untereinheiten des durch den menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigens. Die N-terminalen Enden der Banden G und H sehen wie folgt aus:
In den obigen Sequenzen steht X für eine nicht bestimmte Aminosäure.

ATCC-Hinterlegungen

Eine von menschlichen B-Zellen stammende Zellinie zur Herstellung des menschlichen monoklonalen Antikörpers MCA 16- 88 wurde am 30. Januar 1984 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA gemäss den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 8495.
Die murinen Hybridoma-Zelllinien MID 95, MID 268 und MID 65-6 wurden am 2. July 1987 bei der ATCC gemäss den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer HB 9470, HB 9471 beziehungsweise HB 9472.

Beispiele

Zelllinien

Die menschliche Kolonadenokarzinomzelllinie HT-29 wurde von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland erhalten. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Kulturmedium gezüchtet, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war. Die Zellen wurden bei 37º C und in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2; inkubiert.

Herstellung und Reinigung von menschlichem MCA 16-88

Die diploiden Zelllinien zur Herstellung des menschlichen monoklonalen Antikörpers 16-88 wurden in Hohlfasergefässen mit RPMI 1640, das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt wurde, wachsen gelassen. Der Antikörper [ein menschliches Immunglobulin-M (IgM)] wurde durch Gelfiltration und Ionenaustauscherchromatographie gereinigt.

Entwicklung von monoklonalen Mausantikörpern

6 bis 8 Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden mit 50µg gereinigtem Antigen der HT-29 Zelle in vollständigem Freundschen Adjuvans immunisiert. Zwei weitere Antigenimmunisierungen wurden mit unvollständigem Adjuvans vorgenommen. Drei Tage vor der Fusion wurden die Mäuse mit Somg des Antigens in PBS immunisiert. Milz-Lymphozyten wurden wie früher mit Mausmyeloma-NS-1 (ATCC) fusioniert (Verhältnis von 3:1) (11). Die Überstände wurden mittels EIA gegen gereinigtes Antigen überprüft. Positive Kulturen wurden erweitert und durch limitierende Verdünnung geklont.

Entwicklung der antiidiotypischen Mausantikörper MID65, MID95 und MID268

Balb/c-Mäusen wurden 25µg menschliches IgM (Miles) IV, 25µg menschliches IgM intraperitoneal injiziert. Drei Tage später wurden den Mäusen 200µg/kg Cyclophosphamid (Sigma) und danach in Abständen von zwei Tagen zwei weitere Cyclophosphamidinjektionen injiziert. Daraufhin wurden die Mäuse mit 50µg des gereinigten Antikörpers 16-88 (Pool 160) immunisiert: das erste Mal in vollständigem Freundschen Adjuvans (Gibco) und zwei Wochen später in unvollständigem Freundschen Adjuvans (Gibco). Es wurde eine Maus aufgrund hoher Serumsreaktionsfähigkeit mit dem 16-88 und geringer Reaktionsfähgkeit mit IgM ausgewählt. Drei Tage vor der Fusion wurde die Maus mit Soug 16-88 (Pool 141) in PBS geboostert. Milz-Lymphozyten wurden in einem Verhältnis von 3:1 mit Mausmyeloma NS-1 (ATCC) unter Verwendung von PEG vermischt. Kulturen, die in kompetitiven 16-88-Versuchen positive Ergebnisse aufwiesen, aber kein mit IgM banden, wurden vermehrt und kryokonserviert. MID65, MID95 und MID268 banden den Antikörper 16-52 nicht (der von den gleichen Patientenlymphozyten abstammt wie 16-88).

³H-Glukosaminmarkierung von HT-29 Zellen

HT-29 Zellen wurden in Kultur-Flaschen mit RPMI 1640, das mit 10 % fötalem Kalbsserum (Gibco, Inc.) ergänzt wurde, gezüchtet. Nachdem die Zellen mit RPMI 1640 gewaschen worden waren, wurde sie in RPMI 1640 ohne Glukose gegeben, mit 9 % dialysiertem, hitzeinaktiviertem fötalem Kalbsserum und 1 % hitzeinaktiviertem fötalem Kalbsserum supplementiert und bei 37º C während 60 Minuten inkubiert. Dieses Medium wurde dann durch ein 0,05 mCi/ml ³H-Glucosamin (ICN) enthaltendes Medium ersetzt und bei 37º C während 16 Stunden inkubiert. Das mit ³H-Glucosamin versetzte Medium wurde entfernt, die Zellen mehrere Male mit PBS gewaschen und mit einen Lysispuffer wie weiter unten beschrieben extrahiert.

³²Orthophosphat-Markierung von HT-29 Zellen

HT-29 Kolonkarzinomzellen wurde wie weiter oben beschrieben mit ³²P Orthophosphat markiert (22). Kurz, 2x10&sup7; Zellen wurden zweimal mit 50mM HEPES, das 01 % Rinderserumalbinum (BSA, Sigma), pH 7,5, enthielt, gewaschen. Danach wurden die Zellen während 15 Minuten in einem phosphatfreien Medium (High Glucose EMEM, Irvine Scientific, Santa Anna, CA) inkubiert und schliesslich mit 500µCi ³²P-Orthophosphat (NEN Research Products) während 3 Stunden bei 37º C und in einer Atmosphäre von 6 % CO&sub2; gepulst. Nach der Markierung wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, das 100 mM Natriumfluorid, 100 mM Natriumdiphosphat und 1,0 mM EDTA pH 7,4 enthielt, und anschliessend wie oben beschrieben gelöst.

³&sup5;S Sulfat-Markierung von HT-29 Zellen

Für die Markierung mit ³&sup5;S-Sulfat wurden 2x10&sup7; Zellen zweimal mit Hams F-12 (Gibco) gewaschen und während 30 Minuten bei 37º C und einer Atmosphäre von 6 % CO&sub2; in 10 % dialysiertes FBS enthaltendem Hams F-12 vorinkubiert. Anschliessend wurde 500µCi ³&sup5;S Sulfat (NEN Research Products) beigegeben und die Zellen während 18 Stunden bei 37º C und in einer Atmosphäre von 6 % CO&sub2; gezüchtet, wonach die Zellen wie oben beschrieben gelöst und vorgeklärt wurden.

Immunopräzipitierung des Antigens

Die Immunopräzipitierung wurde mit dem monoklonalen Mausantikörper durchgeführt, dessen Herstellung weiter oben beschrieben ist und der mit 575-20 (IgG1) bezeichnet wurde. 50 ml-Aliquots des ³H-glucosaminmarkierten Extrakts wurden mit 50 mg des Antikörpers gemischt und 30 Minuten bei 23º C gehalten. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden durch Inkubation 16 Stunden bei 4º C mit 200 ml 10 % Formalinfixierter Staphylococcus auerus-Protein A-Lösung ausgefällt. Nach fünfminütiger Zentrifugation bei 20'000 x g wurde der Niederschlag mehrere Male gewaschen und mit SDS- PAGE Probenpuffer behandelt.

Extraktion des durch den menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigens

Gefrorene HT-29 Zellen wurden mit einem Extraktionspuffer (50 mM Tris, pH 7,5 + 150 mM NaCl + 5 mM EDTA + 0,1 mM PMSF + 0,5 % NP40) gemischt. Die Zellen wurden 60 Minuten bei 4º C gerührt und die Mischung anschliessend bei 4º C 60 Minuten bei 100'000 x g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde verworfen, die klare Flüssigkeit im Überstand abgenommen und weiteren Reinigungen unterzogen.

Salzausfällung des durch den menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigens

Der klare Überstand der extrahierten HT-29 Zellen wurde bei 4º C gehalten und auf 20 % Ammoniumsulfat durch Zugabe einer gesättigten Lösung gebracht. Die Mischung wurde bei 4º C 60 Minuten gerührt und dann 30 Minuten zentrifugiert bei 40'000xg bei 4º C. Der Überstand wurde dann entfernt und das Pellet mit dem relevanten Antigen in einer kleinen Menge Gelfiltrationspuffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8) wieder aufgelöst.

Gelfiltrationschromatographie

Die Trennung des durch Ammoniumsulfat ausgefällten Antigens wurde mittels einer TSK 4000SW HPLC-Säule(2,5 x 60 cm) (Toyo Soda), die in einem Gelfiltrationspuffer equilibriert war, vorgenommen. Das Antigen wurde auf die Säule gegeben und bei einer Flussrate von 4,0 ml/min. eluiert. Das Antigen enthaltende Fraktionen wurden für den nächsten Reinigungsschritt gepoolt. Andere Gelfiltrationsmatrixen wie Fractogel HW (Toyo Soda), Zorbax GF-450 (DuPont) oder Sephacryl S-400 (Pharmacia, Inc.) erwiesen sich als geeignete Methoden, um die TSK 4000SW Säule zu ersetzen.

Thiopropyl-Sepharose 6B-Chromatographie

Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia, Inc.) wurde in phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und equilibriert. Die Sammelfraktion aus der Gelfiltrationssäule wurde bei geringer Flussrate (15 ml/Std) auf eine Säule geladen. Die Säule wurde mit PBS und danach mit PBS + 1,0 M NaCl so lange gewaschen bis keine Proteine mehr eluiert werden konnten. Das Antigen wurde anschliessend mit 10,0 mM Dithothreitol (DTT) in 0,3 M Natriumbicarbonat, pH 8,4 und 1,0 mM EDTA eluiert. Der gereinigte Antigenpool wurde gegen 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 dialysiert und bei 200 C gelagert.

Polyacrylamidgelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde wie vorgängig beschrieben durchgeführt (12). In der Gelzusammensetzung wurden sowohl homogene als auch Gradienten-Gele verwendet. Die Nativgradientgelelektrophorese wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (13).

Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung des durch den menschlichen MCA 16-88 erkannten Antigens wurde in 1 %-igen Agarosegelen (25 x 125 x 0,5 mm) durchgeführt, die Ampholine in einem pH-Bereich von 3,5 - 10,0 enthielten. Nach 60-minütiger Vorfokussierung bei 1500 V, 15 W, 10 mA und einer Temperatur von 10º C, wurden die Proben appliziert und die Fokussierung unter den gleichen Bedingungen während 120 Minuten vorgenommen. Um die Proteine nach der Fokussierung zu fixieren wurde das Gel 30 Minuten in 20 %-iges TCA eingetaucht. Das Gel wurde 15 Minuten in 0,25 % CBB R 280 in 40 % Ethanol und 10 % Essigsäure angefärbt und in 40 % Ethanol und 10 % Essigsäure entfärbt. Die folgenden Proteine wurden als pI Marker verwendet: C-Phycocyanin (4,75; 4,85), Azurim P (5,0; 6,0), trifluoracetyliertes Myoglobin Met mit Trifluoressigsäure (6,86), Myoglobin met (6,64) und Myoglobin Met E (7,30).

Westernblot-Analyse

Westernblot-Analysen diverser Antigenpools wurde wie von Towbin (14) beschrieben durchgeführt. Nitrocelluloseblätter, auf die die Proteine übertragen worden waren, wurden mit Blotto blockiert, anschliessend mit einem ersten Antikörper, menschliches MCA 16-88 oder monoklonale Mausantikörper gegen das Antigen (Maus-MCA 16-88), markiert und weiter mit einem peroxidasernarkierten zweiten Antikörper - antimenschliches Ziegen-IgM oder Antimaus-Ziegen-Ig (G, A, M) [KPL, Rockville, MD] - reagieren gelassen, um ein entsprechendes Signet zu erzeugen. Beim verwendeten Substrat handelte es sich um Dimethylaminobenzol (DAB) und Hydrogenperoxid, die auf 0,06 % beziehungsweise auf 0,003 % gebracht wurden.

Antigennachweis durch EIA

Zum Nachweis des Antigens entwickelten wir zwei Arten von EIA. In einem ersten Versuch verwendeten wir zur Identifizierung des Antigens den menschlichen MCA 16-88. Die das Antigen enthaltende HT-29 Proteinextraktlösung wurde in geeigneten Verdünnungen (z.B. von 10 µg/ml an) auf Mikrotiterplatten aufgetragen und 16 Stunden bei 4º C oder 2 Stunden bei 23º C belassen. Danach wurde die Proteinlösung entfernt und zweimal mit PBS + 0,05 % Tween -20 gewaschen. Die nichtreagierten Stellen in jeder Vertiefung wurden mit Blotto (5 % nichtfettige Trockenpulvermilch in PBS) in 0,05 % Tween -20 durch Inkubation während 60 Minuten bei 23º C blockiert. Nachdem sie gewaschen worden waren, wurden die Vertiefungen mit dem ersten, in Blotto verdünnten Antikörper, menschlicher MCA 16-88 (1,0 µg/ml), getestet und während 60 Minuten bei 23º C inkubiert. Nachdem der erste Antikörper entfernt und die Vertiefungen gewaschen worden waren, wurden die Vertiefungen 60 Minuten bei 23º C mit einer geeigneten Verdünnung (1:30'000) von peroxidasemarkiertem anti-menschlichem Ziegen-IgM (KPL) gewaschen. Nach der Entfernung des anti-menschlichen Konjugats und verschiedenen Waschungen, wurden die Vertiefungen mit dem Peroxidasesubstrat (0,006 % Tetramethylbenzol und 0,0007 % Harnstoffperoxidase in 0,5 M Natriumacetat, pH 5,5) behandelt.
Im zweiten Assay verwendeten wir zwei der monoklonalen Mausantikörper, die gegen das Antigen 810-12 und 575-20 entwickelt worden waren. Der Maus-MCA 810-12 wurde zu 3 mg/ml in PBS auf Platten aufgetragen und während 16 Stunden bei 4º C belassen. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen 45 Minuten bei 23º C blockiert (3 % Fischgelatine in PBS). Anschliessend wurden die Vertiefungen nach dem Waschen mit das Antigen enthaltendem Testserurn inkubiert, danach mit peroxidasegekennzeichnetern Maus-MCA 575-20 überzogen und 60 Minuten bei 37º C inkubiert. Nach mehreren Waschungen mit 0,05 % Tween -20 enthaltendern 1 % Glycerin wurden die Vertiefungen wie oben beschrieben mit Substrat behandelt. Die Absorption wurde bei 450 nm bestimmt.

Saccharosedichtegradienten

10 - 40 %-ige lineare Saccharosegradienten wurden in Gegenwart von PBS in den Zentrifugenröhrchen hergestellt. Standard-Proteine oder gereingte, durch den menschlichen MCA 16-88 erkannte Antigene wurde auf die Gradienten in den Röhrchen geschichtet. Anschliessend wurden alle Röhrchen bei 40º C 17 Stunden in einem Beckmann-SW41-Rotor bei 40'000 U/Min. zentrifugiert. Der Inhalt der Röhrchen wurde fraktioniert und die relative Molekulargrösse entweder durch Messen der Absorption bei 280 nm oder durch die Bestimmung der Reaktionsfähigkeit mit dem menschlichen MCA 16-88 mittels EIA bestimmt.

Referenzen

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20. Romano, V. et al., Diff (1986) 30:244-253. TUMORANTIGEN-PROFIL VON KREBSPATIENTEN PROBE# PATIENT KLININSCHER VERLAUF Antigen* KOLONKREBS Fortsetzung Tabelle 1 TUMORANTIGEN-PROFIL VON KREBSPANTIENTENSAMMEL-FRAKTION # PATIENT KLINISCHER VERLAUF Antigen KOLONKREBS MEANOM
Bemerkung: Die Probe #281 ist anomal falsch positiv
N.B. nicht bestimmt
* durch menschliches MCA 16-88 erkanntes Antigen Tabelle 2 16-88 HRP IgM ELISA 16-52 ELISA
Die Werte sind OD450 x 1000. CN sind nur Mediumkontrolle. Bei Test A wurden Platten verwendet, die mit dem Antigen beschichtet sind. Als positives Resultat gilt ein tiefer Wert, der sich aus der Kompetition des den MCA 16-88 bindenden Antigens und dem Maus-MCA ergibt. Bei den Tests B und C wurden mit dem angegebenen Antikörper beschichtete Platten verwendet. Tiefe Werte zeigen an, dass keine Bindung stattgefunden hat. In Test B ging es um die Bindung des Maus-MCA an menschliches IgM (MCA 23 ist eindeutig positiv). Test C hatte die Bindung von menschlichen IgM MCA1 16- 52, das vom gleichen Patienten isoliert wurde wie das MCA 16-88, zum Gegen stand. MCA 16-52 ist gegen ein anderes Epitop gerichtet als MCA 16-88 (MCA 342 und 399 sind positiv). Diese Resultate zeigen, dass MCA 65, 95 und 268 gegen das dem MCA 16-88-eigene Idiotop gerichtet ist. TABELLE 3 Antikörper Molekulargewicht Antigen Cytokeratin
1. Für menschliches Cytokeratin Nr. 18 spezifisches Maus-MCA (Boehringer-Mannheirn #814385).
2. Für menschliches Cytokeratin Nr. 19 spezifisches Maus-MCA (ICN #63-773).
3. Authentisches Cytokeratin Nr. 18 (ICN #771031).
4. rCTA rekombinantes Kolontumorantigen. TABELLE 4 Kompetitive RIA Kokurrierende Antikörper 1²&sup5; I-markierte MCA menschliches IgM -- zeigt an , dass keine Kompetition stattgefunden hat. Werte: µg/ml um 50 % Inhibition zu erreichen TABELLE 5 Zusammenfassung des Westernblots der elektroeluierten Polypeptide des durch MCA 16-88&sup6;¹ erkannten Antigens Verwendete Antikörper Band Cyto
&sup6;¹ Die Banden wurden nach der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (39) elektroeluiert. Pro Bahn wurden zehn Microgram des Antigens verwendet, das mittels SDS-Polyacrylamidgelektrophorese aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen worden war und anschliessend mit für die Cytokeratine 8, 18 und 19 spezifischen monoklonalen Antikörpern, menschlichem MCA 16-88 und murinem MCA 575-20 getestet wurde. TABELLE 6 EIA-Titration von für IF Proteinea spezifischen MCA Antigen Monoklonaler Antikörper Klon Antigen Cyto Desmin Vimentin Anti-cyto anti-Vimentin anti-Desmin anti-GFAP
a Die Antigene wurden in PBS auf Mikrotiterplatten aufgetragen (100 µl/Vertiefung zu 3 µg/ml in PBS). Die Platten wurden mit 200 µl/Vertiefung Blotto blockiert und dreimal mit PBS/Tween gewaschen. Anschliessend wurden in PBS/Tween monoklonale Antikörper zugegeben und bei 27º C eine Stunde inkubiert. Nach dem Waschen wurden Meerrettichperoxidasekonjugate von anti-menschlichen Ziegen-IgM oder anti-Maus Ziegen IgM + IgM in geeigneten Verdünnungen in PBS/5,0 % normalen Ziegenserum zugegeben und diePlatten bei 25º C eine Stunde inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS/Tween wurde das Substrat zugegeben, und die Platten konnten bei A&sub4;&sub5;&sub0; abgelesen werden.
b Die Ergebnisse sind als Konzentration in µg/ml Antikörper ausgedrückt, was einen OD&sub4;&sub5;&sub0; von 0,5 ergibt.
c (-) = negativ bei einer MCA-Konzentration von bis zu 5,0 µg/ml.
d durch MCA 16-88 erkanntes Antigen

Claims

1. Menschliches Tumorzellepitop, das

a. mit dem menschlichen monoklonalen Antikörper 16-88 immunreagiert, der von den Hybridoma mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8495 erhältlich ist,

b. auf einem Tumor assoziierten Antigen nachgewiesen wurde, das den Koloncarcinomzelllinien HT-29, SW1463, SW948, SW403 und LoVo gemeinsam ist, die die ATCC-Nummern HB 38, CCL 234, CCL 237, CCL 230 beziehungsweise CCL 229 haben und WiDr, die von dem Wistar Institut, Philadelphia, PA USA erhältlich ist und

c. auf Vimentin nicht nachgewiesen werden kann.

2. Menschliches Tumorzellantigen, das das menschliche Tumorzellepitop von Anspruch 1 umfasst, das ein durch Gelfiltrationschromatographie bestimmtes Molekulargewicht von ungefähr 900 K und einen isoelektrischen Fokusierungspunkt von ungefähr pH 5,5 besitzt, sowie Untereinheiten davon, wobei sowohl das Antigen als auch die Untereinheiten mit dem monoklonalen Antikörper 16-88 immunreagieren, welcher von den Hybridoma mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8495 erhältlich ist, sowohl das Antigen als auch die Untereinheiten sind nicht in gesundem Kolongewebe vorhanden.

3. Menschliches Tumorzellantigen, das das menschliche Tumorzellepitop von Anspruch 1 umfasst, das mit dem menschlichen monoklonalen Antikörper 16-88 immunreaktiv ist, der von den Hybridoma mit der Hinterlegungsnumrner ATCC HB 8495 erhältlich ist, wobei genanntes Antigen ein Protein umfasst, das in dem Bereich von ungefähr 43 K bis ungefähr 35 K wandert, wie durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylarnidgelelektophorese bestimmt wurde.

4. Antigen von Anspruch 3, das die teilweise Aminosäuresequenz V L E V D P N I Q A V R T Q umfasst.

5. Antigen gemäss Anspruch 3, das den Cytokeratinen 18 und 19 gemeinsame Epitope umfasst, jedoch löslich Proteine umfasst, die nicht mit Antiseren sowohl gegen Cytokeratin 18 als auch Cytokeratin 19 reagieren.

6. Von B-Zellen stammende Zelllinie zur Herstellung des menschlichen monoklonalen Antikörpers IgM 16-88 mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8495.

7. Menschlicher monoklonale Antikörper 16-88, der von den Hybridoma mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8495 erhältlich ist.

8. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Tumorzellen in einem Säugerversuchsobjekt, das das Reagieren einer Probe des genannten Versuchsobjekts mit einem Reagenz umfasst, das einen gegen das Antigen von Anspruch 3 gerichteten Antikörper umfasst und Nachweisen aller resultierender Antikörper/Antigen-Immunkonjugate.

9. Verfahren von Anspruch 8, worin das Versuchsobjekt ein Mensch ist.

10. Verfahren von Anspruch 8, worin das Reagenz den menschlichen monoklonalen Antikörper 16-88 umfasst, der von den Hybridoma mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8495 erhältlich ist.

11. Verfahren zur Überwachung einer Krebstherapie, das das Messen des Vorhandenseins sowie der Menge der Tumorzellen mit dem Verfahren von Anspruch 8 umfasst.

12. Verfahren von Anspruch 11, worin das Reagenz den menschlichen monoklonalen Antikörper 16-88 unfasst, der von den Hybridoma mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8495 erhältlich ist.

13. Antikörper hergestellt durch Immunisieren eines Tieres mit dem Epitop von Anspruch 1.

14. Anti-idiotypischer Antikörper hergestellt durch Immunisieren eines Tieres mit menschlichem monoklonalen Antikörper 16-88, der von den Hybridoma mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8495 erhältlich ist.

15. Anti-idiotypischer Antikörper von Anspruch 14, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MID65, MID95 und MID268, die von den Hybridomas mit den Hinterlegungsnummern ATCC HB9472, ATCC HB9470 be ziehungsweise ATCC HB9471 erhältlich sind.

16. Immunochemisches Reagenz, das einen nachweisbaren Marker oder eine cytotoxische Verbindung und einen Antikörper, der gegen das Antigen von Anspruch 3 gerichtet ist, umfasst.